Nghiên cứu phát hiện đồng thời 3 GEN VRRA, CAPA,PAGA của vi khuẩn than (bacillus anthracis) bằng phản ứng multiplex PCR

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------

-------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ĐỀ TÀI:
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN ĐỒNG THỜI 3 GEN VRRA,
CAPA, PAGA CỦA VI KHUẨN THAN (BACILLUS ANTHRACIS)
BẰNG PHẢN ỨNG MULTIPLEX - PCR

Người hướng dẫn

: PGS. TS. NGHIÊM NGỌC MINH

Sinh viên thực hiện

: ĐINH THỊ HIỀN

Lớp

: 11 - 02

HÀ NỘI – 2015



LỜI CẢM ƠN!
Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất tới PGS. TS. Nghiêm Ngọc
Minh, người thầy tâm huyết đã tạo điều kiện cho tôi được thực tập tại phòng Công

nghệ sinh học Môi trường thuộc Viện Công nghệ sinh học – Viện Hàn lâm Khoa Học
và Công Nghệ Việt Nam. Thầy luôn tận tình hướng dẫn, dành thời gian trao đổi, định
hướng cũng như động viện, nhắc nhở và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu, học tập
và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến toàn thể các anh chị trong phòng Công
nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt là ThS. Nguyễn Thị Hoài Thu và KS. Phạm Thùy
Linh đã giúp đỡ, chỉ bảo tận tình cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu hoàn
thành khóa luận của mình.
Bên cạnh đó, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô Khoa Công nghệ sinh học,
Viện Đại học Mở Hà Nội cùng với Ban lãnh đạo viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian học tập, nghiên cứu tại trường cũng như tại viện.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc tới gia đình và bạn bè đã
động viên, giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành tốt khóa
luận này.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày tháng
Sinh viên

Đinh Thị Hiền

năm 2015



MỤC LỤC
Trang
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………i
DANH MỤC HÌNH……………………………………………………………………ii

DANH MỤC BẢNG…………………………………………………………………..iii
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1
PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
1.1. Bệnh than ................................................................................................................. 3
1.1.1. Sơ lược về bệnh than ...................................................................................... 3
1.1.2. Các dạng bệnh than ......................................................................................... 4
1.1.2.1. Bệnh than ở thể da .................................................................................... 5
1.1.2.2. Bệnh than ở thể tiêu hóa và họng - thanh quản ........................................ 6
1.1.2.3. Bệnh than ở thể hô hấp ............................................................................. 6
1.1.2.4. Bệnh than thể màng não ........................................................................... 7
1.1.3. Bệnh than và chiến tranh sinh học .................................................................. 7
1.2. Trực khuẩn than ..................................................................................................... 8
1.2.1. Lịch sử phát hiện ............................................................................................. 8
1.2.2. Đặc điểm của B. anthracis .............................................................................. 9
1.2.2.1. Hình thể ..................................................................................................... 9
1.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy .................................................................................. 10
1.2.2.3. Sức đề kháng ........................................................................................... 12
1.2.2.4. Kháng nguyên ......................................................................................... 12
1.2.2.5. Độc lực .................................................................................................... 13
1.2.2.6. Khả năng gây bệnh cho người và động vật ............................................ 14
1.2.3.

Đặc điểm hệ gen của B. anthracis ............................................................. 15

1.2.3.1.Gen trên chromosome .............................................................................. 15
1.2.3.2.Gen trên plasmid ...................................................................................... 16
1.3. Các phương pháp chẩn đoán B. anthracis .......................................................... 17
1.3.1. Phương pháp trực tiếp ................................................................................... 17
1.3.2. Phương pháp nuôi cấy ................................................................................... 18
1.3.3. Các phương pháp chẩn đoán nhanh............................................................... 18

i


1.3.4. Phương pháp PCR – Multiplex PCR .............................................................19
PHẦN II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................22
2.1. Vật liệu, trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu ...................................................22
2.1.1. Vật liệu ..........................................................................................................22
2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị ......................................................................22
2.2. Các phương pháp nghiên cứu ..............................................................................26
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu ...........................................................................................26
2.2.2. Các phương pháp nghiên cứu ........................................................................26
2.2.2.1. Thiết kế mồi cho phản ứng PCR .............................................................26
2.2.2.2. Tách chiết DNA tổng số của vi khuẩn than.............................................27
2.2.2.3. Kỹ thuật PCR đơn mồi (Polymerase Chain Reaction) ............................28
2.2.2.4. Kỹ thuật PCR đa mồi (Multiplex PCR) ...................................................30
2.2.2.5. Phương pháp điện di DNA trên gel agarose...........................................32
2.2.2.6. Phương pháp tinh sạch DNA từ gel agarose ..........................................33
2.2.2.7. Phương pháp giải trình tự .......................................................................34
PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................35
3.1. Kết quả thiết kế các cặp mồi ................................................................................35
3.2. Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khuẩn than (Bacillus anthracis) ................35
3.3. Kết quả khuếch đại 3 gen vrrA, capA, pagA của B. anthracis bằng kỹ thuật
PCR ................................................................................................................................36
3.3.1. Gen VrrA........................................................................................................37
3.3.2. Gen pagA .......................................................................................................37
3.3.3. Gen CapA ......................................................................................................38
3.4. Tinh sạch sản phẩm PCR .....................................................................................39
3.5. Xác định trình tự và so sánh trên ngân hàng gen ..............................................39
3.6. Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen vrrA, capA, pagA .............................42
PHẦN IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ..................................................................44

