Luận văn nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá trình bảo quản sản phẩm

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2. 1. Danh mục hóa chất sử dụng trong nghiên cứu ........................................23
Bảng 2. 2. Các dung dịch sử dụng trong nghiên cứu ................................................24
Bảng 2. 3. Công thức các môi trường nuôi cấy vi sinh vật .......................................25
Bảng 2. 4. Chủng vi sinh vật làm chứng dương tính cho phép thử vi sinh ...............27
Bảng 2. 5. Các máy móc thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .....................................28
Bảng 2. 6. Thành phần gel polyacrylamide 12,5% ...................................................35
Bảng 2.7. Lượng vi khuẩn gram âm dung nạp mật có trong chế phẩm ....................36
Bảng 2. 8. Hướng dẫn đọc kết quả kit API 20 E ....................................................... 40
Bảng 3. 1. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu
được bằng kết tủa phân đoạn.....................................................................................43
Bảng 3. 2. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme tủa
amonium sulphate .....................................................................................................45
Bảng 3. 3. Hàm lượng protein và hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn
enzyme sau khi qua cột sephadex G100 ...................................................................48
Bảng 3. 4. Tóm tắt q trình tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế ..............51
Bảng 3. 5. Hoạt tính thủy phân casein của các mẫu trước và sau khi tinh sạch .......51
Bảng 3. 6. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm enzyme lumbrokinase ............52
Bảng 3. 7. Tổng số vi sinh vật hiếu khí (CFU/g) của sản phẩm sau .........................54
Bảng 3. 8. Tổng số vi nấm (CFU/g) của sản phẩm sau thời gian bảo quản ..............55
Bảng 3. 9. Kết quả thử giới hạn nhiễm khuẩn chế phẩm LK theo dược điển Việt
Nam 5 dành cho thuốc uống có nguồn gốc tự nhiên .................................................64


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1. 1. Cơ chế hoạt hố plasminogen ....................................................................9
Hình 1. 2. Vai trị của antiplasmin trong cơ chế điều hịa cục máu đơng ...................9
Hình 1. 3. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các loài giun đất .............13
Hình 1. 4. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase ........................................................ 14
Hình 2. 1. Đường chuẩn plasmin ..............................................................................32

Hình 2. 2. Đường chuẩn BSA ...................................................................................33
Hình 2. 3. Đường chuẩn tyrosine .............................................................................. 34
Hình 3. 1. (A) Hình ảnh giun quế Perionyx escavatus sử dụng trong nghiên cứu; (B)
Hoạt tính thủy phân đĩa fibrin của mẫu dịch nghiền .................................................42
Hình 3. 2. (A) Hoạt tính thủy phân fibrin của mẫu enzyme thu được bằng kết tủa
phân đoạn; (B) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch bằng kết tủa phân đoạn ..............44
Hình 3. 3. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tủa amonium sulphate ; (B) Hoạt tính thủy
phân fibrin của mẫu enzyme tủa amonium sulphate pha lỗng 10 lần .....................46
Hình 3. 4. Sắc kí đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex
G100 ..........................................................................................................................47
Hình 3. 5. Hoạt tính thủy phân fibrin của các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau
khi qua cột sephadex G100 .......................................................................................47
Hình 3. 6. Điện di đồ các phân đoạn enzyme lumbrokinase sau khi qua cột sephadex
G100 ..........................................................................................................................49
Hình 3. 7. (A) Điện di đồ mẫu enzyme tinh sạch qua cột cut – off ; (B): Hình ảnh
đánh giá bằng phần mềm dolphin 1D .......................................................................50
Hình 3. 8. Hoạt tính thủy phân fibrin của sản phẩm lumbrokinase mẻ 1 ở thời điểm
ban đầu .....................................................................................................................53
Hình 3. 9. Tổng số vi sinh vật hiếu khí trên môi trường thạch casein đậu tương ở
nồng độ 10-3 của sản phẩm mẻ 2 sau bảo quản 3 tháng ở nhiệt độ phịng ................54
Hình 3. 10. Tổng số vi nấm trên môi trường thạch Sabouraud dextrose ở nồng độ
10-1 của sản phẩm mẻ 1 sau bảo quản 1 tháng ở 40C ................................................55
Hình 3. 11. Hình ảnh mẫu thử trong mơi trường tăng sinh Enterobacteria –Mossel 56
Hình 3. 12. Mẫu thử trên mơi trường muối mật violet-red .......................................57
Hình 3. 13. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên mơi trường Mac-Conkey agar ........58


Hình 3. 14. Hình ảnh tế bào vi sinh vật trên mơi trường Mac-conkey ở ..................58
Hình 3. 15. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch Levine - eosin xanh methylen ...........................................................................................................59
Hình 3. 16. Hình ảnh vi sinh vật trên kit API 20E ....................................................59

Hình 3. 17. Kết quả kit API 20 E trên phần mềm API WEB....................................60
Hình 3. 18. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên mơi trường thạch muối Manitol ......61
Hình 3. 19. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch muối xylose – lysin
– desoxycholat ...........................................................................................................62
Hình 3. 20. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường thạch xanh brilliant ......62
Hình 3. 21. Hình ảnh vi sinh vật phân lập trên môi trường ......................................63


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt

Viết đầy đủ

APS

Ammonium persulfate

BSA

Bovine serum albumin (albumin huyết thanh bò)

Cs

Cộng sự

CFU

Colony forming unit (đơn vị tạo thành khuẩn lạc)

EDTA

Ethylene diamine tetraacetic acid

kDa

Kilo dalton

M

Marker (Thang chuẩn)

OD

Optical density (Mật độ quang học)

LK

Lumbrokinase

SDS

Sodium dodecyl sulfate

SDS- PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

TCA

Trichloroacetic acid

t-PA

Tisue plasminogen activator

TEMED

N, N, N', N'-Tetramethylethylenediamine

u-PA

Urokinase plasminogen activator

WHO

World Health Organization (Tổ chức Y tế thế giới)


1

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
MỤC LỤC ................................................................................................................... 1
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................... 3
TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................................... 5
1.1. CÁC BỆNH TẮC MẠCH MÁU NÃO ............................................................ 5

1.1.1. Sơ lược tình hình chung về bệnh tắc nghẽn mạch máu ............................. 5
1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân bệnh tắc nghẽn mạch máu ............................. 5
1.1.3. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối ............................................... 7
1.1.4. Một số thuốc điều trị huyết khối .............................................................. 10
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE ....................................... 12
1.2.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase ...................... 12
1.2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới ..................... 14
1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam ....................... 17
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC PHẨM
CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI................................................ 18
CHƯƠNG 2 .............................................................................................................. 23
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 23
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU .................................................................................... 23
2.1.1. Nguyên liệu .............................................................................................. 23
2.1.2. Hóa chất ................................................................................................... 23
2.1.3. Các dung dịch và đệm.............................................................................. 23
2.1.4. Môi trường nuôi cấy vi sinh vật............................................................... 25
2.1.5. Chủng vi sinh vật ..................................................................................... 27
2.1.6. Máy móc và thiết bị ................................................................................. 27
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................... 28
2.2.1. Lựa chọn nguồn nguyên liệu và chuẩn bị mẫu enzyme thô .................... 28


