Báo cáo thực hành thử độc thuốc lá trên phôi cá ngựa vằn

BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÁT TRIỂN
THỬ ĐỘC KHÓI THUỐC LÁ TRÊN PHƠI CÁ NGỰA VẰN
I.Mục đích
- Quan sát sự biến đối và phát triển của phôi cá ngựa vằn
- Khảo sát mức độ độc của thuốc lá với sự phát triển của phôi cá ngựa vằn
II. Giới thiệu:
Thuốc lá có nhiều thành phần độc hại:
1. Nicotine
Nicotine là một chất không màu, chuyển thành
màu nâu khi cháy. Nicotine được hấp thụ qua da,
miệng và niêm mạc mũi hoặc hít vào phổi. Nicotine
tác động đến hệ thần kinh bằng cách đưa dopamine
vào hệ thần kinh kích thích sự sinh ra của
adrenaline.
Bộ Y tế ban hành Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với thuốc lá điếu quy
định hàm lượng tối đa Nicotin trong khói 01 điếu thuốc lá là 1,4mg.
2. Monoxit carbon (khí CO)
Khí CO có nồng độ cao trong khói thuốc lá và sẽ được hấp thụ vào máu, gắn
với hemoglobin với ái lực mạnh hơn 20 lần oxy, dẫn đến giảm lượng oxy chuyển
đến tổ chức gây thiếu máu tổ chức và có lẽ góp phần hình thành các mảng xơ vữa
động mạch.
3. Các phân tử nhỏ trong khói thuốc lá
Khói thuốc lá chứa nhiều chất kích thích dạng khí hoặc dạng hạt nhỏ. Các
chất kích thích này gây nên các thay đổi cấu trúc của niêm mạc phế quản dẫn đến
tăng sinh các tuyến phế quản, các tế bào tiết nhầy và làm mất các tế bào có lơng
chuyển.
Dự đốn kết quả: Tại nồng độ cao phơi của cá ngựa vằn yếu đi, chậm chạp,
giảm sức sống, có thể chết, xuất hiện biến dạng liên quan đến hô hấp – tim, vận
động bị ảnh hưởng do tác động của thuốc lá đến hệ thần kinh.
(Bài báo tham khảo về tác động của nicotine đến phôi cá ngựa vằn
/>h_And_Development_in_Larval_Zebrafish )

III. Dụng cụ thí nghiệm:
- Thuốc lá Vinataba và Thăng Long
- Ống Falcon 50ml

- Đĩa petri
- Khay nhựa 24 giếng


- Pipet nhựa
- Cân
- Máy bơm tự chế

- Cá ngựa vằn
- Kính hiển vi
- Nước

IV. Thực hành ( kéo dài 6 ngày: từ 28/11/2017 đến 3/12/2017)
Tiến trình thí nghiệm:
Ngày 1: Chuẩn bị hóa chất và ghép cá ngựa vằn
- Chuẩn bị môi trường:
+ Dùng thiết bị bơm tự chế để thu lấy khói thuốc lá đã được lọc bằng giấy
lọc.
+ Mang giấy lọc đi cân (m1)rồi ngâm vào 100ml nước.
+ Mang giấy lọc sau khi ngâm đi sấy khô rồi cân lại(m2) để xác định nồng
độ thuốc lá.


+ Thu 100ml nước đã ngâm ở trên rồi pha để nồng độ thuốc lá trong mẫu là
100mg/l. Pha thêm nước để về nồng độ chẵn thuận tiện cho việc pha loãng
tiếp theo

Thăng Long
Vinataba
m1(mg)
93,7
124,5
m2(mg)
85
113,3
Nồng độ sau khi ngâm(mg/l) 87
112
V nước pha thêm(ml)
8,75
12
Nồng độ thu được(mg/l)
80
100
+ Chia dung dịch ra các ông Falcon và pha để đạt được gradient nồng độ
mong muốn. (ghi rõ nồng độ và loại thuốc ở nắp và cạnh ống)
Nồng độ Thăng Long
Nồng độ
Vinataba
V dd thuốc
V nước(ml)
V dd thuốc V nước(ml)
lá(ml)
lá(ml)
5
15(nồng độ 10) 15
10
5

45
10
5
35
20
10
40
20
15(nồng độ 40) 15
30
15
35
30
15(nồng độ 60) 15
40
20
30
40
20
20
60
30
20
50
15
9
60
30
10
70

