Hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất vacxin viêm gan B tái tổ hợp pdf

Bộ khoa học và công nghệ bộ y tế


Chơng trình khoa học và công nghệ
phục vụ chăm sóc và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng




Báo cáo tóm tắt Dự án sản xuất thử nghiệm
cấp nhà nớc


Hoàn thiện qui trình công nghệ
sản xuất vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp





M số KC.10-DA06







5971
10/8/2006

Hà Nội-2004


Dự án sản xuất thử nghiệm cấp nhà nớc KC.10-DA.06
__________________________________________________________________________________





Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất
vắcxin viêm gan B tái tổ hợp



Cố vấn khoa học: GS.TSKH. Nguyễn Thu Vân

Chủ nhiệm dự án: TS.Ngô Thùy Anh

Các cán bộ tham gia: KS. Trịnh Tuấn Việt
Cn. Vũ Vân Quỳnh
Cn. Vũ Hồng Nga
Cn. Đinh Minh Tuấn
Cn. Quách Minh Tuân
Ts. Đỗ Thủy Ngân
Ts. Vũ Hồng Cơng

Các cơ quan tham gia:
- Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh
Dịch tễ Trung ơng
- Trung tâm Quốc gia Kiểm định vắcxin và các
chế phẩm sinh học
- Trung tâm y tế dự phòng - Thanh Hóa


mục lục

Đặt vấn đề 1
CHƯƠNG I: Vật liệu và phơng pháp 2
1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp. 2
2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp
sản xuất tại Việt Nam. 3
2.1. An toàn chung 3
2.2. Kiểm tra vô khuẩn 3
2.3. Xác định hàm lợng HBsAg 3
2.4. Kiểm tra chất gây sốt 4
2.5. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)
3
4
2.6. Kiểm tra hàm lợng Merthiolat 4
2.7. Kiểm tra hàm lợng Formaldehyt 4
2.8. Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 4
2.9. Kiểm tra công hiệu 4
2.10. Thử nghiệm nhận dạng 5
3. Phơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của
vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng . 5

3.1. Đối tợng nghiên cứu 5
3.2. Vật liệu nghiên cứu 5
3.3. Phơng pháp nghiên cứu 5
CHƯƠNG II : Kết quả và bàn luận 7
1. Hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 7
1.1. Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 7
1.2. Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 7
1.3. Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 7
1.4. Kiểm tra vỡ tế bào 8
1.5. Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 8
1.6. Pha chế vắcxin và đóng ống. 12
2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp
sản xuất tại Việt Nam. 12
2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 12
2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học. 13
3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin
viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 14
3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn 14
3.2. Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch
sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2 15
Chơng III. Kết luận 18
Tài liệu tham khảo 21


mục lục

Đặt vấn đề . 1
Chơng I: Tổng quan 3
1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B 3
1.1. Thông tin đại cơng về virút viêm gan B 3

1.2. Lịch sử virút viêm gan B 3
1.3. Cấu trúc sinh học phân tử của virút B 4
1.4. Bệnh lý học 12
1.5. Dịch tễ học virút viêm gan B 12
1.6. Chẩn đoán viêm gan B 13
1.7. Các thể lâm sàng 14
1.8. Điều trị 15
1.9. Dự phòng 16
1.10. Chiến lợc loại trừ lây truyền viêm gan virút B 17
1.11. Phòng nhiễm virút viêm gan B 18
1.12. Globulin miễn dịch phòng viêm gan B (HBIG) 18
2. Các loại vắcxin viêm gan B và những nghiên cứu về vắcxin
viêm gan B hiện nay 18
2.1. Các loại vắcxin phòng viêm gan B và xu hớng phát triển. 18
2.2. Tính an toàn của vắcxin viêm gan B 20
2.3. Tính sinh miễn dịch của vắcxin viêm gan B 21
2.4. Các yếu tố ảnh hởng đến tính sinh miễn dịch của
vắcxin phòng viêm gan B 23
3. Sử dụng công nghệ tái tổ hợp ADN để biểu thị kháng nguyên 26
3.1. Các hệ biểu thị khác nhau 26
3.2. Biểu thị ở nấm men 26
3.3. Biểu thị ở tế bào động vật 27
3.4. Hệ biểu thị ở Pichia pastoris 27
CHƯƠNG II: Vật liệu và phơng pháp 31
1. Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp. 31
1.1. Chủng sản xuất 31
1.2. Môi trờng . 31
1.3. Cấy chủng 33
1.4. Nhân chủng . 33

1.5. Biến nạp nội bào . 33
1.6. Gặt tế bào 34
1.7. Tách chiết HBsAg. 34
1.8. Tinh chế HBsAg 34
1.9. Bất hoạt virút. 35
1.10. Pha chế vắcxin. 35
1.11. So sánh qui trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp đã đợc
hoàn thiện với qui trình sản xuất ở qui mô phòng thí nghiệm 35
2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp
sản xuất tại Việt Nam. 37
2.1. An toàn chung 37
2.2. Kiểm tra vô khuẩn 37
2.3. Xác định hàm lợng HBsAg 38
2.4. Kiểm tra chất gây sốt 38
2.5. Kiểm tra chất hấp phụ Al(OH)
3
38
2.6. Kiểm tra hàm lợng Merthiolat 39
2.7. Kiểm tra hàm lợng Formaldehyt 39
2.8. Kiểm tra hàm lợng protein toàn phần 40
2.9. Kiểm tra công hiệu 40
2.10. Thử nghiệm nhận dạng 40
3. Phơng pháp đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của
vắcxin viêm gan B tái tổ hợp trên thực địa lâm sàng . 40
3.1. Đối tợng nghiên cứu 40
3.2. Vật liệu nghiên cứu 41
3.3. Phơng pháp nghiên cứu 41
CHƯƠNG III: KếT QUả Và bàn luận 46
1. Hoàn thiện quy trình sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp 46
1.1. Kết quả kiểm tra chủng sản xuất KM71-47-1 46