KẾT LUẬN ...................................................................................................................44
KIẾN NGHỊ ..................................................................................................................44
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...............................................................................................

ii


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

µl, ml, l

Microliter, milliliter, liter

B. anthracis

Bacillus anthracis

Bp

Base pair (cặp base)

dH2O

Deion water

DNA

Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylene Diamine Tetraacetic Acid

EF

Edema Factor

Epp

Eppendorf

kDa

Kilo Dalton

LF

LethalFactor

mg, g

Milligram, gram

NCBI

National Center for Biotechnology
Information

PA

Protective Antigen

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic Acid

TAE

Tris - Acetate – EDTA

Taq DNA polymerase

Thermus aquaticus DNA polymerase

iii


DANH MỤC HÌNH
Tên hình

Trang

Hình 1.1: Biểu hiện bệnh than ở thể da trên người ..........................................................5
Hình 1.2: Trung thất dãn ra do hít phải bào tử than .........................................................6
Hình 1.3: Não của người bị nhiễm bệnh than ..................................................................7
Hình 1.4: B. anthracis và bào tử ....................................................................................10

Hình 1.5: Bào tử của B. anthracis ..................................................................................10
Hình 1.6: Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu ................................11
Hình 1.7: Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường Sodium bicarbonat agar .................12
Hình 1.8. Vị trí gen pagA trên plasmid pOX1. ..............................................................17
Hình 2.1: Sơ đồ các bước được thực hiện trong quá trình nghiên cứu. .........................26
Hình 3.1: Điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA tổng số của vi khuẩn than ..................36
Hình 3.2: Điện di đồ sản phẩm PCR gen vrrA từ vi khuẩn than ....................................37
Hình 3.3: Điện di đồ sản phẩm PCR gen pagA từ vi khuẩn than ................................... 38
Hình 3.4: Điện di đồ sản phẩm PCR gen capA từ vi khuẩn than ...................................38
Hình 3.5: Sản phẩm PCR sau khi được tinh sạch ..........................................................39
Hình 3.6: Trình tự gen PagA.POX1của vi khuẩn than ...................................................40
Hình 3.7: Trình tự gen CapA.POX2 của vi khuẩn than .................................................41
Hình 3.8: Trình tự gen VrrA vi khuẩn than ....................................................................42
Hình 3.9: Điện di đồ sản phẩm khuếch đại đồng thời 3 gen từ của vi khuẩn than bằng
phản ứng Multiplex PCR................................................................................................43

iv


DANH MỤC BẢNG
Tên bảng

Trang

Bảng 2.1: Danh mục các hóa chất sử dụng .................................................................... 22
Bảng 2.2: Các dung dịch và đệm sử dụng trong phòng thí nghiệm ............................... 23
Bảng 2.3: Danh mục các máy móc và thiết bị sử dụng .................................................. 24
Bảng 2.4. Thành phần các phản ứng PCR đơn mồi ....................................................... 29
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR đơn mồi.................................................. 30
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng Multiplex – PCR ........................................................ 31

Bảng 3.1: Trình tự các cặp mồi được thiết kế để khuếch đại các gen của vi khuẩn than.
........................................................................................................................................ 35
Bảng 3.2: Bảng so sánh độ tương đồng của gen pagA.POX1 của B. anthracis nghiên
cứu với một số chủng B. anthracis trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ...................... 40
Bảng 3.3: Bảng so sánh độ tương đồng của gen CapA.POX2 của B. anthracis nghiên
cứu với một số chủng B. anthracis trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ...................... 41
Bảng 3.4: Bảng so sánh độ tương đồng của gen VrrA của B. anthracis nghiên cứu với
một số chủng B. anthracis trên ngân hàng gen thế giới (NCBI) ................................... 42

v



ĐẶT VẤN ĐỀ
Bệnh than (hay bệnh nhiệt thán) là bệnh do trực khuẩn Bacillus anthracis (B.
anthracis) gây ra. Bệnh thường diễn ra ở gia súc, động vật thuộc họ móng guốc như
cừu, trâu, bò, ngựa… có thể truyền sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao. Người
mắc bệnh than trong các trường hợp bị nhiễm vi khuẩn qua vết sây sát ở da khi tiếp
xúc với chất thải động vật mắc bệnh hoặc ăn thịt động vật chết vì bệnh than. Ngoài ra
còn gặp trong các trường hợp ăn thịt bị nhiễm khuẩn than do chưa nấu chín. Bệnh gây
nhiễm trùng và hoại tử cơ quan và có tỉ lệ gây tử vong cao nếu không được điều trị kịp
thời. Dù bệnh ít phổ biến nhưng bệnh dễ lây lan, nguy cơ tử vong cao nên B. anthracis
đã được sử dụng như là vũ khí sinh học nguy hiểm nhất trong lịch sử chiến tranh bởi
thời gian lây nhiễm nhanh, tỷ lệ gây chết cao, tác nhân gây bệnh có thể chống chịu
được với điều kiện khắc nghiệt. Chính vì vậy, việc nghiên cứu phát hiện, chẩn đoán
bệnh than và tác nhân gây bệnh than là rất quan trọng.
B. anthracis có khả năng sinh ra hai loại độc tố là ngoại độc tố và độc tố vỏ nhày
(capsule toxin). Ngoại độc tố gồm 3 thành phần: Kháng nguyên bảo vệ Protective
antigen (PA), yếu tố gây phù nề Edema Factor (EF) và yếu tố gây chết Lethal Factor
(LF). Gen mã hóa cho 3 loại độc tố này lần lượt là pagA, cya, lef nằm trên plasmid

