CRISPR shpt FINAL hoan chinh

KỸ THUẬT CHỈNH SỬA GENE CRISPR/CAS9

1


NỘI DUNG

1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Giới thiệu
CRISPR/CAS9 và cơ chế
Các bước đưa CRISPR CAS 9 vào tế bào
Ưu và nhược điểm
Ứng dụng của CRISPR/CAS9
Kết luận
Tài liệu tham khảo

2


1. GIỚI THIỆU

Việc thao tác và biến đổi DNA bộ gene từ lâu đã là niềm khao khát của con người. Giấc mơ
đó đã gần với hiện thực hơn bao giờ hết khi dự án giải mã bộ gene người hoàn thành năm
2003

3


1. GIỚI THIỆU

Thông tin từ bộ gen của người và sinh vật khác đã giúp các nhà khoa học hiểu rõ
hơn về từng gen riêng biệt, từ đó thực hiện các kỹ thuật thao tác trên gen giúp con
người nghiên cứu chức năng của từng gen hoặc hệ gen, sửa chữa các sai hỏng do
đột biến ở các bệnh di truyền, và biến đổi đặc điểm di truyền theo mục đích riêng
của con người.

4


1. GIỚI THIỆU

Làm thế nào để biến đổi, sữa chửa sai hỏng đối với từng gen cụ thể?



Kỹ thuật thao tác DNA bộ gen dựa như Zinc Finger Nucleases (ZFNs) và Transcription
Activator Like Effector Nuclease (TALEN).



Nhiều nghiên cứu đã sử dụng thành công kỹ thuật biến đổi DNA bộ gen dựa trên hệ thống
CRISPR/Cas và CRISPR/Cas9 là một trong số đó.

 Vậy thì CRISPR/Cas9 là gì?

5


1. GIỚI THIỆU

 CRISPR- được phát hiện lần đầu tiên ở
trong vi khuẩn và vi khuẩn cổ năm 1987.

 CRISPR được mơ tả là một họ các trình tự
DNA ngắn (20-40 nucleotides) xuôi ngược
lặp lại (đọc theo hướng xuôi hay ngược thì
đều có trình tự DNA giống nhau

6


1. GIỚI THIỆU



Các trình tự này được ngăn cách với nhau bởi các vùng đệm (spacer), mỗi vùng đệm DNA là
độc nhất. Vào những năm 2000, họ phát hiện rằng các vùng đệm DNA này phù hợp tuyệt đối
với DNA của virus, đặc biệt là các thể thực khuẩn

7


1. GIỚI THIỆU



Chúng cũng là những gen liên quan tới CRISPR hay gen Cas. Các gen Cas này sẽ dịch
mã thành protein Cas. Protein Cas này cơ bản sẽ trở thành các helicase, protein tháo xoắn
DNA, và các nuclease, protein cắt DNA. Nó như một hệ thống miễn dịch của vi khuẩn.

8


1. GIỚI THIỆU

9


1. GIỚI THIỆU

10


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

 Năm 2012, lần đầu tiên công nghệ CRISPR được áp

dụng làm kĩ thuật chỉnh sửa hệ gen nhờ cơng trình
nghiên cứu của nhóm tác giả Jennifer Doudna và
Emmanuelle Charpentier tại trường đại học California
(Jinek et al., 2012) trên liên cầu khuẩn (Streptococcus
pyogene - SPY).

 Nhóm nghiên cứu đã phát hiện ra SPY chỉ có 1 protein
Cas gọi là Cas9.

11


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

Các protein Cas9 chịu trách nhiệm cho việc định vị và cắt DNA mục tiêu, cả trong tự nhiên và trong các hệ thống
CRISPR/Cas9 nhân tạo. Một protein Cas9 có cấu tạo gồm 6 tiểu phần:
REC I, REC II, cầu nối Helix, PAM Interacting, HNH và RuvC
12


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

 Các protein Cas9 sẽ ở  trạng thái bất hoạt trong trường hợp có gRNA. Trong các hệ thống CRISPR/Cas9 nhân
tạo, gRNA bao gồm một sợi đơn RNA tạo thành một hình chữ T.

 Các gRNA được thiết kế để có đầu 5’ là trình tự bổ sung với trình tự DNA mục tiêu.

13


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

 gRNA nhân tạo liên kết với các protein Cas9 và khi tương tác tạo
thành phức hợp sẽ gây ra một sự thay đổi về hình dạng của
protein kích hoạt Cas9 chuyển sang trạng thái hoạt động.

 Cơ chế của sự thay đổi về hình dạng khơng được hiểu hồn tồn
nhưng Jinek và các đồng nghiệp đưa ra giả thuyết rằng sự tương

tác về không gian hay liên kết yếu giữa các tiểu phần protein và
gRNA có thể là nguyên nhân gây ra sự thay đổi (Jinek et al.
2014).

