Nghiên cứu phát hiện đồng thời 3 GEN VRRA, CAPA,PAGA của vi khuẩn than (bacillus anthracis) bằng phản ứng multiplex PCR

VIỆN DẠI HỌC MỞ HÀ NỘI

KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC
-------.............................

KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP
Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

ĐỀ TÀI:

NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI 3 GEN VRRA,

CAPA, PAGA CỦA VI KHUẨN THAN (BACILLVS ANTHRACIS)
BẰNG PHẢN ỨNG MULTIPLEX - PCR

Người hưóng dẫn

: PGS. TS. NGHIÊM NGỌC MINH

Sinh viên thực hiện

: ĐINH THỊ HIÈN

Lớp

: 11 - 02

HÀ NÔI - 2015


Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

LỜI CẢM ƠN!

Trước hết, tơi xin bày tó lịng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc
Minh, người thầy tâm huyết đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập tại phịng Cơng
nghệ sinh học Mơi trường thuộc Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa Học
và Cơng Nghệ Việt Nam. Thầy ln tận tình hướng dan, dành thời gian trao đoi, định

hướng cũng như động viện, nhác nhở và dìu dal tơi trong q trình nghiên cứu, học tập
và hồn thành khóa luận này.

Tơi xin gửi lời cảm on chân thành đen toàn thê các anh chị trong phịng Cơng
nghệ sinh học Mơi trường, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thị Hoài Thu và KS. Phạm Thùy
Linh đã giúp đỡ, chi báo tận tình cho tơi trong suất q trình học tập nghiên cứu hồn

thành khóa luận của mình.

Bên cạnh đó, tơi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học,
Viện Đại học Mở Hà Nội cùng với Ban lãnh đạo viện Công nghệ sinh hục, Viện Hàn

lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo diều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi tời căm ơn chân thành và sâu sac tới gia đình và bạn bè đã

động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần đê tơi có thê hồn thành tot khóa
luận này.
Một lần nữa tơi xin chân thành cám ơn!

Hà Nội, ngày tháng

Sinh viên

Đinh Thị Hiền

năm 2015


Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội


MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẤT................................................. i
DANH MỤC HÌNH........................................................................................................... ii
DANH MỤC BẢNG......................................................................................................... iii

ĐẶT VÁN ĐÊ.................................................................................................................... 1
PHẦN I: TÓNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................ 3

1.1.

Bệnh than................................................................................................................ 3
1.1.1.

Sơ lược về bệnh than................................................................................... 3

1.1.2.

Các dạng bệnh than..................................................................................... 4

ỉ. ỉ.2.1. Bệnh than ờ thể da...................................................................................... 5
1.1.2.2.

Bệnh than ở the tiêu hóa và họng - thanh quản..................................... 6

1.1.2.3.

Bệnh than ớ thế hô hấp........................................................................... 6

1.1.2.4.

1.2.

Bệnh than thế màng não..........................................................................7

Bệnh than và chiến tranh sinh học............................................................. 7

1.1.3.

Trực khuẩn thẸ|w.íf4ện..y.jện..{>ạị.^ạe..M4-H-à-Nệl'................... 8
1.2.1. Lịch sử phát hiện.......................................................................................... 8
1.2.2.

Đặc điểm cùa B. anthracis............................................................................ 9

1.2.2.1.

Hình thế.....................................................................................................9

1.2.2.2.

Đặc điểm ni cay.................................................................................10

1.2.2.3.

Sức đề kháng.......................................................................................... 12

1.2.2.4.

Kháng nguyên........................................................................................ 12

1.2.2.5.

Độc lực................................................................................................... 13

1.2.2.6.

Khá năng gây bệnh cho người và độngvật........................................... 14

1.2.3.

1.2.3.

Đặc điểm hệ gen cùa B. anthracis...............................................................15
Ỉ.Gen trên chromosome............................................................................15

1.2.3.2. Gen trên plasmid......................................................................................... 16
1.3.

Các phưomg pháp chẩn đoán B. anthracis........................................................ 17

1.3.1.

Phương pháp trực tiếp..................................................................................17

1.3.2.

Phương pháp nuôi cấy.................................................................................. 18

1.3.3.

Các phương pháp chẩn đoán nhanh............................................................. 18


1.3.4.

Phương pháp PCR - Multiplex PCR.......................................................... 19

PHÀN II: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP............................................................. 22

2.1.

2.2.

Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu................................................ 22
2.1.1.

Vật liệu........................................................................................................ 22

2.1.2.

Hóa chất, máy móc và thiết bị..................................................................... 22

Các phưong pháp nghiên cứu........................................................................... 26

2.2.1.

Sơ đồ nghiên cứu......................................................................................... 26

2.2.2.

Các phương pháp nghiên cứu......................................................................26

2.2.2.1.

Thiết kế mồi cho phân ứng PCR.......................................................... 26

2.2.2.2.