1.2. Kết quả kiểm tra quá trình nhân lên của tế bào nấm men 46
1.3. Kết quả kiểm tra quá trình biến nạp 48
1.4. Kiểm tra vỡ tế bào 50
1.5. Kiểm tra quá trình tinh chế HBsAg 50
1.6. Pha chế vắcxin và đóng ống. 58
2. Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp
sản xuất tại Việt Nam. 59
2.1. Xây dựng tiêu chuẩn về thành phần hoá học 59
2.2. Xây dựng về các chỉ số sinh học. 64
3. Kết quả đánh giá tính an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắcxin
viêm gan B tái tổ hợp RecomBvax trên thực địa lâm sàng 68
3.1. Kết quả đánh giá tính an toàn 68
3.2. Các kết quả đánh giá về khả năng đáp ứng miễn dịch
sau khi tiêm vắcxin theo phác đồ tháng 0-1-2 74
Chơng IV. Kết luận 78
Tài liệu tham khảo 81


các chữ viết tắt

aa Amino acid
(axít amin)
ADN Desoxyribonucleic acid
(axít desoxyribonucleic)
ARN Ribonucleic acid
(axít ribonucleic)
AH Aluminium hydroxide
(nhôm hydroxit)
Anti-HBc Antibody against Hepatitis B core antigen
(kháng thể kháng kháng nguyên lõi virút viêm gan B)

Anti-HBe Antibody against Hepatitis B e antigen
(kháng thể kháng kháng nguyên e virút viêm gan B)
Anti-HBs Antibody against Hepatitis B surface antigen
(kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B)
Au Australia antigen
(kháng nguyên Australia)
CHO Chinese hamster ovary
(tế bào trứng chuột đất vàng)
CTTCMR Chơng Trình Tiêm Chủng Mở Rộng
CDC Centers for Disease Control and Prevention
(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng- Mỹ)
D Dalton
DR Double repeat
(lặp lại kép)
ĐƯMD Đáp ứng miễn dịch

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
(thử nghiệm miễn dịch gắn enzym)
FDA Food and Drug Administration
(cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm)
GMP Good manufacturing practice
(thực hành sản xuất tốt)
GMT Geometric mean titer
(hiệu giá trung bình nhân)
GP Glycoprotein
(glycoprotein)
HBV Hepatitis B virus
(virút viêm gan B)
HBcAg Hepatitis B core antigen
(kháng nguyên lõi virút viêm gan B)

HBeAg Hepatitis B e antigen
(kháng nguyên e virút viêm gan B)
HBsAg Hepatitis B surface antigen
(kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B)
HBx Hepatitis B x antigen
(kháng nguyên x virút viêm gan B)
HBIg Hepatitis B immunoglobulin
(globulin miễn dịch phòng viêm gan B)
HLKN Hàm lợng kháng nguyên
HT Huyết thanh
HT1 (n) Huyết thanh lấy lần thứ nhất (hoặc lần thứ n)
HLA kháng nguyên bạch cầu ngời
IU International unit
(đơn vị quốc tế)
IFN interferon-
IFN
interferon-
IFN

interferon-
kb kilobase
(kilôbazơ)
kD kilodalton
(kilôdalton)
KN Kháng nguyên
KT Kháng thể
LD
50
Lethal dose 50%
(liều gây chết 50%)

LHBs Large hepatitis B surface antigen
(kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B loại lớn)
LH
3
E Lactalbumin hydrolysate Egle
MHBs Medium hepatitis B surface antigen
(kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B loại trung bình)
MLD Minimal lethal dose
(liều gây chết tối thiểu)
MSV Master seed virus
(Chủng gốc giống)
NMWL Nominal Molecular Weight Limit
( Kích cỡ giới hạn trọng lợng phân tử )
OD Optical density
(mật độ quang)
ORF Open reading frame
(khung đọc mở)
P Protein
PCR Polymerase chain reaction
(phản ứng chuỗi polymeraza)
ptl Phân tử lợng
SDS-PAGE Sodium-dodecyl-sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis
(điện di trên gel polyacrylamid)
SD Standard deviation
(độ lệch chuẩn)
SHBs Small hepatitis B surface antigen
(kháng nguyên bề mặt của virút viêm gan B loại nhỏ)
TCYTTG Tổ Chức Y Tế Thế Giới
TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam

VABIOTECH Công ty vắcxin và sinh phẩm số 1
vđ vừa đủ
v/p vòng/phút
VSDTTƯ Vệ Sinh Dịch Tễ Trung Ương
WSV Working seed virus
( Chủng sản xuất)










1
đặt vấn đề

Việt Nam là một trong những nớc có tỷ lệ ngời mang HBsAg cao trong
cộng đồng, theo các báo cáo của các tác giả khác nhau có thể giao động từ 11%-
26%. HBV vẫn chiếm một tỷ lệ lớn trong các căn nguyên gây viêm gan ở các
bệnh nhân bị viêm gan, trên 40% có căn nguyên gây bệnh là HBV. HBV cũng
chịu trách nhiệm tới 90% các trờng hợp ung th gan nguyên phát, trong khi ở
các nớc đã tiến hành tiêm phòng vắcxin viêm gan B cho cộng đồng từ những
năm đầu thập niên 80 thì căn nguyên chủ yếu gây ung th gan nguyên phát hiện
nay lại là virút viêm gan C, khi tỷ lệ ngời mang HBsAg đã giảm xuống dới 1%
do kết quả tiêm phòng viêm gan B. Tỷ lệ ngời mang ở phụ nữ có thai là khoảng
12%, trong đó nếu mẹ chỉ bị HBsAg dơng tính không thôi thì khả năng truyền
sang cho con trong thời kỳ chu sinh là khoảng 40%, và nếu mẹ mang cả HBsAg

và HBeAg dơng tính thì khả năng truyền cho con sẽ là khoảng > 90%.

Ngời mang HBV mạn tính có nguy cơ cao bị bệnh gan trầm trọng khi
trởng thành, bao gồm ung th gan và xơ gan. Tử vong và bệnh gây ra bởi bệnh
gan mạn tính là rất phổ biến. Cũng rất khó có thể nói đợc bệnh nào là do HBV
gây ra vì tình trạng bệnh thờng không đợc báo cáo đầy đủ. Tuy nhiên rõ ràng
là nhiễm HBV là một vấn đề y tế cộng đồng quan trọng và có thể dự phòng đợc.