14


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

 Khi các protein Cas9 được kích hoạt, nó sẽ tìm kiếm DNA mục tiêu bằng cách liên kết với các trình tự
phù hợp với trình tự PAM (protospacer adjacent motif) của nó.

 Khi protein Cas9 tìm thấy một trình tự mục tiêu phù hợp với trình tự PAM, Cas9 sẽ tách các base phía
trước trình tự PAM và bắt cặp với vùng bổ sung trong đoạn gRNA.

 Nếu vùng bổ sung và vùng mục tiêu bắt cặp đúng thì RuvC và HNH nuclease sẽ cắt DNA mục tiêu tại vị
trí nuclotide thứ  4 phía trước PAM tạo ra vùng DSB (double strand break)

15


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

16


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

 Các gRNA được thiết kế đặc hiệu để xác định vị trí chèn hoặc loại bỏ (indels) sẽ xảy ra. Khi
gRNA và Cas9 được biểu hiện trong các tế bào mục tiêu, các gRNA sẽ điều khiển Cas9 liên kết

với trình tự mục tiêu và cắt sợi đơi DNA tại vị trí nhận biết (đặc tính chun biệt của các
endonuclease). Từ đó, các tế bào có thể sửa chữa tại vị trí cắt với những đoạn trung gian không
tương đồng như NHEJ (non-homologous end joining) hoặc tương đồng HDR (homologous
directed repair)

17


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

 Nếu indel xảy ra trong khung đọc ORF (open reading frame), nó có thể làm thay đổi khung ORF dẫn đến
tín hiệu của mã kết thúc sớm (premature stop codon) qua đó loại bỏ các chức năng ban đầu của gen-tắt
gen gây bệnh.

 Các phân tích gen như SURVEYOR hoặc giải trình tự gen (Sanger hoặc NGS) sau đó sẽ giúp xác định
các tế bào có chứa indels ở gen mục tiêu hay khơng.

 Ngồi ra, bằng cách sử dụng cơ chế sửa chữa không hoàn hảo của tế bào, CRISPR cho phép các nhà
khoa học chỉ đơn giản là xây dựng thư viện các dòng tế bào với knockout indel tại những vùng của bộ
gen muốn nghiên cứu.

18


2. CRISPR/CAS9 và cơ chế

/>KFw2KZA5o&t=136s

19

3. Các bước đưa CRISPR CAS 9 vào tế bào

Bước 1: Xác định loại tế bào sử dụng và trình tự gen mục tiêu

Bước 2: Thiết kế các trình tự oligo và primer cần thiết: gRNA, Fw, Rv

 Lựa chọn trình tự mục tiêu (ví dụ, một đoạn gen 1-kb từ các khu vực quan tâm), xác định và
phân loại các vùng mục tiêu phù hợp. Các thông số được thiết lập giúp tính tốn cho từng
mục tiêu dự định trên phần mềm chuyên dụng. 

20


3. Các bước đưa CRISPR CAS 9 vào tế bào

Bước 3: Tổng hợp gRNA

 Có thể tổng hợp gRNA bằng phương pháp PCR hoặc phương pháp cloning.
Bước 4: Vận chuyển phức hợp gRNA-Cas9 đến tế bào mục tiêu

 Việc vận chuyển phức hợp gRNA/Cas9 đến tế bào mục tiêu có thể theo 3 phương pháp khác
nhau: Lipofection, Electroporation, Lentiviral transduction

21


Lipofection

 Lipofection là phương pháp dựa trên đặc

tính của liposome mang điện tích dương sẽ
liên kết với DNA/RNA mang điện tích âm
tạo nên một phức hợp mang mạng lưới điện
tích dương từ đó giúp việc tiếp cận (bám)
và xâm nhập vào tế bào một cách dễ dàng
hơn

22


Electroporation

 Electroporation là phương pháp sử dụng dòng điện
300-400mV để tạo ra xung động đến tế bào trong
khoảng thời gian ít hơn 1/1000 giây. Xung động này
giúp tạo ra những lỗ tạm thời trân màng tế bào và
thơng qua đó gRNA/Cas9 xuyên qua để đi vào tế bào
đến locus mục tiêu.

23


Lentiviral transduction

 Lentiviral transduction là phương pháp sử dụng lentiviral vector để vận chuyển gRNA/Cas9 vào tế bào thông
qua cơ chế xâm nhiễm của virus. Lentiviral vector có nguồn gốc từ một lớp của Retrovirus-gây ra suy giảm hệ
thống miễn dịch ở người (HIV-1)

24

3. Các bước đưa CRISPR CAS 9 vào tế bào

Bước 5: Phát hiện các indel

 Có 2 cách để phát hiện các indel bao gồm SURVEYOR và giải trình tự
Bước 6: Xác định hiệu quả knockout gen hay hiệu quả chỉnh sử gen mục tiêu của hệ thống
CRISPR/Case

 Phân tích bằng RFLP
 Phân tích bằng phương pháp giải trình tự: Sanger, NGS

25