Thực hành KT di truyền

MỤC LỤC

BÀI 1
CHUYỂN GENE VÀO TẾ BÀO VI KHUẨN BẰNG PHƯƠNG PHÁP
SHOCK NHIỆT
I.

Nguyên tắc:


Chuyển gen là quá trình đưa DNA ngoại lai vào tế bào sinh vật. Quá trình chuyển
plasmid vào tế bào vi khuẩn (q trình biến nạp) khơng chỉ quan trọng trong nghiên
cứu mà còn trong nhân bản và lưu trữ plasmid. Bởi vì điều này, hầu như tất cả các
plasmid, thậm chí các plasmid được thiết kế cho ứng dụng ở thực vật và động vật,
cũng đều mang vùng khởi đầu sao chép (ori) và vùng gene kháng kháng sinh dùng
như một marker để chọn lọc dịng vi khuẩn. Có nhiều biến đổi di truyền được thực
hiện để tạo các chủng vi khuẩn có thể chuyển gene vào dễ dàng hơn cũng như giúp
duy trì plasmid mà khơng làm thay đổi plasmid.
Các tế bào sẽ tiếp nhận các đoạn DNA một cách ngẫu nhiên. Khơng phải tất cả các
lồi vi khuẩn đều có khả năng tiếp nhận DNA. Ngay cả những lồi có khả năng này
cũng chỉ có thể tiếp nhận được DNA ở những pha sinh trưởng nhất định và trong
những mơi trường ni cấy cụ thể. Các lồi Streptococcus pneumoniae và Bacillus
subtilis tương đối dễ khả biến hơn, trong khi E. coli phải mất đi hai loại enzyme
exonuclease và phải được ni cấy trong mơi trường có nồng độ cao của calcium
chlodride để làm cho màng tế bào của nó có thể thấm được DNA. Như vậy, những
quá trình xử lý đặc biệt cũng được thực hiện nhằm gia tăng hiệu quả chuyển gene ở vi
khuẩn và làm chúng nhạy cảm hơn dưới tác động của cá chất hóa học hay dịng điện
trong kỹ thuật chuyển gene. Những tế bào vi khuẩn này được gọi là tế bào khả nạp
(competent cells).
Qua q trình biến nạp, một dịng vi khuẩn bị biến đổi di truyền do tiếp nhận DNA
ngoại lai. Để chọn lọc được những dòng vi khuẩn chuyển gene, các môi trường nuôi

cấy chứa chất kháng sinh tương ứng với gene kháng kháng sinh trên vector dung
trong quá trình chuyển gene thường được sử dụng. Các khuẩn lạc hình thành trên mơi
trường có kháng sinh có xác suất cao chứa vector. Ngoài ra, chọn lọc xanh trắng
(blue-white screening) dựa vào vùng gene lacZ mã hóa enzyme beta-galactosidase
trên một số vector cũng được sử dụng giúp chọn lọc dòng vi khuẩn mang vector chứa
insert.


Hình 1: Plasmid pET11a

II.

Vật liệu:

Plasmid pET11a: 2µl
Vi khuẩn khả nạp E. coli DH5-alpha: 100µl
Mơi trường LB agar: 50ml
Kháng sinh ampicillin 50mM:100µl
Dung dịch CaCl2 100mM vơ trùng: 5ml
Glycerol 100% vơ trùng: 5ml
III.
1.

Quy trình thí nghiệm:
Chuẩn bị tế bào khả nạp E. coli DH5-alpha và BL21:

Hút lần lượt 1ml dịch vi khuẩn
sang eppendorf
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường LB khơng có kháng sinh

Ni cấy lắc với tốc độ 150 rmp ở 370C trong thời gian 16-20h


Ly tâm ở tốc độ 8000rpm trong 2 phút

Loại bỏ dịch nổi để thu sinh
khối vi khuẩn
Lặp lại các bước để thu nhận toàn bộ sinh khối từ dịch vi khuẩn