pXO1. Độc tố vỏ nhầy của B. anthracis là một chuỗi poly - D glutamic acid được mã
hóa bởi gen cap nằm trên plasmid pXO2. Gen VrrA là một gen đặc trưng của B.
anthracis, nó nằm trên chromosome và mã hóa cho một protein có tên là glutamine.
Để phát hiện tác nhân gây bệnh than, đã có nhiều phương pháp được nghiên
cứu, phát triển và ứng dụng như các phương pháp nhuộm, phương pháp nuôi cấy trên
môi trường thạch máu cừu, sử dụng các phương pháp chẩn đoán nhanh như phản ứng
hạt trai, phương pháp miễn dịch huỳnh quang trực tiếp….Tuy nhiên, những phương
pháp này tốn khá nhiều thời gian (bệnh nhân có thể chết trước khi có kết quả xét
nghiệm), tốn công sức, đòi hỏi kỹ thuật phức tạp. Hơn nữa, phải tiếp xúc trực tiếp với
mầm bệnh nên nguy cơ lây nhiễm cao cho kỹ thuật viên.

1


Ngày nay, với sự phát triển của sinh học phân tử, nhiều phương pháp đã được
phát triển và áp dụng có hiệu quả trong việc phát hiện ra tác nhân gây bệnh.Trong đó,
phương pháp phân tử dựa trên phản ứng PCR được áp dụng phổ biến nhất, vì phương
pháp này cho phép phát hiện gen hoặc hệ gen ngay cả khi chưa biểu hiện kiểu hình và
đặc tính gây bệnh. PCR là phản ứng thao tác trực tiếp trên chất liệu di truyền và có khả
năng nhân lên bất cứ đoạn gen nào trong thời gian ngắn. Kỹ thuật này có độ nhạy và độ
đặc hiệu cao, thao tác lại khá đơn giản. Đặc biệt là PCR có thể thao tác trên các gen vi
khuẩn đã chết nên phương pháp này đã được ứng dụng ngày càng rộng rãi ở nhiều
nước trên thê giới, trong đó có Việt Nam. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành đề tài:
“ Nghiên cứu phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, capA, pagA của vi khuẩn than
(Bacillus anthracis) bằng phản ứng Multiplex PCR.”
Mục tiêu nghiên cứu :
Phát hiện đồng thời 3 gen VrrA, capA, pagA của vi khuẩn than (Bacillus
anthracis) để phục vụ cho việc tạo Kit phát hiện nhanh vi khuẩn than.
Nội dung nghiên cứu
Để đạt được mục tiêu đề ra, đề tài cần thực hiện các nội dung sau:

1.

Thiết kế các cặp mồi cho 3 gen: vrrA, capA, pagA của vi khuẩn than.

2.

Tách chiết DNA tổng số từ mẫu vi khuẩn than.

3.

Thực hiện phản ứng PCR đơn mồi phát hiện từng gen vrrA, capA, pagA
của vi khuẩn than.

4.

Xác định trình tự và so sánh trình tự trên ngân hàng gen.

5.

Thực hiện phản ứng Multiplex PCR phát hiện đồng thời 3 gen VrrA,
CapA, PagA.

2


PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh than
1.1.1. Sơ lược về bệnh than
Trên thế giới
Bệnh than hay còn gọi là bệnh nhiệt than, đã gây ra những thiệt hại vô cùng to

