Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)” potx

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN







TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN







NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC
CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT
HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)








LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN






TRƯƠNG THỊ MỸ DUYÊN







NGHIÊN CỨU KIỂU PLASMID VÀ TÍNH KHÁNG THUỐC
CỦA VI KHUẨN Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT

HUYẾT TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)





LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN





CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ths. NGUYỄN THỊ THU HẰNG








2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ

Để hoàn thành tốt một Luận văn tốt nghiệp thì mỗi một sinh viên đều phải trãi
qua những khó khăn và vất vả. Tuy nhiên, những khó khăn đó không gây trở ngại

cho quá trình làm luận văn của tôi. Vì đã được sự giúp đỡ cũng như động viên
của gia đình, thầy cô và bạn bè trong suốt thời gian thực hiện đề tài của mình.
Nhân đây tôi xin được gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến:
Gia đình và người thân của tôi đã ủng hộ rất nhiều về mặt tinh thần cũng như vật
chất cho quá trình thực tập.
Cô Nguyễn Thị Thu Hằng đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý
kiến quý báo trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Thầy cô và các anh chị trong bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản, khoa Thủy sản,
Đại học Cần Thơ đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình nghiên cứu.
Các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên cũng như giúp đỡ tôi khi thực
hiện đề tài và trong suốt quá trình học tập tại trường.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
ii
TÓM TẮT

Đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus)”
được thực hiện trên 8 chủng A. hydrophila phân lập trên cá tra bệnh xuất huyết và
tất cả vi khuẩn đã được định danh đến loài. Đề tài được thự hiện thông qua 3 nội
dung: (i) kiểm tra kháng sinh đồ với các kháng sinh Amoxycillin (AMX, 25µg),
Ciprofloxacin (CIP, 5µg), Colistin (CS, 50µg), Doxycycline (DO, 30µg),
Florfenicol (FFC, 30µg), Oxolinic acid (OA, 2µg), Streptomycin (S, 10µg),
Norfloxacin (NOR, 10µg), (ii) xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của kháng
sinh streptomycin và (iii) ly trích plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila.
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy có 7/8 chủng kháng với amoxicillin, 7/8 mẫn cảm
với ciprofloxacin, doxycycline, florfenicol, streptomycin. Với kháng sinh colistin
có 2/8 chủng nhạy trung bình và 6/8 mẫn cảm với kháng sinh này. Kháng sinh
oxolinic acid có 3/8 kháng, 5/8 mẫn cảm. Kháng sinh norfloxacin có 1/8 kháng,
1/8 trung bình nhạy, 6/8 mẫn cảm. Từ kết quả kiểm tra kháng sinh đồ chọn ra 1
loại kháng sinh (streptomycin) mà vi khuẩn mẫn cảm để xác định nồng độ ức chế

tối thiểu (MIC) của kháng sinh trên vi khuẩn A. hydrophila. Qua đó cho thấy, đa
phần các chủng cho kết quả mẫm cảm với streptomycin với giá trị MIC dao động
từ 4-16ppm. Chỉ duy nhất 1 chủng kháng với streptomycin ở nồng độ 256ppm.
Bên cạnh đó, để tìm hiểu với những kết quả kháng thuốc trên của A. hydrophila
thì chúng có kiểu plasmid như thế nào. Đề tài đã tiến hành ly trích và diện di
plasmid của 8 chủng A. hydrophila. Kết quả chỉ phát hiện được plasmid của 2
chủng: CA1.2T và CA1.3TT. Chúng có kiểu plasmid khác nhau, biểu hiện hai
vạch không tương đồng nhau.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH V
CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1 Giới thiệu 1
1.2 Mục tiêu đề tài 2
1.3 Nội dung đề tài 2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long 3
2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila) 5
2.3 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL .
6
2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc 8
2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9
2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản 9
2.5.2 Khái niệm kháng sinh 9

2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản 9
2.6 Sơ lược về plasmid ở vi khuẩn. 12
2.6.1 Các loại plasmid 13
2.6.2 Plasmid tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào 13
2.6.3 Plasmid có khả năng vận chuyển gen 14
2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid. 14
2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 14
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 16
3.2 Vật liệu nghiên cứu 16
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu 16
3.2.2 Dụng cụ 16
3.2.3 Thiết bị 16
3.2.4 Hóa chất và môi trường 16
3.3 Phương pháp nghiên cứu 17
3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn 17
3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ 17
3.3.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC 19
3.3.4 Phương pháp ly trích plasmid DNA vi khuẩn (Bartie, 2004) 20
3.3.5 Phương pháp xử lý số liệu 21
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 22
4.1 Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22
4.2 Kết quả xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 26
4.3 Kết quả ly trích plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila 28
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 32
5.1 Kết luận 32
5.2 Đề xuất 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO 33

PHỤ LỤC 38

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
v
DANH SÁCH BẢNG VÀ HÌNH

Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ 18
Bảng 3.2: Nuôi vi khuẩn ở các hàm lượng thuốc khác nhau (cho một chủng) 20
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ 23
Hình 4.1: Vi khuẩn Aeromonas hydrophila trên môi trường NA 22
Hình 4.2: Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Aeromonas hydrophila 22
Hình 4.3: Kết quả kháng sinh đồ trên vi khuẩn Aeromonas hydrophila 23
Hình 4.4: Kết quả MIC của streptomycin với vi khuẩn Aeromonas hydrophila
27
Hình 4.5: Kết quả MIC ở nồng độ 256ppm (mũi tên) 28
Hình 4.6: Kết quả điện di trên 8 chủng Aeromonas hydrophila 29

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
CHƯƠNG 1

ĐẶT VẤN ĐỀ
1.1 Giới thiệu
Cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) là một trong các loài cá da trơn có kích
thước lớn nhất trong họ Pangasiidae phân bố ở hạ lưu sông Mê Kông. Vùng Đồng
Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống nuôi cá tra ở quy mô nông hộ từ
lâu đời. Những thành công trong sản xuất giống nhân tạo vào những năm 1990 đã
thúc đẩy sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi cá tra, trở thành nghề công nghiệp ở
nhiều nơi như An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long v.v… (Dương Nhựt
Long, 2003).

