Nghiên cứu kỹ thuật tách chiết silumarin từ hạt kế sữa và axit amin từ đậu tương làm nguyên liệu cho thực phẩm chức năng tăng cường chức năng gan

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
NGUYỄN THỊ QUY

NGHIÊN CỨU KỸ THUẬT TÁCH CHIẾT SILUMARIN TỪ HẠT KẾ SỮA
VÀ AXIT AMIN TỪ ĐẬU TƯƠNG LÀM NGUYÊN LIỆU CHO THỰC
PHẨM CHỨC NĂNG TĂNG CƯỜNG CHỨC NĂNG GAN

Ngành: Sinh học

2015


1

LỜI CẢM ƠN
Để có thể hoàn thành luận văn thạc sĩ một cách hoàn chỉnh, bên cạnh sự
nỗ lực cố gắng của bản thân còn có sự hƣớng dẫn nhiệt tình của quý Thầy Cô,
cũng nhƣ sự động viên ủng hộ của gia đình và bạn bè trong suốt thời gian học
tập nghiên cứu và thực hiện luận văn thạc sĩ.
Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Phạm Việt
Cƣờng- Phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển, ngƣời đã hết lòng
giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành luận văn này.
Đồng thời, tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn tớ
các anh chị em trong phòng Công nghệ sinh học - Viện Hóa sinh Biển đã tận
tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu để hoàn thành đề tài luận văn.
Xin chân thành biết ơn đến toàn thể quý Thầy Cô trong bộ môn Vi sinh
vật học đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu cũng nhƣ tạo mọi điều
kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu và cho đến
khi thực hiện đề tài luận văn.
Cuối cùng xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến gia đình, bạn bè,

những ngƣời đã không ngừng động viên, hỗ trợ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn.
Hà Nội, Ngày 21 tháng11năm 2014
Học viên

Nguyễn Thị Quy


2

MỤC LỤC
............................................. 4
................................................................................ 5
................................................................................ 6
........................................................................................................... 7
............................................................................. 9
.............................................................................. 9
............................................................................................... 9
........................................................ 9
1.1.3. Đặc điể

ủa flavonoid..................................................... 10

1.1.4. Tác dụng sinh học của

. ........................................................ 14

1.1.4.1. Sơ lƣợc về lịch sử sử dụng cây

làm thuốc. ............................. 14

1.1.4.

ủa silymarin và ứng dụng .................................... 15

1.1.5

...........................................18

1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin ...................... 18
.............................................................. 20
1.2.1. Cây đậu tƣơng ....................................................................................... 20
............................................. 20
.................................................................................. 21
1.2.3.1. Thành phần Protein đậu tƣơng ........................................................... 21
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tƣơng ........................................................ 21
ậu tƣơng .......................... 23
............................................... 26
2.1. Vật liệu ..................................................................................................... 26
2.1.1. Nguyên liệu ........................................................................................... 26
2.1.2. Hoá chấ

............................................................................... 26

2.2. Phƣơng pháp............................................................................................ 27


3

silymarin

............................ 27

2.2.2. Phƣơng pháp Sắc ký HPLC .................................................................. 28
2.2.3

............................ 29

2.2.4. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng axit amin tự do ............................... 29
2.2.5

......................................... 29

2.2.5

........................................................... 29

2.2.5

................................................................................. 30

2.2.5

................................................................... 30

2.2.5

.......................................................................... 31

2.2.6

..................................................................... 32

CHƢƠNG 3 : KẾT QUẢ ................................................................................ 33
................................................. 33
ết xuất silymarin ....................... 33
3.1.2. Kết

sắc kí HPLC ............................................................................ 37
ả

........... 39
ận axit amin tự

tƣơng................................................................................................................ 42
3.4. Một số đặc tính sinh học của chế phẩm chứa sylimarin .......................... 47
............................................................................ 48
............................................................................. 49
3.4.3.

................................................................................... 52

3.4.3.1. Tác dụng trên lƣu lƣợng mật .............................................................. 53
3.4.3.2. Tác dụng trên hàm lƣợng cắn khô và bilirubin trong dịch mật.......... 54
.................................................. 56
4.1. Kết luận .................................................................................................... 56
.................................................................................................. 56
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 57

4

ADN

Acid Deoxyribo Nucleic

ARN

Acid Ribonucleic

ALT

Alanine Aminotransaminase

AST

Aspartate Aminotransaminase

CCI4

Cacbon Tetrachlorid

EtOH

Ethanol

MeOH

Methanol

NaCl
cAMP

C

-

TFN-α

-

LD50

u năng cao

HPLC
SKLM
Cs
CN

Công nguyên

TPCN
WHO
UV

-


5

Bảng 3.1. Kết

khảo sát dung môi để chiết xuất silymarin ...................... 34

Bảng 3.2. Kết

chiết xuất silymarin bằng các phƣơng pháp khác nhau ... 35
axit amin

............................. 39

3.4: ảnh hƣởng của thời gian thủy phân bột đậu tƣơng bằng protease lên
..................................................................................... 44
3 ................................. 44
3.6: Hàm lƣợng axit amin tự
3.7: Hàm lƣợng axit amin tự

ch thủ

........... 45
ủ

................................................................................................................... 46
Bảng 3.8: Liều uống chế phẩm silymarin trong các lô chuột thực nghiệm thử
độc tính cấp ..................................................................................................... 48
Bảng 3.9: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên hoạt độ enzym ALT huyết
thanh chuột thực nghiệm ................................................................................. 51
Bảng 3.10: Tác dụng của chế phẩm silymarin trên bilirubin huyết thanh chuột
thực nghiệm. .................................................................................................... 52