Tách chiết DNA tông so cùa vi khuân than.......................................... 27

2.2.23. Kỹ thuật PCR đon moi (Polymerase Chain Reaction)............................ 28

2.2.2.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR).................................................... 30
2.2.2.5. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose.......................................... 32

2.2.2.Ó. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose......................................... 33

2.2.2.7. Phương pháp giải trình tự.......................................................................34

PHÀN III: KÉT
ịVÀ Í^ẲpiệỊỉ^ạị.Ịìẹe.MỚ-Hà-NệÌ'..................... 35
3.1. Kết quả thiết kế các cặp mồi..............................................................................35
3.2.

Tách chiết DNA tổng số từ mẩu vi khuẩn than (Bacillus anthracis)............35

3.3.

Kết quả khuếch đại 3 gen vrrA, capA, pagA của B. anthracis bằng kỹ thuật

PCR................................................................................................................................... 36
3.3.1.

Gen VrrA.......................................................................................................37

3.3.2.

Gen pagA......................................................................................................37

3.3.3.

Gen CapA.....................................................................................................38

3.4.

Tinh sạch sản phẩm PCR................................................................................... 39

3.5.

Xác định trình tự và so sánh trên ngân hàng gen......................................... 39

3.6.

Multiplex PCR phát hiện đồng thòi 3 gen vrrA, capA, pagA........................ 42

PHÀN IV: KÉT LUẬN VÀ KIÊN NGHỊ.................................................................. 44
KÉT LUẬN...................................................................................................................... 44

KIẾN NGHỊ..................................................................................................................... 44
TÀI LIỆU THAM KHẢO.................................................................................................

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHŨ VIẾT TẮT

pl, ml, 1

Microliter, milliliter, liter

B. anthracis

Bacillus anthracis

Bp
dH2O

Deion water

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EF

Edema Factor

Epp
kDa

Eppendorf

LF

LethalFactor

mg,g

Milligram, gram

NCBI

Base pair (cặp base)

Kilo Dalton

Thư viện Viện E

National Center.forBiotechnology

Information

PA

Protective Antigen

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

TAE

Tris - Acetate - EDTA

Taq DNA polymerase

Thermus aquaticus DNA polymerase

iii

DANH MỤC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 1.1: Biếu hiện bệnh than ở thể da trên người........................................................... 5
Hình 1.2: Trung thất dãn ra do hít phải bào tứ than.......................................................... 6
Hình 1.3: Não của người bị nhiễm bệnh than................................................................... 7
Hình 1.4: B. anthracis và bào tử.......................................................................................10
Hình 1.5: Bào tứ cùa B. anthracis.................................................................................... 10

Hình 1.6: Khuẩn lạc B. anthracis trên mơi trường thạch máu cừu................................11
Hình 1.7: Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường Sodium bicarbonat agar................ 12
Hình 1.8. VỊ trí gen pagA trên plasmid pOX 1..................................................................17
Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu........................... 26
Hình 3.1: Điện di kiểm tra sàn phẩm tách DNA tổng số cùa vi khuẩn than.................. 36
Hình 3.2: Điện di đồ sán phấm PCR gen vrrA từ vi khuần than....................................37

Hình 3.3: Điện di đồ sàn pham PCR gen pagA từ vi khuẩn than...................................38
Hình 3.4: Điện di đồ^sẩA phầrh PCRgtìi cởpA kptì khuẩn tỉtẳnù.ọ............................. 38
Hình 3.5: Sàn phàm PCR sau khi được tinh sạch........................................................... 39
Hình 3.6: Trình tự gen PagA.POXIcùữ. vi khuẩn than................................................... 40

Hình 3.7: Trình tự gen CapA.POX2 của vi khuẩn than.................................................41
Hình 3.8: Trình tự gen VrrA vi khuẩn than.................................................................... 42
Hình 3.9: Điện di dồ sản phấm khuếch đại đồng thời 3 gen từ của vi khuân than bang
phàn ứng Multiplex PCR.................................................................................................. 43

iv

DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Trang

Báng 2.1: Danh mục các hóa chất sử dụng..................................................................... 22
Bảng 2.2: Các dung dịch và đệm sử dụng trong phịng thí nghiệm............................... 23
Bảng 2.3: Danh mục các máy móc và thiết bị sử dụng.................................................. 24
Bảng 2.4. Thành phần các phản ửng PCR đơn mồi........................................................ 29
Báng 2.5. Chu trình nhiệt của phán ứng PCR đơn mồi................................................... 30
Bàng 2.6. Thành phần phàn ứng Multiplex - PCR......................................................... 31
Bàng 3.1: Trình tự các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại các gen của vi khuẩn than.
............................'............
:................................................
35
Báng 3.2: Báng so sánh độ tương đồng của gen pagA.POXl của B. anthracis nghiên
cứu với một số chùng B. anthracis trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)..................... 40
Bàng 3.3: Bảng so sánh độ tương đồng của gen CapA.POX2 của B. anthracis nghiên
cứu với một số chúng B. anthracis trên ngân hàng gen thế giới (NCBI)..................... 41