Sản phẩm cá tra nuôi được chế biến đa dạng và xuất khẩu nhiều nước trên thế
giới. Thị trường tiêu thụ được mở rộng góp phần rất lớn trong việc phát triển
công nghiệp nuôi cá tra hiện nay. Diện tích nuôi càng mở rộng, năng xuất nuôi và
sản lượng cá tra hàng năm tăng lên rất đáng kể. Cụ thể năm 2006 sản lượng cá tra
là 825.000 tấn, kim ngạch xuất khẩu là 736.872.115 USD (Vũ Văn Dũng, 2007).
Tuy nhiên, bên cạnh sự phát triển đó thì người nuôi cá tra ở ĐBSCL cũng gặp
không ít những khó khăn trở ngại. Trở ngại đầu tiên là việc phát triển diện tích
nuôi thủy sản với tốc độ nhanh đang phá vỡ quy hoạch vùng nuôi thuỷ sản an
toàn, gây ô nhiễm môi trường làm phát sinh dịch bệnh. Khó khăn lớn nhất mà
người nuôi gặp phải là tình hình dịch bệnh, làm giảm năng xuất và sản lượng
nuôi. Thêm vào đó việc nuôi cá tự phát, không kiểm soát trong những năm gần
đây, người nuôi luôn gia tăng mật độ trong khi trình độ kỹ thuật còn hạn chế.
Chất thải ao nuôi thải trực tiếp ra môi trường đã tạo điều kiện cho mầm bệnh phát
triển, nhất là bệnh vi khuẩn chiến đa số và xuất hiện với tần xuất cao. Trong đó,
bệnh xuất huyết do Aeromonas hydrophila gây ra chiếm tỉ lệ khá cao. Mặc khác,
do bệnh trên cá nuôi xuất hiện ngày càng nhiều: Xuất huyết, phù đầu, gan thận
mủ,…và việc diễn biến phức tạp của bệnh đã khiến người nuôi sử dụng rất nhiều
loại kháng sinh, hóa chất với nồng độ không ngừng gia tăng (Nguyễn Quốc
Thịnh, 2004−2006). Từ những nguyên nhân đó đã làm cho tình hình dịch bệnh
ngày càng diễn biến phức tạp. Tạo nên dòng vi khuẩn kháng thuốc làm cho việc
điều trị gặp nhiều khó khăn và trở ngại. Theo kết quả nghiên cứu của Đặng Thị
Hoàng Oanh và ctv (2005), trong 196 dòng vi khuẩn phân lập từ các hệ thống
nuôi thủy sản ở ĐBSCL (có cả Aeromonas) hầu hết cho kết quả kháng thuốc và
có 34% kháng nhiều loại kháng sinh. Với giá trị MIC có 91 % các dòng vi khuẩn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
2
thử nghiệm có giá trị rất cao (dao động 512 đến ≥1.024ppm). Bên cạnh đó, thì
việc kháng thuốc ở vi khuẩn một số còn có liên quan đến việc hình thành plasmid
kháng thuốc (R-plasmid) của chúng (Trần Thị Thanh, 2000; Nguyễn Lân Dũng
và ctv, 2007 và Saitanu et al., 1994). Tuy nhiên, những thông tin về việc hình

thành plasmid kháng kháng sinh ở vi khuẩn gây bệnh trên động vật thuỷ sản ở
ĐBSCL còn cần nhiều nghiên cứu để góp phần tìm hiểu rõ hơn những plasmid
kháng thuốc ở vi khuẩn.
Từ những vấn đề trên đề tài “Nghiên cứu kiểu plasmid và tính kháng thuốc
của vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra
(Pangasianodon hypophthalmus)” được thực hiện.
1.2 Mục tiêu đề tài
Nhằm tìm hiểu kiểu plasmid và tính kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas
hydrophila
1.3 Nội dung đề tài
− Lập kháng sinh đồ và xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của vi khuẩn
Aeromonas hydrophila.
− Xác định kiểu plasmid của vi khuẩn Aeromonas hydrophila.

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
CHƯƠNG 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược tình hình dịch bệnh trên cá tra ở Đồng Bằng sông Cửu Long
Cá tra là loài có khả năng sống tốt trong điều kiện ao tù nước đọng, nhiều chất
hữu cơ, mật độ nuôi cao và oxy hòa tan thấp (Dương Nhựt Long, 2003). Tuy
nhiên, chúng vẫn bị một số bệnh do vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng… Sự hiện
diện của những bệnh này đã làm giảm năng xuất và sản lượng cá nuôi rất lớn, gây
nhiều thiệt hại cho người nuôi cá tra thâm canh ở ĐBSCL.
Những năm 1999-2000, 2002-2003 cá tra bị bệnh, chết nhiều với các biểu hiện:
xuất huyết ở miệng và hầu, nổ mắt, thận sưng và có những đốm trắng (Nguyễn
Chung, 2008). Đặc biệt vào đầu năm 2006 trên sông Tiền và sông Hậu xảy ra
hiện tượng cá tra chết hàng loạt, với đa số có biểu hiện xuất huyết và gan thận có
nhiều đốn trắng (Hà Văn và Bình Nguyên, 2006). Trước đây, bệnh do vi khuẩn

Edwardsiella ictaluri (gan thận mủ) gây ra trên cá tra nuôi ở ĐBSCL đã được
Ferguson et al., (2001) phát hiện là xuất hiện đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1998
đã gây nhiều thiệt hại cho nghề nuôi cá nơi đây.
Hiện nay những bệnh thường gặp và gây thiệt hại lớn cho nghề nuôi cá tra gồm
ký sinh trùng như: Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus, nấm thủy mi, trùng quả
dưa (Ichthyophthyrius), trùng mỏ neo (Lerneae), rận cá (Argulus), trong đó hai
loài gây thiệt hại nhiều nhất là Trichodina và Dactylogyrus. Bệnh vi khuẩn như:
Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, A. sobria, Edwardsiella ictaluri, E.
tarda, Pseudomonas sp,…Trong đó hai loài gây thiệt hại nhiều nhất là
Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ, đỏ kỳ, xuất huyết và
Edwardsiella ictaluri tác nhân gây bệnh mủ gan (Trần Anh Dũng, 2005).
Bên cạnh những bệnh ký sinh trùng trên thì trong một số nghiên cứu của Nguyễn
Quang Hưng (2001), Cao Tuấn Anh (2005) về bệnh ký sinh trùng trên cá tra
giống cũng có các bệnh tương tự là Trichodina, Dactylogyrus, Myxobolus,
Ichthyophthyrius… Ngoài ra, theo kết quả khảo sát của Huỳnh Cẩm Tú (2006),
thì có thêm một số giống loài ký sinh trùng như: Epistylis sp, Protoopalina sp,
trong đó Trichodina và Dactylogyrus xuất hiện thường xuyên và chiếm tỉ lệ cao.
Theo Nguyễn Quốc Thịnh (2004), vào năm 2004 bệnh phù đầu có tần suất xuất
hiện nhiều nhất, chiếm (60%). Đây là loại bệnh nguy hiểm, tốn nhiều chi phí cho
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
việc điều trị và gây thiệt hại lớn cho nông dân. Kế đến là bệnh gan thận mủ chiếm
tỷ lệ cao (40,7%). Đây là bệnh gây nhiều thiệt hại làm ảnh hưởng đến năng suất
và lợi nhuận. Bệnh có tần suất xuất hiện thấp nhất là tuột nhớt, lở loét, trắng
mang (chiếm 1,9%). Đến năm 2006, bệnh ký sinh trùng và vàng da xuất hiện hầu
hết các hộ nuôi còn bệnh phù đầu cũng như gan thận mủ xuất hiện với tỉ lệ thấp
(21,4% và 3,6%). Ngoài bệnh ký sinh trùng và bệnh vàng da thì xuất huyết đường
ruột hay còn gọi là bệnh đốm đỏ cũng có xu hướng tăng mạnh (từ 13% năm 2004
lên đến 93% năm 2006).
Theo thống kê của Lý Thị Thanh Loan (2008) tần suất xuất hiện bệnh trên cá tra