Bảng 3.11: Lƣu lƣợng mật ở các lô chuột thí nghiệm .................................... 53
Bảng 3.12: Hàm lƣợng cắn khô trong dịch mật của chuột thực nghiệm ........ 54
Bảng 3.13: Hàm lƣợng bilirubin trong dịch mật của chuột thực nghiệm ....... 54


6

...................................................10
.....37
3.2: Sắc ký đồ mẫu silymarinthu đƣợc sau khi tách chiế
................................................................................38
3.3: Sắc ký đồ mẫu silybin chuẩn...........................................................38
3.4:

..................................................40

3.5

..................................44


7

V

dùng thuốc có nguồn gốc từ thảo dƣợc hoặc phối hợp sử dụng

thuốc đông dƣợc và tân dƣợc hiện

cộng đồng

. Do các

loại thuốc thảo dƣợc và sự kết hợp đông –tây y không những chữa đƣợc bệnh
mà ít có tác dụng phụ. Vì vậy, thuốc có nguồn gố

, đặc biệt là

những cây thuốc đã đƣợc dùng rộng rãi theo kinh nghiệm cổ truyền để chữa
bệnh đƣợc các nhà khoa học trên thế giới và Việt Nam quan tâm nghiên cứu.
ọ
cơ thể con ngƣờ

làm cho gan bị xơ, và
g
t

viêm gan siêu vi

là một trong những bệnh truyền nhiễm phổ

biến nhất trên thế giới, ảnh hƣởng đến sức khỏe cộng đồng trong thập niên
này. Hiện có 6 loại virus gây viêm gan : A, B, C, D, E và G, trong đó phổ biến
và nguy hiểm nhất là siêu vi B và C. Khoảng 2 tỷ ngƣời trên thế giới đã hoặc
đang nhiễm virus viêm gan B

. Có khoảng 3% dân số thế giới
nhiễm virus viêm gan C và trên 170 triệu ngƣời

n

[62],
[63].


8

Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin

có tác

dụng chữa bệnh xơ gan do rƣợu. Một trong những hoạt tính triển vọng của
silymarin là chống ung thƣ, vì vậy có thể sử dụng silymarin kết hợp với
phƣơng pháp hóa trị liệu. Silymarin hoạt động nhƣ chất chống oxy hóa, bảo
vệ mô và loại bỏ chất gây độc cho gan [5], [10].
Protein đậu tƣơng đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một thành phần chức năng
trong rất nhiều loại thực phẩm chế biến bởi khả năng tạo gel và các tính chất
hóa lý, cảm quan và dinh dƣỡng cao. Việc thủy phân protein các hạt họ đậu
cải thiện các đặc tính dinh dƣỡng của chúng nhƣ làm chậm quá trình hƣ hỏng,
cải thiện cấu trúc, tăng hoặc giảm độ hòa tan, ngăn cản những tƣơng tác
không mong muốn, loại mùi khó chịu và các thành phần độc. [27], [57].
, để có thể sản xuất một số loại sản phẩm tăng cƣờng chức năng
gan cũng nhƣ hỗ trợ điều trị các bệnh liên quan đến gan tại Việt Nam, thay thế
các sản phẩm nhập ngoại,

là cơ sở để chúng tôi thực hiện đề tài:

“

axit amin
.”

1. Nghiên cứu quy trình tách chiết Sylimarin từ hạt kế sữa.
2. Nghiên cứu quy trình thuỷ phân thu nhậ


.





.
.
.


9

CHƢƠNG 1
1.1.
1.1.1
(Sylibum marianum (L.) Gaernt)
,l

hai năm, cao 30-150cm. Thân

cây thảo

thẳng và phân nhánh. Lá xanh, không có lá kèm, bóng láng, thƣờng có nhiều
đốm trắng dọc theo các gân, mép có răng dạng gai, gai màu vàng và rất nhọn;

các lá phía trên và ở giữa ôm lấy thân; các lá ở dƣới rất to, có phiến chia thuỳ
và có cuống. Cụm hoa đầu đơn độc, rộng 3-10cm. Lá bắc ngoài và giữa có
một phần phụ hình tam giác màu lục thu lại thành một gai to, ở gốc có 4-6 gai
nhỏ, ngắn hơn, ở mỗi bên. Hoa màu tím, hiếm gặp màu trắng, hơi giống nhau,
đều có 5 cánh hoa, 5 nhị và bầu 1 ô với 2 lá noãn và 2 vòi nhuỵ phình ở gốc.
bế hình bầu dục thuôn, dài 7-8mm, màu đen bóng có vân vàng nhiều
hoặc ít, tùy thuộc vào

giống S.marianum

[15],

[24], [26]. Ra hoa vào tháng 5 đến tháng 8 của năm thứ hai.
Cây có nguồn gốc ở Địa Trung Hải và mọc hoang dại ở nhiều nơi trên
thế giới nhƣ miền Nam và Trung Âu, Bắc Phi, Trung Đông, Ấn Độ, Trung
Quốc, Bắc và Nam Mỹ [26].
1.1.2.
Thành phần ho

ính của

. Sily
.

