phân lập và định danh vi khuẩn aeromonas hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá tra (pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở đồng bằng sông cửu long

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

TRẦN THANH PHÚ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

2009


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

TRẦN THANH PHÚ

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH VI KHUẨN
Aeromonas hydrophila GÂY BỆNH XUẤT HUYẾT
TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus)
NUÔI Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2009


LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành gửi lời biết ơn sâu sắc đến cơ Đặng Thị Hồng Oanh,
cơ Nguyễn Thị Thu Hằng và chị Nguyễn Hà Giang đã tận tình hướng dẫn
giúp đỡ tôi thực hiện đề tài nghiên cứu này.
Tơi cũng xin cảm ơn đến tất cả q thầy cô và cán bộ Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ đã chỉ dẫn tận tình và truyền đạt cho tơi những
kiến thức, kinh nghiệm q báo trong thời gian học ở trường. Đồng thời
cảm ơn đến tất cả các bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31, tập thể anh em
P6C1 cùng gia đình đã hết lịng giúp đỡ động viên tơi vượt qua mọi khó
khăn để hồn thành đề tài nghiên cứu này.
Xin chân thành cảm ơn!

i


TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện nhằm mục tiêu sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi khuẩn
Aeromonas hydrophila trên cá tra bị xuất huyết nuôi ở Đồng Bằng Sông Cửu
Long, đồng thời cũng so sánh kết quả định danh vi khuẩn bằng phương pháp
sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E. Kết quả đề tài đã thu được 5/17 ao cá
bị xuất huyết, phân lập được 28 chủng vi khuẩn Aeromonas. Tám chủng vi
khuẩn đại diện gồm SĐ2.1T, SĐ2.2T, CA1.2T, CA1.3TT, TN1.1T, TN2.4TT,
TN2.1G và CS2.3T đã được kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa
bằng bộ kít API 20E và phương pháp sinh hóa truyền thống dựa theo cẩm nang
của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993). Kết quả định danh của hai
phương pháp trong nghiên cứu này khơng có sự khác biệt lớn, cả 8 chủng vi

khuẩn được định danh đều là vi khuẩn A.hydrophila.

ii


MỤC LỤC
TÓM TẮT ......................................................................................................................... i
LỜI CẢM TẠ...................................................................................................................ii
MỤC LỤC.......................................................................................................................iii
DANH SÁCH BẢNG ..................................................................................................... iv
DANH SÁCH HÌNH ....................................................................................................... v
PHẦN I GIỚI THIỆU ...................................................................................................... 1
PHẦN II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU................................................................................. 2
2.1 Tình hình ni cá tra ở Việt Nam và Đồng Bằng Sông Cửu Long...................... 2
2.1.1 Ở Việt Nam ................................................................................................. 2
2.1.2 Ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long .................................................................... 2
2.2 Tình hình bệnh cá tra ở Đồng Bằng Sông Cửu Long........................................... 4
2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila ......................................................................... 6
PHẦN III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................... 8
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................ 8
3.2 Vật liệu nghiên cứu .............................................................................................. 8
3.2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................. 8
3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu ............................................................. 8
3.3 Hóa chất ............................................................................................................... 8
3.3.1 Các hóa chất và mơi trường dùng để phân lập vi khuẩn ............................. 8
3.3.2 Các hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương
pháp sinh hóa truyền thống và bộ kít API 20E .................................................... 9
3.4 Phương pháp nghiên cứu...................................................................................... 9
3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển.............................................................. 9
3.4.2 Phân lập vi khuẩn........................................................................................ 9

3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn ............................................................................ 10
3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn....................................................................... 10
3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống ................ 10
3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E ................................................. 11
PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 14
4.1 Kết quả ............................................................................................................... 14
4.1.1 Tình hình bệnh do vi khuẩn Aeromonas hydrophila................................. 14
4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống.. 15
4.1.3 Định danh vi khuẩn phân lập bằng bộ kít API 20E................................... 20
4.2 Thảo luận............................................................................................................ 22
PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT........................................................................... 24
5.1 Kết luận .............................................................................................................. 24
5.2 Đề xuất ............................................................................................................... 24
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 25
PHỤ LỤC....................................................................................................................... 29

iii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng 3.1 Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng phương pháp sinh
hóa truyền thống.
Bảng 3.2 Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng bộ kít API 20E.
Bảng 4.1 Kết quả thu mẫu.
Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập.

Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra các chỉ tiêu sinh hóa bằng bộ kít API 20E.

iv

DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Cá bị xuất huyết.
Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 100X.
Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên mơi trường TSA.
Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar.
Hình 4.5 Kết quả phản ứng decarboxylase.
Hình 4.6 Kết quả phản ứng citrate.
Hình 4.7 Các phản ứng sử dụng đường.
Hình 4.8 Kết quả định danh bằng bộ kít API 20E.