Vortex để huyền phù sinh khối, ủ
eppendorf trong đá 30 phút

Bổ sung 1ml dung dịch CaCl2 lạnh
vào eppendorf chứa sinh khối vi
khuẩn
Ly tâm dịch vi khuẩn ở 8000 rpm
trong 2 phút

Bổ sung 500µl hỗn hợp dung dịch
CaCl2 và glycerol lạnh, vortex để
huyền phù sinh khối

Hút chuyển lần lượt 100µl dung dịch
vi khuẩn vào các eppendporf lạnh vô
trùng.
Bảo quản các ống vi khuẩn ở nhiệt độ
-80oC

Loại bỏ dịch nổi để thu sinh
khối vi khuẩn

2 . Quy trình chuyển gene vào tế bào vi khuẩn khả nạp bằng phương pháp shock
nhiệt
Giải đông ống vi khuẩn khả nạp
vào hộp đá trong 5-10 phút

Hút bổ sung 5µl của plasmid vào vi khuẩn khả nạp đã giải đông. Trộn nhẹ hỗn hợp bằng micropipette

Đặt ống eppendorf chứa hỗn hợp biến nạp trong chậu nước đá trong 5 phút

Chuyển eppendorf vào bể ổn nhiệt ở 42oC trong 42 giây

Đặt eppendorf lại vào chậu nước đá trong 5 phút

Bổ sung 1ml môi trường LB

Ủ trên máy lắc 37oC trong 45 phút

Cấy trải toàn bộ dung dịch vi khuẩn vào đĩa petri chứa mơi trường LB agar có bổ sung kháng sinh


Nuôi ủ đĩa petri ở 37oC qua đêm

Chọn 10 khuẩn lạc mọc rời trên đĩa petri

Thu được chủng vi khuẩn kháng kháng sinh

IV.

Kết quả thí nghiệm
Hình 2. Vi khuẩn BL21 đã được chuyển gen kháng kháng sinh (trái) – Vi khuẩn DH5alpha (phải) trên mơi trường LB có chứa ampicilin (đối chứng)


V.

Thảo luận

Đĩa cấy vi khuẩn BL21 đã chuyển gen kháng kháng sinh không xuất hiện khuẩn lạc (không
phát triển) do:
-

Chủng vi khuẩn đã được bảo quản quá lâu nên không cịn sống.
Vi khuẩn chuyển gen khơng thành cơng (sai sót trong thao tác).

Đĩa đối chứng: cấy vi khuẩn DH5-alpha không chuyển gen xuất hiện khuẩn lạc do:
-

Ampicilin bị hỏng.
Ampicilin trong đĩa khơng đều nên vi khuẩn có thể sinh sống được trên những vùng
khơng có ampicilin.

VI. Trả lời câu hỏi:
Giải thích cơ chế sàng lọc xanh trắng?
Trả lời:
Sàng lọc xanh trắng phụ thuộc vào việc biến nạp một chủng vi khuẩn biểu hiện gene
lacZ đột biến nên không thể mã hóa peptide alpha của beta-galactosidase, nhưng được
bù đắp bởi vector mang gene. Các tế bào biến nạp được cấy trên môi trường tăng
trưởng bao gồm một số chất cảm ứng phiên mã cho biểu hiện lacZ, IPTG và cơ chất
tạo màu của lacZ là X-gal (5-bromo-4 chloro-3-indolyl-D-galctopyranoside). Trong

sàng lọc xanh trắng, lacZ sẽ thủy phân X-gal, tạo ra cơ chất màu xanh lam và do đó
khuẩn lạc có màu xanh. Khi một đoạn DNA chèn vào làm phá vỡ gene lacZ trên
vector, khơng có lacZ đầy đủ được hình thành và các khuẩn lạc biến nạp có màu
trắng.


BÀI 2
PHƯƠNG PHÁP PCR KHUẨN LẠC XÁC ĐỊNH DÒNG TẾ BÀO VI
KHUẨN MANG GENE MỤC TIÊU
I.