Dịch chiết của hạt cây chứa khoảng 70-80% silymarin flavonolignans và
khoảng 20-30% thành phần không xác định, chủ yếu là các hợp chất
polyphenol oxy hóa và trùng hợp. Thành phần chính của tổ hợp silymarin là
silybin, đồng nghĩa với silybinin. Ngoài silybin là hỗn hợp của 2
diastereomers A và B với tỉ lệ khoảng 1:1, một lƣợng lớn các flavonolygnants

10

khác có trong silymarin, đó là iosilybin, dehydrosilybin, silychristin,
silydanin, và một số flavonoids, chủ yếu là taxifolin (hình 1.1) [28].
Những tài liệu dƣợc lý, y học và quang hóa, tranh luận rất nhiều về hiệu
của silymarin/silybin. Nguyên nhân chính của sự không thống nhất và
không chắc chắn về hiệu

của silymarin/silybin là thành phần khác nhau

của chế phẩm silymarin đƣợc sử dụng trong phần lớn nghiên cứu. Các dẫn
chứng tài liệu cho thấy tỉ lệ của từng chất trong các loại silymarin khác nhau
phụ thuộc rất lớn vào nguồn S.marianum (giống cây và điều kiện trồng) và
quá trình tách chiết, xử lý. Gần đây, silymarin/silybin nhận đƣợc sự quan tâm
do các hoạt tính có lợi của nó không liên quan trực tiếp đến hiệu

bảo vệ

gan và chống oxy hóa [28], [39], [42], [53], [54].

silymarin
1.1.3.

của flavonoid

Flavonoid là một trong những nhóm chất polyphenol thƣờng gặp trong
thực vật, là những sắc tố phần lớn có màu vàng, tan trong nƣớc nên có tên là

11

“flavonoid”. Tuy nhiên, một số sắc tố có màu xanh, đỏ, tím hoặc không màu
nhƣng cũng đƣợc sắp xếp vào nhóm flavonoid vì nó cũng có đặc điểm về cấu
trúc giống nhau [2], [10].
 Tính chất lý học
Flavonoid là một hợp chất phenol có một số tính chất sau:
Flavonoid tinh khiết có dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình, có nhiệt độ
nóng chảy nhất định, có màu vàng nhƣ flavon, chalcon hoặc không màu nhƣ
isoflavonoid, catechin, hay có màu sắc thay đổi tùy thuộc pH môi trƣờng nhƣ
antoxyanidin (ở môi trƣờng acidcó màu đỏ, ở môi trƣờng kiềm có màu xanh).
Các aglycon (nhân phenol) của flavonoid hòa tan trong dung môi hữu cơ
nhƣ ether, cồn etylic, aceton và hầu nhƣ không tan trong nƣớc.
dạng liên kết (glycosid) hòa tan đƣợc trong nƣớc nhƣng
không tan trong ether và chloroform. Flavonoid có hƣơng thơm và vị đắng.
Có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hai vòng benzen A và B. Có hai dải hấp
thụ cực đại: Dải I ở bƣớc sóng 320-380nm, dải II ở bƣớc sóng 220-280nm.
 Tính chất hóa học
Do đặc điểm cấu tạo của flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic,
nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn.
Tính chất hóa học của flavonoid còn phụ thuộc vào vị trí nhóm OH, hệ nối
đôi liên hợp và các nhóm thế.
phản ứng hóa học đặc trƣng của flavonoid:
*Phản ứng của nhóm hydroxyl (OH)
Tính oxy hóa: Dƣới tác dụng của các chất oxy hóa ( nitrat bạc,
ferricyanit, persulfate, các gốc tự do…) hay enzym polyphenoloxydase
,flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc phenoxy ArO* (gốc tự do bền). Các
gốc này có thể dimer hóa hay phản ứng oxy hóa và các phản ứng làm bẻ gãy
vòng.

12

Tính axit: Các flavonoid có tính acidyếu nên dễ dàng phản ứng với dung
dịch kiềm để tạo thành muối tan trong nƣớc khi đun nóng, cho màu vàng cam
hay đỏ thắm. Antoxyan trong dung dịch amoniac hay natri cacbonate cho màu
xanh hoặc tím.
Sự tạo thành liên kết hydro: Khi không có trở ngại gì về mặt cấu trúc
không gian liên kết hydro đƣợc hình thành giữa các nhóm OH trong cùng
phân tử hoặc giữa các phân tử với nhau.
Đặc điểm này làm ảnh hƣởng đến tính chất hóa học nhƣ: Điểm sôi, điểm
nóng chảy, độ hòa tan, đặc tính phổ tử ngoại, cấu trúc phân tử và khả năng
phản ứng.
Phản ứng ether hóa: Ether thiên nhiên của phenol thƣờng gặp trong thực
vật, đặc biệt là những ether etylic. Những nhóm OH phenol dễ dàng tham gia
phản ứng ether hóa.
*Phản ứng của nhóm cacbonyl
Phản ứng này đặc trƣng cho các chất flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí
C4 và có nối đôi ở giữa C2 và C3, điển hình là flanonol, flavon không có OH
ở C3 nên phản ứng khó hơn và cho màu nhạt nên đôi khi khó phát hiện.
Phản ứng tạo phức với kim loại: Khả năng tạo chelat với kim loại nặng
là một trong những tính chất quan trọng của flavonoid, liên quan đến hoạt tính
sinh học của chúng. Các phức màu xanh đen với molipden và sắt. Các
flavonoid có nhóm cacbonyl ở vị trí C4 và hydroxyl ở vị trí C3-C5 dễ tạo
phức với kim loại, đặc biệt với nhôm cho màu vàng hoặc vàng xanh, phát
quang ở bƣớc sóng 365nm.
 Tác dụ