lớn cho ngành chăn nuôi gia súc cũng như làm ảnh hưởng tới sức khỏe con người.Vì
thế mà nó được đặt tên là “Black Bane” nghĩa là thảm họa đen, vì khi bị nhiễm bệnh,
vết thương có màu đen [2].
Bệnh than thường xuất hiện ở những trang trại vào một thời điểm nhất định, đặc
biệt là những vùng nông nghiệp ở phía Nam Châu Mỹ và Châu Phi. Bệnh thường gặp ở
những động vật ăn cỏ như: cừu, dê, ngựa, trâu, bò. Đặc biệt bệnh có thể lây nhiễm sang
người thành dịch với tỉ lệ tử vong cao nên bệnh được coi là mối hiểm họa đe dọa đến
sức khỏe cộng đồng.
Trận dịch than được biết đến đầu tiên trong lịch sử xảy ra năm 1500 trước Công
Nguyên làm chết nhiều vật nuôi của người Ai Cập. Năm 1491 trước Công Nguyên, tiếp
tục một cơn lốc bệnh than ở Ai Cập làm chết nhiều gia súc, và làm nóng lên sự kiện
bệnh than.
Năm 1789, một trận dịch bệnh than lan tràn ở vùng Tresnobin (Nga).
Từ năm 1979-1985 một đại dịch than lớn xảy ra ở Zimbabwe làm khoảng 10.000
người mắc bệnh. Năm 1979, tại Sverdlosvk thuộc nước Cộng hòa Soviet (nay là
Ekaterinburg, Nga) bệnh đã làm 11 người tử vong [18]. Ở Australia vẫn tiếp tục xuất
hiện rải rác các vụ dịch than, hay gặp ở khu vực Nam Wales và Victoria. Tại Anh, năm
1961 báo cáo có 145 ca bệnh, và 10 ca bệnh từ năm 1980-1990 [7]. Dịch than trên
động vật lan khắp ở Ấn Độ, trong những năm 1991 – 1996 có 1613 vụ dịch than trên
động vật được ghi nhận, tỷ lệ động vật chết chiếm 62,5% trong đó 20% là trâu và 80%
còn lại là cừu và dê. Năm 1996, tại Philippine có 4 vụ dịch than xảy ra trên động vật
3


trong khi ở Thái Lan có 6 vụ và có 148 người mắc bệnh. Tại Nepan từ năm 1992 đến
1997 có 19 vụ dịch than xảy ra ở gia súc, cừu, ngựa làm tổng cộng 222 súc vật bị chết
[7]. Năm 1997, tại Pháp đã xảy ra một trận dịch than làm cho 94 động vật bị chết và 3
người mắc bệnh than [28].
Năm 1876, Robert Kock đã tìm ra nguồn gốc của bệnh than và quá trình hình
thành bào tử của vi khuẩn B. anthracis. Sau vụ khủng bố ngày 11/9/2001 tại Mỹ xuất

hiện một vụ khủng bố bằng B. anthracis làm 10 người nhiễm bệnh, điều này đã làm
cho cả thế giới hoang mang [19].
Trận dịch than gần đây nhất là ngày 14/6/2005 xảy ra ở một quốc gia nhỏ ở châu
Phi làm chết 4 người và hơn 80 người bị nhiễm bệnh.
Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bệnh than cũng đã xuất hiện từ lâu nhưng chưa được các nhà dịch tễ
học thông báo một cách đầy đủ. Theo thống kê của Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương:
năm 1997 có 30 người bị mắc bệnh than, năm 1998 có 59 người, năm 1999 có 58
người, năm 2000 có 27 người bị mắc bệnh than trong đó có 12 người ở Cao Bằng, 11
ca ở Lai Châu, 4 ca ở Đồng Nai. Gần đây, từ năm 2008-2010 đã xảy ra các vụ dịch
than tại Mèo Vạc - Hà Giang và Than Uyên - Lai Châu làm 18 người nhiễm bệnh than
trong đó có 2 người tử vong và nhiều động vật mắc bệnh [3]. Hầu hết các ca mắc bệnh
than xuất hiện rải rác ở khu vực các tỉnh miền Bắc như: Sơn La, Điện Biên, Lai Châu,
Hà Giang, nguyên nhân phát sinh chủ yếu do tiếp xúc với động vật ăn cỏ như trâu, bò
hoặc ăn thịt động vật chưa nấu chín. Bệnh xuất hiện chủ yếu ở khu vực dân tộc thiểu
số, nơi có điều kiện vệ sinh kém, điều kiện chăm sóc y tế hạn chế.
1.1.2. Các dạng bệnh than
Bệnh than thường xuất hiện ở các loài động vật hoang dã cũng như động vật nuôi,
đặc biệt là các loại gia súc ăn cỏ như trâu, bò, cừu, ngựa, dê do chúng hít phải hoặc
nhiễm phải bào tử than trong lòng đất. Ở người, nguy cơ mắc bệnh than cao là do tiếp
xúc với động vật ăn cỏ.
4


Bệnh than có thể nhiễm vào cơ thể vật chủ theo ba con đường: qua da, qua đường
tiêu hóa và qua đường hô hấp. Tùy theo cách thức lây nhiễm mà người ta chia bệnh
than thành 4 các thể than khác nhau: Than da, than tiêu hóa, than hô hấp, than màng
não.
1.1.2.1. Bệnh than ở thể da
Đây là hình thức than phổ biến nhất, chiếm hơn 95% và là loại bệnh có khả năng

điều trị. Bệnh thường gặp ở những nhóm đối tượng nguy cơ lây nhiễm cao, thường
xuyên tiếp xúc với động vật và các sản phẩm từ gia súc bị nhiễm than, tiếp xúc với môi
trường đất chứa trực khuẩn than hoặc bào tử của trực khuẩn than. Từ các vết thương hở
trên da, vi khuẩn hay bào tử B. anthracis có thể xâm nhập vào.