35
5
- Ghép cặp cá ngựa vằn:
+ Chuẩn bị 5 âu nhựa có lót rổ ở trong (để thu được phôi lắng xuống dưới,
không bị cá trưởng thành ăn mất).
+ Vớt cá ngựa vằn ra âu nhựa (mỗi âu có một cá đực và một cá cái).
+ Đậy nắp để qua đêm, sáng hôm sau đến thu phôi.
Ngày thứ 2:
- Chuẩn bị các giếng môi trường:
+ Chuẩn bị các khay chứa giếng, mỗi khay ghi nồng độ và tên thuốc lá ở
cạnh khay.
+ Tra nước vào cột giếng đầu tiên để làm đối chứng, tra các giếng còn lại
với dung dịch thuốc lá. (mỗi giếng 1ml, lưu ý tra từ nồng độ từ thấp đến cao)
- Chuẩn bị phôi cá ngựa vằn:
+ Vớt cá ra, rửa đi rửa lại phôi nhiều lần để không bị vi khuẩn bám vào.
+ Hút phơi ra đĩa petri và đưa lên kính soi
+ Quan sát và chọn những phơi đã phân chia ít nhấy 2-3 lần(4-8 tế bào) sang
một đĩa petri khác


+ Hút các phôi và chấm nhẹ vào từng giếng, mỗi giếng một phôi.
Ngày thứ 3:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại sự phát triển của phơi, tỉ lệ sống của phơi trên kính
hiển vi.
Phơi chết sẽ có màu đen( hình ảnh ở phần kết quả)
- Thay môi trường: Hút 0.5ml dung dịch cũ từ các giếng và thay bằng 0.5ml dung
dịch mới, làm cẩn thận để không hút phôi lên.
Ngày thứ 4:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:

+ Quan sát và ghi lại sự phát triển của phôi và tỉ lệ sống của phơi trên kính
hiển vi.
+ Vẫn chưa gọi là bơi vì các cá thể này chưa nổi trong nước, quan sát sự
sống chết bằng cách nhìn tim.
- Thay mơi trường.
Ngày thứ 5:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại sự phát triển của phôi đã phá vỡ màng phôi và tỉ lệ
sống của phôi trên kính hiển vi
+ Quan sát sự sống chết bằng cách nhìn tim hoặc chạm nhẹ đầu pipet vào cá
để xem có di chuyển khơng.
- Thay mơi trường.
Ngày thứ 6:
- Quan sát sự biểu hiện của phôi:
+ Quan sát và ghi lại hình dạng và sự vận động của cá và tỉ lệ sống của
chúng trên kính hiển vi.
+ Cá đã có khả năng bơi nên khi quan sát chỉ thấy mặt lưng, do đó dung đầu
pipet đẩy nhẹ cá để quan sát. (đã có thể quan sát sự biến dạng của cá).
V. Kết quả
1.Quy ước:
Toàn bộ cột 1 là đối chứng (màu xanh)
C-chữ số: Chết ngày thứ mấy (ví dụ: C3: chết ngày 3)
Đánh dấu x: dị dạng (các dị dạng khác sẽ được ghi chú trong cột chú thích)
2. Kết quả quan sát
Ngày 3: (ngày quan sát thứ nhất- sau 24h)
Dấu hiệu: phơi chết sẽ đơng tụ (có màu đen khi soi trên kính hiển vi, màu trắng khi
nhìn bằng mắt thường)


Ngày 4:(sau 48h)

Dấu hiệu giống như ngày 3. Một số phôi đã nở sau 48h.

Xuất hiện một số biến dạng phôi như đuôi ngắn ( Thuốc lá Thăng Long, nồng độ
50,60)

Dị dạng
Ngày 5:(sau 72h)

Đối chứng

Dấu hiệu: quan sát tim đập, trứng tiếp tục nở nhưng cá hoạt động yếu, không bơi.

Ngày 6:(Sau 96h)


Dấu hiệu nhận biết phôi chết: tim ngừng đập. Quan sát và ghi lại dị dạng của cá ở
các nồng độ ở các giếng thuốc lá Thăng Long. Thuốc lá Vinataba không ghi nhận
dị dạng. Không quan sát được ảnh hưởng của thuốc lá với cá di giếng nhỏ

3. Bảng tổng hợp
a. Thăng Long
Nồng Kết quả
độ
5

1

Chú thích
2

3

4

5

6

A

-11 phơi nở sau72h, cịn lại nở sau 96h

B

- Trừ phơi chết sau 24h, các cá thể khác phát
triển bình thường.

C
D
10

C3
1

A
B
C
D

-Chết 1 phơi sau24h

-4 Phôi nở sau 48h

2

3

4

5

=> Nồng độ thấp nên ảnh hưởng ít, phơi chết có
thể do phơi yếu hoặc q trình thao tác.
6

-3 Phôi nở sau 48h, 5 phôi nở sau 72h, cịn lại
nở sau 96h
-Tất cả các phơi phát triển bình thường


20

1
A

2

3

C3 x

B

4

5

6

-6 phôi chết trong ngày đầu.
-A3: hoại tử và chưa nở sau 96h

C3

C3

C3

=> số phôi chết nhiều bất thường có thể do thao
tác hoặc do phơi rất yếu

C
D
30

C3
1

2

3

C3
4

5

6

- B4: Phù màng tim

A
B

-Các ơ cịn lại phát triển bình thường

x

C

C3

D

C3

40

1

2

3

C6
4

5

6

-2 phơi chết sau 24h
-C3: phù màng tim

A
B

-Các ơ cịn lại phát triển bình thường, sau 72h
đã nở hết.