của flavonoid

Flavonoid có nhiều ứng dụng quan trọng trong y học. Những flavonoid
có hoạt tính sinh học gọi là bioflavonoid phụ thuộc vào cấu trúc của chúng.
Khi đƣa flavonoid vào cơ thể sẽ sinh ra các gốc tự do bền vững hơn các gốc


13

tự do hình thành trong quá trình viêm nhiễm bệnh lý. Chúng có khả năng giải
tỏa các điện tử tự do trên mạch vòng của nhân thơm và hệ thống nối đôi liên
hợp, làm triệt tiêu các nguồn gốc tự do sinh ra trong quá trình viêm nhiễm, do
tính bền vững về mặ

a học nên chúng không tham gia vào dây chuyền

phản ứng oxy hóa [23].
Flavonoid còn có tác dụng bảo vệ cho adrenalin hoạt động một cách bình
thƣờng do chúng có khả năng tạo phức với Cu2+, có tác dụng là chất xúc tác
cho phản ứng oxy hóa adrenalin, leucholamin [23].
Flavonoid ảnh hƣởng đến hệ thống nội tiết, làm tăng sức đề kháng của
cơ thể đối với tác dụng gây độc bất kể loại nào, tăng chức năng thải độc của
gan, tăng trao đổi glucose, tăng tổng hợp glucogene, ảnh hƣởng đến quá trình
tổng hợp prothrombin của gan [25].
Các chất thuộc nhóm flavonoid có tác dụng làm giảm sức thấm của mạch
mao nhƣ sinh tố P, một trong những chất quan trọng đó là rutin. Rutin có tác
dụng chữa các bệnh xuất huyết mao

n, làm cho thành mạch đƣợc bền

vững, chữa cao huyết áp tăng, cƣờng công hiệu vitamin khỏi bị oxy hóa. Nó
còn ảnh hƣởng tốt đến chuyển hóa canxi và còn chống đƣợc tia phóng xạ.

Về mặt dƣợc lý, các bioflavonoid có tác dụng chống viêm, giãn cơ trơn,
chống dị ứng, ức chế sự phát triển của ung thƣ, làm giảm các tổn thƣơng xuất
huyết nhỏ trong bệnh đái đƣờng.
Về mặt miễn dịch học, nhiều bioflavonoid có tác dụng kích thích lympho
bào, sản xuất interferol, ức chế hiện tƣợng thoát bọng chứa các amin hoạt
mạch từ tế bào mastocyte, ức chế sụ nhân lên của virus.
Việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm flavonoid trên thế giới ngày
càng phát triển. Ở Việt Nam đã có những nghiên cứu mà kết
dụng vào thực tiễn, tạ

số thuốc chữa bệnh có hiệu

.

đƣợc ứng


14

1.1.4. Tác dụng sinh học của

.

1.1.4.1. Sơ lƣợc về lịch sử sử dụng cây
Cao chiết

làm thuốc.

đã đƣợc sử dụng làm thuốc từ thời Hy Lạp cổ đại.

Dioscorides, một nhà dƣợc thảo học Hy Lạp thế kỷ thứ I đã viết rằng,
pha thành trà uống có thể chữa đƣợc rắn độc cắn. Pliney The Elder (năm
23-79 sau CN) ghi lại rằng, nƣớc ép cây

trộn với mật ong làm thuốc lợi

mật rất tốt. Đây có thể là ghi nhận đầu tiên về tác dụng của cây

liên

quan đến gan [20].
Nhiều thế kỷ sau,

đã trở thành một cây thuốc quen thuộc ở Đức

và đã đƣợc nhắc đến trong một bản thảo tiếng Đức cổ “Physica” của
Hildegarde viết năm 1150 và đƣợc xuất bản vào năm 1533. Tác giả đã viết về
công dụng của rễ, toàn cây và lá

. Một số tác giả khác nhƣ Otto

Brunfels (1534), Hieronimus Bock (1595), Jacobus Theodorus (1664) và
Adam Lonicerus (1679) đã giới thiệu dùng

để trị bệnh về gan [24] .