Hình 1.1: Biểu hiện bệnh than ở thể da trên người
( />Triệu chứng của bệnh: Sau 1-2 ngày đầu, da bị đỏ, thấy xuất hiện các mụn phỏng.
Sau 4-6 ngày, tổn thương tiến triển qua các giai đoạn mụn, phồng nước hoặc bọng
nước và tạo thành ổ loét có vảy hoại tử màu đen, xung quanh ổ loét bao bọc bởi vùng
phù nề rộng, màu nâu (hình 1.1). Trong khoảng 1-2 tuần kể từ khi nhiễm bệnh sẽ xuất
hiện các mủ và các hiện tượng đau nhức, mệt mỏi, bạch cầu tăng, các hạch bạch huyết
tăng lên và sau đó vùng thương tổn sẽ chuyển sang dạng tự phát. Nếu bệnh nặng thêm,
vết loét sẽ lan rộng và ăn sâu làm nhiễm trùng máu dẫn đến không thể chữa khỏi.
5


1.1.2.2. Bệnh than ở thể tiêu hóa và họng - thanh quản
Bệnh than tiêu hóa thường ít gặp nhưng lại có tỷ lệ tử vong khá cao. Nguyên nhân
của bệnh than ở thể tiêu hóa là do ăn phải thịt gia súc đã bị nhiễm bào tử than mà
không được nấu chín, thậm chí cả khi được nấu chín thì khả năng nhiễm bệnh vẫn cao
[1]. Sau khi ăn thịt động vật mắc bệnh có chứa bào tử than, có thể xảy ra các triệu
chứng sốt, đau bụng lan tỏa kèm hồi ứng (rebound tenderness), táo bón hoặc tiêu chảy,
phân có màu bã cà phê hoặc lẫn máu. Trường hợp nặng bệnh nhân biểu hiện tình trạng
sốc nhiễm độc, nhiễm trùng huyết, có thể gây tử vong cao.
Thể họng - thanh quản ít gặp hơn thể tiêu hóa, nhưng cũng do nuốt phải bào tử
than. Những triệu chứng ban đầu gồm phù nề, sưng hạch bạch huyết vùng cổ, nuốt đau
và khó thở. Thể bệnh này nhẹ hơn thể tiêu hóa.
1.1.2.3. Bệnh than ở thể hô hấp
Bệnh than thể hô hấp khởi phát không đặc hiệu với các triệu chứng: thiếu máu,
sốt, đau cơ, ho khan. Sau đó 2-3 ngày, bắt đầu giai đoạn toàn phát với dấu hiệu suy hô

hấp nặng kết hợp với vã mồ hôi, da xanh tím, đau ngực nhiều. Trên X quang lồng ngực
có thể thấy trung thất giãn rộng, tràn dịch màng phổi (hình 1.2). Bệnh nhân tử vong sau
24-36 giờ do suy hô hấp, nhiễm khuẩn huyết và sốc.

Hình 1.2: Trung thất dãn ra do hít phải bào tử than
( />
6


1.1.2.4. Bệnh than thể màng não
Bệnh than thể màng não thường do biến chứng từ ba thể than trên. Than màng
não xuất hiện khi B. anthracis tấn công vào hệ thống thần kinh trung ương theo đường
máu và các mạch bạch huyết (hình 1.3). Triệu chứng của bệnh thường là sốt cao, mệt
mỏi, đau cơ, đau đầu, buồn nôn, lên cơn mê sảng khi phát bệnh và dẫn đến hôn mê. Đa
số bệnh nhân thường tử vong sau 1-2 ngày kể từ khi mắc bệnh. Thể than này có tỷ lệ tử
vong rất cao.

Hình 1.3: Não của người bị nhiễm bệnh than
( />1.1.3. Bệnh than và chiến tranh sinh học
Sức tàn phá của bệnh than là vô cùng to lớn, đồng thời trực khuẩn than có khả
năng phát tán nhanh, khó phát hiện nên đã được sử dụng như một thứ vũ khí sinh học
để làm tê liệt cả một thành phố, thậm chí cả một quốc gia, nó đe dọa đến vấn đề an
ninh quốc phòng của nhiều quốc gia trên thế giới.
Trong chiến tranh thế giới thứ nhất, bệnh than đã được sử dụng như một thứ vũ
khí vô cùng lợi hại. Một vài nước như Đức, Nhật, Hoa Kỳ, Liên hiệp Anh, Iraq và Liên
Xô cũ đã thừa nhận là sử dụng bệnh than làm phương tiện của chiến tranh.

