CHUẨN HOÁ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH GENE SOD1 Ở TẾ BÀO ỐI BÀ MẸ MANG THAI NGHI HỘI CHỨNG DOWN- LUẬN VĂN CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC

LỄ BẢO VỆ KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC

BỘ MƠN HỐ SINH

Hà Nội -2009

© www.kythuatyhoc.com


TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN NGỌC DŨNG
CHUẨN HOÁ KỸ THUẬT PHÂN TÍCH GENE SOD1
Ở TẾ BÀO ỐI BÀ MẸ MANG THAI
NGHI HỘI CHỨNG DOWN
LUẬN VĂN CỬ NHÂN KỸ THUẬT Y HỌC
Người hướng dẫn:
TS. Đặng Thị Ngọc Dung
Hà Nội -2010
© www.kythuatyhoc.com


ĐẶT VẤN ĐỀ
CĐTS:
Vấn đề cả xã hội quan tâm nhằm nâng cao
CLDS
KT hỗ trợ: Nhiều KT trong đó có KT PCR, CĐ
bệnh DT ở mức độ phân tử
HC Down:
Là 1 trong số các bệnh DT hay gặp

Có nhiều cách CĐTS HC Down, thông qua TB ối
là phương pháp phổ biến hiện nay
© www.kythuatyhoc.com


MỤC TIÊU
1. Chuẩn hóa quy trình tách chiết DNA
từ tế bào ối của phụ nữ mang thai.
2. Tối ưu hóa phản ứng PCR với gene
SOD1 ở BN mang hc Down với BN
chứng.

© www.kythuatyhoc.com


TỔNG QUAN
HC Down:

Là BTBS hay gặp trong các bệnh RL NST
Dị tật ở tim (46%), bất thường về ống tiêu hóa (7%),

bệnh Leukemia cấp (3%), 10% động kinh, 11%
Alzheimer’s ở tuổi 50 và 77% ở tuổi 70, IQ< 50

Khoảng 92% thể 3 nhiễm 21 thuần, 2%-3% thể khảm,
4%-5% thể chuyển đoạn
© www.kythuatyhoc.com


TỔNG QUAN

CĐTS HC Down:
Thông dụng : triple test, siêu âm, sinh thiết tua
rau,…
Hiện nay : phân tích TB ối cho kết quả chính xác
và độ tin cậy cao bằng cách nhuộm băng NST và
PCR phân tích gene SOD-1.

© www.kythuatyhoc.com


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NC
1. Đối tượng NC

Bà mẹ mang thai BT ( 4 mẫu ).
Bà mẹ mang thai đã được chẩn đoán trước sinh

thai bị Down ( 1 mẫu ).
Các mẫu TB ối này đều lấy từ các phụ nữ trong độ
tuổi từ 37-43, được nuôi cấy và bảo quản ở -200C
tại Bộ mơn Di truyền Trường ĐHYHN
© www.kythuatyhoc.com


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NC
2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu mơ tả
Hố chất:
Lysis Buffer, pH7,5
Dung dịch K, pH8

Proteinase K: 10 mg/ml
SDS: 10%

Phenol: Chloroform: Isoamyl (25: 24: 1)
Chloroform: Isoamyl (24:1)
Natriacetat: 3 M, 100ml

© www.kythuatyhoc.com


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NC
Ethalnol: 100% và 70%

Thạch Agarose
Nước cất 2 lần đã hấp tiệt trùng
Taq polymerase
dNTP
Primer

Loading eye 6X
Ethidium Bromide
Dung dịch hịa tan DNA
© www.kythuatyhoc.com


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NC
Quy trình tách chiết DNA:
B1: Rửa TB ối

B2: Phá vỡ màng TB ối

B3: Thu DNA
B4: Tủa DNA
B5: Làm sạch, hịa tan DNA và bảo quản

© www.kythuatyhoc.com


ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NC
Kỹ thuật đánh giá kết quả tách chiết:

Đo mật độ quang: Độ tinh sạch và [DNA]
Điện di DNA tổng số: Chất lượng DNA

Chạy PCR với mồi của gene GAPDH: Chất
lượng, độ đặc hiệu của DNA
Phương pháp SHPT sử dụng kỹ thuật PCR:
Tiến hành chạy PCR với primer của gene
SOD-1

© www.kythuatyhoc.com


MƠ HÌNH NGHIÊN CỨU
TÁCH DNA

ĐO OD

NỒNG ĐỘ VÀ ĐỘ
TINH SẠCH

ĐiỆN DI DNA
TỔNG SỐ

HÌNH ẢNH
THU ĐƯỢC

PCR VỚI GENE
SOD-1

ĐiỆN DI SẢN
PHẨM PCR

PCR VỚI GENE
GAPDH

ĐiỆN DI SẢN
PHẨM PCR

HÌNH ẢNH THU
ĐƯỢC

HÌNH ẢNH THU
ĐƯỢC

KẾT LUẬN
© www.kythuatyhoc.com

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Sau khi đã điều chỉnh quy trình :
Điều chỉnh số vịng ly tâm

Chuyển từ ly tâm thường sang điều kiện ly
tâm lạnh

Chúng tôi thu được một số kết quả sau

© www.kythuatyhoc.com


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Bảng đo mật độ quang DNA
Mẫu

Giá tr OD

1

2

3

4

5

Nng
(àg/ml)

87

98

137

120

124

tinh sch
(OD260/OD280)

0,9667

0,9635

0,9831

0,9756

0,9818

â www.kythuatyhoc.com

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

2. Kết quả điện di DNA tổng số

1

2

3

4

5

© www.kythuatyhoc.com


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3. Kết quả điện di sản phẩm PCR với mồi GAPDH
1

2

3

M

© www.kythuatyhoc.com

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

4. Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với primer

SOD-1 lần 1 :
3

4

5

M

© www.kythuatyhoc.com


KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
• 4. Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với
primer SOD-1 lần 2 :
3
4
5
M

© www.kythuatyhoc.com


KẾT LUẬN
1. KT tách chiết DNA từ TB ối theo quy trình
trên đã có sự thay đổi là rất phù hợp, vì

lượng DNA thu được nhiều hơn mà vẫn
giữ được chất lượng của DNA.

© www.kythuatyhoc.com


KẾT LUẬN
2. Việc tối ưu hóa phản ứng PCR đã cho kết
quả phân tích exon 3 của gene SOD-1 rõ
ràng, dễ dàng, góp phần phục vụ chẩn
đốn trước sinh hội chứng Down.
© www.kythuatyhoc.com