Nghiên cứu tính đa dạng của allele hla - DQA1 bằng kỹ thuật polymerase chain reaction sequence specific primers (PCR - SSP) ở dân tộc kinh miền trung - Việt Nam docx

Nghiên cứu tính đa dạng của allele hla - DQA1
bằng kỹ thuật polymerase chain reaction
sequence specific primers (PCR - SSP) ở dân tộc
kinh miền trung - Việt Nam
Trần Đình Bình
1
, Wang Linlin
2
, Lin Weixiong
2
và cộng sự
1
Bộ môn Vi sinh vật Y học, Đại học Y khoa Huế
2
Trờng Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc

Sử dụng kỹ thuật khuyếch đại chuỗi gen Polymerase Chain Reaction Sequence Specific
Primers (PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng của sự phân bố allel HLA - DQA1 ở 214
thanh thiếu niên khoẻ mạnh dân tộc Kinh, miền Trung Việt Nam, kết quả cho thấy:
10 allele HLA-DQA1 đã đợc tìm thấy, trong đó DQA1*0104 là phổ biến nhất với tần suất
là 25.8% và thấp nhất là DQA1*0601 (1%).
Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tính đa dạng allele HLA-DQA1 ở dân tộc Kinh miền trung
Việt Nam có tính đặc trng dân tộc và khác với các dân tộc khác ở Trung Quốc, ở Thái Lan.

I. Đặt vấn đề
Hệ kháng nguyên bạch cầu ngời (HLA,
human lymphocyte antigen) nằm trên
nhiễm sắc thể thứ 6, đây là một hệ kháng
nguyên rất phức tạp, và đa dạng. Hệ HLA
không những là tiêu chí di truyền của mỗi
ngời mà đồng thời còn liên hệ chặt chẽ với

chức năng điều hoà miễn dịch và các bệnh
tật khác. Những ngời không cùng một loại
hình phân bố các allele của HLA thì tính
cảm thụ hay sức đề kháng với một số bệnh
không giống nhau. Nhiều tác giả nớc
ngoài đã nghiên cứu sự khác biệt về phân
bố allele HLA - DQA1 trong quần thể ngời
đã phát hiện một số ngời mang những
allele này sẽ có khả năng cảm thụ, hay đề
kháng với một số bệnh tật nhất định. Trong
thực tế, mỗi dân tộc có mỗi bối cảnh di
truyền, yếu tố di truyền khác nhau, cùng
một dân tộc nhng khác nhau về vị trí địa
lý thì sự phân bố các alleles của hệ HLA
cũng khác nhau [3, 7]. ở Trung Quốc đã có
nhiều nghiên cứu về hệ HLA, nhất là sự
phân bố của allele HLA - DQA1 trên nhiều
dân tộc nh Hán, Choang, Bố y, Duy Ngô,
Nhĩ, Mãn Thái Lan cũng đã có báo cáo về
vấn đề này, nhng cho đến nay cha có
báo cáo nào về phân bố allele HLA - DQA1
ở Việt Nam. Chúng tôi áp dụng kỹ thuật
DCSVkhuyếch đại chuỗi gen Polymerase
Chain Reaction Sequence Specific Primers
(PCR - SSP) để nghiên cứu tính đa dạng
của sự phân bố allel HLA - DQA1 ở dân tộc
Kinh, miền Trung Việt Nam để góp phần
nghiên cứu sự khác biệt về di truyền giữa
các dân tộc khác nhau.
II. Đối tợng và phơng pháp