vào năm 2007 ở các tỉnh ĐBSCL: Gan thận mủ 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù
đầu, phù mắt 20,70% và vàng da 21,60% (Trích dẫn bởi Nguyễn Trọng Bình,
2008).
Từ kết quả điều tra của Huỳnh Văn Quang (2008), cũng cho thấy có hai loại bệnh
thường xuyên xuất hiện và gây thiệt hại nghiêm trọng trong quá trình nuôi của
các hộ nuôi cá tra là bệnh gan thận mủ và xuất huyết. Theo thống kê cho thấy, hai
loại bệnh này xuất hiện hầu như quanh năm. Mức độ thiệt hại của bệnh gan thận
mủ thường cao hơn bệnh xuất huyết, bình quân mức thiệt hại của gan thận mủ là
33,4% tuyến sông Tiền và 43,9% tuyến sông Hậu; trong khi đó, mức thiệt hại
bình quân của bệnh xuất huyết là 8% tuyến sông Tiền và 25,1% tuyến sông Hậu
(Sở Nông nghiệp Vĩnh Long, 2008).
Bên cạnh đó từ kết quả khảo sát của Trần Kiều Lan Phương (2008), cho thấy dịch
bệnh trên cá tra ở Cần Thơ cũng bao gồm: xuất huyết chiếm 35,2%, chiếm tỉ lệ
cao nhất là gan thận mủ 94,4%, và các bệnh như trắng gan trắng mang, đốm đỏ,
vàng da chiếm tỉ lệ thấp khoảng trên 20%. Ngoài ra thì cá tra còn bị ảnh hưởng
bởi bệnh ký sinh trùng chiếm 11,3% và bệnh đỏ mỏ đỏ kỳ và bệnh phù đầu chiếm
không quá 7%.
Hầu như các tỉnh nuôi cá tra ở ĐBSCL đều phải đương đầu với bệnh xuất huyết,
gan thận mủ, vàng da, ký sinh trùng… Nhưng bệnh trên cá tra thường xuất hiện
nhiều ở những vùng có diện tích nuôi cá tra lớn như An Giang, huyện Thốt Nốt,
Phụng Hiệp của tỉnh Cần Thơ… (Từ Thanh Dung và ctv, 2004). Tổng diện tích
nuôi cá tra ở ĐBSCL là rất lớn, thêm vào đó thì con cá tra là loài rất dễ nuôi lại
mau lớn. Cho nên, những người dân không cần trình độ chuyên môn vẫn có thể
nuôi tốt loài cá này. Trước đây nuôi cá tra đa phần là nuôi tự phát, không có quy
hoạch và phần lớn thì cũng chỉ dựa vào kinh nghiệm. Vì vậy việc quản lý tốt môi
trường nuôi cũng như khống chế dịch bệnh thì cũng là một chuyện khó khăn. Bên
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
cạnh đó, đa phần người nông dân nuôi cá cũng không có nhận thức tốt về sự ô
nhiễm của nước thải từ ao nuôi khi cho thải trực tiếp ra môi trường ngoài, trong

khi chúng chưa qua xử lý. Từ đó, đi đôi với việc gia tăng diện tích nuôi thì môi
trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng, là một trong những nguyên nhân lớn làm
bùng phát dịch bệnh khó kiểm soát (Trần Anh Dũng, 2005).
2.2 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila (A. hydrophila)
Trước đây, giống Aeromonas thuộc họ Vibrionaceae do chúng có một vài đặc
điểm tương tự Vibrio. Nhưng đến giữa thập niên 80 Aeromonas được tách ra một
họ riêng là Aeromonadaceae (Horneman và Moris, 2007) bởi có các chỉ tiêu sinh
lý, sinh hóa khác biệt như không mẫn cảm với phản ứng O/129 (150 µg) ngoại trừ
A. caviae (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Theo Barrow và Feltham (1993), Aeromonas được chia thành 2 nhóm dựa trên
khả năng di động và ngưỡng nhiệt độ phát triển của chúng. Nhóm thứ nhất gồm:
A. hydrophila, A. sobria và A. caviae có các đặc điểm là có khả năng di động, hai
đầu hơi tròn, gram âm, hình que ngắn, hiếu khí không bắt buộc, phát triển được ở
37
o
C… Nhóm thứ hai là A. salmonicida (có 3 loài phụ gồm: A. salmonicada, A.
achromogenes và A. nova) có đặc điểm tương tự nhưng chúng chỉ phát triển tốt
nhất ở 22
o
C hoặc thấp hơn và không có tiêm mao cũng như chúng không có khả
năng di động (Trích dẫn bởi Nguyễn Hà Giang, 2008).
Shotts & Rimler (1973), A. hydrophila có những đặc trưng sau: Gram âm, que
thẳng, kích thước khoảng 0,5x1,4-4,0µm, có roi ở hai cực cơ thể, kỵ khí, lên men
cacbonat hình thành acid hoặc khí gas, oxydase dương tính, khử nitrat (Trích dẫn
bởi Dương Võ Mỹ Hạnh, 2008).
Aeromonas hydrophila khi phát triển trên môi trường đặc trưng SA sẽ cho các
khuẩn lạc có dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và có màu vàng nhạt. Cho phản ứng dương
tính với Oxidase và Catalase, có khả năng lên men các môi trường đường và sinh
khí từ glucose nhưng không có khả năng tạo khí H
2

S, cho phản ứng dương tính
với MR-VP, lysine, arginine, và ornithine. Đặc biệt chúng có khả năng phát triển
được ở nồng độ muối 6%, nên đã thể hiện được đặc tính phân bố rộng muối
(Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005).
B. Austin và D. Austin (1986), cho rằng A. hydrophila là nguyên nhân của một
vài tình trạng bệnh khác nhau như thối vây, bệnh đốm đỏ và thường liên kết với
mầm bệnh khác như A. salmonisida. Bệnh đốm đỏ là biểu hiện sự có mặt của
những vết thương trên da, đặc biệt xuất huyết ở mang và hậu môn, loét, ung mủ,
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
lồi mắt, phình bụng. Bên trong xoang bụng tích tụ dịch loãng, gây thiếu máu và
tổn thương các cơ quan như gan, thận.
Đặc điểm bệnh do Aeromonas gây ra là làm cho động vật mắc bệnh xuất huyết,
hình thành các vết đỏ trên cơ thể, lở loét ở da và các vết loét này ngày càng lan
rộng ra trên bề mặt da, các cơ quan hoặc ăn sâu vào bên trong cấu trúc mô. Tùy
vào đối tượng nuôi, nhóm vi khuẩn gây bệnh và giai đoạn bệnh mà có những biểu
hiện bệnh lý khác nhau (Inglis et al., 1993).
Nhóm gây bệnh thường gặp là A. hydrophila, A. sobria và A. caviae, được phát
hiện đầu tiên trên cá chình trong báo cáo dịch bùng phát bệnh của Sanarelli
(1891). Kế đến trong các nghiên cứu sau này trên cá chép của Schaperclaus
(1930), phân lập được vi khuẩn A. hydrophila và cho đây là tác nhân gây bệnh
cho cá (Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993).
Ngoài ra, A. hydrophila còn là tác nhân thứ cấp gây bệnh tuột nhớt trên cá bống
tượng và gây chết cao vào mùa nước đổ ở ĐBSCL (Nguyễn Thị Như Ngọc,
1997). Đến năm 1998, Phạm Hoàng Sanh đã phân lập được 3 giống vi khuẩn trên
cá bệnh xuất huyết là Streptococcus, Aeromonas, Pseudomonas. Đây cũng là
bệnh gây thiệt hại nhiều ở cá bè nuôi thịt, bệnh xuất hiện vào mùa khô (tháng 11
đến tháng 4 dương lịch) và rất thường xảy ra đối với cá nuôi bè, chiếm 33% trong
64,84% số bè bị bệnh, làm giảm đáng kể sản lượng cá basa (Nguyễn Minh Nhí,
2007). Bên cạnh đó thì Aeromonas sp còn được phân lập cả trên tôm càng xanh