v


PHẦN I
GIỚI THIỆU
Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) là vùng đất giàu tiềm năng được thiên
nhiên ưu đãi có lợi thế rất lớn để phát triển nuôi trồng thủy sản. Trong những năm
gần đây nuôi trồng thủy sản ở ĐBSCL đã có những bước phát triển vượt bậc
mang lại hiệu quả kinh tế cao, đặc biệt cá tra đang là đối tượng nuôi chiến lược,
thu lại nguồn ngoại tệ rất lớn. Đến tháng 08 năm 2007, tồn vùng ĐBSCL có tổng
diện tích ni cá tra, ba sa trên 5.600 ha, so với năm 2000, diện tích này tăng trên
10 lần và dự báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007).
Tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của cả nước đạt
mức 4 tỷ USD (VASEP, 2008).
Tuy nhiên do sự gia tăng quá mức của phong trào ni cá tra trong khi trình độ kỹ
thuật của người nuôi chủ yếu chỉ dựa vào kinh nghiệm. Mặt khác do phát triển tự
phát thiếu qui hoạch, mật độ thả nuôi cao và công tác quản lý dịch bệnh còn hạn
chế nên dịch bệnh thường xuyên xảy ra gây thiệt hại cho người nuôi. Theo Từ
Thanh Dung (2005) tần số xuất hiện bệnh trên động vật thủy sản do vi khuẩn

chiếm tới 50,9%. Theo điều tra của Nguyễn Thanh Phương và ctv (2007) thì số
nơng hộ nuôi cá tra ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện vào mùa lũ chiếm tới
88%. Theo Đỗ Thị Hòa và ctv (2004) thì Aeromonas là tác nhân gây bệnh xuất
huyết trên nhiều loài cá, trong các loài vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A.
hydrophila được xem là lồi gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất (Lewis
and Plumb, 1979).
Đề tài “Phân lập và định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila gây
bệnh xuất huyết trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi ở Đồng
Bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm sưu tập và cung cấp dữ liệu về vi
khuẩn A. hydrophila trên cá tra bị bệnh xuất huyết nuôi ở ĐBSCL.
Đề tài bao gồm các nội dung: (1) Thu mẫu và phân lập vi khuẩn A.
hydrophila từ cá tra bị bệnh xuất huyết; (2) Xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa
của chủng vi khuẩn A. hydrophila phân lập từ cá tra bệnh xuất huyết bằng phương
pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E.

Trang 1


PHẦN II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tình hình ni cá tra ở Việt Nam và ĐBSCL
2.1.1 Tình hình ni cá tra ở Việt Nam
Trong những năm gần đây ngành nuôi trồng thuỷ sản ở Việt Nam cùng với sự
phát triển của ngành nuôi trồng thuỷ sản trên thế giới đã không ngừng phát triển
mạnh mẽ có mức tăng trưởng kinh tế cao trong xuất khẩu thuỷ sản. Theo số liệu
của Hải quan, tính đến ngày 14/11/2008, tổng kim ngạch xuất khẩu thuỷ sản của
cả nước đạt mức 4 tỷ USD. Mười tháng đầu năm, xuất khẩu thuỷ sản của cả nước
đạt 1.054.600 tấn, trị giá 3,828 tỷ USD, tăng 39,4% về lượng và 24,4% về giá trị
so với cùng kỳ năm ngối (Bộ thủy sản, 2007).
Riêng nghề ni cá tra cũng có những bước phát triển rất vượt bậc khơng những

ở quy mơ diện tích mà cịn có sự gia tăng mật độ ni ở mức độ thâm canh hóa.
Năng suất cá tra nuôi ao ở một số vùng đã tăng đến 350 - 500 tấn/ha/vụ, thậm chí
đến 700 tấn/ha/vụ, do mật độ nuôi đã tăng lên đến 40 - 50 con/m2 (Nguyễn Thanh
Phương và ctv, 2007).
Mặc dù trong những năm qua nghề ni cá tra ở Việt Nam có những bước thăng
trầm do giá cả không ổn định, chịu tác động của nhiều vụ kiện bán phá giá, yêu
cầu về kỹ thuật an toàn vệ sinh thực phẩm ngày một khắc khe. Đặc biệt các thị
trường lớn như Mỹ, Nhật, EU đòi hỏi rất nghiêm ngặt về chất lượng sản phẩm.
Sản phẩm cá tra thịt trắng có nhu cầu ngày càng cao là những thách thức đặt ra
cho các nhà doanh nghiệp chế biến xuất khẩu và người nuôi.
Theo Bộ Thủy Sản (2007) sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng từ 720.000 tấn ở
năm 2000 lên đến 1.256.938 tấn năm 2004. Năm 2005, sản lượng nuôi trồng thủy
sản đạt 1.437.355 tấn và giá trị xuất khẩu khoảng 1.627,3 triệu USD. Năm 2006,
sản lượng nuôi trồng thủy sản của cả nước đạt 1.694.271 tấn, trong đó sản lượng
cá tra chiếm 825.000 tấn.
2.1.2 Tình hình ni cá tra ở Đồng Bằng Sơng Cửu Long
Đồng Bằng Sơng Cửu Long là nơi có tiềm năng ni cá tra rất lớn, đã có truyền
thống ni cá tra từ lâu đời, cùng với lợi thế về diện tích mặt nước, hàng năm
vùng khơng ngừng nâng cao về mặt sản lượng cá tra, basa xuất khẩu. Tính từ năm
2006, sản lượng cá tra nuôi ở ĐBSCL đạt 800.000 tấn, xuất khẩu được 292.800

Trang 2


tấn, thu về kim ngạch xuất khẩu 773,64 triệu USD, chiếm 23,4% so với xuất khẩu
thủy sản của cả nước.
Chỉ trong 6 tháng đầu năm 2007, diện tích ni cá tra toàn vùng ĐBSCL đã lên
đến 3.642 ha, tăng 1.256 ha so với năm trước, sản lượng cá tra đạt 380.489 tấn, số
lượng cá tra xuất khẩu được 173.100 tấn, đạt kim ngạch xuất khẩu 462,4 triệu
USD, tăng 32% về lượng và 38,9% kim ngạch so với năm 2006 (Quang Hải,