2

2.2.2. Các phương pháp tinh sạch lumbrokinase ............................................... 29
2.2.3. Xác định hoạt tính thủy phân fibrin ......................................................... 31
2.2.4. Xác định hàm lượng protein .................................................................... 32
2.2.5. Xác định hoạt tính thủy phân casein ........................................................ 33
2.2.6. Điện di biến tính protein trên gel polyacrylamide ................................... 34

2.2.7. Thử giới hạn nhiễm khuẩn ....................................................................... 35
2.2.8. Định danh vi khuẩn bằng Kit API 20 E ................................................... 39
2.2.9. Xử lý số liệu ............................................................................................. 41
CHƯƠNG 3 .............................................................................................................. 42
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................................. 42
3.1. LỰA CHỌN NGUỒN NGUYÊN LIỆU TỪ GIUN QUẾ PERIONYX
ESCAVATUS.......................................................................................................... 42
3.2. NGHIÊN CỨU CÁC PHƯƠNG PHÁP TINH SẠCH LUMBROKINASE . 43
3.2.1. Tủa phân đoạn bằng dung môi hữu cơ .................................................... 43
3.2.2. Tủa phân đoạn bằng kết tủa muối amonium sulphate ............................. 44
3.2.3. Tinh sạch bằng phương pháp sắc ký lọc gel ............................................ 46
3.2.5. Thử hoạt tính thủy phân casein ................................................................ 51
3.3. KIỂM TRA SỰ NHIỄM KHUẨN TRONG SẢN PHẨM ENZYME
LUMBROKINASE KHI BẢO QUẢN Ở NHIỆT ĐỘ VÀ THỜI GIAN KHÁC
NHAU.................................................................................................................... 53
3.3.1. Tổng số vi sinh vật hiếu khí và vi nấm .................................................... 53
3.3.2. Tổng số vi khuẩn Gram âm dung nạp mật............................................... 56
3.3.3. Tìm vi khuẩn gây bệnh ............................................................................ 57
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ................................................................................... 65
KÊT LUẬN ........................................................................................................... 65
KIẾN NGHỊ........................................................................................................... 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 66
PHỤ LỤC 1
PHỤ LỤC 2
PHỤ LỤC 3
PHỤ LỤC 4
CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ


3

MỞ ĐẦU
Rối loạn tim mạch và mạch máu dẫn đến khoảng 26 triệu ca tử vong
mỗi năm trên toàn thế giới. Các rối loạn tim mạch và não không chỉ có tỷ lệ tử
vong cao trên tồn cầu mà cịn dẫn đến các biến chứng sau đó như tan huyết
khối có thể ảnh hưởng xấu hoặc đe dọa tính mạng như nhồi máu cơ tim, huyết
khối tĩnh mạch não và huyết khối tĩnh mạch [1]. Trên 80% các ca tử vong xảy
ra tại các nước có thu nhập thấp và trung bình. Tại các nước đang phát triển
bệnh tim mạch ngày càng gia tăng cùng với sự phát triển của xã hội [2]. Tại
Việt Nam, theo thống kê của hội tim mạch, có khoảng 16% dân số mắc các
bệnh tim mạch và đột quỵ. Có nhiều nguyên nhân gây ra các bệnh tim mạch
như: cao huyết áp, tràn mạch máu não, xơ cứng động mạch. Trong số các
bệnh nhân bị tai biến mạch máu não thì có đến 24% tử vong, 50% sống nhưng
bị các di chứng nặng hoặc nhẹ, chỉ có 26% bệnh nhân sống và làm việc bình
thường. Nguyên nhân chủ yếu là do cục máu đông gây tắc động mạch và cản
trở lưu thơng máu, do đó việc làm tan cục máu đơng đóng vai trị rất quan
trọng trong việc điều trị các bệnh này. Việc nghiên cứu, bào chế các thuốc để
phục vụ điều trị các bệnh tim mạch là nhiệm vụ cấp thiết và vô cùng quan
trọng. Các thuốc tan huyết khối hiện nay chủ yếu là nhập ngoại, một số dạng
là thuốc tiêm, gây khó khăn cho người sử dụng, giá thành cao và có nhiều tác
dụng phụ khơng mong muốn, nên việc nghiên cứu, bào chế tạo ra một sản
phẩm sử dụng đường uống, an toàn, hiệu quả, giá thành rẻ là nhu cầu cấp
thiết.
Mihara và cs (1991) đã nghiên cứu và thu nhận thành cơng một enzyme
có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, bao gồm 6
izozyme được đặt tên chung là lumbrokinase. Lumbrokinase có khả năng thủy
phân rất mạnh các sợi fibrin - một loại protein có trong máu để làm tan cục
máu đông. Lumbrokinase được xem là thuốc tan huyết khối đặc hiệu, sử dụng
làm thuốc uống vì có thể hấp thu từ ruột vào máu và hoạt hóa hệ thống fibrin
nội sinh [3], [4], [5]. Một ưu điểm lớn của lumbrokinase so với các thuốc điều

trị bệnh tắc nghẽn mạch thông dụng khác là không có tác dụng phụ, khơng
gây chảy máu hệ thống.


4

Lumbrokinase có tác dụng trực tiếp thủy phân fibrin, làm tan cục máu
đơng, trong khi các chất hoạt hóa khác vẫn đang được sử dụng như tPA (tisue
plasminogen activator) để có tác dụng phải hoạt hóa plasminogen thành
plasmin, sau đó plasmin mới có khả năng thủy phân fibrin, ngồi ra
lumbrokinase cũng có tác dụng hoạt hóa như tPA. Nhờ có tác dụng kép như
vậy nên lumbrokinase cho hiệu quả cao.
Xuất phát từ tình hình thực tiễn trên, chúng tơi thực hiện đề tài
“Nghiên cứu tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun quế làm nguyên liệu
tạo thực phẩm chức năng và xác định mức độ nhiễm vi sinh vật trong quá
trình bảo quản sản phẩm” với mục tiêu tạo ra được sản phẩm lumbrokinase
chất lượng cao và đánh giá độ an toàn của sản phẩm. Với đề tài trên, chúng
tôi tập trung giải quyết các vấn đề sau:
(1) Nghiên cứu phương pháp tinh sạch enzyme lumbrokinase từ giun
quế làm nguyên liệu tạo thực phẩm chức năng.
(2) Tạo nguyên liệu và xác định chỉ tiêu vi sinh vật trong sản phẩm
lumbrokinase trong quá trình tạo sản phẩm


5

CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. H ỘI CHỨNG TẮC MẠCH MÁU NÃO
1.1.1. Sơ lược về hội chứng tắc nghẽn mạch máu