với những biểu hiện cụt râu và mòn phụ bộ (Nguyễn Thị Thu Hằng, 2005). Ngoài
ra, A. hydrophila còn là tác nhân gây bệnh nhiễm trùng máu, xuất huyết trên cá
trắm cỏ, rô phi, tra, basa, mè vinh (Từ Thanh Dung, 1999. Trích dẫn bởi Lê Trung
Tính, 2007)
2.3 Tình hình sử dụng thuốc và hóa chất trong nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL
Trong thời gian qua, do chưa có sự thống nhất cao giữa các Bộ nghành trong việc
đưa ra những qui định về việc quản lý sản xuất kinh doanh, sử dụng thuốc, hóa
chất còn lỏng lẽo, chưa có biện pháp chế tài hữu hiệu đủ răn đe sai phạm. Từ đó
việc sản xuất kinh doanh và sử dụng thuốc trong nuôi trồng thủy sản vẫn còn
nhiều sai phạm. Người nuôi đang chịu áp lực rất lớn từ các nhà sản xuất kinh
doanh thuốc và hóa chất, trong khi các sản phẩm mới thường xuyên được tung ra
thị trường mà thông tin về chúng thì ít. Nhưng các quảng cáo về tính năng, hiệu
quả thì nhiều làm cho người nuôi mù mờ, sử dụng tràn lan gây nhiều nguy cơ mất
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
7
an toàn vệ sinh thực phẩm, ô nhiễm môi trường, tạo dòng vi khuẩn kháng thuốc…
(Nguyễn Thị Phương Nga, 2004).
Cụ thể, trong khảo sát của Nguyễn Thị Phương Nga (2004), tại 3 tỉnh Sóc Trăng,
Bạc Liêu và Cà Mau có 983 sản phẩm thương mại thuốc, hóa chất trên 468 sản
phẩm thuốc, hóa chất được Bộ Thủy sản cho phép sử dụng trong nuôi trồng thủy
sản được cung cấp bởi 110 nhà sản xuất, kinh doanh, trong đó các nhóm: hóa chất
257 sản phẩm, khoáng thiên nhiên 169 sản phẩm, vitamin-premix-lipid 230 sản
phẩm, chế phẩm sinh học 191 sản phẩm, riêng kháng sinh 136 sản phẩm được sử
dụng trong nuôi trồng thủy sản, trong đó có 40 loại chỉ chứa 1 kháng sinh thuộc
nhóm hạn chế sử dụng, còn lại kết hợp ít nhất 1 kháng sinh hoặc thuốc giảm đau,
kháng viêm, trị nấm.
Bên cạnh đó, tình hình sử dụng thuốc, hóa chất trong nuôi cá tra công nghiệp ở
Đồng Tháp cũng được ghi nhận có 90 loại thuốc, hóa chất được sử dụng trong
nuôi trồng thủy sản với các mục đích: Diệt tạp, trộn vào thức ăn để phòng bệnh và
trị bệnh trực tiếp. Riêng kháng sinh trị bệnh cho cá có 58 loại thì hầu hết nằm

trong danh mục hạn chế sử dụng, nhiều loại ở dạng nguyên liệu và nguồn gốc
không rõ ràng, riêng chất Malachite Green là chất nằm trong danh mục Bộ Thủy
sản cấm sử dụng nhưng vẫn được người nuôi sử dụng trong nuôi cá ở đây (Phạm
Thanh Tuấn, 2004).
Ngoài ra, từ kết quả khảo sát của Nguyễn Chính (2005) ở An Giang và Cần Thơ,
cho thấy có 394 loại thuốc, hóa chất do 75 nhà sản xuất đang được kinh doanh
trong khu vực. Trong đó có 16% sản phẩm kháng sinh phối trộn từ 3 kháng sinh
trở lên, vi phạm qui định về phối trộn kháng sinh: theo quyết định 07/2005 của
Bộ Thủy sản. Thuốc, hóa chất nguyên liệu được bán lẻ công khai mà không cần
toa nhãn cho người sử dụng. Đối với nhóm kháng sinh, các nhà sản xuất đưa ra
những khuyến cáo chưa tuân thủ đúng qui định cũng như thời gian ngưng sử dụng
trước khi thu hoạch.
Qua khảo sát của Châu Hồng Thúy, (2008) có 100% người nuôi xác nhận có sử
dụng kháng sinh, hóa chất để phòng trị bệnh cho cá nuôi. Trong đó các loại kháng
sinh thuộc nhóm Quinolone được sử dụng nhiều nhất, kế đến là các chất thuộc
nhóm Aminoside. Nhóm Lactam có Amoxicillin và Ampicillin cũng được sử
dụng rộng rãi. Nhóm Tetracyclin có Oxytetracyclin cũng được sử dụng nhưng
không nhiều lắm còn các nhóm kháng sinh còn lại có mặt nhiều trên thị trường
nhưng người nuôi cho là không quen nên rất ít sử dụng. Và các kháng sinh
florfenicol, doxycycline, norfloxacin, enrofloxacin được hầu hết cá hộ nuôi cá
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
được khảo sát ở Trà Vinh sử dụng. Bên cạnh đó, khảo sát của Nguyễn Chính
(2005) cũng cho thấy kháng sinh ở hầu hết các nhóm đều được người nuôi cá sử
dụng. Trong đó, các kháng sinh thuộc nhóm quinolones là được sử dụng với tần
suất cao.
Riêng nhóm Sulfonamide và Colistin thường được sản xuất như là một dạng
kháng sinh kết hợp nên có mặt trong nhiều sản phẩm thuốc điều trị bệnh và
đương nhiên cũng được sử dụng với tỷ lệ cao. Về liều lượng sử dụng, qua tìm
hiểu thì để chắc ăn, thực tế liều lượng sử dụng để điều trị bệnh là cao hơn liều

lượng ghi trên nhãn nhiều lần (Nguyễn Chính, 2005).
Theo Nguyễn Thị Phương Nga (2004) cũng như Phạm Thanh Tuấn (2004) đều
ghi nhận rằng người nuôi thường tự sử dụng thuốc, hóa chất trong phòng trị bệnh
cho cá nuôi hoặc theo chỉ dẫn của người bán hoặc theo nhãn thuốc (64%) và theo
kinh nghiệm bản thân (59%) tự pha trộn thuốc trong khi không biết rõ tính kết
hợp hay đối kháng của thuốc. Rất ít khi theo chỉ dẫn của cán bộ thú y hoặc cán bộ
khuyến ngư (3%). Người nuôi biết rất rõ về danh mục các loại thuốc cấm nhưng
một số vẫn còn lén lút sử dụng mà chưa hiểu biết rõ về các nguy cơ của việc sử
dụng thuốc, hóa chất trong phòng trị bệnh cho cá. Thuốc nguyên liệu và thuốc sử
dụng cho người vẫn được sử dụng trong nuôi cá tra (Phan Trọng Duy, 2007).
2.4 Hình thành hệ vi khuẩn kháng thuốc
Đây là một bài toán nang giải mà hiện nay các nhà khoa học đang rất quan tâm
nghiên cứu, các quốc gia và người nuôi trồng thủy sản phải đối mặt. Trong khi
kháng sinh được sử dụng rộng rãi cho người và vật nuôi trên cạn thì việc sử dụng
chúng trong nuôi trồng thủy sản lại là vấn đề có tầm quan trọng đặc biệt vì nó liên
quan tới phương thức phân bố thuốc. Không giống như trên cạn môi trường nước
rất dễ phát tán, do đó khi cho vào nước thì thuốc nhanh chóng lan truyền cả ao
nuôi thậm chí ra cả thủy vực tự nhiên quanh trại, thủy sản được nuôi với mật độ
cao, thuốc có thể trộn vào thức ăn hoặc trực tiếp vào nước (Herwig et al., 1977).
Kết quả là thuốc phát tán rất nhanh và tồn lưu (tuy mức độ có khác nhau) cả trong
ao nuôi và nguồn nước tự nhiên chung quanh. Điều này làm cho xuất hiện dòng vi
khuẩn kháng thuốc. Một khi đã có dòng vi khuẩn kháng thuốc thì phải đưa kháng
sinh mới để có thể tiêu diệt chúng và cứ kéo dài chuổi thay đổi thuốc qua nhiều
chu kỳ nuôi thì đến một thời điểm việc nghiên cứu ra thuốc mới sẽ không kịp đáp
ứng như cầu, hơn nữa có rất nhiều chất có độc tính hoặc mối nguy tìm tàng cao đối
với cơ thể con người (Chloramphenicol, nhóm Nitrofurane…). Đã có rất nhiều
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
9
công trình nghiên cứu khoa học cho thấy rằng việc sử dụng kháng sinh trong nuôi
trồng thủy sản có nguy cơ rất cao tạo ra dòng vi khuẩn kháng thuốc, vi khuẩn có