Năm 1991, nhóm Cố vấn toàn cầu của Chơng trình tiêm chủng mở rộng
đã kêu gọi tất cả các nớc đa thêm vắcxin viêm gan B vào Chơng trình tiêm
chủng quốc gia. ở Việt Nam, chính phủ đã cho phép đa vắcxin viêm gan B vào
Chơng trình tiêm chủng mở rộng để tiêm cho trẻ em dới 1 tuổi từ tháng 8 năm
1997. Bên cạnh vắcxin viêm gan B sản xuất từ huyết tơng ngời mang HBsAg
cao, việc ứng dụng tiến bộ khoa học kỹ thuật trong lĩnh vực công nghệ sinh học
để có đợc một vắcxin viêm gan B tái tổ hợp ADN là hết sức cần thiết nhằm đáp
ứng nhu cầu sử dụng vắcxin ngày càng lớn trong nhân dân.

Dựa trên kết quả đáng khích lệ của đề tài KHCN-11-10A (1999) và
KHCN-11-10B (2002): Nghiên cứu tiếp thu chuyển nhợng kỹ thuật để xây
dựng qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan A và vắcxin viêm gan B tái tổ
hợp ADN, vắcxin viêm gan B tái tổ hợp (RecomBvax) do Công ty Vắcxin và
Sinh phẩm số 1- Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng sản xuất có khả năng phục vụ
rộng rãi cho nhu cầu phòng bệnh. Việc bổ sung trang thiết bị để mở rộng sản
xuất, hoàn thiện qui trình, đào tạo cán bộ KHCN nắm vững kiến thức và kỹ thuật
để ứng dụng đợc công nghệ sản xuất vắcxin là hết sức cần thiết. Do đó, dự án
Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp có mục
tiêu nh sau:
- Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp.

2
- Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại
Việt Nam.
- Chuẩn bị năng lực khoa học công nghệ để tiếp thu dự án vay vốn của Hàn
Quốc với công suất 20 triệu liều/năm.

Nội dung chính của dự án là :
- Hoàn thiện qui trình công nghệ sản xuất vắcxin viêm gan B tái tổ hợp.
- Xây dựng tiêu chuẩn Quốc gia cho vắcxin viêm gan B tái tổ hợp sản xuất tại
Việt Nam.
- Đánh giá tính an toàn và khả năng đáp ứng miễn dịch của vắcxin viêm gan B
tái tổ hợp trên thực địa ở giai đoạn 3, với cỡ mẫu n=300.
- Đào tạo đội ngũ cán bộ khoa học, công nhân kỹ thuật lành nghề nắm vững
kiến thức và kỹ thuật để có thể tiếp nhận đợc công nghệ và sử dụng trang thiết
bị trong dự án vay vốn của Hàn Quốc.



3
Chơng I
Tổng quan

1. Những hiểu biết hiện nay về virút viêm gan B
1.1. Thông tin đại cơng về virút viêm gan B
Genôm : ADN sợi kép một phần.
Họ : Hepadna.
Thời kỳ ủ bệnh : 30-180 ngày.
Đờng lây truyền : Máu và dịch tiết.
Tấn công cấp tính : Nhẹ hoặc dữ dội.
Chẩn đoán huyết thanh : Anti-HBc, anti-HBs hoặc HBsAg.

Điều trị : Triệu chứng.

1.2. Lịch sử virút viêm gan B
Danh từ viêm gan virút đợc hiểu là một nhiễm trùng gan do một trong
những virút viêm gan khác nhau gây ra.
Danh từ viêm gan B đợc MacCallum giới thiệu lần đầu tiên vào năm 1947
nhằm phân biệt nhiễm viêm gan (gây thành dịch) và viêm gan huyết thanh.
Những danh từ này sau đó đã đợc ủy ban Viêm gan virút của TCYTTG sử
dụng.
Trớc khi phát hiện ra virút, sự lây truyền viêm gan đợc phân biệt dựa vào
quan sát theo dõi dịch tễ học. Kiểu viêm gan B đợc coi nh là lây truyền qua
đờng máu.
Vào năm 1963, khi nghiên cứu tính đa dạng các protein huyết thanh,
Blumberg đã khám phá ra một protein cha từng đợc biết trớc đây trong máu
của một thổ dân Australia. Ông gọi protein này là kháng nguyên Australia (Au).
Sau này ngời ta thấy kháng nguyên này có liên quan đến kiểu viêm gan B. Đến
năm 1968, các nhà nghiên cứu khác là Prince, Okochi và Murakami đã xác định
đợc kháng nguyên Au (ngày nay ngời ta gọi là kháng nguyên bề mặt virút
viêm gan B hoặc HBsAg) và đợc tìm thấy một cách đặc hiệu trong huyết thanh
bệnh nhân bị nhiễm viêm gan kiểu B.
Vào năm 1973, Dane phát hiện ra các hạt kiểu virút trong huyết thanh bệnh
nhân bị nhiễm viêm gan B. Những hạt này đợc gọi là virút viêm gan B (HBV).
Những virút không có liên quan khác cũng đã đợc khám phá ra sau đó, song
virút viêm gan B vẫn giữ tên của nó.
Bản chất virút của các hạt này cũng đã đợc khẳng định, Kaplan et al. đã xác
định đợc ADN polymeraza nội gen phụ thuộc ADN cùng với lõi của nó. Việc
khám phá ra polymeraza này cho phép Robinson et al. xác định và đặc tính hoá
đợc genôm của HBV.

4
Những nghiên cứu trên toàn cầu về chu trình nhân lên của HBV với quan tâm
hàng đầu là sự kết dính và xâm nhập của virút vào tế bào chủ. Những nghiên cứu
lâm sàng cũng đang đợc tiến hành nhằm tìm ra đợc các phơng pháp điều trị
bệnh viêm gan B cấp tính hoặc mạn tính. Các phòng thí nghiệm khác cũng đang
nghiên cứu tìm kiếm cơ chế gây ung th của HBV.