Hội chứng tắc nghẽn mạch máu (huyết khối) gây ra rối loạn tim mạch
và tai biến mạch máu não là một trong những nguyên nhân gây tử vong hàng
đầu trên thế giới. Liên đoàn tim mạch thế giới đưa ra thống kê cứ ba người thì
có một người tử vong trong đó có một người tử vong vì bệnh tim mạch. Ở Mỹ
cứ 29 giây có một người bị bệnh mạch vành, và cứ 1 phút thì có một người tử
vong. Tử vong do bệnh tim mạch chiếm 42% toàn bộ các ca tử vong, phí tổn
do bệnh này chiếm 128 tỉ USD mỗi năm. Theo thống kê của Hội Đột quỵ Mỹ,
cứ mỗi 45 giây trôi qua, trên thế giới có ít nhất một người bị đột quỵ. Và cứ 3
phút trơi qua, thế giới lại có một người tử vong do đột quỵ. Tại Việt Nam,
mỗi năm có khoảng 200.000 người bị đột quỵ, khoảng 50% trong số đó tử
vong. Nếu như trước đây, đột quỵ thường gặp ở những người tuổi từ 50 trở
lên thì hiện nay, bệnh ngày càng trẻ hóa. Theo thống kê tại các bệnh viện, tỷ
lệ đột quỵ ở người trẻ tuổi đang có xu hướng tăng lên, trung bình khoảng 2%
mỗi năm.
Hiện nay trên thế giới số người chết hoặc chịu di chứng nặng nề từ các
bệnh tim mạch và tai biết mạch máu não ngày càng gia tăng, nhất là các nước
đang phát triển. Ngồi ra cịn có rất nhiều bệnh liên quan đến tắc nghẽn mạch
máu não như: tràn máu não, nhồi máu cơ tim, tắc động mạch phổi. Nguyên
nhân chủ yếu của các bệnh trên là do các cục máu đơng làm tắc nghẽn mạch
máu. Do đó để hạn chế thấp nhất tỉ lệ tử vong và các biến chứng do bệnh tim
mạch gây ra, các nhà khoa học đã đi theo hướng xử lý các huyết khối hình
thành trong thành mạch. Và việc làm tan cục máu đông đóng vai trị quan
trọng trong việc điều trị bệnh tim mạch.
1.1.2. Khái niệm và nguyên nhân của hội chứng tắc nghẽn mạch máu
Hội chứng tắc nghẽn mạch máu là một chứng bệnh cục máu đông được


6

tạo thành do fibrin bị đóng cục lưu giữ trong mạch gây tắc mạch và cản trở

lưu thông máu. Hội chứng huyết khối tác động lên cả hệ thống tĩnh mạch
(thuyên tắc - huyết khối tĩnh mạch) và hệ thống động mạch (huyết khối động
mạch do xơ vữa) [6].
Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch
Thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch, là sự tắc nghẽn tĩnh mạch do máu
cục máu đông, là bệnh tim mạch phổ biến thứ ba ở những nước phương Tây.
Hàng năm có 0,1% dân số thế giới mắc bệnh này. Biểu hiện phổ biến nhất của
thuyên tắc-huyết khối tĩnh mạch là huyết khối tĩnh mạch sâu, hiện tượng này
xảy ra khi có một cục máu đơng hình thành trong lịng các tĩnh mạch sâu của
chi dưới. Đây là một bệnh lý phổ biến ở những bệnh nhân lớn tuổi nằm liệt
giường, những bệnh nhân sau phẫu thuật không thể cử động trong một thời
gian dài cũng như những bệnh nhân vừa trải qua một cuộc đại phẫu, hay phẫu
thuật chỉnh hình. Bệnh này cũng có thể xảy ra ở những bệnh nhân có bệnh di
truyền dẫn đến đơng máu bất thường, xảy ra ở người già, những phụ nữ trẻ
cũng khơng miễn nhiễm, đặc biệt trong thời kì sinh đẻ [7]. Hậu quả nghiêm
trọng nhất của huyết khối tĩnh mạch sâu là thuyên tắc động mạch phổi. Tắc
mạch phổi xảy ra khi cục máu đơng hay một mảnh của nó bong ra và di
chuyển đến phổi và gây ra tình trạng tắc nghẽn mạch máu phổi. Thuyên tắc
phổi là bệnh lý rất nghiêm trọng với tỉ lệ tử vong rất cao.
Huyết khối động mạch do xơ vữa
Huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra khi cục máu đơng hình thành
trên nền của một mảng xơ vữa ở thành động mạch. Khi mảng xơ vữa bị vỡ ra,
tại những chỗ đó máu sẽ bị hoạt hóa và đơng cục gây tắc động mạch [6]. Đây
là một bệnh rất nguy hiểm vì nếu cục máu đơng này phát triển và làm tắc
nghẽn hồn tồn, động mạch bị tổn thương, thì máu qua động mạch này sẽ
ngừng chảy và mô bên dưới do động mạch này cung cấp máu sẽ rơi vào nguy
cơ bị thiếu máu, đôi khi dẫn đến hậu quả là đe dọa tính mạng người bệnh.
Nếu huyết khối động mạch do xơ vữa xảy ra tại những động mạch cung cấp
máu cho tim, hiện tượng này tạo ra hội chứng động mạch vành cấp hoặc

7

những cơn đau tim. Tương tự, nếu bệnh lý này xảy ra tại những động mạch
cung cấp máu cho não thì những cơn đột quỵ do thiếu máu cục bộ sẽ xảy ra.
Bệnh động mạch ngoại biên xảy ra khi huyết khối động mạch do xơ vữa tác
động lên các động mạch chi dưới. Bệnh huyết khối động mạch do xơ vữa
đang gia tăng chủ yếu do lối sống hiện đại của chúng ta.
1.1.3. Cơ chế đông máu và cơ chế tan huyết khối
Sinh lý học hoàn chỉnh của sự hình thành cục máu đơng fibrin là một
q trình tương đối dễ hiểu. Một cục máu đông hoặc huyết khối bao gồm các
tế bào máu được chứa trong một ma trận của protein fibrin. Huyết khối hoặc
tiêu sợi huyết là q trình điều hịa enzyme để hịa tan cục máu đơng. Trong
tuần hồn động vật có vú, enzyme chịu trách nhiệm cho quá trình tiêu sợi
huyết là plasmin, một protease serine giống như trypsin [8].
Đông máu là một cơ chế quan trọng trong quá trình cầm máu. Khi
thành mạch máu bị tổn thương, máu được cầm nhờ chỗ tổn thương được che
phủ bởi cục máu đông chứa tiểu cầu và sợi huyết. Q trình đơng máu diễn ra
gồm một chuỗi các phản ứng theo kiểu bậc thang bao gồm ba giai đoạn: (1)
giai đoạn hình thành phức hợp prothrombinase qua hai con đường nội sinh và
ngoại sinh, (2) giai đoạn hình thành thrombin từ prothrombin và (3) giai đoạn
tạo thành mạng lưới fibrin từ fibrinogen tạo thành cục máu đông [9].
Hệ thống đông máu bao gồm hai thành phần là tế bào (tiểu cầu) và
protein (các yếu tố đông máu). Khi rối loạn một trong hai yếu tố trên đều ảnh
hưởng đến q trình đơng máu. Phản ứng đơng máu ngay lập tức được kích
hoạt khi tổn thương xảy ra làm tổn hại đến nội mạc mạch máu. Bước đầu của
q trình đơng máu, tiểu cầu tạo nút chặn để cầm máu vết thương sau đó các
yếu tố đơng máu có trong huyết tương sẽ đáp ứng một loạt các phản ứng tạo
ra sợi huyết, củng cố nút chặn tiểu cầu. Sợi huyết được tạo thành đó là do q
trình tạo fibrin từ fibrinogen hòa tan trong huyết tương. Tiểu cầu cùng với sợi

huyết tạo thành cục máu đông gắn vào thành mạch máu để ngăn ngừa sự mất
máu và giúp liền vết thương.