Vào cuối thế kỷ XVIII, Culpepper (1787) cho rằng

là thứ thuốc

tuyệt vời làm thông tắc gan, lách và vì vậy dùng rất tốt để chữa bệnh vàng da.
Giữa những năm 1772 đến 1850, một chế phẩm có tên gọi là “Cồn thuốc của
Rademacher”, cao chiết cồn hạt

đã đƣợc dùng phổ biến để trị các rối

loạn về gan, lách. Tƣơng tự, cuối thế kỷ XIX đầu thế kỷ XX, một trƣờng đào
tạo các nhà dƣợc thảo học tên là “Eclectic” đã dùng cao chiết

để điều

trị sung huyết gan, giãn tĩnh mạch, rối loạn kinh nguyệt và các bất thƣờng của
lá lách và thận [20], [21].
Năm 1958, các nhà khoa học ngƣời Đức bắt đầu chú ý nghiên cứu cây
. Các nghiên cứu về tác dụng bảo vệ gan, thành phần hoạt chất và cơ chế
tác dụng đã đƣợc thực hiện. Thành phần hoạt chất trong

đã đƣợc

xác định là silymarin, một hỗn hợp các flavonolignan mà các chất chính là
silybin, silychristin và silydianin. Từ năm 1969, chế phẩm silymarin chiết


15

xuất từ

bắt đầu đƣợc sử dụng rộng rãi trong điều trị ở Đức và sau

đó là trên khắp thế giới. Vào những năm 1990, doanh số bán chế phẩm này ở

Đức lên tới trên 180 triệu đôla/năm. 31% số bệnh nhân mắc bệnh về gan ở
Mỹ đã dùng dƣợc thảo mà chủ yếu là dùng
1.1.4.2.
Hạt củ

[20] .

của silymarin và ứng dụng
(Sylibum marianum (L.) Gaernt.) đã đƣợc sử dụng

hơn 2000 năm nay để chữa các bệnh rối loạn gan và túi mật nhƣ viêm gan, xơ
gan, vàng da và bảo vệ gan khỏi tác động có hại của hóa chất và các chất độc
ngoài môi trƣờng nhƣ nọc rắn, côn trùng, ngộ độc nấm hoặc rƣợu [43], [52].
 Hiệu

bảo vệ gan:
s
. Đã có những bằng chứng cho thấy silymarin có tác dụng

chữa bệnh xơ gan do rƣợu. Cơ chế của quá trình này do silymarin phục hồi
alanin transaminase, aspartate transaminase và bilirubin huyết thanh về mức
bình thƣờng, giảm γ-glutamyl transpeptidase, làm tăng đáng kể vận tốc biến
đổi của lymphhoccytes và giảm rõ ràng lƣợng tế bào CD8+. Có thể thấy cơ
chế này dựa trên hoạt tính điều biến miễn dịch của silymarin. Silymarin cũng
đƣợc dùng để chữa xơ gan do biến chứng tiểu đƣờng và viêm gan C mãn tính
cùng với các chất khác, gan nhiễm mỡ và đều cho kết

khả quan [18].

Các cơ chế bảo vệ chống bệnh gan

- Chống oxy hóa: Khả năng chố

của silymarin đã đƣợc chứng

minh bởi nhiều thử nghiệm. Các kết

nhận đƣợc chỉ ra rằng silymarin là

dạng chống oxy hóa bẻ chuỗi (chain-breaking) và loại gốc tự do. Cơ chế phân
tử của hoạt tính chống oxy hóa có thể suy ra từ cấu trúc các sản phẩm nhị
trùng nhận đƣợc từ các phản ứng của silybin.


16

- Ức chế tạo NO: Trƣờng hợp gan nhiễm mỡ, NO dƣ thừa sẽ cảm ứng sự
thiếu oxy máu và tăng độc tính đối với mononuclear macrophage hoạt tính.
Silymarin ức chế tế bào Kupffer của gan tạo NO và giảm tƣơng tác với O2.
- Giảm hoạt tính của phospholipase và bảo vệ màng gan bằng cách
chống lại thromboxane A, làm cho mạch máu chắc, ngăn phản ứng độc của tế
bào T và tăng lƣợng cAMP nội bào.
- Bảo vệ màng tế bào: Thông qua phản ứng chống oxy hóa lipid.
Silymarin điều chỉnh tính lƣu động của microsome gan và màng mitochondria
và giữ cho tính lƣu động của màng ở trạng thái chuyển động hoàn hảo.
- Màng tế bào ổn định và trao đổi năng lƣợng thuận tiện: Sử dụng
silymarin làm giảm đáng kể chức năng dị thƣờng và quá trình xơ hóa.
- Đẩy mạnh hepatic cytothesis: Silymarin có thể kết hợp với estradiol
receptor và hoạt hóa nó trong tế bào gan và kết

là tăng hoạt tính của RNA

polymerase nội bào.
- Cytokine và chức năng miễn dịch: Hiệu

kháng viêm và kháng xơ

hóa là do silymarin hoạt hóa tế bào hình sao (stellate) của gan và ổn định tế
bào lớn (mast). Silymarin có thể làm giảm lƣợng và hoạt tính cytotoxic
lymphocytes và các tế bào natural killer trong máu, điều đó cho thấy
silymarin có chức năng điều biến miễn dịch.
 Chất bảo vệ và chống ung thư : Silymarin/silybin ức chế tác dụng gây
ung thƣ của nhiều loại hóa chất. Một số khối u phụ thuộc hormone steroid
cũng bị ức chế. Những kết

nhận đƣợc khi thử nghiệm với các dòng tế

bào ung thƣ tuyến tiền liệt, buồng trứng…cho rằng điều chỉnh xuống thụ thể
phát triển màng trong mạch (vascular endothelial growth recptor 4 – VEGR)
và điều chỉnh lên angiopoietin-2 là các cơ chế tiềm năng chịu trách nhiệm cho
hoạt tính của các chất này [28], [45], [58].