1.3. Cấu trúc sinh học phân tử của virút viêm gan B
1.3.1. Genôm của virút viêm gan B
Genôm của virút viêm gan B đợc trình bày ở hình 1. Kích thớc genôm
giao động giữa các phân týp khác nhau của HBV, song tất cả đều có độ dài
khoảng 3,2 Kb.
ở viriôn của HBV ngời ta tìm thấy genôm ở dạng sợi kép không hoàn
chỉnh. Điều này có lẽ do tính chất riêng trong chu trình sống của HBV. HBV sử
dụng Transcriptaza phiên mã ngợc để phiên mã toàn bộ độ dài ARN sợi dơng
trong genôm của nó ngợc trở lại thành ADN. Transcriptaza ngợc này cũng có
hoạt tính ADN polymeraza và nhờ đó bắt đầu một quá trình sao chép một ADN-
sợi âm mới đợc tổng hợp. Tuy nhiên protein lõi capsid hoá Transcriptaza phiên
mã ngợc/polymeraza trớc khi hoàn thành quá trình sao chép.
Khi nào và ở đâu ADN sợi kép một phần này của genôm đợc sửa chữa
thành ADN khép kín đồng hoá trị vẫn còn cha đợc biết.

1.3.2. Quá trình sao chép genôm của HBV
Sự sao chép genôm HBV xảy ra bên trong nhân một tế bào bị nhiễm. ARN
polymeraza II phiên mã ADN sợi tròn của HBV thành một sợi ARNm lớn hơn độ
dài đầy đủ. Một khi đã đợc sao chép, ARN genôm có mặt trong nhân và xâm
nhập vào bào tơng, ở đó đợc phiên dịch để tái sinh polymeraza, protein lõi và
e của HBV.
Từ trạng thái tự do, trớc hết virút phải kết dính bản thân nó vào màng một tế
bào chủ đặc hiệu. Quá trình kết dính của virút là một trong những bớc quan

trọng để xác định tế bào chủ và tính đặc hiệu tế bào. Tuy nhiên hiện nay cũng
cha có một giòng tế bào nào để HBV có thể gây nhiễm đợc in vitro. Một vài
giòng tế bào nh HepG2 có thể hỗ trợ quá trình nhân lên của virút chỉ ở mức gây
nhiễm ngắn ngủi hoặc sử dụng ổn định HBV.ADN.
Sau khi kết dính, quá trình hoà nhập vỏ virút với màng tế bào chủ phải xẩy ra
để cho phép protein lõi của virút có chứa genôm và polymeraza xâm nhập vào tế
bào. Những nghiên cứu trớc đây cho thấy quá trình axít hoá là cho phép đối với
sự xâm nhập của virút, song các kết quả nghiên cứu hiện nay lại ngợc lại. Cũng
không đáng ngạc nhiên khi những giai đoạn đầu tiên của quá trình nhiễm trùng
vẫn còn nhiều tranh luận.





7
Viriôn gây nhiễm, gọi một cách khác là hạt Dane có đờng kính khoảng
42nm. Nh sơ đồ trên, có chứa tất cả các protein bề mặt của HBV cũng nh
protein lõi, genôm và polymeraza của HBV.

1.3.4. Những hạt virút viêm gan B khác
Có hai loại hạt khác đã đợc tìm thấy trong huyết thanh của ngời bị nhiễm
HBV và đợc gọi là hạt viêm gan B hình cầu và hạt viêm gan B hình ống. Cả hai
loại hạt này đều không có chứa bất kỳ một thông tin di truyền nào chứng tỏ
chúng gây nhiễm. Cả hai loại hạt đều có đờng kính 22 nm, tuy nhiên hạt viêm
gan B hình ống có độ dài thay đổi. Mỗi loại hạt đợc cấu thành độc nhất từ các
protein bề mặt của virút viêm gan B. Hạt hình cầu tiết ra đợc cấu tạo chủ yếu từ
protein bề mặt có kích thớc nhỏ và trung bình trong khi hạt hình ống tiết ra có

chứa cả protein bề mặt virút viêm gan B trọng lợng phân tử lớn. Có thể tìm thấy
những hạt này với hiệu giá cao trong máu những ngời mang HBV.
Các hạt không gây nhiễm này có hiệu giá cao cho thấy virút phải đợc hình
thành để sử dụng chúng theo một kiểu nào đấy. Cũng có giả thiết cho rằng các
hạt không gây nhiễm có hàm lợng cao trong huyết thanh cho phép các hạt virút
gây nhiễm chạy ngang qua máu không xác định đợc bằng hệ miễn dịch. Tuy
nhiên theo mô hình mẫu virút viêm gan B ở vịt hình nh có sự tăng nhanh nhiễm
trùng khi virút đợc trộn ở tỷ lệ nào đó với các hạt không gây nhiễm. Sự bám
dính các hạt không gây nhiễm vào tế bào có thể để hoạt hóa tế bào, chuẩn bị sẵn
sàng cho virút gây nhiễm. Điều này cũng có thể đúng cho virút viêm gan B ở
ngời, song vẫn cha đợc kết luận.

1.3.5. Protein lõi virút viêm gan B (HBc)
Protein lõi virút viêm gan B (HBc) đợc cấu tạo phần lớn từ axít amin a
nớc và tích điện. Protein này không bao giờ đợc glycosyl hoá, cũng nh không
có liên kết lipit nào. Tuy nhiên trong các tế bào eukayriot có lẽ protein này đợc
phosphoryl hoá.
Protein này đợc tổng hợp trong bào tơng và có thể lắp ghép với nhau thành
hạt lõi có chứa genôm của virút. Biểu thị protein HBc ở vi khuẩn cho thấy ARN
lắp ráp theo một kiểu không đặc hiệu. Khả năng lắp ráp hạt c trú trong vòng 149
axít amin đầu. Bốn cụm Arginin trong vòng 36-38 axít amin cuối có lẽ tham gia
vào quá trình lắp ghép các axít nucleic.
Quá trình phosphoryl hoá xẩy ra hoặc ở Serin thứ 170 hoặc 172. Các axít
amin này khu trú giữa cụm Arginin 3 và 4. Vì thế quá trình phosphoryl hoá các
điểm Serin có thể ức chế quá trình gắn các axít amin.
Những nghiên cứu sử dụng hệ lai kép cùng với kỹ thuật quét peptit đã xác
định đợc các axít amin tơng tác mạnh (aa 78 và 117) có thể tạo thành một phần
bề mặt tiếp giáp dimer. Ngợc lại, các vị trí 113 và 143 có lẽ tham gia vào quá
trình multimer hoá các dimer. Đột biến ở hai vị trí này có lẽ đã tác động đến tính
ổn định của capsit.