8

Ngược với q trình đơng máu là q trình tan huyết khối, giúp tái lưu
thơng tuần hồn máu. Có hai cơ chế tan huyết khối là: cơ chế thủy phân fibrin
thơng qua hoạt hóa plasminogen tạo thành plasmin và cơ chế thủy phân trực
tiếp fibrin.
Với sự có mặt của chất hoạt hóa, plasmin có hoạt tính thủy phân
fibrin được sản xuất từ plasminogen khơng hoạt động có trong hệ thống
tuần hồn. Sự chuyển đổi sinh hóa của plasminogen khơng hoạt động
thành plasmin liên quan đến sự phân cắt protein do các chất kích hoạt
plasminogen khác nhau [10].
Cơ chế thủy phân fibrin thơng qua hoạt hóa plasminogen chỉ xảy ra khi
tuyệt đối cần thiết và theo một quy trình rất kĩ càng, lúc đầu chỉ ở khu trú ở
khu vực có cục máu đơng (tức là nơi có fibrin). Bình thường khi máu đang
lưu thơng thì khơng có sự xuất hiện của plasmin. Khi có cục máu đơng lập tức
xảy ra q trình kích hoạt plasminogen, như vậy fibrin chính là tác nhân chủ
yếu và quan trọng nhất để khởi phát cho sự hoạt hóa plasminogen và từ đó
dẫn đến quá trình tiêu fibrin. Các chất hoạt hóa (t-PA, urokinase,
streptokinase…) đều thực hiện việc hoạt hóa bằng cách cắt phân tử
plasminogen qua mối liên kết với arginine (acid amin số 561) và valine (acid
amin số 562). Plasminogen bị cắt thành hai chuỗi: chuỗi A là chuỗi nặng,
trọng lượng phân tử 6.000 kDa, và chuỗi B là chuỗi nhẹ, trọng lượng phân tử
là 2.600 kDa, hai chuỗi được kết nối với nhau bằng một cầu disulfua. Về mặt
cấu trúc plasmin chỉ khác plasminogen ở chỗ có hai chuỗi, trình tự acid amin
vẫn giống nhau, và có cầu disulfua nối hai chuỗi nên trọng lượng phân tử và
tính kháng nguyên vẫn như nhau. Plasmin sau khi được tạo ra xúc tác cho quá

trình cắt fibrin thành các sản phẩm tan được gọi là sản phẩm thoái giáng của
fibrin (FDPs), các sản phẩm này có tác dụng cạnh tranh với thrombin làm
chậm q trình chuyển hóa fibrinogen thành fibrin nên làm chậm tạo thành
cục máu đơng (Hình 1.1).


9

Hình 1. 1. Cơ chế hoạt hố plasminogen
Trong các chất hoạt hóa plasminogen thì t-PA có vai trị quan trọng, nó
thường phát huy tác dụng sớm nhất và mạnh nhất, hiệu lực hoạt hóa tăng lên
rất nhiều khi có mặt của fibrin. Trong máu người bình thường plasmin tồn tại
song song với yếu tố ức chế là antiplasmin, nó có nồng độ cao gấp 30 lần so
với plasmin, có tác dụng ngăn chặn việc tác động của plasmin tới việc phân
hủy các protein trong huyết tương [11]. Hai yếu tố hoạt hóa plasminogen tự
nhiên trong máu là urokinase (u-PA) và yếu tố hoạt hóa mơ (t-PA), hoạt động
tiêu sợi huyết được kiểm soát bởi các chất ức chế plasmin (a1- antiplasmin,
a2- macroglobulin), các chất ức chế hoạt hóa plasminogen (PAL-I:
plasminogen activator inhibitor -1, một chất ức chế nhanh tác dụng của t-PA
và u-PA) [12]. Nhờ cơ chế trên mà cơ thể giữ được sự cân bằng, ổn định,
khơng có sự đơng máu hoặc chảy máu bất thường (Hình 1. 2).

Hình 1. 2. Vai trò của antiplasmin trong cơ chế điều hịa cục máu đơng


10

Cơ chế tan huyết khối thông qua sự thủy phân trực tiếp fibrin an toàn
hơn cơ chế thủy phân bằng q trình hoạt hóa plasminogen vì plasmin liên
quan đến hệ thống cầm máu của cơ thể, nếu lượng plasmin được tạo ra mất

cân bằng với lượng antiplasmin thì sẽ rất nguy hiểm với các vết thương chảy
máu, có thể gây ra chảy máu ồ ạt và nguy hiểm đến tính mạng. Ngồi các yếu
tố lumbrokinase, t-PA, u-PA khơng có yếu tố nào có thể thủy phân trực tiếp
fibrin mà đều phải thơng qua q trình hoạt hóa plasminogen [1].
1.1.4. Một số thuốc điều trị huyết khối
Hiện nay nhu cầu về các thuốc điều trị huyết khối ngày càng tăng cao
do bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến tim mạch, huyết khối trên thế giới
ngày càng gia tăng theo tốc độ phát triển của xã hội và lối sống hiện đại.
Việc điều trị các bệnh huyết khối chủ yếu tập trung vào việc kìm hãm
sự tạo thành fibrin hoặc sử dụng các nhân tố tác động vào sự chuyển hóa
plasminogen thành plasmin.
1.1.4.1. Các thuốc có bản chất hóa học
Các thuốc điều trị huyết khối có bản chất hóa học thường được sử dụng
là coumarin và heparin, các thuốc này có tác dụng kìm hãm sự tạo thành cục
fibrin [2]. Heparin có tác dụng tức thời nên nhanh chóng ngăn cản sự phát
triển của huyết khối, nó có thể tác dụng kéo dài trong vòng 3-4 giờ trước khi
bị phá hủy bởi heparinase trong máu. Khi tiêm heparin với liều 0,5-1 mg/kg
trọng lượng cơ thể có thể kéo dài thời gian đông máu tới trên 30 phút.
Coumarin khi được tiêm vào cơ thể sẽ cạnh tranh với vitamin K ở những vị trí
hoạt động trong các phản ứng enzyme dẫn đến tạo thành bốn yếu tố II, VII,
IX, X. Sau khi tiêm 12 giờ hoạt tính đơng máu giảm xuống cịn 50%, sau 24
giờ còn khoảng 20%, sau khoảng 3 ngày chấm dứt điều trị với coumarin thời
gian đông máu sẽ trở lại trạng thái bình thường [9].
Vào đầu những năm 1950, aspirin được sử dụng trong việc ngăn ngừa
nhồi máu cơ tim [13], tuy nhiên vai trị của nó trong việc điều trị cấp tính
khơng được chứng minh. Các thuốc heparin, atropine, papaverine và
nitroglycerin cũng thường xuyên được sử dụng để ngăn ngừa hoặc làm giảm