7

Năm 1915, Mỹ đã tiêm vi khuẩn bệnh than vào ngựa, la, trâu, bò, để cung cấp cho
các nước trong chiến tranh thế giới thứ nhất.
Năm 1943, Mỹ bắt đầu phát triển vũ khí bệnh than. Sau chiến tranh thế giới thứ
hai, Mỹ vẫn tiếp tục thực hiện chiến tranh sinh học ở Fort Detrick, Maryland.
Năm 1979, bào tử than đã được phóng thích ở quân đội Liên Xô cũ làm chết 68
người.
Năm 1995, Iraq thừa nhận đã tạo ra 8.500 lá thư có chứa tác nhân gây bệnh than.
Ngày 22/10/2001, những lá thư có chứa bào tử than được chuyển đến các bưu
điện Mỹ làm 5 người chết và 17 người bị nhiễm bệnh. Sự kiện này đã làm đau đầu các
nhà cầm quyền Mỹ và buộc họ phải chi trả nhiều triệu đô la cho việc tiêm phòng
vaccine.
Tháng 9/2001, sau vụ khủng bố ngày 11/9, tại Cangene xảy ra một vụ tương tự
làm 22 người mắc bệnh than hô hấp, 5 người trong số những người mắc than hô hấp đã
chết [32].
Nguyên nhân mà bệnh than được sử dụng như một loại vũ khí sinh học hiệu quả
là do vi khuẩn than phát tán rất nhanh và bào tử của nó có khả năng chống chịu tốt với
điều kiện khắc nghiệt của ngoại cảnh.
1.2. Trực khuẩn than
1.2.1. Lịch sử phát hiện
Bệnh than phát hiện đầu tiên ở Ai Cập, chúng gây chết hàng loạt gia súc. Đến thế
kỷ 17 xảy ra một đại dịch lớn ở châu Âu gây chết rất nhiều người và động vật. Vào thời
điểm đó thì chưa ai tìm ra được nguyên nhân gây ra bệnh và cách phòng trị, vì thế mọi
người đặt cho căn bệnh này với nhiều cái tên khác nhau như: “tai ương đen”, “mụn mủ
ác tính”, “bệnh của người nhặt giẻ”…
Năm 1850, người ta nhìn thấy nó trong máu một con cừu mắc bệnh than sắp chết.
Năm 1876, Robert Koch là người đã tìm ra vi khuẩn gây bệnh than đó chính là Bacillus
8


anthracis (B. anthracis). Ông đã phân lập được B. anthracis trên môi trường nhân tạo

và phát hiện ra bào tử của nó. Năm 1877, Pastuer và Joubert đã xác định được cơ chế
gây bệnh của B. anthracis [20]. Năm 1822-1905, Pasteur và cộng sự đã tìm thấy bào
tử B. anthracis ở nơi chôn xác động vật bị chết bởi bệnh than.
1.2.2. Đặc điểm của B. anthracis
B.anthracis là loại trực khuẩn thuộc chi Bacillus, họ Bacillaceae. Họ Bacillaceae
gồm hai chi Bacillus và Bacteridium. Chi Bacillus gồm nhiều loài, chúng là các trực
khuẩn Gram dương sinh bào tử. B. anthracis tồn tại trong đất, trong nước và không khí.
Các loài thuộc chi Bacillus đa số không gây bệnh, một số gây nhiễm trùng nhiễm độc
thức ăn (Bacillus cereus), một số có lợi cho con người (B. subtilis, B. thuringiensis, B.
mycoides). Đặc điểm hình thái, tính chất sinh lý, sinh hóa, tính chất nuôi cấy của các
loài thuộc chi Bacillus có những đặc tính rất giống nhau. B. anthracis có đặc điểm khác
biệt với các loài trực khuẩn hiếu khí sinh bào tử khác, đó là B. anthracis có plasmid
pXO1 mã hóa kháng nguyên PA (protective antigen) và pXO2 mã hóa vỏ.
1.2.2.1. Hình thể
Vi khuẩn than (B. anthracis) có hình dạng thẳng, hai đầu vuông, có kích thước từ
1÷1,5× 3÷10 µm, thường đứng với nhau thành chuỗi, bắt màu Gram dương, không có
lông roi nên không có khả năng di động. Ở ngoại cảnh hoặc trong môi trường nuôi cấy,
vi khuẩn hình thành bào tử, nằm giữa thân và không làm thay đổi hình thể vi khuẩn
(hình 1.4). Trên động vật bị bệnh hoặc môi trường nuôi cấy đặc biệt, vi khuẩn than có
vỏ.

9


Hình 1.4: B. anthracis và bào tử
( />Bào tử B. anthracis có hình elip nằm ở trung tâm tế bào, kích thước khoảng từ
1-1,5 µm, nang bào tử không phồng, bào tử được hình thành vào thời kỳ cuối của pha
sinh trưởng Logarit [17].

Hình 1.5: Bào tử của B. anthracis

( />Khuẩn lạc B. anthracis có màu trắng sữa hoặc trắng xám tới xám, bề mặt sần sùi,
dính, ướt, đường kính 3-5 mm (hình 1.5) [10].
1.2.2.2. Đặc điểm nuôi cấy

10


- B. anthracis dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích
hợp là 37oC, pH 6,9-7.
- Trên thạch máu cừu: vi khuẩn không làm tan máu (hình 1.6)
- Trên môi trường lỏng: vi khuẩn phát triển nhanh, mọc thành cặn xốp như bông
ở dưới đáy ống nghiệm, lắc không tan.
- Trên thạch thường: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc dạng R, đường kính 4-5 mm,
trắng ngà, bờ không đều, rất dai, bám chặt vào bề mặt môi trường. Phóng đại vài chục
lần thấy hình thể như búi tóc xoăn hoặc bờm sư tử.
- Đặc biệt trong môi trường thạch sodium bicarbonat trong khí trường 5% CO2 ở
37oC, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc nhầy có vỏ (hình 1.7).
- Tính chất lên men đường: lên men không sinh hơi với các đường glucose,
manitol, saccarose, không lên men đường salicin, làm lỏng gelatin, đông huyết tương,
không mọc trên thạch Mac Conkey.