8
1.3.6. Protein e virút viêm gan B (HBe)
Virút hepadna biểu thị dạng tiết của protein HBc. Điều này đạt đợc nhờ quá
trình phiên dịch trình tự đầu 5 vào ORF của HBc đợc gọi là trình tự tiền-C.
Trình tự tiền-C có chứa vị trí xuyên màng kỵ nớc/tín hiệu tiết xuất dẫn đến di
chuyển protein HBe vào trong lòng ống mô lới nội bào (ER).
Trong ER, vị trí 19 trong 29 vị trí vùng tiền -C đợc cắt ra nhờ một tín hiệu
peptidaza trong khi 10 vị trí còn lại ngăn ngừa việc lắp ráp HBe vào hạt lõi. Một
vùng khác sau này đợc cắt ra bằng một proteaza Golgi ở vùng giàu Arginin.
Sản xuất các thể tiết xuất này của HBc có thể bằng cách nào đấy đã đàn áp
sự đào thải miễn dịch của tế bào sản xuất - HBV. HBe ở hàm lợng cao đợc tìm
thấy trong huyết thanh bệnh nhân nhiễm HBV huyết cao với ít triệu chứng. Đồng
thời, cáo đuôi chồn sẽ không phải chịu đựng nhiễm dai dẳng virút viêm gan B,
nếu sử dụng phơng án HBe-âm của virút.

1.3.7. Hạt lõi
Hạt virion tinh khiết có chứa protein HBc tạo ra các hạt lõi bao bọc genôm
và polymeraza của virút. ở virion trởng thành, hạt lõi này đợc tạo vỏ bọc bằng
nhiều kháng nguyên bề mặt khác nhau của HBV. Hơn nữa có thể một protein-
kinaza cũng đợc bao vào trong hạt lõi. Có lẽ một nồng độ HBc nhất định là cần
thiết cho quá trình lắp ráp hạt. Các dimer của protein HBc bắt đầu đợc hình
thành, lắp ráp ở nồng độ 0,8 àM thành các hạt đẳng điện đối xứng không gian ba
chiều (180 tiểu đơn vị HBc tạo thành một hạt lõi). Các hạt lõi đã lắp ghép sau đó
đợc làm ổn định nhờ các cầu nối disulphid.
Hiện nay, ngời ta thấy một cách rõ ràng hơn là vùng tiền -S1 và S của
protein vỏ bọc sẽ tơng tác với hạt lõi. Điều này cũng không có gì đáng ngạc
nhiên vì hạt lõi phải đợc lắp ghép một cách đặc hiệu bởi màng giàu protein bề
mặt của HBV để có thể sản sinh ra đợc các viriôn trởng thành.

1.3.8. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B
Sơ đồ sau đây là các kiểu khác nhau của kháng nguyên bề mặt virút viêm
gan B. Trong genôm của HBV, vùng mã hoá kháng nguyên bề mặt HBV gồm ba
khung bắt đầu từ các vị trí có chung một codon kết thúc. Bởi vậy, các protein bề
mặt khác nhau của HBV đều có liên quan đến nhau bởi một vùng chung nhau
nh đã biết là vùng S.

1.3.8.1. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại nhỏ (HBsAg hay là SHBsAg)
Protein này là loại protein nhỏ nhất trong số các protein bề mặt virút viêm
gan B và có chứa độc nhất vùng-S. Trong lịch sử nó cũng đợc gọi là kháng
nguyên Australia (kháng nguyên Au). Là kháng nguyên kỵ nớc chứa 4 vùng
xuyên màng có trật tự. HBsAg chứa một lợng lớn Cystein, tổng số là 14 và từng
Cystein có liên kết chéo với một Cystein khác. HBsAg cũng có thể đợc glycosyl
hoá ở Asp 146. Hai dạng protein này thờng nhìn thấy đợc trên gel chạy điện di


9
với hạt HBsAg tinh khiết từ huyết tơng ngời mang. Protein này là đoạn khởi
đầu lập thành tất cả các dạng hạt của HBV, vì vậy protein này đợc sản xuất với
một lợng lớn ở virút. Nó cũng chứa epitop có tính kháng nguyên cao. Phân tích
epitop này cho phép xác định đợc phân týp của ngời mang HBV.
Vi tính hoá mô hình cho thấy liên quan đến các đờng xoắn ốc 3 và 4 là
vùng xuyên màng ngăn nắp đợc gài vào màng ER sau giai đoạn phiên dịch. Hai
vòng xoắn này đợc xem nh là vị trí thực hiện quá trình multimer hoá. Điều này
đợc củng cố thêm nhờ quan sát HBsAg bị xén bớt vùng xoắn ốc này sẽ không
có khả năng tạo thành các hạt và sẽ ở lại màng ER. Tế bào bị nhiễm ở giai đoạn
sớm sản sinh ra một lợng lớn nhất protein. Hiệu giá hạt HBsAg không gây
nhiễm tìm thấy trong huyết thanh ngời mang có thể cao tới 200àg/ml. Biểu thị
HBsAg có thể cũng đợc cảm ứng nhờ một chấn động trong lòng ống lới nội