11

co thắt mạch vành. Như vậy, cho đến những năm 1950, các phương pháp điều
trị chỉ là giảm nhẹ chứ khơng phải điều trị [14], [15].
1.1.4.2. Các thuốc có bản chất enzyme
Hiện nay, các enzyme tiêu sợi huyết được sản xuất bởi các vi sinh vật,
rắn, giun đất, côn trùng, thực vật và các sinh vật khác đang được sử dụng
thành công trong việc điều trị cục máu đông, đặc biệt là phân hủy trực tiếp
fibrin với chi phí thấp hơn và ít tác dụng phụ [16].
Các nghiên cứu lâm sàng đã chỉ ra cách tiếp cận tốt nhất để điều trị
nghẽn mạch là tiêm trực tiếp vào tĩnh mạch 1 enzyme có khả năng chuyển
hóa plasminogen thành plasmin. Các enzyme đang được sử dụng rộng rãi
trong việc điều trị là streptokinase (từ vi khuẩn α- haemolytic Streptococcus),
urokinase (từ nước tiểu của người) và tPA (chất hoạt hóa plasminogen của
mơ) tái tổ hợp [16].
Streptokinase: là một protein có khối lượng phân tử 47 kDa, do liên
cầu khuẩn tan huyết I nhóm A sinh ra. Nó tác động theo một cơ chế phức tạp
với cả plasminogen liên kết và không liên kết với fibrin trong tuần hoàn để
tạo thành một phức hợp hoạt hóa. Phức hợp này biến đổi plasminogen cịn dư
thành plasmin bằng cách thủy phân liên kết L-arginine-L-valine, có tác dụng
tiêu fibrin và có thể làm tan các cục máu đồng trong lòng mạch. Streptokinase
được sử dụng để điều trị thuyên tắc mạch phổi và tĩnh mạch sâu. Bên cạnh
những ưu điểm trên thì streptokinase cũng có những tác dụng phụ khi sử dụng
lâu dài như đau cơ, buồn nôn, sốt, hạ huyết áp, loạn nhịp tim [17], [18].
Nattokinase: là một loại enzyme tự nhiên được chiết xuất từ môi
trường lên men của vi khuẩn Bacillus natto. Nattokinase làm tan fibrin gấp 4
lần plasmin nội sinh trong cơ thể. Nattokinase giúp duy trì và tăng cường khả
năng phân hủy fibrin bình thường của cơ thể nhằm hỗ trợ điều trị và phòng
ngừa các bệnh liên quan đến huyết khối như nhồi máu cơ tim, thiếu máu lên
não, đột quỵ [19], [20].
t-PA: là yếu tố hoạt hóa mơ, có thể sản xuất bằng con đường tái tổ hợp

nhưng giá thành cao. Đầu tiên t-PA gắn với fibrin, phức này sau đó gắn vào
plasminogen tạo thành phức hợp hoạt hóa plasminogen để thủy phân fibrin


12

[21], [22]. Tác dụng phụ của t-PA là gây chảy máu như ở nơi tiêm, đường tiêu
hóa, trong não, hạ huyết áp [6].
Urokinase: được tổng hợp bởi tế bào biểu mơ hình ống trong thận
người và thu được trong nước tiểu, do đó việc sản xuất và khai thác lâm sàng
bị hạn chế (2300 lít nước tiểu mới thu được 29 mg urokinase tinh khiết) [23].
Enzyme này cũng hoạt động như một chất hoạt hóa plasminogen, thủy phân
liên kết ester ở L-valine và L-arginine [18]. Nó thường được dùng để tiêu hủy
huyết khối tại chỗ, điều trị tắc nghẽn phổi, huyết khối tĩnh mạch sâu. Tác
dụng phụ của urokinase là giảm huyết áp, loạn nhịp, sưng quanh hố mát, chảy
máu ở nơi chấn thương xuyên da [24].
Mặc dù việc sử dụng các enzyme này trong điều trị đã thu được những
kết quả tích cực, tuy nhiên vẫn tồn tại một số vấn đề phát sinh trong quá trình
điều trị như giá thành cao (t-PA tái tổ hợp, urokinase), khó xác định liều phù
hợp (streptokinase), sốt, tăng chảy máu, tạo kháng nguyên, không hiệu quả
khi uống qua đường miệng [25].
1.2. TỔNG QUAN VỀ ENZYME LUMBROKINASE
1.2.1. Cấu trúc, đặc tính và cơ chế hoạt động của lumbrokinase
Lumbrokinase là tên gọi chung chỉ một nhóm gồm 6 isozyme có tác
dụng thủy phân fibrin, làm tan cục máu đông. Khối lượng phân tử trung bình
của lumbrokinase từ 25 đến 32 kDa [1]. Lumbrokinase là những chuỗi
polypeptide đơn giàu asparagine hoặc aspartic acid, rất ít proline và lysin,
không chứa thành phần đường. Chúng được xếp vào serine protease kiềm
giống trypsin. Tuy nhiên chúng giàu asparagine và aspartic acid hơn so với
các serine protease khác đã biết.

Lumbrokinase (LK) được tìm thấy trong ruột, dịch mơ và dịch ruột của
rất nhiều lồi giun đất. Chúng có tác dụng tiêu sợi huyết mạnh, người ta giải
thích sự có mặt của nó trong các loại giun là do chúng cần để tiêu hóa thức ăn
là những mảnh vụn thực vật và các chất hữu cơ trong đất nên chúng sản xuất
enzyme LK như một serine protease [1].


13

Ưu điểm lớn nhất của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất là có thể hấp
thụ qua đường ruột vào máu. Khi vào trong máu, enzyme này vừa có tác dụng
hoạt hóa hệ thống thủy phân fibrin, vừa có hoạt tính plasmin hịa tan trực tiếp
fibrin. Đây chính là những cơ sở của các nghiên cứu ứng dụng enzyme thủy
phân fibrin từ giun đất làm thuốc uống chữa bệnh tim mạch [18], [19], [3].
Từ việc phân tích protein của các loài giun đất cho thấy, cấu trúc bậc 3
của các isoenzyme lumbrokinase từ lồi L. rubellus có rất nhiều điểm giống
nhau so với các protein từ loài E. fetida ở các xoắn α, nếp gấp β và các đoạn
cuộn xoắn [1]. Một phần trình tự acid amin của LK giống với trình tự amino
acid cùng vị trí của các serine protease tương tự trypsin bao gồm: elastase,
yếu tố đông máu IX, trypsin, kallikrien và chymo trypsin [18] (Hình 1.3).

Hình 1. 3. Cấu trúc bậc 3 của lumbrokinase tách chiết từ các lồi giun đất

Giống như các yếu tố hoạt hóa mơ t-PA khác, LK cũng có cơ chế hoạt
động là kích hoạt sự chuyển hóa plasminogen tạo thành plasmin và phân hủy
trực tiếp fibrin mà không phân hủy các protein huyết tương khác bao gồm
plasminogen và albumin (Hình 1.4). Các enzyme LK có hoạt động tiêu sợi
huyết rất mạnh mẽ, ổn định trong pH rộng và sự ổn định cao chống lại sự thay
đổi nhiệt độ. Chúng là serine protease kiềm giống trypsin nhưng được đánh
giá có sự ổn định và khả năng chịu đựng dung môi cao hơn. Vilhardt (1986)

bằng phản ứng miễn dịch đã chứng minh 10-15% LK được hấp thụ hồn tồn
qua các mơ và đường ruột. Do vậy LK được đánh giá cao hơn các chất khác
trong hoạt động phân hủy các cục máu đông [3], [4].