Hình 1.6: Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường thạch máu cừu
( />
11


Hình 1.7: Khuẩn lạc B. anthracis trên môi trường Sodium bicarbonat agar
( />
1.2.2.3. Sức đề kháng
Thể sinh dưỡng có sức đề kháng không cao, có thể bị tiêu diệt ở nhiệt độ 60oC

trong 30 phút, ở 100oC trong 5 phút, dễ bị diệt bởi những chất khử trùng thông thường.
Trực khuẩn than có thể tồn tại rất lâu ở môi trường trong dạng bào tử. Bào tử trực
khuẩn than có sức đề kháng tốt, đề kháng với nhiệt, khô hạn, tia cực tím, bức xạ
gamma và nhiều chất sát khuẩn. Bào tử trực khuẩn than sốngđược nhiều năm trong đất,
nước, bề mặt các vật dụng,..., kể cả trong những điều kiện khắc nghiệt, nhiệt độ cao
bào tử vẫn có thể tổn tại được. Đặc biệt, ở môi trường đất thuận lợi (độ ẩm nhiều, ô
nhiễm đất do các chất thải sinh hoạt, công nghiệp, nông nghiệp...) bào tử có thể tồn tại
trong vài thập kỷ mà vẫn còn khả năng gây bệnh. Bào tử chỉ bị phá hủy bởi nhiệt độ
khô 170oC trong 60 phút hoặc nhiệt ướt 121oC sau 30 phút.
1.2.2.4. Kháng nguyên
Kháng nguyên thân là chất đa đường, gồm polisaccharid, alpha glucosamin,
galactose. Kháng nguyên thân có tính đặc hiệu cao, ổn định, thường được dùng để chẩn
12


đoán B. anthracis. Tuy nhiên, kháng nguyên thân không có khả năng kích thích hình
thành miễn dịch bảo vệ.
Kháng nguyên vỏ là một protein có trọng lượng phân tử cao trong đó có chất
glucotamic D.
1.2.2.5. Độc lực
Độc lực của B. anthracis được tạo bởi 2 yếu tố đó là vỏ và ngoại độc tố:
• Vỏ
- Vỏ của trực khuẩn than là một loại kháng nguyên, có bản chất là chuỗi trùng
hợp của acid poly-D-glutamic mà sự tổng hợp của nó liên quan đến sự xuất hiện của
plasmid pXO2 và một yếu tố nữa đó là sự có mặt của bicarbonate. Trong đó plasmid
pXO2 đóng vai trò quyết định khả năng tạo thành vỏ của B. anthracis, plasmid này có
thể truyền từ loài có khả năng hình thành vỏ sang loài không có khả năng đó. Độc tố vỏ
được mã hóa bởi các gen capA, capB, capC nằm trên plasmid pXO2 (trọng lượng phân
tử là 95kb) [15].
- Tất cả các dòng độc của B.anthracis đều tạo ra vỏ nhày. Bản thân vỏ poly-Dglutamic không gây độc, nhưng nó có chức năng bảo vệ vi khuẩn tránh được sự bảo vệ

của hệ thống miễn dịch vật chủ và kích thích gây nhiễm trùng do có khả năng chống lại
phức hợp bổ thể và hiện tượng thực bào của bạch cầu. Vỏ ức chế đại thực bào và gây ra
đáp ứng miễn dịch yếu. Ngoài ra vỏ còn có tác dụng bảo vệ làm tăng tính độc của vi
khuẩn bệnh than. Thông thường các khuẩn lạc xù xì sẽ độc hơn các khuẩn lạc nhẵn [29].
Những chủng không còn khả năng tạo vỏ thì cũng mất khả năng gây bệnh và chúng
thường được dùng để chế tạo vaccin. Vỏ chỉ hình thành trong môi trường thạch huyết
ngựa hoặc môi trường có bổ sung 0,7 % Na2CO3, ủ ở 37oC, trong điều kiện kị khí [16].
Vỏ được phát hiện bằng nhiều phương pháp như: nhuộm mực tàu [26], kỹ thuật miễn
dịch huỳnh quang. Cả B. cereus và B. thurigiensis đều không tổng hợp được vỏ, vì vậy
đây là một trong những cách để phân biệt B. anthracis với các loài trên.