nghiên cứu
1. Đối tợng nghiên cứu:
Là 214 thanh thiếu niên khoẻ mạnh, tuổi
từ 7 - 36, dân tộc Kinh, c trú tại các tỉnh
Thừa Thiên Huế, Quảng Trị và Quảng Bình
tỷ lệ nam nữ: 1: 1, tuổi bình quân là 14.
2. Tách DNA: trên mỗi đối tợng lấy 2ml
máu tĩnh mạch, thêm 0,5ml Natri citrate
3,8% chống đông và dùng phơng pháp
chiết tách DNA kinh điển có cải tiến là
Phenol/chloroform. Các bớc nh sau:
Với 2ml máu chống đông, thêm 5ml
dung dịch gelatine 3%, trộn đều ủ ở
37
0
C/10 phút, tách lấy phần dịch phía trên,
46
ly tâm 3500 rpm/5 phút, bỏ phần dịch phía
trên, thêm 2ml dung dịch TES 2mm, trộn
đều, thêm 0,5ml dung dịch 10% SDS, trộn
đều, thêm 2ml dung dịch Phenol bão hoà
trong TES. Trộn đều, ly tâm 3500 rpm/5
phút, tách lấy phần dịch ở trên (có thể tiến
hành bớc này thêm một lần nữa), thêm
2ml dung dịch Chloroform/Isoamylic (v/v:
24/1) trộn đều, ly tâm 3500 rpm/5 phút.
Tách lấy phần nớc trong ở trên, thêm 5ml
dung dịch cồn Ethylic 95%, nhẹ nhàng quay
ống nghiệm để các sợi DNA xoắn lại, dùng
ống hút nhỏ nhẹ nhàng hút lấy DNA và bảo

quản ở một ống khác trong dung dịch cồn
75%. Khi sử dụng có thể dùng dung dịch
TE hoặc nớc cất để hoà tan DNA.
3. Kỹ thuật PCR để phân tích allele
HLA - DQA1.
Các cặp mồi đặc hiệu (specifiec
primers) căn cứ vào bảng các nucleotides
của các alleles của hệ HLA II năm 2002 và
dựa vào các Primers đặc hiệu của
O.Olerup, chúng tôi thấy các Primers đặc
hiệu từ Trung tâm nghiên cứu Vi sinh vật
học và Công nghệ sinh học của Viện Khoa
học Trung Quốc (tham khảo bảng 1), bao
gồm 9 chuỗi 5' và 7 chuỗi 3' hợp thành 12
đôi Primers đặc hiệu để khuyếch đại và
phân tích exon thứ 2 của HLA - DQA1
allele.
Các cặp mồi đối chiếu: mỗi lần tiến hành
PCR đều dùng một đôi mồi đối chiếu là
Ctr1 1 (
5
TAT CAT GCC TCT TTG CAC
CAT TC
3
, 23 mer, TM 66
0
C) Ctrl 2 (AAT
GCA CTG AAC TCC CAC ATT CC
3
, 23

mer, Tm 70
0
C) để kiểm soát và đối chiếu
phản ứng khuyếch đại PCR.
Kỹ thuật PCR - SSP: Dựa vào phơng
pháp của O. Olerup để tiến hành, cụ thể là:
mỗi ống tiến hành PCR chứa 10àl gồm có:
75ng tiêu bản DNA, dung dịch đệm 5 x
PCR (50mmol KCl; 1.5mmol MgCl2;
10mmol Tris-HCl (pH 8.3); 0,001% (w/v)
Gelatin) 1% BSA, 200àl dNTPs chính là các
dATP, dGTP, dCTP và dTTP; 0,25 àM các
đôi mồi đặc hiệu, 0,05 àM đôi mồi đối chiếu
và 0,50 IU Taq DNA polymerase. Tiến hành
30 chu kỳ, mỗi chu kỳ nh sau: Biến tính
94
0
C/30 giây => giảm nhiệt 62
0
C/30 giây =>
nối dài 72
0
C/90 giây. Sản phẩm thu đợc
sau PCR đợc tiến hành điện di ở trong
thạch Agarose 1,5% với điện áp 100V trong
15 phút. Xem và phân tích kết quả ở đèn
cực tím hoặc ở máy vi tính để chụp ảnh và
bảo lu kết quả.
4. Xử lý số liệu thống kê: dùng cách
tính tần suất % theo Hardy - Weinberg để