14

Hình 1. 4. Cơ chế hoạt động của lumbrokinase

Khả năng hấp thu lumbrokinase qua thành ruột non trên thỏ cũng đã
được chứng minh. Lumbrokinase tinh khiết pha trong dung dịch đệm KrebsHenseleit ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml đã được
đưa vào bên trong niêm mạc ruột của thỏ trong các khoảng thời gian khác
nhau (30, 60, 120 phút). Xác định khả năng tiêu sợi huyết bằng cách lấy dịch
bên ngoài niêm mạc ruột thỏ sau các khoảng thời gian và nhỏ lên đĩa fibrin
theo dõi vịng hoạt tính. Kết quả cho thấy, sau hai giờ theo dõi, vịng hoạt tính
trên đĩa fibrin đạt 21,798 ± 11,0; 22,118 ± 0,4; 11,8 ± 31,977 mm2. Khi nhỏ
trực tiếp lumbrokinase ở các nồng độ khác nhau lên đĩa fibrin, diện tích vịng
hoạt tính lần lượt là 148,3; 253,5; 276,2 mm2 tương ứng với 14,7; 8,7 và
11,5% lumbrokinase được chuyển từ bên trong ra bên ngoài niêm mạc ruột
non. Điều đó chứng tỏ rằng, lumbrokinase được hấp thu hiệu quả qua thành
ruột non vào máu và thích hợp làm nguyên liệu sản xuất thuốc trị tắc nghẽn
mạch máu qua đường uống [5].
LK cũng đã được chứng minh mặc dù có khả năng phân hủy protein
nhưng khơng gây ra phân hủy hồng cầu, cũng không gây ra sự tập kết tiểu cầu
tự phát bởi Shim và cộng sự năm 1998 [26].
Một số nghiên cứu gần đây đã chứng minh được nhiều đặc tính có lợi
của LK trong việc chống viêm, chống oxy hóa, chống xơ hóa, chống vi
khuẩn, chống ung thư [27], [28].
1.2.2. Tình hình nghiên cứu enzyme Lumbrokinase trên thế giới
Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu về LK nhưng chủ yếu là tách chiết

enzyme này từ những loài giun đất.


15

Loài giun đất Lumbricus rubellus đã được phát hiện tại Nhật, có khả
năng thủy phân mạnh fibrin. Năm 1991, Mihara và cs đã tách chiết được
enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ giun đất Lumbricus rubellus, một
thành phần chính để chữa những cơn sốt và nhận ra rằng enzyme này gồm có
6 isozyme, ơng đã đặt tên chung cho 6 enzyme này là lumbrokinase. Các phân
đoạn nhóm tác giả thu được là F-I-0, F-I-1, F-I-2, F-II, F-III-1, F-III-2 bằng
quá trình tủa amonisulphate 60% và qua quá trình tinh sạch bằng các cột
sephadex G200, DEAE-cellulose, sephadex G75, toyopearl HW-55 cân bằng
với 30% amonisulphate, cột sắc ký ái lực sepharose, sephadex G97. Đây là
những enzyme bền nhiệt và thích ứng với khoảng pH rộng, pH tối ưu 7-9
[29].
Năm 1998, Shim và cs đã tách chiết và tinh sạch thành công LK từ giun
đất Lumbricus rubellus bằng cách tủa dịch thô bằng muối amonisulphat 30%
và 60%, sau đó tinh sạch qua cột DEAE-cellulose, cột sepharose 6B, thu được
enzyme lumbrokinase có khối lượng phân tử 34,2 kDa, không phụ thuộc vào
các ion kim loại, bền nhiệt và có phạm vi pH tối ưu rất rộng [26].
Một số nghiên cứu cho rằng các enzyme thủy phân fibrin có thể hịa tan
cục máu đơng và hạn chế được khả năng vón cục [30], [31]. Tuy nhiên, hầu
hết các nghiên cứu đều vẫn là đi vào tách chiết, tinh sạch, đánh giá tính chất
lý hóa và ứng dụng lâm sàng của enzyme thủy phân fibrin từ giun đất L.
rubellus, L. bimastus, E. fetida hoặc E. andrei [5], [32], [33]. Một số tác giả
thử nghiệm tác dụng chống tắc nghẽn mạch ở mức độ sâu trên động vật thí
nghiệm, nghiên cứu biến đổi hóa học nhằm mục đích làm enzyme bền hơn,
nghiên cứu các đặc tính và biến đổi hóa học của enzyme khi đưa vào cơ thể [18].
Từ năm 2002 đến 2003, các nhà khoa học Trung Quốc cũng tách chiết

được enzyme có hoạt tính thủy phân fibrin cao từ loài giun E. fetida. Họ đã
chứng minh rằng các enzyme này có thể sử dụng làm thuốc uống thay thế một
số thuốc chữa bệnh tim mạch rất đắt trên thị trường hiện nay như urokinase và
tPA [34], [35].
Đến năm 2004, Cho và cs đã tinh sạch được 6 phân đoạn lumbrokinase
(F1 đến F6) từ giun đất L. rubellus có hoạt tính thủy phân fibrin bằng phương


16

pháp tủa muối amoni sulfate và sắc ký cột. Hoạt tính thủy phân protein trên
cơ chất casein của 6 isoenzyme này đạt được từ 11,3-167,5 U/mg xếp theo
thứ tự hoạt tính F2>F1>F5>F6>F3>F4. Hoạt tính thủy phân fibrin của 6 phân
đoạn này trên đĩa fibrin đạt được từ 20,8-207,2 U/mg xếp theo thứ tự tương
ứng F6>F2>F5>F3>F1>F4. Khối lượng phân tử của các isozyme được xác
định bằng điện di SDS-PAGE tương ứng là 24,6 (F1); 26,8 (F2); 28,2 (F3);
25,4 (F4); 33,1 (F5) và 33,0 kDa (F6). Nhiệt độ tối ưu của 6 isozyme là 50C,
và pH tối ưu trong vùng pH 4-12. Bốn isozyme (F1-F4) hoàn toàn bị ức chế
bởi PMSF. Hai enzyme F5-F6 hoàn toàn bị ức chế bởi aprotinin, N-p-torsylL-lysine chloromethyl ketone, N-torsyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone,
soybean trypsin inhibitor, lima bean trypsin inhibitor và leupeptin [36].
Sun và cs (2006) đã nghiên cứu tác dụng bảo vệ của lumbrokinase
chống lại chứng thiếu máu cục bộ cơ tim ở chuột và tiến tới nghiên cứu cơ
chế của nó. LK đã làm giảm chứng nhồi máu cơ tim phụ thuộc vào các liều
khác nhau. Tốc độ hạn chế của LK ở các liều 20, 40 và 80 mg/kg thể trọng
tương ứng là 7,7%; 34,6% và 46,2%. Các nghiên cứu về điện tâm đồ cho
rằng, khi dùng LK ở nồng độ 10 và 50 µl ở +10 mV, dòng canxi dạng L (ICaL) của cơ tim đã giảm rõ ràng tương ứng từ -14,42±1,5 pA/pF tới -11,33±1,4
pA/pF (giảm tới 21,4%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01) và -9,92 ± 1,31
pA/pF (giảm 36,5%, có ý nghĩa thống kê với p<0,01). Cơ chế chống chứng
thiếu máu cục bộ làm giảm dòng canxi dạng L (ICa-L) của cơ tim ở tâm thất
chuột nhắt trắng [37].