13


- Trong trường hợp không có plasmid pXO2 thì vỏ không hình thành, khi đó vách
của B. anthracis xuất hiện S-layer. Đây là 1 dạng siêu cấu trúc xuất hiện phổ biến ở một
số đơn bào nguyên thủy và vi khuẩn khác. Lớp S-layer được cho là có vai trò quan trọng
trong mối liên hệ giữa vi khuẩn và môi trường bên ngoài, đảm bảo hình dạng vi khuẩn
và là nơi gắn kết của các phage. Ngoài ra S-layer còn được coi là yếu tố độc lực, có vai
trò giúp vi khuẩn chống lại tác động của bổ thể và thay đổi khả năng tiếp cận của đại
thực bào vật chủ [15].
• Ngoại độc tố
- Ngoại độc tố của B. anthracis được hợp thành bởi 3 protein riêng biệt là:
+ Kháng nguyên bảo vệ PA (Protective antigen): giúp độc tố xâm nhập vào tế bào chủ.
+ Nhân tố gây phù EF (Edema Factor): làm ức chế chức năng của bạch cầu đa nhân
trung tính.
+ Nhân tố gây chết LF (Lethal Factor): làm tăng hoạt hóa đại thực bào, hoạt hóa quá
trình đốt oxy, giải phóng cytokine, làm bất hoạt protein kinase.
Kháng nguyên bảo vệ PA được mã hóa bởi gen pagA nằm trên plasmid pXO1 có
kích thước khoảng 185 kb. Bản thân kháng nguyên bảo vệ PA không có khả năng gây

độc nhưng lại là một nhân tố quan trọng trong quá trình gây bệnh của B. anthracis. PA
có khả năng kết hợp với nhân tố gây chết LF hay nhân tố gây phù EF, sản sinh độc tố
gây chết hoặc phù cho tế bào vật chủ. Do đặc tính này mà kháng nguyên bảo vệ PA được
xem là một kênh dẫn truyền gián tiếp cho các nhân tố EF và LF để chúng phát huy độc
lực.
1.2.2.6. Khả năng gây bệnh cho người và động vật
• Khả năng gây bệnh cho người
Bacillus anthracis là tác nhân gây bệnh nhiễm khuẩn cấp tính cho gia súc, đặc
biệt là cho các động vật ăn cỏ như trâu, bò, dê,cừu, ngựa.. Bệnh có khả năng lây nhiễm
sang người thành dịch với tỷ lệ tử vong cao. Bệnh thường biểu hiện ở 4 dạng: thể da,
tiêu hóa, hô hấp, viêm màng não. Người mắc bệnh than trong các trường hợp bị nhiễm
vi khuẩn qua vết sây sát ở da khi tiếp xúc với các chất thải của động vật mắc bệnh hoặc
14


khi làm thịt các động vật chết vì bệnh than. Ngoài ra còn gặp trong các trường hợp ăn
thịt bị nhiễm vi khuẩn chưa nấu chín, mắc bệnh khi hít phải B. anthracis từ bệnh nhân
mắc bệnh thể phổi hoặc do các thao tác không đảm bảo nguyên tắc vô khuẩn trong các
phòng thí nghiệm [9]. Đường lây bệnh than ở người chủ yếu là qua da (94 - 95%), qua
ăn uống (0,5 – 0,7%), qua aerozon (0,3%).
• Khả năng gây bệnh cho động vật
Trong tự nhiên trực khuẩn than gây bệnh chủ yếu cho gia súc và các loài động vật
ăn cỏ. Trong đó, cừu hay bị bệnh nhất, sau đó đến trâu, bò, ngựa, dê, ngựa và lợn ít nhạy
hơn.
Đôi khi dịch than cũng xảy ra ở hươu và một số loài động vật ăn cỏ khác. Một số
loại động vật gặm nhấm nhỏ rất nhạy cảm khi được gây bệnh thực nghiệm. Thỏ, chuột
lang, chuột bạch có thể bị chết khi tiêm 1 lượng nhỏ độc tố than.
Mặc dù có sức đề kháng hơn so với động vật ăn cỏ, nhưng một số động vật ăn thịt
như báo, sư tử, gấu vẫn bị ảnh hưởng của dịch than. Một số động vật có sức đề kháng tự
nhiên với than. Hầu hết các loài chuột cống đề kháng với than đặc biệt là chuột cống

trắng. Chó trưởng thành chỉ nhạy cảm nhẹ, loài chim đặc biệt là chim bồ câu có thể bị
nhiễm bệnh than nhưng không được chứng minh rõ ràng. Cáo đề kháng hoàn toàn nhưng
cóc rất nhạy cảm [7].
Ở động vật nhạy cảm cao thì bệnh diễn biến cấp tính, tỷ lệ chết khoảng 80% ở gia
súc và cừu, với biểu hiện là tình trạng nhiễm trùng huyết, biểu hiện tại chỗ có thể không
xuất hiện. Vi khuẩn than nhân lên với số lượng lớn trong máu và phủ tạng.
Động vật mắc bệnh do ăn cỏ, uống nước nhiễm bào tử B. anthracis. Ngoài ra còn
có thể bị bệnh do côn trùng đốt (do ruồi trâu, muỗi cát).
1.2.3. Đặc điểm hệ gen của B. anthracis
1.2.3.1.

Gen trên chromosome

Kích cỡ chromosome của B. anthracis vào khoảng 5,23Mb với tổng số 5058 gen
trong đó số trình tự mã hóa chiếm 84,3%, tỷ lệ G + C chiếm 35,4% [29]. Chromosome
15