2008).
Theo số liệu đến tháng 08 năm 2007, toàn vùng ĐBSCL có tổng diện tích ni cá
tra, ba sa trên 5.600 ha. So với năm 2000, diện tích này đã tăng trên 10 lần và dự
báo sẽ tiếp tục tăng nhanh trong những năm tới (Chu Thạch, 2007).
An Giang là tỉnh có nghề ni cá tra phát triển nhất ở ĐBSCL, chiếm 90% tổng
kim ngạch xuất khẩu của tỉnh. Sản lượng cá tra nuôi của tỉnh An Giang tăng từ 25
đến 27%/năm và chiếm 70% sản lượng cá tra nuôi của khu vực Đồng Bằng Sơng
Cửu Long.
Trong q I/2008, An Giang đạt sản lượng nuôi cá tra trên 90.000 tấn, tăng 63%
so cùng kỳ. Chủ tịch Hiệp hội nuôi và chế biến xuất khẩu thủy sản An Giang
(AFA) cho biết: sản lượng cá tra ni của tỉnh An Giang q II/2008 lứa đầu thu
hoạch khoảng 25.000 tấn. Trong khi cá nguyên liệu cần cho các nhà máy chế biến
trong tỉnh trên 100.000 tấn/quí. Hiện nay, sản phẩm cá tra xuất khẩu đang thuận
lợi cả về thị trường và giá cả, giá xuất sản phẩm cá tra thịt trắng từ 3,2 đến 3,4
USD/kg (4 tháng đầu năm giá xuất bình quân 2,8 USD/kg) (Huy Bình, 2008).
Cịn Đồng Tháp tuy vào mùa thu hoạch rộ cá tra cũng đối mặt với nhiều khó khăn
như doanh nghiệp khơng đủ vốn để mua cá nguyên liệu, người nuôi cá tra không
đủ tiền mua thức ăn cho cá phải “treo” ao... nhưng kim ngạch xuất khẩu thủy sản,
mà chủ lực là cá tra, ba sa, vẫn tăng khá. Hiện nay, thủy sản là mặt hàng xuất
khẩu chính yếu, chiếm gần 70% tổng kim ngạch xuất khẩu toàn tỉnh Đồng Tháp.
Từ đầu năm đến nay, các doanh nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu trên địa bàn
tỉnh Đồng Tháp đã chế biến 83.101 tấn thủy sản, đồng thời xuất khẩu trên 62.509
tấn thủy sản, trị giá hơn 179 triệu USD, tăng 61,92% về sản lượng và 47,14% về
giá trị (Sở Công Thương Đồng Tháp, 2009).
Và theo báo cáo của Sở Nông Nghiệp & Phát Triển Nông Thôn tỉnh Vĩnh Long,
mặc dù trong thời gian gần đây giá cá tra nguyên liệu giảm ở mức thấp gây khó
khăn cho các hộ ni nhưng diện tích ao, hầm ni cá tra trên địa bàn tỉnh vẫn
duy trì ở mức 334 ha. Sản lượng cá tra trong tháng 8 này ước đạt khoảng 11.030,5
Trang 3

tấn, sản lượng từ đầu năm đến hết tháng 8/2008 khoảng 85.030 tấn (tăng gần
11.000 tấn so với cuối tháng 6/2008). Theo dự báo của Sở Nông Nghiệp & Phát
Triển Nông Thôn, đến hết năm 2008 sản lượng cá tra cơng nghiệp ước tính đạt
khoảng 122.000 tấn (Mỹ Trung, 2008).
2.2 Tình hình bệnh trên cá tra ở ĐBSCL
Cá tra, basa cũng như nhiều loài cá nước ngọt khác, dễ bị nhiễm nhiều loại bệnh
phổ biến, các tác nhân gây bệnh cho cá gồm 2 nhóm là các bệnh truyền nhiễm (do
virus, vi khuẩn và ký sinh trùng) và tác nhân không truyền nhiễm do môi trường,
dinh dưỡng. Theo Từ Thanh Dung (2005) thì tần số xuất hiện bệnh vi khuẩn trên
động vật thủy sản là cao nhất với 50,9%. Cũng theo điều tra của Lê Phú Khởi
(2006) tại An Giang đã ghi nhận được một số bệnh xuất hiện trên cá tra với tần
suất khác nhau từ năm 2004 trở lại đây là: bệnh đốm đỏ, mủ gan, ký sinh trùng,
thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, rong bè (bỏ ăn), sưng thận,
nấm, thối mang. Trong đó bệnh mủ gan xảy ra với tần suất cao nhất.
Vi khuẩn E.ictaluri được Hawke (1979) phân lập đầu tiên trên cá Nheo nuôi tại
châu Mỹ (Ictalurus punctatus) và được xác định là nguyên nhân gây bệnh ESC
(Enteric septicaemia of catfish). Còn ở Việt Nam E.ictaluri gây bệnh trên cá tra
được gọi bệnh mủ gan. Bệnh được ghi nhận đầu tiên ở ĐBSCL vào cuối năm
1998 trên cá tra nuôi bè với dấu hiệu bệnh có nhiều nốt trắng trên gan (Ferguson
và ctv, 2001).
Theo Từ Thanh Dung và ctv (2004) vùng ĐBSCL bệnh mủ gan xuất hiện đầu tiên
ở các tỉnh nuôi cá tra thâm canh phát triển mạnh như An Giang, Đồng Tháp và
Cần Thơ, sau đó bệnh lây lan sang các vùng lân cận. Đặc biệt những năm gần đây
bệnh cũng xuất hiện ở một số tỉnh mới phát triển ni cá tra như Trà Vinh, Bến
Tre và Sóc Trăng. Cá bị bệnh mủ gan khơng có dấu hiệu bất thường bên ngoài. Ở
giai đoạn mới chớm bệnh cá vẫn còn bắt mồi. Tuy nhiên ở giai đoạn này nếu
không phát hiện sớm và môi trường nuôi quá bẩn thì bệnh cá sẽ trở nên trầm
trọng hơn và rất khó khăn trong điều trị. Khi bị bệnh nặng hơn, cá có biểu hiện
gầy, bơi lờ đờ, da nhợt nhạt, có hiện tượng xuất huyết trên da và hậu mơn. Bên