bào, điển hình là khi LHBsAg có ở lợng lớn.
Mặc dù những hạt này có tính kháng nguyên và tỷ lệ mắc cao, song hệ miễn
dịch hình nh về cơ bản đã quên lãng sự có mặt của chúng. Nghiên cứu các yếu
tố hoà tan điều chế từ tế bào lyphô T khi có nhiễm HBV cho thấy HBsAg có
nguồn gốc từ tế bào T có lẽ đã ngăn chặn sự sản sinh ra kháng thể kháng HBsAg
trong các tế bào T khác. Sự ngăn chặn này là đặc hiệu đối với HBsAg. Sự kiềm
chế miễn dịch của các kháng thể kháng các thành phần khác nhau của HBV
thờng dai dẳng ở ngời có tình trạng mang HBsAg mạn tính.
Gen khởi động S nằm trong vùng tiền-S. Đột biến ở vùng này sẽ dẫn đến
HBsAg đợc sản sinh ra với mức thấp. Sản xuất HBsAg giảm đi có lẽ làm cho
virút ứ đọng trong nội bào cũng nh mất khả năng lắp ráp các hạt virút.
Các phân týp của SHBsAg đã đợc xác định nguồn gốc bằng sự nhận biết
kháng thể. Vùng kháng nguyên có mặt ở tất cả các phân lập HBs đã biết đợc gọi
là quyết định kháng nguyên a. Bốn phân týp chủ yếu khác nhau là d hoặc y và w
hoặc r. Hai bộ này đợc cặp đôi theo kiểu thành viên của mỗi cặp sẽ loại trừ lẫn
nhau. Quyết định d có Lysin ở vi trí 122, trong khi y có Arginin. Tơng tự, quyết
định w có Lysin ở vị trí 160 trong khi r có Arginin. Hiện nay ng
ời ta cũng đã
tìm thấy các quyết định khác có chứa các epitop kháng nguyên không đợc nhận
biết bởi các kháng thể kháng lại các phân týp đã đợc biết trớc đây. Với cách
nhận định nh vậy, một số kháng thể đặc hiệu phân týp đặt vấn đề : liệu vắcxin
sử dụng hạt HBs có gây đợc đáp ứng miễn dịch bảo vệ ở ngời với tất cả các
chủng HBV không ? Câu trả lời là có. Tuy nhiên cũng vào những năm này kiểu
đột biến chạy thoát (escape) đã đợc phát hiện cho chúng ta thấy rằng cần phải
có vắcxin hoặc phơng pháp điều trị hiện đại hơn.

1.3.8.2. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại trung bình (MHBsAg)
Protein bề mặt virút viêm gan B loại trung gian hoặc kích thớc trung bình
này có chứa thêm một vùng 55 aa đã đợc biết là tiền -S2. Vùng này a nớc và
có lẽ c trú ở ngoại bào. Vùng tiền-S2 cũng có một vị trí glycosyl hoá bổ xung ở

Asp 4. Có thể vị trí này luôn luôn đợc glycosyl hoá, song vị trí glycosyl hoá ở


10
vùng S có lúc ở dạng glycosyl hoá hoàn toàn, có lúc ở dạng glycosyl hoá một
phần protein này.
Một số nghiên cứu cho rằng protein MHBsAg tham gia vào quá trình kết
dính và xâm nhập của HBV vào tế bào gan. Tuy nhiên, trong một nghiên cứu
phân tích di truyền HBV ở bệnh nhân viêm gan bạo phát, codon khởi đầu tiền-S2
có mang một biến dị đúp ngăn cản biểu thị protein tơng ứng. Nh vậy, có lẽ
tiền-S2 không cần thiết cho tính gây nhiễm của HBV cũng nh hình thái của hạt
virút. Điều này có thể loại trừ HBsAg trung bình là protein kết dính của HBV,
mặc dù nó có thể chia sẻ với quá trình kết dính virút theo kiểu cơ chế thứ phát.

1.3.8.3. Kháng nguyên bề mặt virút viêm gan B loại lớn (LHBsAg)
Đây là protein lớn nhất trong số protein bề mặt của HBV có chứa vùng tiền-
S1, tiền-S2 và S. Trình tự vùng tiền-S1 có thể giao động rất lớn trong số bệnh
nhân bị nhiễm cho thấy rằng có thể đây là protein của HBV tham gia vào quá
trình kết dính vào tế bào gan. Vùng tiền-S1 không có vị trí glycosyl hoá bổ sung,
song có chứa tín hiệu myrin hoá ở đầu cuối -N, buộc đầu cuối -N vào màng tế
bào.
Có giả thiết về hai kiểu sắp xếp của protein này : Một kiểu tìm thấy trên bề
mặt tế bào và trong viriôn trởng thành, kiểu khác tìm thấy trên bề mặt của hệ
thống lới nội bào (ER). Các kiểu sắp xếp đợc ghi chép dựa trên những nghiên
cứu proteaza và kháng thể. ở virút viêm gan B của vịt, LHBsAg có kiểu họa đồ
lỡng cực. Có lẽ cả hai vùng tiền-S1 và tiền-S2 ở lại trong nội bào khi LHBsAg ở
trong ER. Vì vậy, vùng tiền-S2 không đợc glycosyl hoá trong khi vùng tiền-S1
đợc myrin hoá. Khi nào, ở đâu và nh thế nào vùng tiền-S đợc di chuyển qua
màng tế bào vẫn còn là một vấn đề cần tranh luận. Tuy vậy, một mô hình giả
thiết cho virút viêm gan B ở vịt cũng đã đợc thiết lập. Mô hình này cho biết

vùng tiền-S đợc di chuyển qua một lỗ nớc trong vỏ của virút. Lỗ này đợc hình
thành nhờ quá trình oligomer hoá các vùng trải rộng xuyên màng trong vùng S.
Biểu thị d thừa LHBsAg không thôi, dẫn đến ứ đọng protein này trong ER. Tuy
nhiên, lúc đầu ngời ta nghĩ rằng sự ứ đọng trong ER là do một yếu tố bào tơng
liên kết LHBsAg nh một protein xuyên màng. Tuy vậy, các chứng minh mới
đây cho rằng quá trình hình thành các hạt trong nội bào của LHBsAg xẩy ra
trong lòng ống của lới nội bào. Sự ứ đọng có lẽ do liên kết LHBsAg với
calnexin. Protein này, theo đa số ý kiến, là protein chịu trách nhiệm cho sự kết
dính của virút vào tế bào chủ. Tuy nhiên, thụ thể cho HBV vẫn cha phân lập
đợc.