17

Chất hỗ trợ trong liệu pháp chống ung thƣ: Một trong những hoạt tính
triển vọng của silybin là chống ung thƣ, vì vậy có thế sử dụng kết hợp với
phƣơng pháp hóa trị liệu. Silybin hoạt động nhƣ chất chống oxy hóa và bảo
vệ mô và loại bỏ chất độc cho gan.
 Bảo vệ thần kinh: Nhờ hoạt tính chống oxy hóa của chất này.
Silymarin ức chế sựu tạo thành các chất trung gian gây viêm nhƣ TFN-α và

nitric oxide và nhƣ vậy làm giảm hƣ tổn cho thần kinh dopaminergic. Dịch
chiết

bảo vệ thần kinh cá ngựa khỏi stress oxy hóa [40].

 Chữa và phòng chống các vấn đề dạ dày – ruột: Hiệu

phòng

bệnh đái đƣờng của silymarin là do hoạt tính chống oxy hóa hoặc tăng nồng
độ glutathione tuyến tụy và huyết tƣơng, hoặc cả hai. Silymarin là một khả
năng mới trong chữa bệnh đái tháo đƣờng do khả năng tăng lƣợng insulin và
phục hồi chức năng tuyến tụy. Silymarin cũng hoạt động trong ruột kết nhƣ
các chất ức chế đặc biệt β-glucoronidase vi khuẩn đƣờng ruột [40].
 Phòng và chữa bệnh thận: Cũng nhƣ đối với các bộ phận khác,
silymarin bảo vệ thận và chống oxy hóa.
 Phòng và chữa bệnh tim phổi: Silymarin tăng hiệu
phổi khi đƣợc sử dụng kết hợp với các loại thuốc. Hiệu

chữa bệnh tim
chữa bệnh của

silymarin có thể giải thích bởi tác dụng sinh học khác nhau của chất này, đó là
ổn định màng tế bào, chống viêm và ức chế con đƣờng arachiddonic axit.
Hiệu

phòng bệnh của silymarin có lẽ do cơ chế gián tiếp làm giảm đáp

ứng đến histamine và kết

là đáp ứng quá mẫn tức thì [40].

 Bảo vệ da: Cả silymarin và silybin đều biểu hiện hi

bảo vệ

chống ung thƣ do ánh sáng gây ra trên mô hình chuột. Cơ chế bảo vệ da đƣợc
chứng minh do khả năng làm giảm và ức chế tác dụng có hại của tia UV mặt
trời nhƣ stress oxy hóa, viêm, đáp ứng miễn dịch và tổn thƣơng DNA cũng
nhƣ cảm ứng chƣơng trình tự chết của tế bào [40].


18

 Tương tác với các thụ thể hormone steroid: Cả silymarin và silybin
đều biể

hoạt tính antiandrogenic trong dòng tế bào ung thƣ tuyến tiền

liệt, chúng ức chế sựu tăng sinh của tế bào ung thƣ phụ thuộc thụ thể
homonee steroid.
 Điều biến sự vận chuyển thuốc: Một cơ chế nhờn thuốc quan trọng là
do protein màng, ví dụ Pgp trong tế bào động vật. Silymarin ức chế protein
này và làm tăng sự tích tụ của thuốc trong tế bào.
 Điều khiển chương trình tự chết tế bào (apoptosis) và quá trình viêm:
Silybin biết

cảm ứng chƣơng trình tự chết của tế bào màng trong

(endothelial) và ức chế hình thành mạch, là quá trình quan trọng để khối u

phát triển và di căn. Slymarin có hoạt tính chống xơ vữa động mạch, có thể là
do bảo vệ lipoprotein vận chuyển cholesterol khỏi bị oxy hóa.

ực hiệ

1958 v

flavonolignans gồm silyibin, silychristin, silydianin

, aceton, methanol,
clorofom [35], [55].
cs

1500
1:50

[56].

-


19

cetat ethyl

t [61].
1.1.6. Những thành tựu trong nghiên cứu chế phẩm silymarin
Các chế phẩm chủ yếu của slymarin là viên nang, viên rắn, thể nhũ,
muối silymarin tiêm, hoặc phối trộn với một số tá dƣợc khác nhƣ PEG, PVP,
cyclodextrin…[18].

Thuốc viên: Nature,
Nature,s Bounty.

, N- Acetyl Cy
.
Viên nang:

: Viên

công ty US Trusted LLC.
, Inc
Bột: Hepatis B Xintai của

ng Châu, Trung Quốc có 5 loại thảo

dƣợc khác nhau: Dành dành (gardenia); rễ hòe (sophora), cành cây
amoorcom, rễ danshen và silymarin.
Thuốc tiêm: Muối meglumine là sản phẩm của phản ứng giữa silibin và
amine hữu cơ. Muối Di-meta-succinate sodium có chức năng bảo vệ gan
mạnh.
Các sản phẩm khác: Hỗn hợp β-cyclodextrin (β-CD) với silymarin; chất
phân bố silymarin rắn là PVP hoặc PEG; liposome; hỗn hợp phospholipid; các
hạt nano.