thể tự đột biến và kháng được nhiều thuốc, có thể thừa hưởng về đặc điểm di
truyền, cấu trúc hoặc trạng thái sinh lý mà cho chúng sự thuận lợi để đề kháng
thuốc… (Claudia Harper, 2002. Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005).
Vài nhóm nghiên cứu trên thế giới đã cho thấy các điều kiện trung bình cho việc
phát triển vi khuẩn kháng thuốc ở nuôi trồng thủy sản là nước, bùn đáy và cả cá
nuôi (Schmidt, 2000; Sorum, 1998), bùn đáy ở rần một số trại nuôi có sử dụng
nhiều kháng sinh thường chứa nhiều vi khuẩn kháng thuốc hơn những trại chung
quanh ít hoặc không sử dụng thuốc kháng sinh, mà những vi khuẩn này phần lớn
kháng một hoặc nhiều thuốc (Schmidt et al., 2000; Gonzalez et al., 1999; Herwig
et al., 1997). Tuy nhiên (theo Herwig et al., 1997) nếu điều kiện nuôi trồng thủy
sản tốt, sử dụng kháng sinh một cách hợp lý thì ít khi gặp phải vi khuẩn kháng
thuốc (Trích dẫn bởi Nguyễn Chính, 2005).
2.5 Thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản
2.5.1 Khái niệm thuốc, hóa chất dùng trong nuôi trồng thủy sản
Theo Bộ Thủy Sản (2002), thuốc là chế phẩm có nguồn gốc động vật, thực vật,
khoáng chất, hóa chất, vắc-xin và các chế phẩm sinh học khác dùng để phòng và
trị bệnh; điều chỉnh sinh trưởng, phát triển và sinh sản của thủy sản; xử lý và cải
tạo môi trường nuôi. Và hóa chất là sản phẩm hóa học dùng để xử lý, cải tạo môi
trường, phòng và trị bệnh cho thuỷ sản nuôi trồng (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007).
2.5.2 Khái niệm kháng sinh
Kháng sinh là các chất hữu cơ có cấu tạo hóa học phức tạp, có nguồn gốc sinh học
(do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra) hay do con người tổng hợp nên, có tác
động một cách chuyên biệt trên một giai đoạn chính yếu của sự biến dưỡng của
các vi khuẩn (tác nhân kháng khuẩn), của các nấm (tác nhân kháng nấm), của các
siêu vi (tác nhân kháng virus) (Lê Thị Kim Liên, 2007).
2.5.3 Các loại kháng sinh thường dùng trong nuôi trồng thủy sản
Nhóm ß-lactamin
Là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn hẹp chủ yếu có tác dụng trên vi khuẩn
Gram dương và một số ít vi khuẩn Gram âm, là kháng sinh diệt khuẩn tác dụng ức
chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn. Nhưng theo Nguyễn Khang (2005) thì ngoài

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
tác dụng diệt khuẩn nhóm này còn tác dụng kìm hãm vi khuẩn và nhận thấy kháng
sinh ß-lactamin chỉ có tác dụng với vi khuẩn đang phát triển, còn vi khuẩn không
phân bào thì không chịu tác dụng của thuốc vì chúng không tổng hợp màng ngoài.
Và một số vi khuẩn không có màng ngoài có thể sống sót trong môi trường có
ß−lactamin (Trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007).
Đại diện của nhóm này thường được sử dụng trong thủy sản là amoxicillin,
ampicillin thường dùng điều trị các bệnh do: Edwardsiellosis, Streptococosis,
Furunculosis, Pasteurellosis. Thường điều trị không hiệu quả đối với Vibrio và
Aeromonas thường kháng với kháng sinh này (Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị
Như Ngọc, 2006). Tuy nhiên, kháng sinh này có thể dùng điều trị bệnh đỏ mỏ, đỏ
kỳ, trắng da, lở loét, chướng hơi, ngửa bụng trên cá. Dùng 100g amoxiciline/tấn
thức ăn từ 3−5 ngày để trị bệnh xuất huyết trên cá tra−Enthic Septicaenia of
Catfish (ESC), đốm trắng hoại tử nội tạng (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004) và
Edwardsiella ictaluri (Từ Thanh Dung, 2005. Trích dẫn bởi Phan Trọng Duy,
2007).
Nhóm Tetracycline
Đây là nhóm kháng sinh có tác dụng kiềm khuẩn ở nồng độ thấp và diệt khuẩn ở
nồng độ cao, có phổ kháng khuẩn rất rộng tác dụng trên vi khuẩn Gram âm, Gram
dương, nguyên sinh động vật. Tuy nhiên, do mức đề kháng của nhiều loại vi khuẩn
như: Streptococus, Staphylococus, Pseudomonas, E.coli… nên các tetracycline
không còn được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng do các vi khuẩn trên (Lê Thị
Kim Liên và ctv, 2007).
Kháng sinh này có tác dụng ức chế giai đoạn sinh tổng hợp Protein (Đỗ Thị Hòa
và ctv, 2004). Hấp thu không đều qua dạ dày, ruột, hấp thu thấp nhất là
chlotetracycline (30%), trung bình là tetracycline, oxytetracycline (60−80%), hấp
thu tốt nhất là doxycyclin (90−100%), thức ăn và các chất kháng acid làm giảm
hấp thu thuốc (Trần Thị Thu Hằng, 2006. Trích dẫn bởi Huỳnh Chí Thanh, 2007).
Đại diện cho nhóm là cá kháng sinh oxytetracyclin và chlotetracyclin thường được