thống kê và xử ý các kết quả đạt đợc.
Bảng 1: Vị trí, kích thớc và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuyếch đại allele
DQA1
TT Tên gọi các
allele
Đôi Primers đặc
hiệu
Sản phẩm
PCR
Các allele thu hoạch
sau PCR
1 DQA1 * 0101/4 A * 5'01 + A * 3'01 DQA1 *0101,
DQA1*0104
2 DQA1 * 0102/4 A * 5' 02 + A * 3'01 DQA1 *0101,
DQA1*0102,
DQA1*0104
3 DQA1 * 0102/3 A * 5'03 + A * 3'01 DQA1 *0101,
DQA1*0103
4 DQA1 * 0103 A * 5'04 + A * 3'02 149bp DQA1 *0103
5 DQA1 * 0201 A * 5'04 + A * 3'02 172bp DQA1 *0201
47
Bảng 1: Vị trí, kích thớc và tên gọi của các Primers đặc hiệu để khuyếch đại allele
DQA1(tiếp)
TT Tên gọi các
allele
Đôi Primers đặc
hiệu
Sản phẩm
PCR
Các allele thu hoạch

sau PCR

6 DQA1 * 0301 A * 5'05 + A * 3'03 170bp DQA1 *0301
7 DQA1 * 0302 A * 5'06 + A * 3'03 183bp DQA1 *0302
8 DQA1 * 0401 A * 5'07 + A * 3'04 190bp DQA1 *01030401
9 DQA1 * 0501 A * 5'02 + A * 3'05 186bp DQA1 *0501
10 DQA1 * 0601 A * 5'02 + A * 3'05 117bp DQA1 *0601
11 DQA1 * "A" A * 5'08 + A * 3'07 196bp All DQA1 alleles
except DQA1*0104
12 DQA1 * 0104 A * 5'09 + A * 3'07 170bp DQA1 *0104

II. Kết quả
Kết quả phân tích HLA - DQA1 từ 214
mẫu máu (xem bảng 2). Đã kiểm tra đợc
10 loại allele DAQ1, tần suất tìm thấy cao
nhất là allele DQA1 * 0140 (25,8%), tiếp đó
là các allele DQA1 * 0101 và DQA1 * 0102
với tần suất tìm thấy lần lợt là 19,4% và
15,7%, các allele DQA1 còn lại đều đợc
tìm thấy dới 10%. Nhiều alleles là đồng
hợp tử nên tổng số các alleles là đồng hợp
tử thì cần phải tiếp tục kiểm tra chuỗi DNA.
Đề tài này cha tiến hành xác định các
alleles là đồng hợp tử bằng kỹ thuật đọc
chuỗi. Hình ảnh dới đây là kết quả điện di
sản phẩm PCR sau khuyếch đại đợc phân
tích và lu ảnh ở máy tính Bio - Rad Gel
Doc. 2000.
Bảng 2: Tần suất các allele HLA - DQA1 của ngời Kinh Việt Nam
TT

Tên gọi các
allele
Lợt tìm
thấy (328)
Tần suất kháng
nguyên (%)
Tần suất allele tìm
đợc (%)
1 DQA1 * 0101/4 75 0.35 0.194
2 DQA1 * 0102/4 62 0.29 0.157
3 DQA1 * 0102/3 8 0.04 0.020
4 DQA1 * 0103 96 0.45 0.258
5 DQA1 * 0201 24 0.11 0.056
6 DQA1 * 0301 24 0.11 0.056
7 DQA1 * 0302 6 0.03 0.015
8 DQA1 * 0401 22 0.10 0.051
9 DQA1 * 0501 7 0.03 0.015
10 DQA1 * 0601 4 0.02 0.010