Bảng 3.4: Bảng so sánh độ tương đồng của gen VrrA của B. anthracisnghiêncứu với
một số chùng B. antlưacis trên ngân hàng gẹn thếgiới (NCBI)
............................ 42

V



DẶT VÁN ĐỀ

Bệnh than (hay bệnh nhiệt thán) là bệnh do trực khuẩn Bacillus anthracis (B.
anthracis) gây ra. Bệnh thường diễn ra ờ gia súc, động vật thuộc họ móng guốc như

cừu, trâu, bị, ngựa... có thố truyền sang người thành dịch với tỳ lệ từ vong cao. Người
mắc bệnh than trong các trường hợp bị nhiễm vi khuẩn qua vết sây sát ớ da khi tiếp

xúc với chất thãi động vật mắc bệnh hoặc ăn thịt động vật chết vì bệnh than. Ngồi ra

cịn gặp trong các trường hợp ăn thịt bị nhiễm khuấn than do chưa nấu chín. Bệnh gây
nhiễm trùng và hoại tử cơ quan và có ti lệ gây tử vong cao nếu không được điều trị kịp
thời. Dù bệnh ít phố biến nhưng bệnh dễ lây lan, nguy cơ tử vong cao nên B. anthracis

đã được sử dụng như là vũ khí sinh học nguy hiếm nhất trong lịch sứ chiến tranh bởi
thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu

dược với điều kiện khắc nghiệt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chân đốn
bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng.

B. anthracis có khà năng sinh ra hai loại độc tố là ngoại độc tố và độc tố vó nhày
(capsule toxin). Ngoại độc tố gồm 3 thành phàn: Kháng nguyên bao vệ Protective
antigen (PA), yếu tố gây phù nề Edema Factor (EF) và yếu tố gây chết Lethal Factor

(LF). Gen mã hóa cho 3 loại độc tố này lần lượt là pagA, cya, lef nam trên plasmid
pXOl. Độc tố vỏ nhầy cùa B. anthracis là một chuồi poly - D glutamic acid được mã

hóa bời gen cap nằm trên plasmid pXO2. Gen VrrA là một gen đặc trưng của B.

anthracis, nó nam trên chromosome và mã hóa cho một protein có tên là glutamine.

Đe phát hiện tác nhân gây bệnh than, đã có nhiều phương pháp được nghiên

cứu. phát triền và ứng dụng như các phương pháp nhuộm, phương pháp nuôi cấy trên

môi trường thạch máu cừu, sử dụng các phương pháp chân đoán nhanh như phán ứng

hạt trai, phương pháp miền dịch huỳnh quang trực tiếp....Tuy nhiên, những phương
pháp này tốn khá nhiều thời gian (bệnh nhân có thế chết trước khi có kết q xét
nghiệm), tốn cơng sức, địi hói kỹ thuật phức tạp. Hơn nữa, phái tiếp xúc trực tiếp với

mầm bệnh nên nguy cơ lây nhiễm cao cho kỹ thuật viên.


Ngày nay, với sự phát triền của sinh học phân tứ, nhiều phương pháp đã được

phát triển và áp dụng có hiệu quá trong việc phát hiện ra tác nhân gây bệnh.Trong đó,
phương pháp phân tử dựa trên phàn ứng PCR được áp dụng phơ biến nhất, vì phương
pháp này cho phép phát hiện gen hoặc hệ gen ngay cà khi chưa biểu hiện kiểu hình và
đặc tính gây bệnh. PCR là phản ứng thao tác trực tiếp trên chất liệu di truyền và có khá

năng nhân lên bất cứ đoạn gcn nào trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao, thao tác lại khá đơn gián. Đặc biệt là PCR có thề thao tác trên các gen vi

khuân đã chết nên phương pháp này đã được ứng dụng ngày càng rộng rãi ở nhiều
nước trên thê giới, trong đó có Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“ Nghiên cứu phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, capA, pagA của vi khuấn than
(Bacillus anthracis) bằng phản ứng Multiplex PCR.”
Mục tiêu nghiên cứu :

Phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, capA, pagA cùa vi khuân than (Bacillus
anthracis) đề phục vụ cho việc tạo Kít phát hiện nhanh vi khụấn than.

Nội dung nghiên cứu

Đe đạt được mục tiêu đề ra. đề tài cần thực hiện các nội dung sau:
7.

Thiết kế các cặp mồi cho 3 gen.- vrrA, capA, pagA cùa vi khuân than.

2.

Tách chiết DNA tống số từ mầu vi khuẩn than.

3.

Thực hiện phàn ứng PCR đơn mồi phát hiện từng gen vrrA, capA, pagA

4.

Xác định trình tự và so sánh trình tự trên ngân hàng gen.

5.

Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen VrrA,

cúa vi khuẩn than.

CapA, PagA.