dùng phổ biến trong nuôi thủy sản nước lợ, mặn, tetracycline và doxycyclin dùng
trong nuôi thủy sản nước ngọt. Các kháng sinh này thường dùng để trị bệnh đường
ruột, bệnh nhiễm khuẩn máu, xuất huyết của các loài cá nước ngọt: cá tra, basa,
trắm cỏ. Theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc (2006), các kháng sinh
này dùng để điều trị đỏ mỏ, đỏ kỳ, trắng da, lở loét, chướng hơi ngửa bụng trên cá,
trầy da của ếch, bệnh phồng cổ của baba (Huỳnh Chí Thanh, 2007).
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
11
Nhóm Aminosid
Là kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng đối với hầu hết vi khuẩn Gram âm và một
số vi khuẩn Gram dương hiếu khí, ít tác dụng đối với vi khuẩn kỵ khí vì aminosid
thấm qua màng tế bào vi khuẩn một phần nhờ hệ thống vận chuyển hoạt động phụ
thuộc vào oxygen nên vi khuẩn kỵ khí tuyệt đối không chịu tác động. Amonisid là
kháng sinh diệt khuẩn, chúng ức chế tổng hợp protein, thường được dùng để trị
bệnh phát sáng, giảm nhầy, hầu như kháng sinh này không hấp thu qua ruột. Do
chúng không hấp thu qua ruột nên không nên dùng bằng đường miệng để trị nhiễm
khuẩn toàn thân. Mặt khác, kháng sinh này gây hại tạp khuẩn ruột vì thế cũng
không nên dùng để trị các bệnh viêm ruột (Lê Thị Kim Liên và ctv, 2007).
Các kháng sinh thuốc nhóm aminosid thường được dùng trong nuôi thủy sản là:
streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin. Đối với cá bệnh trướng bụng,
đầy hơi do nhiễm ở cá, ếch, baba, tôm có thể dùng chộn vào thức ăn cho ăn (Lê
Thị Kim Liên và ctv, 2007). Ngoài ra, từ kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thị Như
ngọc (1997) đã sử dụng gentamycin trị bệnh tuột nhớt trên cá bống tượng cũng
mang lại hiệu quả khả quan.
Nhóm Quinolones
Là nhóm những kháng sinh được tổng hợp hoàn toàn bằng phương pháp hóa học,
chúng có tác dụng diệt khuẩn, gồm hai nhóm: thế hệ I gọi là quinolon kinh điển,
và thế hệ II hay fluoro quinolon. Quinolon thế hệ I có phổ kháng khuẩn hẹp, tác
động chủ yếu trên các vi khuẩn Gram âm, không có hiệu lực trên vi khuẩn Gram
dương. Quinolon thế hệ II có hoạt tính kháng khuẩn vừa nhanh, vừa mạnh, đặc

biệt phổ kháng khuẩn cũng đã được mở rộng với cả vi khuẩn Gram âm và Gram
dương (Edwardsiella, Aeromonas, Pseudomonas ngoại trừ norfloxacin). Quinolon
ức chế AND-gyrase là men cần thiết cho sự tái bản hay sao chép của phân tử
AND, do đó ngăn chặn sự tổng hợp AND và protein ở vi khuẩn (Lê Thị Kim Liên
và ctv, 2007).
Các kháng sinh nhóm quinolon được sử dụng phổ biến trong nuôi trồng thủy sản:
enrofloxacin, norfloxacin, ciprofloxacin được sử dụng phổ biến trong điều trị bệnh
mủ gan do vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây ra rất có hiệu quả (Từ Thanh Dung
và ctv, 2005). Kháng sinh norfloxacin, oxolinic acid có hoạt phổ mạnh trên nhóm
vi khuẩn Vibrio sp gây bệnh trên tôm (Đỗ Thị Hòa và ctv, 2004). Nguyễn Thị Như
Ngọc (1997) cũng nhận thấy kháng sinh oxolinic acid điều trị có hiệu quả bệnh
tuột nhớt trên cá bống tượng và theo Lê Thị Kim Liên và Nguyễn Thị Như Ngọc
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
12
(2006) thì các kháng sinh này còn điều trị hiệu quả trên các giống vi khuẩn
Aeromonas sp, Pseudomonas sp, nhưng hiện nay các kháng sinh này đã cấm sử
dụng trong nuôi trồng thủy sản do tồn lưu trong động vật thủy sản và ảnh hưởng
đến sức khỏe con người (Huỳnh Chí Thanh, 2007).
Nhóm Phenicol
Có phổ kháng khuẩn rộng, là kháng sinh kìm khuẩn, có hiệu lực diệt khuẩn trên
một vài loài và có khả năng phân tán tốt vào các mô cơ thể. Cụ thể
chloramphenicol rất được ưa chuộng trong trị liệu, nhưng hiện nay kháng sinh này
đã bị cấm do ngoài việc tác dụng trên vi khuẩn chúng còn ảnh hưởng trực tiếp lên
cả con người, gây hiện tượng quái thai và có thể truyền yếu tố kháng thuốc cho vi
khuẩn gây bệnh ở người.
Tuy nhiên, hiện nay vẫn có thể sử dụng nhóm này trong trị bệnh cho động vật thủy
sản thông qua florfenicol. Theo Từ Thanh Dung (2008) dùng florfenicol
0,1−0,2g/kg thức ăn cho ăn liên tục trong 5−7 ngày để trị bệnh gan thận mủ trên cá
tra do Edwardsiella ictaluri.
2.6 Sơ lược về Plasmid ở vi khuẩn

Ở tế bào Prokaryote, mà cụ thể là ở vi khuẩn qua kính hiển vi điện tử có thể quan
sát được chất nhân là phân tử DNA nguyên vẹn có dạng vòng tròn hình chiếc
nhẫn. Đấy là nhiễm sắc thể của vi khuẩn−nơi chứa nguyên liệu di truyền của tế
bào. Đồng thời bên cạnh nhiễm sắc thể, người ta còn quan sát thấy những cấu trúc
dạng hình nhẫn nhỏ hơn gọi là plasmid. Đặc điểm nổi bật của plasmid là có cấu
tạo từ DNA, có khả năng tự nhân đôi một cách độc lập, có khả năng tồn tại một
cách độc lập với bộ gen của vi khuẩn cũng như có thể gắn vào bộ gen của vi
khuẩn. Người ta xem plasmid là phần tử di truyền nằm ngoài bộ máy di truyền của
vi khuẩn (Trần Thị Thanh, 2000).
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007) plasmid là phân tử ADN có khả năng mang đoạn
ADN ngoại lai vào trong tế bào chủ (E.Coli hoặc nấm men Saccharomyces
cerevsiae) và đảm bảo sự nhân lên của đoạn ADN này trong tế bào chủ. Là phân
tử ADN ngoài nhiễm sắc thể có khả năng tự nhân đôi, mang những đoạn gen đặc
hiệu (kháng kháng sinh hoặc độc lực). Với những ưu điểm: kích thước nhỏ, dễ sử
dụng để tuyển lựa (tính kháng kháng sinh), với cấu trúc gen khởi động có thể sử
dụng để thể hiện chức năng của gen. Tuy nhiên, chúng lại có kích thước đoạn
AND mang không lớn hơn 12 kbp.
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
2.6.1 Các loại plasmid
Plasmid được phân loại theo hai nhóm chính gồm (Trần Thị Thanh, 2000 và
Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007):
Dựa vào khả năng truyền vào vi khuẩn khác:
v Plasmid tiếp hợp (conjugative) chứa các gen giúp thực hiện một quá trình
phức tạp gọi là tiếp hợp, chuyển một plasmid sang vi khuẩn khác.
v Plasmid không tiếp hợp là những plasmid không có khả năng thực hiện
quá trình tiếp hợp, vì thế chúng chỉ có thể được chuyển sang một vi khuẩn
khác khi có sự trợ giúp của plasmid tiếp hợp.
v Nhóm plasmid trung gian gọi là nhóm plasmid di chuyển được. Chúng chỉ
mang các gen cần thiết cho việc di chuyển. Những plasmid này có thể