trong nội tạng (gan, thận, tỳ tạng) xuất hiện những đốm trắng đường kính 1 3mm và các cơ quan này sưng to và có hiện tượng nhũn ở thận.
Bệnh mủ gan có thể xảy ra trên cá tra ni ở tất cả các giai đoạn, tỉ lệ hao hụt có
thể lên đến 90% (Nguyễn Quốc Thịnh và ctv, 2003), tỉ lệ hao hụt ở cá tra giống

Trang 4


có thể từ 10 - 90%, nhưng gây thiệt hại kinh tế lớn nhất là ở giai đoạn cá có trọng
lượng từ 300 - 500g (Từ Thanh Dung và ctv, 2004).
Đầu năm 2006, bệnh mủ gan đã gây thiệt hại nghiêm trọng với cá tra nuôi thâm
canh ở hai tỉnh An Giang và Đồng Tháp cá chết lên tới 60% (Bộ tài nguyên môi
trường Việt Nam, 2006).
Kết quả điều tra của Từ Thanh Dung (2005) cho biết bệnh mủ gan thường bắt đầu
xuất hiện vào tháng 5 và phát triển mạnh nhất vào khoảng tháng 7 đến tháng 10
rồi giảm xuống ở các tháng còn lại. Đặc biệt bệnh mủ gan xuất hiện cao nhất vào
thời gian lũ về với tỉ lệ 85,4% số hộ nuôi cá ở An Giang bị nhiễm bệnh (Trần Anh
Dũng, 2005). Lê Thị Bé Năm (2002) cũng cho rằng bệnh xuất hiện mạnh vào
mùa lũ trong năm, nước đục mang nhiều phù sa, chất lượng nước biến động, đồng
thời nước chảy mạnh làm cá dễ bị sốc, giảm khả năng đề kháng đối với mầm
bệnh. Ngồi ra, Trương Quốc Phú (2004) cịn cho rằng nhiệt độ nước dao động
trong khoảng 26 - 28oC là điều kiện tốt cho vi khuẩn E. ictaluri phát triển và gây
bệnh.
Bên cạnh đó, bệnh xuất huyết do vi khuẩn A. hydrophila cũng là một loại bệnh
phổ biến, xuất hiện hầu như quanh năm trên cá tra và cá basa nuôi bè. Bệnh xuất
huyết cịn gọi là bệnh đốm đỏ, có dấu hiệu bệnh lý bên ngoài là xuất huyết trên
gốc các vi và xoang miệng. Bên trong thấy xuất huyết ở cơ, ruột, mô mỡ, kèm
theo những dấu hiệu khác như trương bụng hay lỡ loét ở gốc vi đuôi và vi hậu
môn (Phan Văn Ninh và ctv, 1993). Bệnh xuất huyết gây tổn thất cho người nuôi
về sản lượng và chất lượng sản phẩm khi xuất bán. Trường hợp cấp tính có thể
gây tử vong cao đến 80 - 90% những trường hợp mãn tính thịt cá có nhiều điểm

xuất huyết màu đỏ và sẽ bị loại bỏ hay hạ phẩm cấp trong quá trình chế biến xuất
khẩu (Hứa Thị Phượng Liên, 1998).
Bệnh vàng da trên cá tra là một bệnh mới xuất hiện gần đây cũng gây thiệt hại lớn
cho ngành thủy sản. Tác nhân gây ra bệnh thì chưa được xác định rõ ràng. Phan
Thị Hừng (2004) cho biết cá tra vàng da lượng hồng cầu của máu cá chỉ còn 50%
so với cá khỏe. Phạm Thanh Hương (2006) cũng có kết luận tương tự khi đưa ra
tỷ lệ giảm hồng cầu của cá tra vàng da là 20%. Đồng thời, Lê Thành Cường
(2006) cũng nhận xét trên cá tra bị vàng da thì lượng máu cá khơng có nhiều và
máu khơng có màu đỏ như cá khỏe, quan sát mẫu nhuộm máu thấy hồng cầu bị
biến dạng nhiều. Ngoài ra, một tác nhân khác cũng được đề cập đến là kí sinh
trùng, đặc biệt là giun trịn với đặc tính thích chui vào ống mật làm viêm nhiễm
đường mật, tắc ống mật gây vàng da. Tuy nhiên, tác giả Lê Thành Cường (2006)
Trang 5