2

PHÀN I: TỐNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh than

1.1.1. Sư lược về bệnh than
>

Trên thế giói

Bệnh than hay cịn gọi là bệnh nhiệt than, đã gây ra những thiệt hại vô cùng to
lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng như làm ánh hường tới sức khóe con người.Vì

thế mà nó được đặt tên là “Black Bane" nghĩa là thám họa đen, vì khi bị nhiễm bệnh,
vết thương có màu den [2J.

Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điềm nhất định, đặc
biệt là những vùng nông nghiệp ớ phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi. Bệnh thường gặp ớ
những động vật ăn cò như: cừu, dê, ngựa, trâu, bị. Đặc biệt bệnh có thế lây nhiễm sang

người thành dịch với ti lệ từ vong cao nên bệnh được coi là mối hiếm họa đe dọa đen
sức khỏe cộng đồng.

Thư viên Viện Đại học Mở Hà Nội
Trận dịch than được biết đến đầu tiên trong lịch sử xáy ra năm 1500 trước Công
Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập. Năm 1491 trước Công Nguyên, tiếp

tục một cơn lốc bệnh than ớ Ai Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện
bệnh than.
Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga).

Từ năm 1979-1985 một đại dịch than lớn xày ra ờ Zimbabwe làm khoáng 10.000

người mắc bệnh. Năm 1979, tại Sverdlosvk thuộc nước Cộng hòa Soviet (nay là
Ekaterinburg, Nga) bệnh đã làm 11 người tử vong [18]. Ớ Australia vẫn tiếp tục xuất

hiện rải rác các vụ dịch than, hay gặp ớ khu vực Nam Wales và Victoria. Tại Anh, năm
1961 báo cáo có 145 ca bệnh, và 10 ca bệnh từ năm 1980-1990 [7|. Dịch than trên

động vật lan khắp ờ Ẩn Độ, trong những năm 1991 - 1996 có 1613 vụ dịch than trên

động vật được ghi nhận, tỷ lệ động vật chết chiếm 62,5% trong đó 20% là trâu và 80%
cịn lại là cừu và dê. Năm 1996, tại Philippine có 4 vụ dịch than xây ra trên động vật

3


trong khi ớ Thái Lan có 6 vụ và có 148 người mắc bệnh. Tại Nepan từ năm 1992 đến

1997 có 19 vụ dịch than xảy ra ở gia súc, cừu, ngựa làm tống cộng 222 súc vật bị chết
[7]. Năm 1997, tại Pháp đã xãy ra một trận dịch than làm cho 94 động vật bị chết và 3

người mắc bệnh than [28].
Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguồn gốc của bệnh than và quá trình hình

thành bào tứ của vi khuân B. anthracis. Sau vụ khủng bố ngày 11/9/2001 tại Mỹ xuất

hiện một vụ khủng bo bang B. anthracis làm 10 người nhiễm bệnh, điều này đã làm
cho cả thế giới hoang mang [19],
Trận dịch than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ờ một quốc gia nhỏ ờ châu

Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh.

>

Ở Việt Nam

Ớ Việt Nam, bệnh than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng chưa được các nhà dịch tề
học thông báo một cách đầy đủ. Theo thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương:

năm 1997 có 30 ngươi bị niSc bệnh !ỉhattV ^^‘4998 cổ 59 ngỉrởi, năm 1999 có 58

người, năm 2000 có 27 người bị mắc bệnh than trong đó có 12 người ở Cao Bằng, 11

ca ở Lai Châu, 4 ca ờ Đồng Nai. Gần đây, từ năm 2008-2010 đã xáy ra các vụ dịch

than tại Mèo Vạc - Hà Giang và Than Uyên - Lai Châu làm 18 người nhiễm bệnh than
trong đó có 2 người tử vong và nhiều động vật mắc bệnh [3]. Hầu hết các ca mắc bệnh

than xuất hiện rải rác ở khu vực các tĩnh miền Bắc như: Sơn La, Điện Biên, Lai Châu,

Hà Giang, nguyên nhân phát sinh chủ yếu do tiếp xúc với động vật ăn cỏ như trâu, bò
hoặc ăn thịt động vật chưa nấu chín. Bệnh xuất hiện chu yếu ở khu vực dân tộc thiếu

số, nơi có điều kiện vệ sinh kém, điều kiện chăm sóc y tế hạn chế.

1.1.2. Các dạng bệnh than
Bệnh than thường xuất hiện ở các lồi động vật hoang dã cũng như động vật ni,
đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ như trâu, bị. cừu, ngựa, dê do chúng hít phài hoặc

nhiễm phái hào tứ than trong lòng đất. Ớ người, nguy cơ mác bệnh than cao là do tiếp

xúc với động vật ăn có.