Năm 2015, Lee và cs đã đánh giá hiệu quả điều trị của LK trong tái tạo
thần kinh ngoại biên trên chuột bằng cách sử dụng mơ hình tổn thương thần
kinh tọa được xác định rõ ở chuột bị tiểu đường do tiêm streptozotocin. Nhóm
nghiên cứu đã thấy rằng liệu pháp LK có thể cải thiện lưu lượng máu tuần
hoàn của chuột và thúc đẩy tái tạo sợi trục trong ống dẫn cao su silicon sau
khi chuyển dây thần kinh, điều trị bằng LK cũng có thể cải thiện các chức
năng thần kinh cơ với hiệu suất dẫn truyền thần kinh tốt hơn, ngoài ra LK
cũng có thể kích thích bài tiết interleukin -1, yếu tố tăng trưởng thần kinh, yếu


17

tố tăng trưởng có nguồn gốc tiểu cầu và biến đổi yếu tố tăng trưởng β trong
bệnh đái tháo đường bị cắt bỏ đoạn thần kinh [38].
Năm 2016, Tang và cs cũng đã tách LK từ giun đất Pheretima
Praepinguis bằng phương pháp tủa muối và nghiên cứu tính chất enzyme.
Nhóm tác giả đã thử hoạt tính của LK bằng phương pháp đĩa thạch casein, thu
được hoạt tính tương đối cao, hoạt tính của LK trong mơi trường trung tính
hoặc hơi kiềm cao hơn, có khả năng chịu nhiệt độ cao, hoạt tính enzyme đạt
cao ở nhiệt độ dưới 600C và phạm vi thích nghi nhiệt độ rộng [39].
Cũng trong năm 2016, Tingming và cs cũng đã tách chiết lumbrokinase
từ giun đất bằng cách sử dụng cột sợi rỗng cut – off 50 kDa và 6 kDa sau khi
nghiền đồng thể giun để thu dịch thơ, sau đó tinh chế qua cột sephadex G75,
thu được ba phân đoạn protein có độ tinh khiết cao, một trong số ba phân
đoạn này đã được thử cho hoạt tính tiêu sợi huyết cao [40].
Năm 2017, Mahendra và cs đã nghiên cứu và thu nhận thành công một
enzyme phân hủy fibrin từ giun đất Ấn Độ Pheretima posthumous có trình tự
acid amin tương đồng với lumbrokinase P2 của giun đất Lumbricus rubellus
bằng phương pháp tủa muối amonium sulphate và sắc ký trao đổi ion. Trọng
lượng phân tử protein thu được là 29,5 kDa bằng maldi-TOF/MS. Enzyme thể

hiện khả năng phân giải protein tối đa 1,2 U/ml với hoạt tính riêng là 17,65
U/mg ở pH 8,0 và nhiệt độ là 400C. Nghiên cứu cho thấy enzyme có hoạt
động phân giải protein trong phạm vi pH rộng từ 4 đến 12 và nhiệt độ từ 20
đến 600C [41].
1.2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme lumbrokinase ở Việt Nam
Việt Nam là quốc gia có khí hậu nóng ẩm, rất phù hợp cho sự sinh sản
và phát triển của rất nhiều lồi giun, vì vậy số lượng các lồi giun rất đa dạng
[42]. Nhờ việc ứng dụng sự phát triển của cơng nghệ sinh học, đã có nhiều
cơng trình nghiên cứu các sản phẩm chống đông máu đăc biệt là các sản phẩm
tách chiết từ các loài giun trong nước.
Trên cơ sở khai thác và tìm kiếm nguồn enzyme thủy phân fibrin ở một
loài giun đất Việt Nam (nhánh đề tài KC04-17: “Nghiên cứu các giải pháp


18

công nghệ sinh học sản xuất các chế phẩm y sinh học đặc thù để bảo vệ sức
khỏe nhân dân từ nguồn tài nguyên sinh vật Việt Nam” năm 2002-2004),
Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự (2006) đã thực hiện đề tài cấp cơ sở viện
Công nghệ sinh học: “Tách dịng và tìm điều kiện biểu hiện gen mã hóa cho
enzyme lumbrokinase từ giun quế”. Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả đã
sàng lọc được các lồi giun đất có hoạt tính thủy phân fibrin cao và bước đầu
tìm cách nhân dịng trình tự gen mã hóa LK từ lồi giun quế Perionyx
excavatus.
Lý Thị Bích Thủy và cs (2006) đã tinh sạch enzyme có hoạt tính thủy
phân fibrin từ P. excavatus và đánh giá được một số tính chất của nó [43].
Phan Thị Bích Trâm và cộng sự (2008) cũng đã tách chiết và tinh sạch
enzyme thủy phân fibrin từ P. excavatus và tách chiết được 8 phân đoạn có
hoạt tính thủy phân fibrin cao [44].
Nguyễn Văn Rư (2015) đã tinh sạch lumbrokinase từ giun quế

Peryonyx excavatus bằng phương pháp kết tủa phân đoạn bằng ethanol 50%,
80% và sắc ký lọc gel sephadex G75, đã xác định được hoạt độ enzyme của
chế phẩm và khảo sát được một số đặc tính sinh học và các yếu tố ảnh hưởng
tới hoạt tính enzyme như nhiệt độ, pH, các ion kim loại đặc biệt là khả năng
hịa tan cục máu đơng và fibrin invitro, ngoài ra nghiên cứu của tác giả cũng
đã tạo được bột đơng khơ lumbrokinase có hoạt độ protease 30,60 IU/mg
dùng để làm nguyên liệu sản xuất enzyme làm thuốc [45].
Hầu hết các nghiên cứu trong nước mới chỉ tập trung vào nghiên cứu
tách chiết, tinh sạch và đánh giá tính chất lý hố của LK.
1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÁC SẢN PHẨM THUỐC VÀ THỰC
PHẨM CHỨC NĂNG ĐIỀU TRỊ BỆNH HUYẾT KHỐI
Hiện nay trên thị trường các thuốc và thực phẩm chức năng hỗ trợ điều
trị bệnh huyết khối đang có xu hướng phát triển rất mạnh để đáp ứng nhu cầu
điều trị các căn bệnh nguy hiểm này. Song song với việc nghiên cứu phát triển
các chế phẩm mới thì việc giám sát chất lượng thuốc để đáp ứng đúng các yêu
cầu và bảo vệ sức khỏe cho người bệnh là công tác quan trọng hàng đầu.


19

Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thuốc phải đáp ứng các yêu cầu của
dược điển Việt Nam hiện hành (dược điển Việt Nam 4, dược điển Việt Nam
5) hoặc các dược điển hiện hành trên thế giới theo quy định của ngành kiểm
nghiệm. Các chỉ tiêu về vi sinh vật được yêu cầu theo dược điển là xác định
tổng số vi khuẩn hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc, tống số vi
khuẩn Gram âm dung nạp mật, xác định sự có mặt của một số vi khuẩn gây
bệnh như Escherichia coli, Staphhylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa, Candida albicans trong 1 g chế phẩm, xác định Salmonella trong
10 g chế phẩm.
Các chế phẩm đăng kí dưới dạng thực phẩm chức năng phải đáp ứng