chuyển với tần suất cao khi có mặt một plasmid tiếp hợp.
Dựa vào chức năng chia làm 5 nhóm chính:
v Plasmid giới tính, chúng mang nhân tố giới tính F (Fertility Factor). Sự vận
chuyển DNA từ tế bào vi khuẩn này sang tế bào vi khuẩn khác nhờ vào các
sợi nhung mao hình ống trên bề mặt của vỏ tế bào vi khuẩn, do plasmid F
hình thành (Trần Thị Thanh, 2000).
v Plasmid mang tính kháng (Resistance-(R) plasmid), mang các gen có khả
năng kháng lại các thuốc kháng sinh hay chất độc.
v Col-plasmid, chứa các gen mã hóa cho sự tổng hợp colchicine, một protein
có thể giết chết các vi khuẩn khác.
v Plasmid phân hủy, giúp phân hủy các chất lạ như toluene hay salicylic acid.
v Plasmid mang độc tính, làm cho sinh vật trở thành sinh vật gây bệnh.
2.6.2 Plasmid tham gia vào cơ chế tái tổ hợp gen nội bào
Khi plasmid nhân đôi nó sẽ tạo ra những vòng dính liền nhau như một chuỗi nhẫn
(cấu trúc này gọi là caten). Các caten sẽ đức đoạn, đưa các plasmid về dạng thẳng
và nếu như bên cạnh có nhiễm sắc thể của vi khuẩn đang sinh sản cũng bị đức ra
thì các đoạn thẳng của plasmid và nhiễm sắc thể của vi khuẩn có thể gắn lại với
nhau tạo thành một thể thống nhất. Như vậy, các plasmid của vi khuẩn có thể lọt
vào trong phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn và ngược lại. Những thông tin
như vậy sẽ nhân lên và truyền lại cho tế bào con cháu, có thể không giống mẹ nó ở
một điểm nào đó. Chính nhờ cơ chế tái tổ hợp gen nội bào này mà ta có thể giải
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
14
thích tại sao xảy ra sự biến đổi tính chất kỳ lạ của vi khuẩn, sự phản ứng tức thì
của chúng đáp ứng lại những thay đổi của môi trường ngoài hay khả năng sống sót
mãnh liệt của chúng… (Trần Thị Thanh, 2000).
2.6.3 Plasmid có khả năng vận chuyển gen
Plasmid có thể làm “vật chủ trung gian” − vector, là những cấu trúc có khả năng tự
sinh sản, có khả năng gắn kết vào mình những gen lạ và chuyển giao những gen lạ
này cho một tế bào khác. Cùng với việc chuyển giao thông tin di truyền với các cơ

thể khác, các plasmid còn truyền cho các tế bào nhận những đặc điểm quan trọng
của mình như: tính đề kháng với các chất kháng sinh, kim loại nặng (Hg, Cd…) và
tia cực tím. Đặc tính tham gia trực tiếp hoặc gián tiếp vào quá trình sinh tổng hợp
một số chất kháng sinh, trong đó có cả những kháng sinh bị đề kháng bởi chính vi
khuẩn đó. Đặc điểm sử dụng nguồn cacbon khó đồng hóa như: Campor, octane,
cồn octane… làm nguồn dinh dưỡng (Trần Thị Thanh, 2000).
2.6.4 Ý nghĩa sinh học của plasmid
Các tính trạng đọc mã bởi plasmid thường cung cấp cho tế bào chủ ưu thế sinh
trưởng và nhờ đó mà các tế bào này thu được ưu thế chọn lọc.
Plasmid kháng: Đáng chú ý là các vi khuẩn thể hiện tính đa kháng thuốc được
truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác qua tiếp xúc tế bào đơn giản. Ngày nay
ta đã biết các gen của plasmid-R giúp cho vi khuẩn chủ kháng với sunphonamit,
streptomixin, chloramphenicol, kanamixin và tetraxiclin. Một số plasmid-R cho
tính kháng với 8 kháng sinh, số khác kháng với kim loại nặng, độc. Các plasmid-R
thường là tiếp hợp hoặc có thể huy động. Có 2 cơ chế kháng kháng sinh: kháng do
plasmid đọc mã và kháng do nhiễm sắc thể đọc mã. Chẳng hạn, tính kháng
streptomycin do nhiễm sắc thể dựa vào sự thay đổi của hạt riboxom 30S. Trái lại,
tính kháng streptomycin do plasmid lại dựa vào sự biến đổi chất kháng sinh này
nhờ enzim (streptomycin bị adenyl hóa). Một đặc tính khác của vi khuẩn cũng do
plasmid đọc mã là vi khuẩn có thể tạo thành các protein có khả năng giết chết hoặc
kìm hãm sinh trưởng của các loài thân thuộc, các protein có tác dụng đặc biệt này
được gọi là bacterioxin (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2007).
2.7 Plasmid và sự kháng thuốc của vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Majumdar et al (2007), cho biết việc tồn tại của R-plasmid trong A. hydrophila sẽ
ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc bề mặt, sự phát triển và tính độc của chúng khi
được cảm nhiễm vào vật chủ. Và R-plasmid này quyết định đến sự phát sinh dịch
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
bệnh do A. hydrophila. Ngoài ra, sự hiện hiện hay không R-plasmid của A.
hydrophila còn quyết định tính kháng hay mẫn cảm với một loại kháng sinh mà

nó đã kháng trước đó.
Theo Meyer (1964), vi khuẩn Aeromonas hydrophila được khống chế bởi
oxytetracycline. Tuy nhiên, đến năm 1988 trong nghiên cứu của Aoki đã phát
hiện một loại plasmid của vi khuẩn này với trọng lượng trung bình 20-30 MDa
kháng lại oxytetraxycyline, sự kháng thuốc này hầu như phát triển rộng rãi trong
các ao nuôi kể cả ao nuôi lươn và nó có tiềm năng có thể phủ nhận lợi ích của
một số chất chống vi khuẩn (Aoki và Egusa, 1971; Toranzo et al., 1983). Aoki
(1988) cảnh báo plasmid-R sẽ được tìm thấy trong một vài chủng loài mầm bệnh
ở cá không liên quan nhau gồm: Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida,
và Edwardsiella tarda. Bên cạnh đó, Aeromonas hydrophila cũng kháng thụ động
lại nhiều kháng sinh như: ampicillin, chloramphenicol, erythromycin,
nitrofurantoin, novobiocin, streptomycin, sulphonamides và tetracycline (Aoki,
1988 và De Paola et al., 1988). Cụ thể, có khoảng trên 38% vi khuẩn Aeromonas
hydrophila phân lập từ các ao nuôi cá da trơn bệnh kháng lại oxytetracycilne
(Trích dẫn bởi B. Austin và D. Austin, 1986).
Bên cạnh đó, theo Mitchell & Plumb (1980); Aoki & Egusa (1971) cũng cho thấy
R-plasmid là nguyên nhân của việc đa kháng với hầu hết các kháng sinh
chloramphenicol, oxytetracycline (Meyer, 1964) and sulphamerazine (Seaman,
1951) đã sử dụng trị các bệnh nhiễm khuẩn do aeromonad (Ansary et al., 1991;
Chang & Bolton, 1987. Trích dẫn bởi Inglis et al., 1993).
Ngoài ra, từ kết quả nghiên cứu của Saitanu et al (1994), việc chuyển đổi R-
plasmid đã được phát hiện từ những chủng A. hydrophila kháng thuốc phân lập
trên cá ở Thái Lan. Hầu hết, những R-plasmid được phát hiện đã đọc mã kháng
lại kháng sinh chloramphenicol (CP), sulfamonomethoxine (SA), tetracycline
(TC). Đặc biệt, việc chuyển R-plasmid ở vi khuẩn phân lập từ Nhật Bản và Đài
Loan thì mã hóa kháng lại TC, SA, CP và Streptomycin (SM) (Aoki et al, 1971;
Akashi and Aoki 1986). Thêm nữa, trong nghiên cứu này của ông cũng cho thấy
hầu hết vi khuẩn kiểm tra kháng với 19 loại kháng sinh mà ông thử nghiệm. Ông
còn cho biết kháng sinh TC và SA được sử dụng rất thường trong việc trị bệnh
cho cá. Và hầu hết những chủng kháng với TC, SA có chứa R-plasmid (Saitanu et

al,1994).