4


Bệnh than có thê nhiễm vào cơ thê vật chú theo ba con đường: qua da, qua đường

tiêu hóa và qua đường hô hấp. Tùy theo cách thức lây nhiễm mà người ta chia bệnh

than thành 4 các thê than khác nhau: Than da, than tiêu hóa, than hơ hấp, than màng
não.
1.1.2.1. Bệnh than ỏ' thể da

Đây là hình thức than phổ biến nhất, chiếm hơn 95% và là loại bệnh có khả năng

điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây nhiễm cao, thường
xuyên tiếp xúc với động vật và các sán phẩm từ gia súc bị nhiễm than, tiếp xúc với môi

trường đất chứa trực khuẩn than hoặc bào tử của trực khuấn than. Từ các vết thương hớ
trên da, vi khuân hay bào tử B. anthracis có thê xâm nhập vào.

Hình 1.1: Biểu hiện bệnh than ở thế da trên người

( )

Triệu chứng cùa bệnh: Sau 1-2 ngày đầu, da bị đó, thấy xuất hiện các mụn phóng.

Sau 4-6 ngày, tốn thương tiến triền qua các giai đoạn mụn. phồng nước hoặc bọng
nước và tạo thành 0 loét có vảy hoại từ màu đen, xung quanh 0 loét bao bọc bời vùng

phù nề rộng, màu nâu (hình 1.1). Trong khoảng 1-2 tuần kế từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất

hiện các tnú và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết
tăng lên và sau dó vùng thương tốn sẽ chuyên sang dạng tự phát. Neu bệnh nặng thêm,

vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu làm nhiễm trùng máu dẫn đến khơng thể chữa khói.
5


1.1.2.2. Bệnh than ỏ’ thể tiêu hóa và họng - thanh quản

Bệnh than tiêu hóa thường ít gặp nhưng lại có tỳ lệ tử vong khá cao. Nguyên nhân
của bệnh than ở the tiêu hóa là do ăn phải thịt gia súc đã bị nhiễm bào tứ than mà
không được nấu chín, thậm chí cá khi được nấu chín thì khã năng nhiễm bệnh vần cao

[ I ]. Sau khi ăn thịt động vật mắc bệnh có chứa bào tứ than, có thê xáy ra các triệu
chứng sốt, đau bụng lan tỏa kèm hồi ứng (rebound tenderness), táo bón hoặc tiêu chảy,
phân có màu bã cà phê hoặc lẫn máu. Trường hợp nặng bệnh nhân biểu hiện tình trạng

sốc nhiễm độc. nhiễm trùng huyết, có the gây tử vong cao.
Thể họng - thanh qn ít gặp hon thể tiêu hóa, nhưng cũng do nuốt phái bào tử
than. Những triệu chứng ban đầu gồm phù nề, sưng hạch bạch huyết vùng cổ, nuốt đau

và khó thờ. Thể bệnh này nhẹ hơn thế tiêu hóa.

1.1.2.3. Bệnh than ớ' thế hơ hấp
Bệnh than thế hô hấp khới phát không đặc hiệu với các triệu chứng: thiếu máu.

sốt, đau cơ. ho khan. Sau đó 2-3 ngìty, bắt đầu gỉai ẻốạn toấn phát với dấu hiệu suy hô
hấp nặng kết hợp với vã mồ hôi, da xanh tím, đau ngực nhiều. Trên X quang lồng ngực

có thế thấy trung thất giãn rộng, tràn dịch màng phối (hình 1.2). Bệnh nhân từ vong sau
24-36 giờ do suy hơ hấp. nhiễm khuấn huyết và sốc.

Hình 1.2: Trung thất dãn ra do hít phái bào tứ than
( />
6


1.1.2.4. Bệnh than thể màng não

Bệnh than thế màng não thường do biến chứng từ ba thể than trên. Than màng
não xuất hiện khi B. anthracis tấn công vào hệ thống than kinh trung ương theo đường

máu và các mạch bạch huyết (hình 1.3). Triệu chứng của bệnh thường là sốt cao, một
mói. đau cơ, đau đầu, buồn nơn, lên cơn mê sàng khi phát bệnh và dẫn đến hôn mê. Đa
số bệnh nhân thường tử vong sau 1-2 ngày kế từ khi mac bệnh. Thế than này có tỳ lệ tử

vong rất cao.

Hình 1.3: Não cùa người bị nhiễm bệnh than

( />ỉ.1.3. Bệnh than và chiến tranh sinh học
Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời trực khuẩn than có khá
năng phát tán nhanh, khó phát hiện nên đã được sử dụng như một thứ vũ khí sinh học

đế làm tê liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia, nó đe dọa đến vấn đề an
ninh quốc phòng của nhiều quốc gia trên thế giới.

Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sừ dụng như một thứ vũ

khí vơ cùng lợi hại. Một vài nước như Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh. Iraq và Liên
Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương tiện cùa chiến tranh.

7


Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuân bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, đế cung cấp cho

các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất.
Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than. Sau chiến tranh thế giới thứ

hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick. Maryland.
Năm 1979, bào tử than đã được phóng thích ớ qn đội Liên Xơ cũ làm chết 68

người.