Nguyên tắc:

Phương pháp PCR khuẩn lạc (colony PCR) là phương pháp rất thuận lợi và hiệu quả trong
việc sàng lọc số lượng lớn các dòng vi khuẩn để xác định sự hiện diện hay vắng mặt của
plasmid mang gene mục tiêu trong quá trình tạo dịng. Các dong vi khuẩn chuyển gene có
thể được ly giải trong nước hoặc dung dịch đệm trong một bước xử lý nhiệt trước khi bổ
sung vào hỗn hợp phản ứng PCR hoặc cũng có thể bổ sung trực tiếp vào phản ứng và được
ly giải trong giai đoạn khởi đầu của chu kỳ nhiệt. Bước xử lý nhiệt trong giai đoạn khởi đầu
cho phêp giải phóng plasmid DNA từ tế bào vi khuẩn làm nguyên liệu (mạch khuôn) cho
phản ứng PCR.
Trong phản ứng PCR, với một cặp mồi đặc hiệu cho gene mục tiêu cho phép xác định sự
hiện diện của gene mục tiêu trong cấu trúc của plasmid. Ngoài ra, với các mồi chuyên biệt
được thiết kế cho các vùng gene trên khung vector, bên cạnh gene mục tiêu, cho phép xác
định chiều và kích thước của gene mục tiêu. Trong tất cả các trường hợp, sản phẩm của phản
ứng PCR được xác định bằng điện di trên gel agarose.

Hình 3. Quy trình PCR khuẩn lạc

II.
Vật liệu và phương pháp:
1. Vật liệu:
- Các chủng vi khuẩn được sàng lọc xanh trắng và kháng kháng sinh đặc trưng.
- Mồi xi 20µM: 12µl

Mồi ngược 20µM: 12µl
- My Taq mix 2X: 150µl
2. Phương pháp:
- Phản ứng PCR.
- Phân tích kết quả bằng điện di gel agarose.
III.
QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM:
1. Chuẩn bị phản ứng colony PCR:
-

(*) Hút các thành phẩn phản ứng theo bảng sau:
Chuẩn
Các thành
phầnbị eppendorf sạch
Thể tích
H2O
10.5 µl
My Taq mix 2X
12.5 µl
Hút các thành phần phản ứng PCR vào eppendorf (*)
Mồi xi 20µM
1 µl
Mồi ngược 20µM
1 µl

Hồ tan khuẩn lạc vào dung dịch phản ứng bằng đầu típ vơ trùng
Vortex và spindown nhanh các ống phản ứng

2. Quy trình nhiệt của phản ứng colony PCR: được cài đặt theo bảng sau:

Các
nhiệt

bước
950C
950C
620C
720C
720C
40C

Thời gian

Số lần lặp lại

10 phút
30 giây
30 giây
30 giây
10 phút
∞

1 lần
30 lần
1 lần

3. Điện di kiểm tra kết quả phản ứng colony PCR:

Chuẩn bị bản gel agarose 1,5%

IV.

Trộn 25l sản phẩm PCR vào 6,25l gel loading buffer (GLB)

Nạp mẫu vào gel

Điện di sản phẩm cắt ở 100 voltage trong 30 phút

Quan sát xác định band sản phẩm PCR

So sánh với marker để xác định kích thước
Kết quả thí nghiệm
Sau khi tiến hành thí nghiệm ta có được kết quả như sau:

Hình 4. Kết quả điện di gel agarose
(L: Ladder 100bp – 1013bp, 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn chứa gen mục tiêu, 1112: Đối chứng âm - dương)
V. Thảo luận


*Sau khi điện di sử dụng thuốc nhuộm gel safeview:
- Trong thời gian chờ gel đơng thì safeview đã bị mất màu.
- Qua nhiều lần sử dụng safeview thì khơng hiển thị được các band sản phẩm PCR.
Nên có thể thuốc nhuộm safeview đã bị hỏng hoặc hết hạn sử dụng. Và các thao tác chưa
đúng nên ảnh hưởng đến kết quả.