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
CHƯƠNG 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 05/2009 đến tháng 07/2009
Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy sản – Khoa Thủy sản –
Đại học Cần Thơ.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn Aeromonas hydrophila được phân lập trên cá tra bệnh xuyết huyết, tất
cả vi khuẩn đều đã được định danh tới loài và được trữ ở điều kiện -80
0
C trong
glycerol 25% gồm các chủng: TN1.1T, TN2.1G, CA1.3TT, CA1.2T, TN2.4TT,
CAF2, SĐ2.1T, CS2.3T.
3.2.2 Dụng cụ
− Đĩa petri, chai nấu môi trường 500ml, que trãi thủy tinh, cốc thủy tinh 100ml.
− Micropipet 1ml và 5ml, ống nghiệm, hộp đầu col, ống eppendorf, que cấy, đèn
cồn, bình xịch cồn, hộp quẹt, lame, lamella, viết lông dầu, găng tay, v.v….
3.2.3 Thiết bị
− Cân điện tử, máy khuấy từ, nồi khử trùng áp suất (autoclave), kính hiển vi.
− Tủ sấy khô, tủ cấy vi khuẩn, tủ lạnh, tủ ấm, tủ đông, máy so màu quang phổ.
− Máy vortex, bồn điện di, máy li tâm, lò vi sóng…
3.2.4 Hóa chất và môi trường
Hóa chất

− Nước cất, cồn đốt, cồn tuyệt đối, NaCl, BaCl
2
1%, H
2
SO
4
1%.
− Đĩa thuốc kháng sinh thương mại (sản phẩm của Biorad) gồm: Ciprofloxacin
(CIP, 5µg), Amoxycillin (AMX, 25µg), Colistin (CS, 50µg), Doxycycline
(DO, 30µg), Florfenicol (FFC, 30µg), Oxolinic acid (OA, 2µg), Streptomycin
(S, 10µg), Norfloxacin (NOR, 10µg)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
17
− Hóa chất nhuộm gram:
+ Dung dịch 1: crystal violet, ethanol 95%, ammonium oxalate, nước cất.
+ Dung dịch 2: potassium iodide, iodine, nước cất.
+ Dung dịch 3: 95% ethanol : 5% acetone.
+ Dung dịch 4: safranin, ethanol 95%, nước cất.
− Tris, EDTA, glucose, sodium hydroxide, SDS, potassium acetate, glacial
acetic acid, isopropanol, ethanol, agarose, Ethidium bromide, Loading die.
Môi trường
− Môi trường nuôi cấy chung TSA (Triptone Soya Agar), nutrient agar (NA):
nuôi cấy vi khuẩn.
− Môi trường mueller hinton agar (MHA): lập kháng sinh đồ.
− Môi trường lỏng nuôi vi khuẩn NB (Nutrient Broth; Merck).
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phục hồi và tách ròng vi khuẩn
Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008.
Vi khuẩn được lấy từ tủ -80
0

C, rã đông. Sau đó được phục hồi trên môi trường
NA và ủ sau 24 giờ ở 28-39
0
C. Quan sát hình dạng, màu sắc khuẩn lạc, nếu khuẩn
lạc đã rời rạc và đồng nhất thì tiến hành nhuộm gram vi khuẩn để kiểm tra tính
thuần. Kết quả nhuộm gram đã thuần thì tiến hành kiểm tra kháng sinh đồ cũng
như xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC và ly trích plasmids.
3.3.2 Phương pháp kiểm tra kháng sinh đồ
Theo tài liệu hướng dẫn thực tập chuyên đề bệnh học thủy sản, 2008.
Sử dụng ống McFarland số 3 (0,3 ml BaCl
2
1% + 9,7 ml H
2
SO
4
1%), khi đó mật
độ vi khuẩn tương đương 9x10
8
CFU/ml (Ống McFarland phải giữ trong bóng tối,
nhiệt độ 2−8
0
C và không quá 6 tháng).
Dùng que cấy tiệt trùng nhặt một ít khuẩn lạc cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước
muối sinh lý tiệt trùng, lắc trộn đều. So sánh độ đục giữa ống nghiệm có chứa vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
18
khuẩn với ống nghiệm chuẩn, điều chỉnh độ đục bằng nước muối sinh lý cho bằng
với ống nghiệm chuẩn.
Dùng pipet tiệt trùng hút 0,1ml dung dịch vi khuẩn trong ống nghiệm cho lên đĩa
môi trường, dùng que trải thủy tinh tiệt trùng trải đều, đậy đĩa petri lại và ủ

khoảng 1−2 phút cho mặt thạch tương đối khô. Sau đó dùng pel tiệt trùng dán các
đĩa kháng sinh vào đĩa môi trường vi khuẩn. Mỗi đĩa thạch dán tối đa 6 đĩa kháng
sinh, các đĩa kháng sinh được dán sao cho khoảng cách giữa 2 đĩa là 24mm,
khoảng cách giữa đĩa kháng sinh và mép đĩa petri là 10−15mm. Tất cả đĩa được ủ
trong tủ ấm (28−30
0
C) và đọc kết quả sau 24−48 giờ.
Đọc kết quả
Quan sát trên đĩa petri xuất hiện các vòng tròn vô trùng (không có vi khuẩn phát
triển trong vòng tròn) và chỉ có một vòng vô trùng cho một đĩa kháng sinh thì tiến
hành đọc kết quả.
Kiểm tra kết quả của chủng vi khuẩn chuẩn, nếu các kết quả đúng với các nghiên
cứu trước đây thì tiến hành đọc kết quả các chủng vi khuẩn cần xác định kháng
sinh đồ, ngược lai thì thí nghiệm cần phải lặp lại. Nếu kết quả cho chủng chuẩn
đúng thì dùng thước đo đường kính của các vòng vô trùng (đơn vị tính là mm).
Kiểm tra kết quả đo được với bảng đường kính chuẩn của một số loại thuốc
kháng sinh (Bảng 3.2), để xác định tính nhạy cảm của vi khuẩn với kháng sinh có
thể ở 1 trong 3 cấp độ là kháng, trung bình hoặc nhạy.
Bảng 3.1: Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ
Kháng sinh
( công ty Biorad)
Chuẩn đường kính vòng vô trùng

Kháng Trung bình Nhạy
Amoxycillin (AMX, 25µg)
≤13

14
−

17

≥18

Ciprofloxacin (CIP, 5µg)
≤15

16
−
20

≥21

Colistin (CS, 50µg)
≤8

9
−
10

≥11

Doxycycline (DO, 30µg)
≤12

1
3
−
15

≥16

Florfenicol (FFC, 30µg)
≤16

17
−
19

≥20

Oxolinic acid (OA, 2µg)
≤10

−

≥11

Streptomycin (S, 10µg)
≤11

12
−
14

≥15

Norfloxacin (NOR, 10µg)
≤12
13−16

≥17
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version