Năm 1995, Iraq thừa nhận đã tạo ra 8.500 lá thư có chứa tác nhân gây bệnh than.
Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào từ than được chuyền đến các bưu

điện Mỹ làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh. Sự kiện này đã làm đau đầu các
nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trá nhiều triệu đơ la cho việc tiêm phịng

vaccine.
Tháng 9/2001. sau vụ khùng bố ngày 11/9, tại Cangene xảy ra một vụ tương tự
làm 22 người mắc bệnh than hô hấp, 5 người trong số những người mắc than hô hấp đã

chết

[32],

Thư viện Viện Đại học Mớ Hà Nội

Nguyên nhân mà bệnh than được sứ dụng như một loại vũ khí sinh học hiệu quá

là do vi khuân than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khá năng chống chịu tốt với

điều kiện khắc nghiệt cúa ngoại cảnh.
1.2. Trực khuẩn than
1.2.1. Lịch sử phát hiện

Bệnh than phát hiện đầu tiên ờ Ai Cập, chúng gây chết hàng loạt gia súc. Đen thế
kỷ 17 xáy ra một đại dịch lớn ở châu Âu gây chết rất nhiều người và động vật. Vào thời
điểm đó thì chưa ai tìm ra được nguyên nhân gây ra bệnh và cách phịng trị, vì thế mọi
người đặt cho căn bệnh này với nhiều cái tên khác nhau như: “tai ương đen”, “mụn mủ

ác tính”, “bệnh của người nhặt giẻ”...
Nãm 1850, người ta nhìn thấy nó trong máu một con cừu mac bệnh than sap chết.
Năm 1876, Robert Koch là người đã tìm ra vi khn gây bệnh than đó chính là Bacillus

8


anthracis (B. anthracis). Ông đã phân lập được B. anthracis trôn môi trường nhân tạo
và phát hiện ra bào tư của nó. Năm 1877, Pastuer và Joubert đã xác định được cơ chế
gây bệnh cùa B. anthracis [20], Năm 1822-1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thay bào

tử B. anthracis ở nơi chôn xác động vật bị chết bởi bệnh than.
1.2.2. Đặc điếm của B. anthracis

B.anthracis là loại trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Họ Bacillaceae
gồm hai chi Bacillus và Bacteridium. Chi Bacillus gồm nhiều loài, chúng là các trực
khuan Gram dương sinh bào tử. B. anthracis tồn tại trong đất, trong nước và khơng khí.
Các lồi thuộc chi Bacillus đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc

thức ăn (Bacillus cercus), một số có lợi cho con người (B. subtilis, B. thuringiensis, B.

mycoides). Đặc điêm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa, tính chất ni cấy cùa các
lồi thuộc chi Bacillus có những đặc tính rất giống nhau. B. anthracis có đặc điểm khác

biệt với các lồi trực khuấn hiếu khí sinh bào từ khác, đó là B. anthracis có plasmid

pXOl mã hóa kháng nguyên PA (protective antigen) và pXO2 mã hóa vỏ.

,.
-, w
X Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội
1.2.2.1. Hình thê
Vi khn than (B. anthracis) có hình dạng thăng, hai đầu vng, có kích thước từ
141,5x 34-10 |im. thường đứng với nhau thành chuồi, bat màu Gram dương, khơng có
lơng roi nên khơng có khá năng di động. Ớ ngoại cánh hoặc trong mơi trường ni cấy,
vi khn hình thành bào tử. nam giữa thân và khơng làm thay đơi hình the vi khuấn

(hình 1.4). Trên động vật bị bệnh hoặc mơi trường ni cấy đặc biệt, vi khuẩn than có

vỏ.

9

Hình 1.4: B. anthracis và bào tử

(http://www. textbookofbacteriology. net/Anthrax. html)

Bào tứ B. anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước khoảng từ
1-1,5 |im, nang bào tử khơng phồng, bào từ được hình thành vào thời kỳ cuối của pha
sinh trưởng Logarit [ 17],

Hình 1.5: Bào tử của B. anthracis

( />Khuân lạc B. anthracis có màu trang sữa hoặc trắng xám tới xám, bề mặt sần sùi,

dính, ướt, đường kính 3-5 mm (hình 1.5) 110].
1.2.2.2. Đặc điểm ni cấy

10


- B. anthracis de mọc trên các môi trường nuôi cấy thơng thường, nhiệt độ thích

hợp là 37°c, pH 6,9-7.
-

Trên thạch máu cừu: vi khn khơng làm tan máu (hình 1.6)

- Trên mơi trường lịng: vi khuẩn phát triển nhanh, mọc thành cặn xốp như bông
ớ dưới đáy ống nghiệm, lấc không tan.

- Trên thạch thường: vi khuẩn mọc thành khuấn lạc dạng R, đường kính 4-5 mm,
trắng ngà. bờ không đều. rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Phóng đại vài chục

lần thấy hình thế như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tứ.

- Đặc biệt trong mơi trường thạch sodium bicarbonat trong khí trường 5% CO2 ở
37°c, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhầy có vị (hình 1.7).