*Nhóm thực hành đã quyết định chọn thuốc nhuộm Ethidium bromide (EtBr) để thay thế
cho safeview:
- Cách thực hiện:

Điện di trên gel agarose 1.5%

Dùng sản phẩm điện di ngâm vào EtBr 15 phút

Quan sát xác định band sản phẩm PCR trong hộp đèn soi UV
So sánh với marker để xác định kích thước

-

Sau khi thay đổi thuốc nhuộm vẫn khơng thể thấy được các band của sản phẩm PCR.

Có thể do thao tác thực hiện cịn nhiều sai sót, hố chất khơng đảm bảo chất lượng, mồi
q dài (khơng đặc hiệu) nên kết quả không thể xác định được các band sản phẩm PCR
và xác định được kết qủa chính xác.
 Bổ sung kết quả thực hiện lần 2
Do PCR khuẩn lạc không đạt được kết quả mong muốn, tiếp tục tiến hành thực hiện lại thí
nghiệm lần 2 với một số thay đổi:
+ Giữ nguyên thể tích của các thành phần: My Taq mix và nước, thay đổi thể tích của mồi
xi và mồi ngược:
Các thành phần
H2O
My Taq mix 2X
Mồi xi 20µM
Mồi ngược 20µM

Thể tích

10.5 µl
12.5 µl
0.25 µl
0.25 µl


+ Giữ nguyên quy trình nhiệt, thay đổi nhiệt độ bắt cặp:
Các
nhiệt

bước
950C
950C
520C
720C
720C
40C

Thời gian

Số lần lặp lại

10 phút
30 giây
30 giây
30 giây
10 phút
∞

1 lần

30 lần
1 lần

Kết quả điện di PCR khuẩn lạc lần 2

Hình 5. Kết quả điện di gel agarose lần 2
(L: Ladder có kích thước từ 100 bp – 1013bp; 1-10: Sản phẩm PCR khuẩn lạc vi khuẩn
chứa gen mục tiêu; 11-12 : Đối chứng dương : Sinh khối sau khi ly tâm dịch vi khuẩn được
cấy trong môi trường LB lỏng chứa Amp)
Thảo luận kết quả
- Sau khi thay đổi một số điều kiện của phản ứng PCR colony, nhìn vào bản gel sau khi điện
di ta thấy ở giếng số 4 và số 10 xuất hiện các band, điều chứng tỏ gen mục tiêu đã được chèn
thành công vào plasmid ở các khuẩn lạc này. Ước tính kích thước plasmid chứa đoạn gen ở
giếng số 10 khoảng 900bp.
- Ở các giếng cịn lại (ngoại trừ ladder) khơng xuất hiện band nào, kết luận các plasmid
không được chèn thành công gen mục tiêu ở các khuẩn lạc này.

BÀI 3


PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA PLASMID TỪ TẾ BÀO
VI KHUẨN
I. Nguyên tắc

Quá trình chuyển gen đưa plasmid vào tế bào vi khuẩn là một bước quan trọng trong quy
trình tạo dòng giúp chọn lọc và nhân bản plasmid. Với những dịng vi khuẩn đã được sàng
lọc, tuyển chọn, việc ni cấy và tách chiết plasmid sẽ cho phép thu nhận một lượng lớn
plasmid để dùng cho các bước tiếp theo trong quy trình tạo dịng. Thơng thường, sinh khối vi
khuẩn sẽ được ly giải kiềm giúp giải phóng plasmid khỏi tế bào. Một bước xử lý acid hóa
nhanh bằng dung dịch kali acetate đậm đặc sẽ cho phép kết tủa protein và DNA nhiễm sắc

thể. DNA plasmid ở trạng thái siêu cuộn xoắn, vẫn ở trong dung dịch và có thể được giữ lại
trên cột silica spin. DNA plasmid được rửa bằng dung dịch ethanol va sau đó được rửa giải
trong nước hoặc đệm TE.