1.3.9. Polymeraza của virút viêm gan B
Protein polymeraza của HBV đợc lắp ráp cùng với ARN tiền genôm trong hạt
lõi. Polymeraza trong virion trởng thành có kích thớc 90 KD và có lẽ là ARN-
hoặc ADN-phụ thuộc (có nghĩa là Transcriptaza phiên mã ngợc). Có thể nhìn
thấy một băng protein có trọng lợng phân tử 70 KD trên điện di trên gel blot với


11
kháng huyết thanh tấn công vào tâm hoạt động đã đợc bảo vệ của Transcriptaza
phiên mã ngợc. Liệu đây có phải là kết quả hoá giáng protein của toàn bộ ORF-
P hay là quá trình biểu thị riêng biệt của vùng ADN-polymeraza thì vẫn cha có
câu trả lời.

1.3.10. Các vùng ORF-P trong HBV
Từ kết quả nghiên cứu phân tích đột biến ORF-P, sự đồng nhất trình tự và
những nghiên cứu về cơ chế sao chép của genôm virút cho thấy hầu hết các phần
của ORF-P là không thể thiếu đợc. Có thể có 4 vùng khác biệt của ORF-P :
Vùng đầu kết thúc amino mã hoá một protein liên kết với đầu 5 của

ADN-sợi âm của virút. Protein này là thiết yếu để khởi đầu cho quá
trình tổng hợp sợi âm, vì vậy cũng đợc gọi là primaza.
Vùng tiếp theo có lẽ có chức năng không đặc hiệu trừ khi đó có thể là
một khoảng trống.
Vùng này mã hoá ARN-polymeraza hoặc ARN-polymeraza phụ thuộc
ADN
Vùng cuối cùng có hoạt tính H-ARN-aza hoá giáng ARN nếu nó có
mặt trong một thể lai ghép ARN và ADN.
Có thể hoạt tính của protein polymeraza phụ thuộc vào ion kim loại và phần
có cấu trúc hình cong kiểu elíp. Yêu cầu phải có tín hiệu elíp này để hoạt hoá
polymeraza cũng đã đợc chứng minh ở hệ virút viêm gan B của vịt. Ion
Magnesium có lẽ là cần thiết cho quá trình sao chép ngợc.

1.3.11. Protein X của virút viêm gan B
Protein X của HBV đợc gọi nh vậy vì chức năng đầy đủ của nó vẫn còn là
một điều bí mật. Protêin X có 154 axít amin đợc mã hoá bởi ORF-X. Trình tự
của nó không thay đổi ở cả hai loại virút viêm gan của sóc và chuột chũi, song
virút viêm gan ở vịt không có HBx. Điều này ngụ ý rằng protein HBx không
tham gia trực tiếp vào quá trình sao chép genôm và lắp ráp virion.
Trên quan điểm triết lý di truyền học cho thấy gen HBx là một sự bổ sung
tức thời từ genôm của tế bào eukariot vào genôm của HBV mà ngợc lại là hoàn
toàn không thay đổi. Không có một chứng cớ nào chứng tỏ protein HBx là thành
phần của virion trởng thành hoặc hạt lõi. Phân tích aa cho thấy protein HBx có
nguồn gốc bào tơng. Những nghiên cứu về protein HBx cho biết rất khó biểu
thị protein này in vitro và rất không ổn định với thời gian bán hủy hoại rất ngắn -
20 phút. Tuy nhiên, nó có thể phosphoryl hoá.
Sợi trên của gen này có một vùng đã biết là vùng tăng cờng I của HBV, có
chứa một số trình tự hoạt hoá phần Cis- cho việc biểu thị gen của HBV có hiệu
quả. Có thể một tỷ lệ vùng tăng cờng này là trung gian cho quá trình phiên mã
gen X của HBV. Protein này có nhiều hoạt tính d thừa từ Dinucleotit-kinaza đến

ức chế proteaza. Phần lớn những luận điểm này cần phải đợc nghiên cứu sâu
hơn nữa. Tuy nhiên, cũng có nhiều nghiên cứu chứng minh rằng HBx protein


12
hoạt hoá quá trình phiên mã của nhiều gen. Có thể có một kiểu là qua HBx tăng
cờng khả năng liên kết ADN và hiệu quả phiên mã qua tác động tơng hỗ với
vùng dây kéo Leucin (bZcp) của nhiều yếu tố phiên mã. Có lẽ khả năng đáng ghi
nhận nhất của protein HBx là hoạt tính gây khối u. Hoạt tính này đã đợc chứng
minh ở nuôi cấy tế bào gan chuột và ở chuột truyền gen. Một con đờng có khả
năng là qua sự hoạt hoá Src-kinaza. Ngời ta cho rằng protein HBx tác động
tơng hỗ với Ras-Raf-kinaza. Liệu sự kích thích sinh trởng này có xẩy ra ở các
khối u hay không vẫn đang đợc xem xét.
Một số công trình cho rằng HBx gây cảm ứng ARN polymeraza III-phụ
thuộc phiên mã gen qua sự hoạt hoá đờng tín hiệu Ras. Điều này dẫn đến làm
tăng mức độ protein liên kết TATA trong tế bào. Protein X cũng có liên quan đến
việc điều hoà quá trình phiên mã trung gian Sp1 của Insulin-kiểu yếu tố sinh
trởng II (IGF-II). Điều hoà gen IGF-II có thể khởi động sự phân chia tế bào
trong quá trình phát triển của tổ chức gen.