- Tính chất lên men đường: lên men khơng sinh hơi với các đường glucose,
manitoỊ saccarose, không lên men đường salicin, làm lỏng gelatin, đông huyết tương,

không mọc trên thạch Mac Conkey.

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

Hình 1.6: Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu

( />
II


Hình 1.7: Khuấn lạc B. anthracis trên mơi trường Sodium bicarbonat agar

( />
I.2.2.3. Sức đe khá^lir

vjện Viện 0ại họC \1ór Hà Nội

Thê sinh dường có sức đề kháng khơng cao, có thê bị tiêu diệt ớ nhiệt độ 60°C
trong 30 phút, ớ 1 oo'’c trong 5 phút, dỗ bị diệt bởi những chất khứ trùng thơng thường.

Trực khuan than có the tồn tại rất lâu ờ môi trường trong dạng bào tứ. Bào từ trực

khuân than có sức đề kháng tốt, đề kháng với nhiệt, khơ hạn, tia cực tím, bức xạ

gamma và nhiều chất sát khuẩn. Bào tử trực khuẩn than sốngđược nhiều năm trong đất,

nước, bề mặt các vật dụng,..., kế cà trong những diều kiện khắc nghiệt, nhiệt độ cao
bào tử vẫn có thề tồn tại được. Đặc biệt, ở môi trường đất thuận lợi (độ ẩm nhiều, ô

nhiễm đất do các chất thái sinh hoạt, công nghiệp, nơng nghiệp...) bào tử có thể tồn tại

trong vài thập kỷ mà vẫn còn khá năng gây bệnh. Bào tử chi bị phá hủy bởi nhiệt độ
khô 170”C trong 60 phút hoặc nhiệt ướt 121°c sau 30 phút.
1.2.2.4, Kháng nguyên

Kháng nguyên thân là chất đa đường, gồm polisaccharid, alpha glucosamin,
galactose. Kháng ngun thân có tính đặc hiệu cao, ơn định, thường được dùng đế chan

12


đốn B. anthracis. Tuy nhiên, kháng ngun thân khơng có khá năng kích thích hình
thành miễn dịch bảo vệ.

Kháng ngun vỏ là một protein có trọng lượng phân tứ cao trong đó có chất
glucotamic D.
1.2.2.5. Độc lực

Độc lực của B. anthracis được tạo bởi 2 yếu tố đó là vỏ và ngoại độc tố:

•Vó

- Vỏ của trực khuấn than là một loại kháng nguyên, có bán chất là chuồi trùng
hợp của acid poly-D-glutamic mà sự tổng hợp cúa nó liên quan đến sự xuất hiện cũa
plasmid pXO2 và một yếu tố nữa đó là sự có mặt của bicarbonate. Trong đó plasmid

pXO2 đóng vai trị quyết định khá năng tạo thành vở cùa B. anthracis, plasmid này có

thề truyền từ lồi có khả năng hình thành vị sang lồi khơng có khá năng đó. Độc tố vị
dược mã hóa bởi các gen capA, capB, capC nam trên plasmid pXO2 (trọng lượng phân

từià95kb) [15].

Thư viện Viện Đại học Mở Hà Nội

- Tất cả các dòng độc cùa B.anthracis đều tạo ra vị nhày. Bân thân vơ poly-Dglutamic khơng gây độc. nhưng nó có chức năng báo vệ vi khuân tránh được sự bảo vệ
cùa hệ thống miền dịch vật chủ và kích thích gây nhiễm trùng do có khả năng chống lại

phức hợp bô thê và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vò ức chế đại thực bào và gây ra
đáp ứng miễn dịch yếu. Ngồi ra võ cịn có tác dụng bào vệ làm tăng tính độc cùa vi

khuẩn bệnh than. Thơng thường các khuấn lạc xù xì sẽ độc hơn các khuẩn lạc nhẵn [29J.

Những chùng khơng cịn khâ năng tạo vỏ thì cũng mất khâ năng gây bệnh và chúng
thường được dùng để chế tạo vaccin. vỏ chi hình thành trong mơi trường thạch huyết
ngựa hoặc mơi trường có bố sung 0,7 % Na2CO3, ú ở 37°c, trong điều kiện kị khí [16],

Võ được phát hiện bằng nhiều phương pháp như: nhuộm mực tàu [26], kỹ thuật miền

dịch huỳnh quang. Cả B. cereus và B. thurigiensis đều khơng tồng hợp được vỏ, vì vậy
đây là một trong những cách đê phân biệt B. anthracis với các loài trên.