thì cho rằng kí sinh trùng khơng phải là tác nhân gây bệnh vàng da ở cá tra tại
ĐBSCL.
2.3 Vi khuẩn Aeromonas hydrophila
Vi khuẩn Aeromonas thuộc họ Aeromonadaceae, Aeromonas là vi khuẩn Gram
âm, di động, hình que, hiếu khí và yếm khí khơng bắt buộc, khử nitrate, có khả
năng lên men, oxidase dương tính, kháng với O/129 bao gồm A. hydrophila,
A.caviae, A.sorbia… (Từ Thanh Dung, 2005).
Bệnh xuất huyết còn gọi là bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm trùng máu hay bệnh
sởi…Nguyên nhân của bệnh là do vi khuẩn A. hydrophila gây ra (theo Bergey
1957, trích dẫn bởi Từ Thanh Dung, 2005).
Trong các lồi vi khuẩn thuộc giống Aeromonas thì A. hydrophila được xem là
loài gây bệnh cho cá nước ngọt quan trọng nhất, vi khuẩn này gây bệnh nhiễm
trùng máu xuất huyết ở những lồi cá ni và cá tự nhiên (Lewis and Plumb,
1979).
Theo Bùi Quang Tề (2006) cá bị nhiễm A. hydrophila có biểu hiện chung là da

thường đổi màu tối, khơng có ánh bạc, cá mất nhớt, khơ ráp, xuất hiện các đốm
xuất huyết đỏ trên thân, các gốc vây, quanh miệng, xuất huyết hậu môn, mắt lồi
đục. Ở cá tra và cá basa, xoang bụng xuất huyết, mô mở xuất huyết nặng, gan tái
nhợt, mật sưng to, thận sưng, ruột dạ dày và bóng hơi đều xuất huyết, xoang bụng
chứa nhiều dịch nhờn mùi hôi thối. Cá trê giống bị bệnh thường tách đàn treo râu.
Theo thí nghiệm cảm nhiễm của Lý Thị Thanh Loan (2008) thì cá tra sau khi cảm
nhiễm với A. hydrophila có biểu hiện xuất huyết trên thận, hậu môn sưng đỏ, các
tia vây xuất huyết,…nhưng không gây chết hàng loạt trong thời gian 7 ngày thí
nghiệm. Thu mẫu cá chết phân lập chỉ có một lồi duy nhất là A. hydrophila.
A. hydrophila cũng gây bệnh lở loét cho cá tại Java - Indonesia và gây tỉ lệ chết từ
80 - 90% (Angka, 1990). Năm 1982 Saitanu và ctv đã tìm thấy vi khuẩn A.
hydrophila gây bệnh xuất huyết trên cá chép (Saitanu et al., 1982). Vi khuẩn này
còn gây bệnh xuất huyết trên cá trê trắng giống (Clarias batrachus) và là tác nhân
gây bệnh xuất huyết ở cá basa nuôi trong bè gỗ (Tanasomwang và Saitanu, 1979).
Vi khuẩn A. hydrophila cịn được tìm thấy trên bệnh phẩm cá trê (Clarias sp)
(trích dẫn bởi Trần Anh Dũng, 2005).
Cũng theo điều tra của Trần Anh Dũng (2005) vào thời gian lũ rút, các hộ nuôi cá
tra ao ghi nhận bệnh xuất huyết xuất hiện rất cao, với 85.4% hộ đã ghi nhận.
Trang 6


Bệnh do A. hydrophila trên cá chình thường xuất hiện vào mùa xuân - hè, nhiệt
độ nước khoảng 17 - 22oC, khoảng nhiệt độ này cũng được cho là khoảng nhiệt
độ thích hợp cho vi khuẩn này phát triển (Esteve et al., 1993). Bên cạnh đó,
Groberg khi gây cảm nhiễm A. hydrophila trên cá hồi đã kết luận tỉ lệ chết thường
cao ở 20,5oC và 17oC, tỉ lệ chết thấp hơn ở 15oC và 12oC, ở 9oC hay thấp hơn nữa
thì cá chết rất ít hoặc khơng thấy cá chết (trích dẫn bởi Roselynn and Stevenson,
1988).
Trong báo cáo của Rahman et al., (2000) ông cho rằng vi khuẩn A. hydrophila có
độc lực cao nhất khi to = 17oC (LD50=106.03 CFU/ml) và 25oC (LD50=106.53

CFU/ml) đối với thí nghiệm gây cảm nhiễm trên cá vàng (Carassius auratus).
Bên cạnh đó, Azad et al., (2001) gây cảm nhiễm vi khuẩn A. hydrophila trên cá rô
phi bằng phương pháp tiêm với mật độ vi khuẩn 107 CFU/ml đã gây chết 80% cá
thí nghiệm. Năm 2001 trong thí nghiệm của mình, Đồn Nhật Phương tiến hành
gây cảm nhiễm 15 chủng A. hydrophila trên cá chép bằng phương pháp tiêm với
mật độ vi khuẩn từ 103 CFU/ml đến 107 CFU/ml trong thời gian 14 ngày, qua 2
lần thí nghiệm thì các chủng vi khuẩn độc lực mạnh có LD50 lần lượt là 3,68x106
CFU/ml (chủng A4); 2,64x106 CFU/ml và 4,52x106 CFU/ml (chủng A11);
1,96x106 CFU/ml và 1,45x107 CFU/ml (chủng A13).

Trang 7


PHẦN III
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Địa điểm nghiên cứu
-

Thu mẫu cá tra từ các ao nuôi thâm canh ở Vĩnh Long, Đồng Tháp và Cần
Thơ.

-

Phân tích mẫu tại các phịng thí nghiệm Bộ mơn Sinh học và Bệnh Thủy sản
- Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ.

Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12 năm 2008 đến tháng 05 năm 2009.
3.2 Vật liệu nghiên cứu
3.2.1 Ðối tượng nghiên cứu

-

Cá tra có dấu hiệu xuất huyết được thu mẫu trong ao nuôi thâm canh ở Vĩnh
Long, Đồng Tháp và Cần Thơ.

3.2.2 Dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu
-

Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa.
Pipet, ống nghiệm, ống đong.
Lame, lamella, đĩa petri, giấy nhơm.
Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi.
Chai nấu mơi trường, cá từ, bình tam giác, cốc thủy tinh.
Đầu cole, ống hút, găng tay.
Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh.
Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.
Cân điện tử, lò viba, máy lắc.
Các vật liệu khác …

3.3 Hóa chất
3.3.1 Các hóa chất và mơi trường dùng để phân lập vi khuẩn
-

Cồn 70o, cồn 96o.
Tryptone soya agar (TSA), nutrient agar (NA).

Trang 8


3.3.2 Các hóa chất và mơi trường dùng để định danh vi khuẩn bằng phương

pháp sinh hóa truyền thống và kít API 20E
-

Vaseline.
Bộ hóa chất nhuộm Gram.
Dung dịch H2O2.
Que thử oxidase.
Mơi trường O/F, glucose, parafin.
Nước cất.
Bộ kít API 20E (bộ test và thuốc thử: TDA, IND, VP).
Các loại hóa chất và môi trường dùng để định danh vi khuẩn theo phương
pháp sinh hóa truyền thống.

3.4 Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Thu mẫu, bảo quản và vận chuyển
-

Dự kiến thu khoảng 90 mẫu ở 15 ao, mỗi ao thu ít nhất 4 cá bệnh và 2 cá
khỏe.

-

Cá thu có dấu hiệu bệnh lý và cịn sống.

-

Mẫu được vận chuyển về phịng thí nghiệm trong thùng mướp có sục khí và
được phân tích ngay. Chỉ sử dụng những mẫu còn sống.

3.4.2 Phân lập vi khuẩn

-

Mẫu cá dùng để lấy mẫu vi khuẩn phải còn sống.

-

Trước khi giải phẩu đặt cá trên khay sạch. Quan sát cá bằng mắt thường, ghi
nhận tất cả các biểu hiện bên ngoài: vết thương, điểm xuất huyết, mùi và các
triệu chứng của bệnh.

-

Cá được tiệt trùng bên ngoài bằng cồn 70o và lau sạch. Sau đó, dùng dao kéo
đã tiệt trùng để mổ cá. Khi mổ tránh làm vỡ các cơ quan nội tạng.

-

Hơ que cấy vi sinh trên ngọn đèn cồn cho đến khi nóng đỏ và để nguội.

-

Quan sát và ghi nhận các dấu hiệu bên trong.

-

Lấy mẫu vi sinh ở 3 cơ quan gan, thận, tỳ tạng cấy trên môi trường NA.

-

Ủ đĩa trong tủ ấm 28oC sau 18 - 24 giờ. Ghi nhận màu sắc hình dạng khuẩn

lạc, tiến hành tách rịng cho đến khi đạt đĩa cấy thuần.
Các thao tác trên được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
Trang 9


3.4.3 Nuôi tăng sinh vi khuẩn
-

Trước khi nuôi tăng sinh các chỉ tiêu cơ bản gồm nhuộm Gram, tính di động,
oxidase, catalase và phản ứng O/F phải được kiểm tra.

-

Sau đó chọn một khuẩn lạc từ đĩa cấy thuần cho vào ống nghiệm 5ml NB đã
tiệt trùng đặt trên máy lắc (200 vòng/phút) sau 18 - 24 giờ đọc kết quả.

3.5 Phương pháp định danh vi khuẩn
3.5.1 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp sinh hóa truyền thống
Các chỉ tiêu sinh hóa được xác định theo phương pháp của Barrow và Feltham
(1993). Cách tiến hành, thành phần môi trường và cách pha chế được trình bày ở
phụ lục 1. Các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa của vi khuẩn được xác định
bằng phương pháp sinh hóa truyền thống được trình bày ở bảng 3.1.
Bảng 3.1: Các chỉ tiêu định danh vi khuẩn A. hydrophila bằng phương pháp sinh
hóa truyền thống.
STT
1
2
3
4
5

6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23

Chỉ tiêu
Nhuộm Gram
Hình dạng
Sinh sắc tố
Di động
Sinh catalaza
Sinh oxidaza
Phản ứng lên men yếm khí
Phản ứng lên men hiếu khí
Arginine
Lysine

Ornithine
Mọc trên mơi trường Aeromonas
Sinh gas từ glucose
Thuỷ phân aesculine
Sinh ureaza
Sử dụng citrate
Sinh amylaza
Sinh indole
Phản ứng VP
Thuỷ phân Tween 80
Tạo nitrit từ nitrat
Mọc ở 0% NaCl
Mọc ở 3% NaCl
Trang 10


24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37

38
39

Mọc ở 6% NaCl
Mọc ở 7% NaCl
Mọc ở 10% NaCl
Mọc trên thạch TCBS
Kháng với O/129
Sử dụng
Arabinose
Cellobiose
Galactose
Glycerol
Lactose
Mannitol
Trehalose
Sucrose
Glucose
Salicin
Xylose

3.5.2 Định danh vi khuẩn bằng bộ kít API 20E
-

Định danh theo hướng dẫn của nhà sản xuất (BioMerieux).

-

Các chỉ tiêu định danh bằng bộ kít API 20E được trình bày ở bảng 3.2.