10 mL dung dịch vi khuẩn chứa plasmid mục tiêu (pha lag)

Hút 1 mL dịch nuôi cấy

Hình 6. Quy trình tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi khuẩn dùng cột silica spin
II. Vật liệu:

Ly tâm ở 11000 rpm
trong 5 phút

- Sinh khối vi khuẩn nuôi cấy ở pha lag
- Bộ kit tách DNA plasmid
- Gel agarose 1.5% / 1 tấm

Thu cặn tế bào
Loại bỏ dịch nổi

III. Quy trình thí nghiệm:

Cho 250 mL PL1 buffer + 10 µl RNase A vào tube chứa 1.5 mL cặn tế bào

Vortex
1. Quy trình thu nhận sinh khối vi khuẩn tách chiết DNA plasmid từ sinh khối vi
khuẩn bằng bộ kit:
Thêm 250 µl PL2 buffer

Đảo tube 6-8 lần



Ủ ở nhiệt độ phịng khoảng 5
phút
Thêm 350 µl PL3 buffer

Đảo tube 6-8 lần

Ly tâm ở 11000 rpm
trong 5 phút
Chuyển tối đa 600 µl sang cột silica

Ly tâm ở 11000 rpm
trong 2 phút

Giữ lại cột

Loại bỏ chất lỏng bên dưới

Ly tâm ở 11000 rpm
trong 2 phút

Giữ lại cột

Đặt cột vào tube cũ
Thêm 500 µl WB1 buffer

Ly tâm ở 11000 rpm

trong 2 phút

Loại bỏ chất lỏng bên dưới


Giữ lại cột
Loại bỏ chất lỏng bên dưới
Đặt cột vào tube cũ
Ly tâm ở 11000 rpm
Thêm 500
trongµl2WB2
phút buffer

Giữ lại cột
Loại bỏ chất lỏng bên dưới
Ly tâm ở 11000 rpm
trong 30 giây
Chuyển cột sang tube mới
Thêm 50 µl EB buffer

Ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 1 phút

Ly tâm ở 11000 rpm
trong 1 phút


Thu dịch chứa DNA

Đo OD
Bảo quản DNA plasmid ở -20ºC

2. Điện di kiểm tra kết quả tách chiết DNA plasmid:


Chuẩn bị bản gel agarose 1.5%

Nạp khoảng 25 µl dung dịch DNA plasmid + GLB
vào gel

Điện di DNA plasmid ở 100V
trong 30 phút

IV. Kết quả thí nghiệm:
Quan sát, xác định chất lượng và kích thước
1. Kết quả đo OD:

DNA plasmid

Hình 7. Kết quả nồng độ dung dịch DNA plasmid
2 . Kết quả điện di:


Hình 8 . Kết quả điện di DNA plasmid
(L: Ladder 100bp-1013bp, 1-2: Sản phầm tách chiết DNA plasmid)
V. Thảo luận
Từ kết quả trên ta thấy:
- Sau khi tiến hành tách chiết, thu được DNA plasmid với nồng độ rất thấp lần lượt là 46 và
55 µg/mL. Ngun nhân có thể do trong q trình thực hiện thí nghiệm, lượng buffer khơng
đủ so với dự tính, nhiệt độ ủ ở điều kiện phịng khơng phù hợp,…
- Nhìn vào bản gel, ta thấy chỉ có xuất hiện một vệt band dài ở giếng thang chuẩn

(marker/ladder), đồng thời các giếng còn lại trên bản gel khơng xuất hiện bất kì band nào
khác. Vì vậy, có thể nói điện di DNA plasmid đã thất bại, nguyên nhân lớn nhất dẫn đến kết
quả này có lẽ do nồng độ DNA plasmid thu được quá thấp hoặc do thuốc thử safeview bị
hỏng,…
 Bổ sung kết quả thực hiện lần 2
Do nồng độ DNA plasmid quá thấp nên nhóm thực hành tiến hành thực hiện tách chiết DNA
plasmid lần 2
Kết quà đo OD:

Hình 9. Kết quả nồng độ dung dịch DNA plasmid lần 2


Kết quả điện di:

1013bp

L

Uncut

Cut1

Cut2

300bp

Hình 10. Kết quả điện di DNA plasmid lần 2
(L: Ladder 100bp- 1013bp, Uncut: Sản phầm tách chiết DNA plasmid với
nồng độ 68 µg/ml)
Thảo luận kết quả:

- Sau khi thực với tách DNA plasmid lần 2, ta thu được DNA plasmid với nồng độ cao hơn
lần lượt là 63 và 68 µg/ml nhưng vẫn ở mức độ thấp so với DNA plasmid thơng thường.
- Nhìn vào bản gel, ta thấy chỉ có xuất hiện một vệt band dài ở giếng thang chuẩn
(marker/ladder) giống như kết quả lần đầu, đồng thời các giếng còn lại trên bản gel khơng
xuất hiện bất kì band nào khác.



BÀI 4
CẮT DNA BẰNG ENZYME CẮT GIỚI HẠN (RESTRICTION
ENZYME)
I. Nguyên tắc
Enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme-RE) là enzyme cắt DNA tại vị trí nhận biết đặc hiệu
để tạo đầu bằng (blunt end) hoặc đầu dính (sticky end). Trong phương pháp tạo dòng truyền
thống, RE được sử dụng để cắt các DNA tạo các đầu tương hợp giúp kết hợp chúng với nhau
tạo DNA tái tổ hợp. Nguồn DNA sử dụng trong tạo dịng rất đa dạng, có thể là DNA tách
chiết từ tế bào vi khuẩn hoặc từ quần thể vi sinh vật, hoặc là dòng DNA cần được chuyển từ
vector này sang vector khác (subcloning). RE cũng được sử dụng để tạo các đầu tương hợp
cho sản phẩm PCR. Trong tất cả các trường hợp, một hay nhiều RE được sử dụng để cắt
DNA giúp chèn có định hướng hoặc khơng định hướng vào plasmid tương thích.
DNA bộ gene (genome), từ bất kỳ nguồn nào, cũng thường được cắt với RE tại vị trí nhận
biết đặc trưng gồm 6-8 base liên tiếp, là dạng vị trí nhận biết với tần suất trong genome ít
hơn so với vị trí nhận biết 4 base, dẫn đến tạo các phân đoạn DNA có kích thước lớn. Kích
thước của các đoạn chèn mong muốn của thư viện dòng nhân bản sẽ quyết định loại enzyme
và điều kiện của phản ứng cắt. Thông thường, một chuỗi các độ pha loãng của enzyme được
lựa chọn thường được sử dụng để phân cắt nguồn vật liệu khởi đầu, sau đó kích thước các
đoạn chèn các đoạn chèn mong muốn được phân tách bằng điện di trên gel agarose. Phương
pháp chuẩn bị này tạo các phần đoạn DNA có kích thước mong muốn với các đầu tương
thích với các vector đã lựa chọn.
Thơng thường, quy trình subcloning yêu cầu sử dụng 1-2 RE cắt ngay bên ngoài đoạn chèn

mà khơng cắt trong chính đoạn chèn. Các RE, có một vị trí nhận biết trong vùng đa điểm tạo
dòng (multi cloning sites-MCS), thường được chọn sử dụng khi chúng khơng cắt vị trí khác
trong DNA vector và thường tạo ra hai phân đoạn dễ tách biệt. Gene mục tiêu được tạo dòng
vào một vector với mục tiêu nâng cao hiệu quả biểu hiện thành protein hoặc giúp sàng lọc
gene. Trong những trường hợp này, gene mục tiêu cần phải được gắn chèn vào đúng hướng
và năm trong khung đọc với promoter phiên mã.
Phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ enzyme polymerase (Polymerase Chain Reaction - PCR)
thường được sử dụng để khuếch đại gene hay phân đoạn DNA của gene mục tiêu, từ bất kỳ
nguồn DNA nào, để tạo dịng. Để tạo các đầu tương thích, thường trình tự nhận biết của RE
sẽ được thêm vào đầu 5' của cả hai mồi PCR. Hơn nữa, để tạo hiệu quả gắn kết và cắt của
RE, một số gốc base cũng sẽ được thêm vào phía trước và phía sau điểm nhận biết ở đầu 5'.
Khi chọn vị trí cắt giới hạn để thêm vào trình tự mồi, điều quan trọng là xác định vị trí cắt
phải tương hợp với vector, chiều của các đoạn chèn và vị tri cắt không xảy ra trong gene
hoặc trong phân đoạn DNA.