đầy đủ các yêu cầu của các tiêu chuẩn TCVN và các tiêu chuẩn ISO, các tiêu
chuẩn cũng tương tự như trong dược điển Việt Nam 5 với các chỉ tiêu: xác
định tổng số vi sinh vật hiếu khí, xác định tổng số nấm men và mốc và định
danh một số vi sinh vật gây bệnh khơng được phép có mặt trong chế phẩm
[46].
Tuy nhiên các công bố về các nghiên cứu về chỉ tiêu vi sinh trong các
chế phẩm này còn rất hạn chế.
Đề tài “Nghiên cứu xây dựng quy trình lên men thu nattokinase tái tổ
hợp trong Bacillus subtilis và ứng dụng sản xuất thực phẩm chức năng hỗ trợ
ngăn ngừa sự hình thành huyết khối” do PGS.TS Trần Cát Đông làm chủ
nhiệm vừa được Sở Khoa học và Công nghệ TP.HCM nghiệm thu năm 2018.
Nhóm nghiên cứu đã xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu
nattokinase, xây dựng quy trình bào chế viên nang thực phẩm chức năng chứa
nattokinase đạt tiêu chuẩn cơ sở theo Dược điển Việt Nam IV. Công thức viên
nang cứng nattokinase 1.000 FU với hệ tá dược gồm calci carbonat, MCC
PH101, mannitol, talc, magnesi stearat, aerosil, povidone K30, natri
croscarmellose đã được xây dựng. Trong đó, tỷ lệ calci carbonat, MCC
PH101, mannitol đã được khảo sát và tối ưu hóa với phần mềm Design
Expert® v 11.0.0 để giúp ổn định hoạt tính nattokinase và pH của viên nang
đạt 8,5. Quy trình bào chế được lưa chọn là phương pháp xát hạt từng phần
đảm bảo cho enzym không bị mất hoạt tính bởi ẩm và nhiệt trong q trình


20

bào chế. Viên nang nattokinase đạt các tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam
IV về độ đồng đều khối lượng, độ rã, độ hịa tan, pH, định tính và định lượng.
Tuổi thọ của viên nang nghiên cứu trên 24 tháng, khi theo dõi ở các điều kiện
khác nhau. Đánh giá sinh khả dụng và tác động dược lý của sản phẩm cho
thấy, thử nghiệm độc tính cấp trên chuột (LD50 > 100.000 FU/kg thể trọng),

khơng có chuột chết. Thử độc tính bán trường diễn, sau khi cho chuột uống
nattokinase liều 2.000 FU/kg và 4.000 FU/kg liên tục trong 60 ngày khơng
gây độc tính trên chuột, chuột tăng trọng bình thường, các chỉ số xét nghiệm
huyết học và đa số thông số sinh hóa đều nằm trong giới hạn bình thường
[47].
Ngồi ra, nhóm nghiên cứu đã xây dựng mơ hình gây huyết khối cảm
ứng với carragenan trên chuột nhắt trắng, khảo sát được tác động ngăn ngừa
huyết khối đối với viên nang chứa nattokinase cho hiệu quả ngăn ngừa huyết
khối tương tự nattokinase thương mại. Đồng thời nhóm đã tiến hành đăng ký
giải pháp hữu ích với sản phẩm đăng ký là “Quy trình lên men thu nhận vượt
mức nattokinase tái tổ hợp từ chủng Bacillus subtilis” [47].
Giai đoạn 2011- 2015, nhóm nghiên cứu của viện Cơng nghệ sinh học
do cố PGS. TS. Quyền Đình Thi và ThS. Lê Thanh Hồng đã nghiên cứu sản
xuất thành công chế phẩm lumbrokinase tái tổ hợp. Trong nghiên cứu này
enzyme lumbrokinase đã được nhân dòng từ giun đất Eisenia fetida và biểu
hiện trong Pichia pastoris với hoạt tính đạt >3000 IU/mg protein. Chế phẩm
lumbrokinase tái tổ hợp ở liều 200 mg/kg có tác dụng tốt trong điều trị nhồi
máu não trên mơ hình thực nghiệm, làm giảm mức độ tổn thương vận động
(cả vận động cưỡng bức và vận động tự nhiên), làm tăng khả năng phối hợp
vận động khi thử trên rotarod, tăng khả năng ghi nhớ và học tập khi thử trên
mê lộ nước. Thuốc tác dụng tốt cả trong giai đoạn cấp (3 ngày đầu sau gây
nhồi máu) và trong dùng điều trị kéo dài. Các tác dụng này của Lumbrokinase
tái tổ hợp tương đương với thuốc chuẩn Boluoke (lumbrokinase) của Canada.
Năm 2018, nhóm nghiên cứu của tác giả Lê Thanh Hồng và cộng sự
cũng đã xác định độc tính cấp và bán trường diễn của lumbrokinase tái tổ hợp.
Kết quả cho thấy lumbrokinase không gây độc trên động vật thực nghiệm. Giá


21

trị LD 50 của lumbrokinase tái tổ hợp trên chuột nhắt trắng qua đường tiêu
hoá khi theo dõi 7 ngày là khơng xác định được, 100% chuột sống sót sau 7
ngày uống lumbrokinase với liều lượng 50 mg/kg thể trọng. Sản phẩm
lumbrokinase tái tổ hợp không gây ảnh hưởng đến chức năng gan của thỏ thí
nghiệm cũng như hình ảnh vi đại thể của tế bào gan chuột sau khi uống chế
phẩm 45 ngày [48].
Các nghiên cứu về quy trình kiểm tra giám sát chất lượng các thuốc và
thực phẩm chức năng điều trị các bệnh huyết khối cũng đã được công bố.
Năm 2010, Nguyễn Thanh Thảo - Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung
ương đã nghiên cứu và xây dựng thành cơng phương pháp xác định hoạt tính
của streptokinase trong chế phẩm chứa đồng thời hai enzyme là streptokinase
và streptodornase bằng phương pháp đo vòng ly giải trên đĩa thạch agarose.
Phương pháp có độ đúng, độ lặp lại cao và độ tuyến tính nằm trong khoảng từ
9 đến 28050 đơn vị streptokinase/ml. Phương pháp này có tác dụng thiết thực
trong việc đánh giá chất lượng các chế phẩm chứa hỗn hợp cả hai enzyme này
với trang thiết bị và các hóa chất thơng dụng, kỹ thuật khơng phức tạp, có thể
thực hiện được ở các cơ sở kiểm nghiệm cấp tỉnh, thành phố và các doanh
nghiệp [49].
Năm 2019, Nguyễn Thị Hằng và cs đã tiến hành thẩm định quy trình
xác định hoạt tính enzyme nattokinase bằng phương pháp đo quang. Các kết
quả thực nghiệm của nhóm tác giả chứng minh rằng quy trình xác định hoạt
lực nattokinase bằng phương pháp đo quang có độ đặc hiệu, độ chính xác và
độ đúng nằm trong giới hạn cho phép về thẩm định phương pháp phân tích
các hoạt chất sinh học, có sự tương quan tuyến tính chặt chẽ giữa nồng độ
enzyme đem phản ứng và chênh lệch độ hấp thụ của hỗn hợp enzyme cơ chất
sau phản ứng trong khoảng nồng độ khảo sát từ 0,69 đến 1,34 FU/ml. Từ đó
cho thấy rằng có thể áp dụng phương pháp đo quang để xác định hoạt lực của
nattokinase trong các chế phẩm có chứa enzyme này [50].
Mặc dù cả trong nước và trên thế giới đều đã có nhiều cơng trình
nghiên cứu về lumbrokinase cả chế phẩm tự nhiên lẫn chế phẩm tái tổ hợp,

tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu dừng lại ở mức độ tinh sạch, thử hoạt tính