20

Có nhiều phƣơng pháp để chiết silymarin nhƣ ép lạnh và chiết bằng các
loại dung môi khác nhau [51] hoặc sử dụng n-hexane [52]. Mỗi phƣơng pháp
có những lợi thế và những bất lợi khác nhau.

1.2
1.2.1. Cây đậu tƣơng
Glycine max

. Trên thế giới có trên
1000 loại đậu tƣơng với nhiều đặc điểm khác nhau, hạt đậu tƣơng có kích
thƣớc nhỏ nhất nhƣ hạt đậu Hà lan (pea) cho tới lớn nhất giống trái anh đào
(cherry), hạt đậu có nhiều màu sắc nhƣ đỏ, vàng, xanh, nâu và màu đen [12],
[13].

thô

yc
c [41].

2

Rhizobium c

[12], [13].

1.2.2
Trong

, lipid,

glucid,
, cellul

: Độ ẩm 8-10%,

Protein 35-45%, Lipid 15-20%, Hydratecarbon 15-16%, Cellulose 4-6%,
Vitamin A 710 UI, Vitamin B1 300 UI, Vitamin B2 90 UI, Vitamin C 11 UI,
Muối khoáng 4,6%. Hàm lƣợng axit amin không thay thế trong protein


21

tƣơng

: Tryptophan 1,1%, Leucine 8,4%, Isoleucine 5,8%, Valine 5,8%,

Threo
ác acidbéo không thay thế có giá trị dinh dƣỡng cao,
acidkhông no: linoleic 52-65%, oleic 25-36%, linolenoic 2-3%,

acid

no: Acidpanmitic 6-8%, stearic 3-5%, arachidoic 0,1-1,0% [7], [12], [13].
Carbohydrates trong

thƣờng có : Các polysaccharide không

hòa tan nhƣ hemicellulose, các peptin, cellulose và các oligosaccharide nhƣ
hexose, rafinose, stachiose, verbascose. Tro của

rất giàu sắt và kẽm

[7], [12], [13].
1.2.3. Protein

1.2.3.1. Thành phần Protein đậu tƣơng
Sau khi hoà tan trong nƣớc hoặc ở pH kiềm nhẹ, các protein của
tƣơng có thể tách ra nhiều đoạn bằng các sắc kí thấm gel, bằng điện di, bằng
siên li tâm…..Với phƣơng pháp siên li tâm ngƣời ta tách ra đƣợc 4 đoạn ứng
với các hệ số sa lắng S20,W là 2S, 7S, 11S, 15
tổng lƣợng protein của hạt.

glixinin

acid

chiếm trên 70%

40%
-

-

1% axit amin S [34].
Trong thực phẩm có PH trung tính và không gia nhiệt thì các globulin 7S
và 11S nói chung đều ở trạng thái hoạt động, không bị biến tính, phân tử ở
dạng dime (7S) và oligome (11S) vì lực ion yếu. Các xử lí nhiệt và thay đổ
.
1.2.3.2. Tính chất của Protein đậu tƣơng
 Sự phân li và sự tập hợp của protein đậu tƣơng


22

Khi đun nóng dung dịch -conglixinin loãng ở pH=7-8 và lực ion yếu,

đến 1000C thì các phân tử của chúng sẽ phân li thành các dƣới đơn vị mà
không kèm theo các hiện tƣợng tập hợp phân tử.
Khi gia nhiệt đến 1000C dung dịch glixinin có nồng độ loãng(<1%P/V
) ), ở pH=7-7,6 và lực ion
0,2-0,4 thì các phân tử cũng phân li thành các dƣới đơn vị và sau đó thì tập
hợp lại.
Khi đun nóng đến 800C một dung dịch vừa chứa glixinin và

-

conglixinin có nồng độ loãng (<1%P/V) ở PH =8 thì các phản ứng phân li và
tập hợp sẽ xảy ra.
 Sự tạo gel của protein đậu tƣơng
Khi dung dịch protein
đun nóng ở PH gần trung tính thì sẽ

có nồng độ đậm đặc (>5% P/V) đƣợc
gel. Dung dịch đầu tiên qua một trạng

thái lỏng có độ nhớt tăng cao, giai đoạn tiền gel. Khi lực ion còn yếu thì trạng
thái này sẽ xảy ra từ 700C là thời điểm mà -conglixinin đƣợc giãn mạch hoàn
toàn. Khi lực ion cao thì việc tăng độ nhớt chỉ xảy ra ở nhiệt độ cao hơn. Việc
tạo thành gel protein sẽ phụ thuộc vào cân bằng giữa liên kết protein – nƣớc
và liên kết protein – protein.
Độ cứng của gel protein đậu nành sẽ giảm cùng nồng độ NaCl và
.
Axit hoá dung dịch protein

đến pH =5,5 hoặc thêm ion Ca2+sẽ

làm đông tụ protein thành từng cục tƣơng đối đàn hồi. Nếu đun nóng các cục
đã thu đƣợc bằng kết tủa đẳng điện hoặc bằng canxi sẽ làm các chuỗi
polypeptide bị giãn mạch và tạo nên một mạng lƣới protein ba chiều có kết
cấu của một gel thực thụ.