III. Bàn luận
Cho đến nay, hệ kháng nguyên bạch
cầu ngời (HLA) đợc coi là hệ kháng
nguyên di truyền phức tạp và đa dạng nhất.
Chúng không chỉ có sự phân bố khác nhau
giữa các cá thể khác nhau, mà còn sự khác
biệt giữa các dân tộc do khác nhau về bối
cảnh di truyền, yếu tố di truyền và ngay cả
cùng một dân tộc nhng khác nhau về vị trí
48
địa lý. Nghiên cứu tính đa dạng của hệ

kháng nguyên bạch cầu ngời có vị trí rất
quan trọng vì nó là một tiêu chí di truyền
học vô cùng chắc chắn, ứng dụng nhiều
trong việc xác định con cái, bố mẹ, trong
khoa học hình sự để tìm tội phạm, trong
nghiên cứu nhân chủng học, dân tộc học để
tìm hiểu nguồn gốc của một dân tộc [1].
Ngoài ra, nhiều kết quả nghiên cứu gần đây
còn khẳng định mối liên hệ mật thiết giữa
HLA và một số bệnh tật nh: đái tháo
đờng không phụ thuộc Isulin, Viêm cứng
cột sống, viêm đa khớp dạng thấp, viêm
khớp thiếu niên Vì thế nghiên cứu HLA
còn có ý nghĩa quan trọng trong phân loại,
chuẩn đoán và hỗ trợ chuẩn đoán, tiên
lợng bệnh, dự phòng và điều trị một số
bệnh tật. Theo đà phát triển mạnh mẽ của
sinh học phân tử, việc nghiên cứu HLA
ngày càng đơn giản, thuận tiện và chính
xác. Tại Việt Nam, lĩnh vực nghiên cứu về
HLA vẫn còn khu trú tại các Viện nghiên
cứu, Phòng Khoa học hình sự còn cha
đợc sử dụng nhiều trong bệnh viện và các
phòng thí nghiệm y học. Đây có lẽ là nghiên
cứu đầu tiên tại Việt Nam về HLA, dẫu rằng
có tài liệu đề cập đến hệ HLA của ngời
Việt Nam nhng không ghi rõ nơi nghiên
cứu [1].
Theo kết quả nghiên cứu trên đây, ngời
dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam có tần

suất tìm thấy allele HLA - DQA1 * 0104 là
cao nhất 25,8%, tiếp đó là các allele DQA1
* 0101 và DQA1 * 0102 với tần suất tìm
thấy lần lợt là 19,4% và 15,7%, các allele
khác đợc tìm thấy với tần suất rất thấp. So
sánh với các dân tộc khác ở Trung Quốc
thấy rằng tần suất tìm thấy các allele phân
bố khá giống với dân tộc Choang (đã tìm
thấy allele HLA - DQA1 * 0104 với tần suất
22,1% và allele HLA - DQA1 * 0401 là
1,1%). Dân tộc Kinh miền Trung Việt Nam
có các allele HLA - DQA1 * 0301 và HLA -
DQA1 * 0501 đợc tìm thấy rất thấp, đều
thấp hơn cả 10 dân tộc ở Trung Quốc (xem
bảng 3). Nh vậy, tần suất allele HLA -
DQA1 * 0401 cao, HLA - DQA1 * 0301 và
HLA - DQA1 * 0501 thấp có lẽ là đặc trng
phân bố allele HLA - DQA1 của ngời Kinh
miền Trung Việt Nam. So sánh với nghiên
cứu trên ngời Thái Lan thấy HLA - DQA1 *
0101, HLA - DQA1 * 0102 có tần suất tơng
tự nhng tần suất HLA - DQA1 * 0501
(12,8%) cũng cao hơn nhiều so với ngời
Kinh miền Trung Việt Nam. (p < 0,005).
Dân số Việt Nam hiện nay khoảng 80
triệu ngời, với 54 dân tộc anh em, trong đó
ngời Kinh chiếm tỷ lệ rất lớn (khoảng 90%)
phân bổ khắp toàn quốc. Dân tộc Kinh có
truyền thống, lịch sử, văn hoá rất lâu đời.
Nghiên cứu về dân tộc học cần tập trung