13


- Trong trường hợp khơng có plasmid pXO2 thì vỏ khơng hình thành, khi đó vách
của B. anthracis xuất hiện S-layer. Đây là 1 dạng siêu cấu trúc xuất hiện phố biến ờ một
số đưn bào nguyên thủy và vi khn khác. Lớp S-layer được cho là có vai trị quan trọng

trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngồi, đâm bào hình dạng vi khuẩn
và là nơi gan kết cùa các phage. Ngồi ra S-layer cịn được coi là yếu tố độc lực, có vai
trị giúp vi khuẩn chống lại tác động cùa bố thế và thay đôi khá năng tiếp cận của đại

thực bào vật chủ 115|.
•

Ngoại độc tố

- Ngoại độc tố của B. anthracis được hợp thành bởi 3 protein riêng biệt là:
+ Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen): giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chù.

+ Nhân tố gây phù EF (Edema Factor): làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân

trung tính.
+ Nhân tố gây chết LF (Lethal Factor): làm tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa q

trình đốt oxy, giãi phóng cytokine, làm bất hoạt protein kinase.

Kháng nguyên bào vệ PẠ được mã hóa bơi gen pagA hàm trên plasmid pXOl có
kích thước khoảng 185 kb. Bàn thân kháng ngun báo vệ PA khơng có khã năng gây
độc nhưng lại là một nhân tố quan trọng trong q trình gây bệnh của B. anthracis. PA

có khã năng kết họp với nhân tố gây chết LF hay nhân tố gây phù EF, sản sinh độc tố

gây chết hoặc phù cho tế bào vật chú. Do đặc tính này mà kháng nguyên bão vệ PA được

xem là một kênh dần truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc

lực.
1.2.2.6. Khả năng gây bệnh cho người và động vật
• Khả năng gây bệnh cho người
Bacillus anthracis là tác nhân gây bệnh nhiễm khuân cấp tính cho gia súc, đặc

biệt là cho các động vật ăn cị như trâu, bị. dê,cừu. ngựa.. Bệnh có khá năng lây nhiễm

sang người thành dịch với tỳ lệ từ vong cao. Bệnh thường biếu hiện ở 4 dạng: thê da,
tiêu hóa. hơ hấp, viêm màng não. Người mắc bệnh than trong các trường hợp bị nhiễm

vi khuẩn qua vết sây sát ớ da khi tiếp xúc với các chất thải của động vật mắc bệnh hoặc
14


khi làm thịt các động vật chết vì bệnh than. Ngồi ra cịn gặp trong các trường hợp ăn

thịt bị nhiễm vi khuẩn chưa nấu chín, mác bệnh khi hít phải B. anthracis từ bệnh nhân
mac bệnh thế phoi hoặc do các thao tác không đảm bào nguyên tắc vô khuấn trong các

phịng thí nghiệm |9]. Đường lây bệnh than ờ người chủ yếu là qua da (94 - 95%), qua
ăn uống (0,5 - 0,7%), qua aerozon (0,3%).

• Khá năng gây bệnh cho động vật
Trong tự nhiên trực khuẩn than gây bệnh chủ yếu cho gia súc và các loài động vật

ăn cỏ. Trong đó, cừu hay bị bệnh nhất, sau đó đến trâu, bị, ngựa, dê, ngựa và lợn ít nhạy
hơn.

Đôi khi dịch than cũng xảy ra ờ hươu và một số lồi động vật ăn có khác. Một số

loại động vật gặm nhấm nhỏ rất nhạy cảm khi được gây bệnh thực nghiệm. Thỏ, chuột
lang, chuột bạch có thổ bị chết khi tiêm 1 lượng nhỏ độc tố than.

Mặc dù có sức đề kháng hơn so với động vật ăn cỏ, nhưng một số động vật ăn thịt

như báo, sư tử. gấu vần bị ảnh hưởng cùa dịch than. Một số động vật có sức đề kháng tự

.Đại hQCxMaHajNCU,. _ 1X .

'

nhiên với than. Hâu hêt các loài chuột công đê kháng với than đặc biệt là chuột cơng
trắng. Chó trường thành chi nhạy cảm nhẹ, lồi chim đặc biệt là chim bồ câu có the bị

nhiễm bệnh than nhưng không được chứng minh rõ ràng. Cáo đồ kháng hồn tồn nhưng
cóc rất nhạy cám [7].

Ĩ động vật nhạy cảm cao thì bệnh diễn biến cấp tính, tỷ lệ chết khoảng 80% ở gia

súc và cừu, với biểu hiện là tình trạng nhiễm trùng huyết, biểu hiện tại chỗ có thê khơng
xuất hiện. Vi khuẩn than nhân lên với số lượng lớn trong máu và phủ tạng.
Động vật mac bệnh do ăn có, uống nước nhiễm bào từ B. anthracis. Ngồi ra cịn
có thê bị bệnh do cơn trùng đốt (do ruồi trâu, muỗi cát).

1.2.3. Đặc điếm hệgen của B. anthracis
I.2.3.I.

Gen trên chromosome

Kích cỡ chromosome cùa B. anthracis vào khoảng 5,23Mb với tơng số 5058 gen

trong đó số trình tự mã hóa chiêm 84,3%, tý lệ G + c chiếm 35.4% [29]. Chromosome

15