23

 Một vài tính chất khác
Protein

cực kỳ bền nhiệt, có thể chịu nhiệt đến 77oC. Tuy

nhiên ở nhiệt độ đó protein không thể tan trở lại. Protein

có thể bền

nhiệt đến 100oC khi thêm vào các yếu tố làm tăng lực ion.
Trong phần lớn các ứng dụng của

, việc gia nhiệt thấp để vô

hoạt các enzym là cần thiết.Tuy nhiên trong một vài ứng dụng, khi protein
gia nhiệt ở nhiệt độ thấ
lipoxygenase hoạt động

thêm vào

các chất có chứa

xảy ra sự oxy hóa. Sự ôxy hóa này có thể gây ra
sản phẩm. Nó cũng có thể

sự phá hủy màu sắc và vì thế

gây ra sự oxy hóa những nhóm sunfit tự do từ liên kết disunfua. Cả 2 chức
năng này đều quan trọng trong việc chuẩn bị bột nguyên liệu cho công nghiệp
làm bánh.
1.2.4.

Protein hydrolysate đậu tƣơng

Protein hydrolysate ( PHs:

hỗn hợp của oligopeptides, polypeptides

và axit amin tự do) đƣợc sử dụng để chữa các bệnh về trao đổi chất, các công
thức cho chế độ ăn kiêng và cho trẻ em, ngƣời già và vận động viên [30]. Quá
trình thủy phân protein đậu tƣơng tạo ra các peptides nhỏ
đƣợ

ng minh

ng, các peptides ngắn hấp thụ trong đƣờng ruột với tốc độ cao hơn so

với các axit amin tự do. Điều này cho thấy lợi thế của protein hydrolysate với
cùng một lƣợng axit amin đƣợc sử dụng trong chế độ dinh dƣỡng của bênh
nhân sau mổ hoặc cho ngƣời có tuổ

cũng đƣợc sử dụng

trong dinh dƣỡng thể thao và kiểm soát trọng lƣợng, trong chế độ ăn uống đặc
biệt đối với các bệnh nhân mắc một số bệnh nhƣ pancreatitis, short bowel
syndrome, bệnh Crohn’s và dị ứng thực phẩm. Hoạt tính chống oxy hóa của
protein đậu tƣơng đã đƣợc báo cáo [33]. Những báo cáo cũng cho thấy hàm
lƣợng các axit amin quan trọng trong protein đậu tƣơng đáp ứng yêu cầu dinh
dƣỡng của ngƣời trừ lysine và methionine [27]. Thủy phân protein đậu tƣơng


24

các phƣơng pháp khác nhau đã nhận đƣợc nhiều peptides hoạt tính sinh
học với các đặc tính chống tăng huyết áp, chống tăng cholesterol, chống béo
phì, chống oxy hóa, chống khối u, điều biến miễn dịch và đối kháng vi sinh
vật [22], [32], [36], [59], [60]. Wang và cs. (2008) đã xác định đƣợc 3
peptides trong protein hydrolysate đậu tƣơng có hoạt tính ức chế
topoisomerase II [57]. Các peptides chống tăng huyết áp và ức chế enzyme
angiotesin – converting (ACE). Enzyme này làm tăng huyết áp bằng cách
biến đổi decapeptide angiotensin I thành octapeptide angiotensin II làm co
mạch, dẫn đến huyết áp tăng. Rất nhiều tài liệu chỉ ra rằng, protein đậu tƣơng
có thể làm giảm nồng độ cholesterol máu ở ngƣời và động vật, nhƣng cơ chế
này đƣợc các tác giả đƣa ra không thống nhất. Một số nhà nghiên cứu cho
rằng, hiệu

giảm cholesterol là do các hợp chất iosflavones tự nhiên, một

số khác lại tin rằng do protein hấp thụ, nhƣng cũng có thể do các peptides
hoạt tính điều biến cholesterol homeostasis tại gan [60]. Hiệu

chống béo

phì của protein và peptides đậu tƣơng đã đƣợc Nakamori (2002) tổng quan
[36]. Một số nghiên cứu chúng minh peptides đậu tƣơng ức chế thu nhận thức
ăn và làm sạch ruột bằng cách tiết ra cholecystokinin kích thích (CCK). Kết
này cho rằng cơ chế hoạt động của peptides đậu tƣơng là điều chỉnh thu
nhận thức ăn bằng cách cảm ứng sự no thông qua việc hoạt hóa các thụ thể
opioid và CCK trong ruột [38].
Hiện có khá nhiều nghiên cứu liên quan đến thủy phân protein đậu tƣơng
để thu các peptides ngắn, chủ yếu s dụng phƣơng pháp nhiệt để thủy phân
bằng enzymes. Các enzymes proteases thƣờng đƣợc sử dụng bao gồm papain,
alcalase, bromelain, pancreatin hoặc trypsin, trong đó papain đƣợc sử dụng
bởi nhiều tác giả [30], [31], [37], [48]. Trong quá trình thủy phân các peptides
có axit amin kỵ nƣớc ở đầu N hoặc C đƣợc tạo ra và chúng làm cho
hydrolysate có vị đắng. Để giảm vị đắng, sử dụng aminopeptidase để tách các