trên nhiều phơng diện nh
văn hoá, lịch
sử, truyền thống, nhân chủng học trong
đó di truyền học giữ một vai trò quan trọng.
Báo cáo này có lẽ là nghiên cứu đầu tiên về
phân bố các alleles của HLA - DQA1 trên
ngời Kinh ở miền Trung Việt Nam, với
những số liệu ban đầu này, chúng tôi hy
vọng có thể tiếp tục nghiên cứu thêm về
phân bố kháng nguyên hệ HLA nhằm tìm ra
đợc đặc trng phân bố kháng nguyên HLA
trên ngời Kinh Việt Nam, điều này có ý
nghĩa lớn trong Y học (chuẩn đoán, dự
phòng, tiên lợng, điều trị một số bệnh ),
trong nhân chủng học nhằm nghiên cứu các
nguồn gốc các dân tộc và mối liên hệ giữa
các dân tộc khác nhau.
Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin
chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu Trờng
Đại học Y khoa Huế, Bệnh viện thực hành
Trờng Đại học Y khoa Huế, Bộ môn Vi
sinh, Khoa Xét nghiệm trờng Đại học Y
khoa Huế, Trung tâm thí nghiệm Trờng
Đại học Y khoa Quảng Tây, Trung Quốc và
các thầy cô, đồng nghiệp. Xin chân thành
biết ơn.
Tài liệu tham khảo
1. Cao Mengde, Tai Dongchun, Sun
Hanxiao et al: Biological molecular and
Clinincal applies of HLA. Human Medical

University Publishing, 1998, 1 - 58.
49
2. Meng Haiying, Hou Yiping: New reseach
hotpots of HLA, Chin. J.Med Genet, 2000 17
(5), 355 - 357.
3. Xu xingpei, Wang Shaoying, Cao
Jianying: Study on DNA typing of HLA - II class
genes of Chinese Buyi nationality. Chin. J.
Microbiol. Immnol. 1992 12(5), 285 - 289.
4. Long Guifang, Ahmed Abdi Mohamed:
HLA - DQA1, DQB1 alleles genotyping by PCR
- SSP in Guangxi Chinese Zhuang nationality.
Chin. J. Microbiol. Immnol. 1999 19(6) 504 -
505.
5. Shen Jingjing, Guan Xiaofan, Yang Ze et
al: Allels at five HLA - II class determined in
Weiwuer nationality in North - Western of
China. Chin.J.Med. Genet. 2000, 17 3), 219 -
220
6. Li Xiaofeng, Chang Chang, Hong
Shenxue et al: Association of alleles HLA -
DRB1, DQA1, DQB1 with SLE in Han
populations in Yunnan, China. Chin. J. Med.
Genet 2001, 18(5), 408 -409.
7. D. Chandanayingyong, Henry
A.F.Stephens, R.Claythong et al: HLA - A, -B, -
DQA1 and - DQB1 Polymorphism in Thais.
Human Inmmunology, 17, 53, 174 - 182.
8. O. Olerup, A.Aldener, A. Fogdell: HLA -
DQB1 and DQA1 typing by PCR - SSP in 2

hours. Tissue Antigens, 193, 41(3), 119 - 134.
9. Zhou Xiaoling, Lin Weixiong: DNA
detection from peripheral blood. Chinese
Guangxi Medical University Magazine, 1999,
16(2), 223.
10. Zhao Tongmao: Genetics of Human
Blood Group, Chinese Science Publishing,
187, 226 -236

Summary
Analysis of HLA – DQA1 alleles of jing nationality in
central vietnam
Objective: To analyse of HLA-DQA1 alleles in Jing nationality of Central Vietnam.
Methods: Applied PCR-SSP technique to determine the polymorphism of the HLA-DQA1 alleles of
214 healthy children and yoth, unrelated individuals in Centre of Vietnam.
Results: 10 HLA-DQA1 alleles were detected, of which DQA1*0104 were the most common alleles
with frequency of 25.8%, and lowest frequency is DQA1*0601 (1%).
Conclusion: The results indicate that HLA-DQA1 alleles polymorphism of Jing nationality in Central
Vietnam have national characteristics and that are different from the other Chinese and Thais.
(Key word: Human leucocyte antigen, HLA-DQA1, PCR-SSP, Jing nationality of Vietnam)

50