-

Các chỉ tiêu nhuộm Gram, di động, oxidase, catalase và phản ứng O/F của vi
khuẩn được kiểm tra trước khi định danh bằng kít API 20E.
Phương pháp thực hiện

-

Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5ml nước muối sinh lý
hoặc nước cất tiệt trùng, lắc trộn đều.

-

Cho một ít nước vào khay nhựa của bộ kít để giữ ẩm khi ủ trong tủ ấm.

-

Dùng pipet với đầu cole tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của
bộ kít. Nhỏ dung dịch vi khuẩn vừa đủ vào tất cả các ô ngoại trừ 3 ô CIT,
VP, GEL thì nhỏ đầy, 5 ơ ADH, LDC, ODC, H2S và URE cho thêm parafin
tiệt trùng để tạo điều kiện yếm khí.

-

Đậy nắp khay lại và ủ trong tủ ấm ở 28oC.

Trang 11


Bảng 3.2: Các chỉ tiêu định danh A. hydrophila bằng bộ kít API 20E.

Chỉ tiêu
ONPG
ADH
LDC
ODC
CIT
H2S
URE
TDA
IND
VP
GEL
GLU
MAN
INO
SOR
RHA
SAC
MEL
AMY

Âm tính

Dương tính

Khơng màu
Vàng
Vàng
Vàng
Vàng

Khơng màu
Vàng
Vàng
Vàng
Khơng màu
Khơng màu (còn kết tủa đen)
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá
Xanh/xanh lá

Vàng
Đỏ/ cam
Đỏ/cam
Đỏ/cam
Xanh/xanh lá
Đen
Đỏ/cam
Nâu sậm
Đỏ (2 phút)
Hồng/đỏ (10 phút)
Đen
Vàng
Vàng
Vàng
Vàng

Vàng
Vàng
Vàng
Vàng

Ghi chú:
-

ONPG: ortho - nitrophenyl galactosidase
ADH: arginine dihydrolase
LDC: lysine decarboxylase
ODC: ornithine decarboxylase
CIT: citrate
H2S: sinh H2S
URE: urea
TDA: tryptophane deaminase
IND: indole
VP: phản ứng Voges - Proskauer

-

GEL: gelatin
GLU: glucose
MAN: mannitol
INO: inositol
SOR: sorbitol
RHA: rhamnose
SAC: sucrose
MEL: melibiose
AMY: amygdaline

ARA: arabinnose

Đọc kết quả: sau 18 - 24h.
-

Kiểm tra và ghi nhận tất cả các chỉ tiêu không cần cho thêm thuốc thử đọc kết
quả dựa vào bảng bên trên.

-

Các chỉ tiêu cần sử dụng thuốc thử.

Trang 12


TDA: Nhỏ một giọt thuốc thử TDA. Một màu đen xuất hiện thì kết quả
phản ứng là dương tính (+), màu vàng thì kết quả phản ứng âm tính (-).
IND: Nhỏ một giọt thuốc thử IND. Đợi 2 phút. Một vịng màu đỏ xuất hiện
là phản ứng dương tính (+), màu vàng là phản ứng âm tính (-).
VP: Thêm một giọt lần lượt mỗi dung dịch thuốc thử VP1,VP2. Đợi ít nhất
10 phút, màu hồng hoặc đỏ xuất hiện là phản ứng dương tính (+). Nếu màu
hồng nhạt xuất hiện trong vòng 10 - 12 phút là phản ứng âm tính (-).

Trang 13


PHẦN IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả
4.1.1 Tình hình bệnh xuất huyết ở các ao nuôi cá tra

Qua kết quả thu mẫu và phân tích mẫu tại phịng thí nghiệm Bộ môn Sinh học và
Bệnh thủy sản - Khoa Thủy Sản - Trường Đại Học Cần Thơ đề tài đã thu mẫu
được tổng số 17 ao ở 3 tỉnh Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ. Trong tổng số
17 ao thu được có 5 ao cá bị bệnh xuất huyết (chiếm 29,41%). Số ao thu được ở
Đồng Tháp là 10 ao trong đó có 1 ao bị bệnh xuất huyết (chiếm 10%). Số ao thu ở
Vĩnh Long là 4 ao trong đó có 1 ao bệnh xuất huyết (chiếm 25%) và ở Cần Thơ
thì cả 3 ao cá đều bị bệnh xuất huyết. (Bảng 4.1 và phụ lục 2).
Bảng 4.1 Bảng kết quả thu mẫu.
STT
1
2
3

Địa điểm
Đồng Tháp
Vĩnh Long
Cần Thơ
Tổng cộng

Tổng số
ao thu
10
4
3
17

Số ao bệnh
xuất huyết
1
1

3
5

Số chủng
Aeromonas
4
4
20
28

Cá bị bệnh xuất huyết có dấu hiệu thường gặp nhất là xuất huyết ở gốc các vi, da,
nắp mang, miệng hay xuất huyết quanh mắt và phù mắt. Cá bệnh nặng có thể có
nhiều vết loét trên cơ thể. Bên trong cá có thể bị xuất huyết ở thành bụng, nội
quan, mở và cơ (Hình 4.1). Xoang bụng thỉnh thoảng chứa nhiều chất dịch có mùi
hơi.
Kết quả phân tích vi sinh ở 5 ao cá bị bệnh xuất huyết đã phân lập được
tổng số 28 chủng vi khuẩn Aeromonas (Đồng Tháp: 4 chủng; Vĩnh Long: 4
chủng; Cần Thơ: 20 chủng). Dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá lúc phân tích và
hình thái khuẩn lạc đã chọn ra 8 chủng vi khuẩn đại diện (Đồng Tháp: 2 chủng;
Vĩnh Long: 2 chủng; Cần Thơ: 4 chủng) (Bảng phụ lục 3) để tiến hành định danh
bằng phương pháp sinh hóa truyền thống và bằng bộ kít API 20E. Kết quả định
danh bằng 2 phương pháp cả 8 chủng vi khuẩn đều là A. hydrophila (Bảng 4.2 và
Bảng 4.3).