II. Vật liệu và phương pháp

1. Vật liệu
-

Plasmid pET11a: 10µl
EcoRI: 10µl
BamHI: 10µl
Buffer 10X: 10µl
Gel agarose 1.5%: 1 tấm
DNA marker 100bp: 5µl

2. Phương pháp
-

Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI
Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với 2 enzyme là EcoRI và BamHI

III. Quy trình thí nghiệm

1. Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với enzyme BamHI

Chuẩn bị eppendorf

rộn nhẹ bằng micropipette

Trộn nhẹ bằng micropipette

Ủ ở 370C trong 60 phút


16µl DNA

2µl

Điện di ở 100 voltage trong 60 phút

Chuẩn b

rộn
nhẹ sát
bằng
Quan
vàmicropipette

so sánh

Ủ, ở 370C trong 60 phút

Nạp thang chuần

Nạp mẫu phản ứng cắt
14,5µl mẫu khơng cắt và 3µl loadin
20µl mẫu cắt bằng 1 enzyme và 4µ
20µl mẫu cắt bằng 2 enzyme và 4µ

Chuẩn bị bản gel agarose 1.5%

2. Thực hiện phản ứng cắt plasmid DNA với 2 enzyme là EcoRI và BamHI
3. Điện di kiểm tra kết quả cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn

IV.

Kết quả thí nghiệm:


Sau khi điện di bản gel agarose 1.5% ở 100 voltage trong 60 phút , ta thu được kết quả như
hình bên dưới

Hình 11. Kết quả điện di trên gel agarose (L: Ladder 100bp-1013bp; 1-2: DNA plasmid
không cắt; 3-4: DNA plasmid được cắt bởi BamHI; 5-6: DNA plasmid được cắt bởi 2
enzyme EcoRI + BamHI và EcoRI + PstI; 7-8: DNA plasmid khơng cắt nhóm sáng)
V. Thảo luận
- Sau khi có được kết quả điện di, nhận thấy các vạch điện di xuất hiện không rõ ràng, không
phân đoạn tách biệt. Ở DNA marker dùng làm mẫu nên xuất hiện rõ ràng hơn cắt plasmid

của mẫu thí nghiệm, điều này khó xác định được sự phân cắt của hai phản ứng cắt enzyme
cắt giới hạn. Vì thế khơng so sánh được khả năng cắt plasmid bằng RE so với plasmid chưa
được cắt.
- Sau khi điện di, các vạch điện di xuất hiện khơng rõ ràng có thể là do tỉ lệ đổ bản gel
agarose không phù hợp ảnh hưởng đến sự di chuyển của các đoạn DNA trong môi trường
diện di, hay cũng có thể do dung dịch điện di không đạt chuẩn ảnh hưởng đến kết quả.
VI. Trả lời câu hỏi
Vì sao phản ứng cắt plasmid DNA với một enzyme giới hạn lại sử dụng enzyme BamHI mà
không sử dụng enzyme EcoRI?
Trả lời: Bởi vì vị trí nhận biết để phân cắt của enzyme BamHI có vị trí là 319bp nằm gần
hơn nhiều so với vị trí nhận biết của enzyme EcoRI (5675bp) vì thế hiệu quả cắt của enzyme
BamHI trên plasmid sẽ dễ dàng hơn.
 Bổ sung kết quả thực hiện lần 2
Thực hiện cắt DNA bằng enzyme cắt giới hạn với nồng độ DNA plasmid cao hơn (68 µg/ml)