1.4. Bệnh lý học
Bệnh lý học của cả viêm gan cấp tính và viêm gan virút đều đang đợc tháo
gỡ một cách chậm chạp. Hơn nữa phần lớn các số liệu đều cho thấy rằng các
thành viên họ Hepadnaviridae về bản chất đều không có tính gây độc cao.
Virút đợc lây truyền một cách có hiệu quả nhất qua đờng xuyên da.
Truyền nhiễm qua đờng tình dục và chu sinh là ít có hiệu quả hơn, đặc biệt đòi
hỏi hiệu giá virút phải cao. HBV có nồng độ đậm đặc nhất trong gan và máu và
với số lợng ít hơn trong nớc bọt và tinh dịch.
Hoàn toàn không có gì đáng ngạc nhiên khi virút viêm gan nhân lên đầu tiên
ở gan. Tuy nhiên, nhiều vị trí khác nhau ngoài gan cũng đã đợc đề cập đến.

Điều này cũng đúng cho hàng loạt những thay đổi huyết học thỉnh thoảng thấy ở
bệnh nhân viêm gan cấp tính.
Các sản phẩm trung gian và/hoặc phiên bản của virút trong quá trình nhân
lên của HBV cũng tìm đợc ở các vị trí ngoài gan.

1.5. Dịch tễ học virút viêm gan B
Viêm gan B đợc lan truyền trong cộng đồng ngời trên toàn thế giới. Mặc
dù có nhiều báo cáo cho thấy rằng HBsAg có cả ở những động vật bậc cao khác
nữa, song ngời vẫn là ổ chứa chủ yếu. ở những nớc phát triển hơn, tỷ lệ nhiễm
HBV đã giảm đi, có lẽ do thay đổi cách sống của nhóm có nguy cơ cao, vắcxin
viêm gan B đã sẵn có cùng với việc sàng lọc những ngời cho máu.
Nguồn HBV đầu tiên là máu. Tuy nhiên, ng
ời ta cũng đã tìm thấy virút
trong hàng loạt dịch tiết cơ thể nh nớc bọt, nớc mũi, tinh dịch và máu hành
kinh. Ngời ta không tìm thấy virút trong phân, có lẽ do virút đã bị bất hoạt bởi
các enzym có trong niêm mạc ruột hoặc khuẩn trí đờng ruột. Có thể giả thiết
một cách chắc chắn rằng virút có mặt trong tất cả các dịch tiết của một bệnh
nhân bị nhiễm. Máu bị nhiễm của một ngời mang HBeAg dơng tính có hiệu


14
1.7. Các thể lâm sàng
1.7.1. Viêm gan cấp tính
Tiến triển lâm sàng của HBV cũng tơng tự nh viêm gan A (HAV), song sẽ
trầm trọng hơn và có thể có liên quan với các triệu chứng nh kiểu bị bệnh huyết
thanh. Những kiểu tấn công nhẹ nhất không có biểu hiện lâm sàng và chỉ có thể
xác định đợc bằng mức tăng transaminaza trong huyết thanh. Nói cách khác
bệnh nhân có thể không vàng da nhng sẽ bị mắc các triệu chứng kiểu bệnh cúm
và viêm ruột- dạ dày. Những bệnh nhân này thờng không chẩn đoán đợc trừ

khi có một tiền sử mắc bệnh rõ ràng. Mức độ trầm trọng của bệnh có thể thay đổi
từ không có triệu chứng và vàng da (ở những ngời đợc hồi phục một cách điển
hình) cho đến bạo phát và tử vong. Thể tấn công vàng da ở ngời lớn đợc đánh
dấu bằng một thời kỳ triệu chứng tiền lâm sàng (điển hình từ 3-4 ngày cho đến 2-
3 tuần). Trong thời kỳ này, bệnh nhân cảm thấy mệt mỏi, bị mắc các triệu chứng
về đờng tiêu hoá nh chán ăn, buồn nôn và có thể sốt. Những triệu chứng chung
nh sốt, rét, chán ăn, không thích uống rợu và hút thuốc, mệt mỏi và thỉnh
thoảng đau đầu nặng. Thời kỳ tiền triệu có kèm theo nớc tiểu sẫm mầu và phân
bạc, vàng da tiến triển.

1.7.2. Viêm gan bạo phát
Rất ít thể bệnh xẩy ra với bệnh nhân trong vòng 10 ngày. Thể này có thể tiến
triển nhanh đến nỗi vàng da không nhận thấy đợc và có thể nhầm lẫn với rối
loạn tâm thần cấp tính hoặc viêm màng não mủ cấp tính. Mặt khác bệnh nhân có
thể bị vàng da trầm trọng. Những biểu hiện của cơ thể lặp lại nh nôn, hơi thở
hôi, chứng lẫn và buồn ngủ. Hiện thợng run rẩy có thể chỉ thoảng qua, nhng co
cứng là thờng xuyên. Những hiện tợng này sau đó sẽ bị gián đoạn bởi hôn mê
chứng tỏ gan bị tổn thơng trầm trọng. Thân nhiệt của bệnh nhân tăng, vàng da
trầm trọng và teo gan, có thể kèm theo xuất huyết lan tỏa. Bilirubin và
Transaminaza là những dấu hiệu tiên lợng kém vì mức Transaminaza có thể
giảm đi thật trong khi tình trạng lâm sàng của bệnh nhân lại kém đi. Promthrobin
là dấu hiệu tiên lợng tốt nhất. Tần suất quá trình viêm gan bạo phát khác nhau
phụ thuộc vào kiểu viêm gan virút và tỷ lệ mắc viêm gan B.

1.7.3. Triệu chứng hậu viêm gan
Bệnh nhân lớn tuổi cảm thấy khá hơn đối với những khoảng thời gian khác
nhau sau viêm gan cấp tính. Điển hình là thời kỳ này kéo dài vài tuần và có thể
đến hàng tháng. Những hình ảnh chung là lo âu, mệt mỏi, sút cân, biếng ăn, sợ
rợu và khó chịu vùng sờn phải trên, bờ gan có thể bị đau. Transaminaza huyết
thanh có thể cao gấp 3 lần mức bình thờng. Tổ chức mô tế bào gan thay đổi nhẹ,

có hiện tợng viêm và xơ hoá, đôi khi có thay đổi thành phần mỡ trong tế bào
gan. Những điểm này cũng không khác so với bệnh nhân đã bình phục và cả
bệnh nhân hết triệu chứng. Không đợc tiến hành làm sinh thiết gan trong vòng 6