Trang 14


Hình 4.1 Cá bị xuất huyết

4.1.2 Định danh vi khuẩn phân lập bằng phương pháp sinh hóa truyền thống

Trong số 28 chủng vi khuẩn phân lập được dựa vào dấu hiệu bệnh lý của cá bệnh
và một số thông tin lúc thu mẫu cũng như trong quá trình phân lập chọn ra 8
chủng vi khuẩn, trong đó có 2 chủng ở Đồng Tháp (SĐ2.1T, SĐ2.2T), 2 chủng ở
Vĩnh Long (CA1.2T, CA1.3TT) và 4 chủng ở Cần Thơ (TN1.1T, TN2.4TT,
TN2.1G, CS2.3T) để tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa.
Kiểm tra các đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa được xác định dựa
theo cẩm nang của Cowan và Steel (Barrow và Feltham, 1993). Mỗi chỉ tiêu được
lặp lại 3 lần, kết quả được ghi nhận là kết quả có ít nhất 2 lần lặp lại. Đặc điểm
hình thái, sinh lý và sinh hóa của các chủng vi khuẩn kiểm tra được trình bày ở
Bảng 4.2.
Theo bảng kết quả kiểm tra các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa
(Bảng 4.2) thì tồn bộ 8 chủng vi khuẩn được định danh đều là vi khuẩn gram âm,
hình que (Hình 4.2), có khả năng di động nhưng không sinh sắc tố. Khuẩn lạc của
vi khuẩn có dạng trịn, hơi lồi, nhẵn và màu trắng đục trên mơi trường TSA (Hình
4.3), cịn trên mơi trường Aeromonas agar thì khuẩn lạc của vi khuẩn cũng có
dạng trịn, lồi, nhẵn, nhưng có màu vàng (Hình 4.4).

Trang 15


Bảng 4.2 Đặc điểm hình thái, sinh lý và sinh hóa của 8 chủng vi khuẩn phân lập
Chỉ tiêu kiểm tra
A0 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8
Nhuộm Gram
Hình dạng
q q q q q q q q q
Sinh sắc tố
Di động
+ + + + + + + + +
Sinh catalaza

+ + + + + + + + +
Sinh oxidaza
+ + + + + + + + +
Lên men yếm khí
+ + + + + + + + +
Lên men hiếu khí
+ + + + + + + + +
Arginine
+ + + + + + + + +
Lysine
+ + + + + + + + +
Ornithine
Mọc trên môi trường Aeromonas + + + + + + + + +
Sinh gas từ glucose
+ + + + + + + + +
Thuỷ phân aesculine
+
- + + + +
- + +
Sinh ureaza
Sử dụng citrate
+ + + + + + + + +
Sinh amylaza
+ + + + + + + + +
Sinh indole
+
- +
- +
- +
Phản ứng VP

+
Thuỷ phân Tween 80
+
Tạo nitrit từ nitrat
+ + + + + + + + +
Mọc ở 0% NaCl
+ + + + + + + + +
Mọc ở 3% NaCl
+ + + + + + + + +
Mọc ở 6% NaCl
+
Mọc ở 7% NaCl
Mọc ở 10% NaCl
Mọc trên thạch TCBS
Kháng với O/129
Sử dụng
Arabinose
+
Cellobiose
Galactose
+ + + + + + + + +
Glycerol
+ + + + + + + + +
Lactose
+ + + + + + + +
Mannitol
+ + + + + + + + +
Trehalose
+ + + + + + + + +
Sucrose

+ + + + + + + + +
Glucose
+ + + + + + + + +
Salicin
+ + + + + + + + +
Xylose
(+): phản ứng dương tính ( - ): phản ứng âm tính; (q) que;A0: chủng chẩn A. hydrophila ATCC 7966;
A1: TN1.1T; A2: TN2.1G; A3:TN2.4TT; A4: SĐ2.2T; A5: SĐ2.1T; A6: CS2.3T; A7: CA1.2T; A8:
CA1.3TT

Trang 16


Hình 4.2 Hình dạng vi khuẩn A. hydrophila ở vật kính 100X

Hình 4.3 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên mơi trường TSA

Hình 4.4 Khuẩn lạc vi khuẩn A. hydrophila trên môi trường Aeromonas agar

Trang 17


Các vi khuẩn phân lập được đều cho phản ứng dương tính với oxidase, catalase,
có khả năng lên men trong cả hai điều kiện hiếu khí và yếm khí. Tất cả đều cho
phản ứng decarboxylase dương tính với arginine, lysine và âm tính với ornithine
(Hình 4.5). Chúng phát triển tốt trên mơi trường Aeromonas agar và có khả năng
phát triển ở nồng độ muối thấp (0% và 3%) nhưng không có khả năng phát triển ở
những nồng độ muối cao hơn (6%, 7% và 10%).

Hình 4.5 Kết quả phản ứng decarboxylase

Hình 4.6 Kết quả phản ứng citrate

Trang 18