C3

C

x

D

C3

50

-2 phơi chết sau24h, 1 phôi chết sau 96h.

1 2

3

4

5 6

A

x

B

C3 C3 x x

C

C5

D

x

-C2: sau 48h phát hiện dị dạng, sau 72h chết.

x

x C4
x
-Các ơ cịn lại nở hết sau 72h
-D2: Phù tim, mất sắc tố lưng
-A3: Phù tim
-D4, B5, C5: Phù màng tim


-A6: Đuôi biến dạng gãy cong một bên, hoại tử
-B6: Phù màng bao tim, hoại tử nhẹ
60

1

2

3

4

5

A

x

x

C3 x

B

x

C

x

D

x

6

x

x

x

x

x

x

C6

x

x

x

x

-A3: dị dạng ngày 4; phù màng bao tim, phù
nỗn hồng, chưa nở hết vào sau 96h

-A2: Phù màng tim, hoại tử nhẹ
-C3: chưa nở hết, phù màng tim, hoại tử
-D5: Phù màng tim, hoại tử nặng
-Các ơ đánh dấu x cịn lại: phù màng tim, hoại
tử


70

1
A

2

3

C3

B

4

5

6

-Khơng có thống kê dị dạng do lỗi thao tác làm
mất mẫu vào ngày 5

C3
C3 C3 C3

C

-7 phôi chết sau 24h

C3

D

C3 C3

b. Vinataba
Nồng Kết quả
độ
10

1
A

Chú thích
2

3

4

5

6

-Số cá thể chết 2/20 con sau 24h
-Đối chứng ở ngày thứ 4 đã phá vỡ màng phơi,
cịn giếng chứa độc thuốc lá sau 72h mới nở
-Sau 96h cá khoẻ và quẫy mạnh.

5

6

-Số cá thể chết 2/20 con ở sau 24h
-Một mẫu đối chứng sau 72h mới nở
-Cá vẫn khoẻ và quẫy mạnh

C3

B
C
D
20

C3
1

2

3

4

A

C3

B

C3

C
D
30

1
A
B
C
D

C3

2

3

4

5

6

-1 mẫu đối chứng bị chết, có thể do phơi yếu
hoặc dùng độc thuốc lá nên có sự ảnh hưởng
của hơi thuốc.
-Tất cả các mẫu đều đều sau 72h mới nở, kể cả
mẫu đối chứng. ( ảnh hưởng của hơi thuốc lá)


40

1
A

2

3

4

5

6

-C3: thao tác sai làm vỡ màng phôi
-C5: thao tác quá mạnh (dùng pipet kiểm tra)
làm đứt lìa cơ thể cá

C3

B
C

C5

D

-Phôi sau 72h mới bắt đầu nở.
-Phôi bắt đầu yếu dần, quẫy yếu và có khi
khơng quẫy khi tác động bằng đầu pipet
60

1

2

3

4

A
B

C
D
4.Đồ thị:

5
C3

C3

C3
C5 C3

6

-Có 4 mẫu chết sau 24h, 1 mẫu chết sau 72h.


5.Nhận xét
-Khơng xác định được mối quan hệ tuyến tính giữa số lượng phôi cá chết và nồng
độ thuốc lá.:
+ Số lượng phơi chết sau 24 thay đổi khơng có quy tắc ở các nồng độ( tăng
đột biết ở nồng độ 20 Thăng Long và giảm ở 30-40 với Vinataba). Có thể do chất
lượng phơi cá khơng đồng đều
+Từ sau 24h, số lượng phơi chết rất ít hoặc khơng chết thêm.
-Có thể kết luận số lượng cá thể dị dạng tỉ lệ thuận với nồng độ thuốc lá Thăng
Long. Đặc biệt, các dị dạng phù màng tim, hoại tử noãn hồng rất phổ biến với
phơi trong mơi trường thuốc lá Thăng Long nồng độ cao (50-60)
- Thuốc lá Vinataba không gây dị dạng kể cả với nồng độ cao (60).
-Không khảo sát được ảnh hưởng của thuốc lá Vinataba đến sự vận động của cá
ngựa vằn do kích thước giếng nhỏ, khó quan sát.

IV. Kết luận
-Thuốc lá Thăng long (đến nồng độ 60 mg/l) có chứa lượng độc tố ảnh hưởng đến
phôi cá ngựa vằn
+ Vấn đề trong trao đổi chất (gây hoại tử),
+ Khuyết tật chức năng tim (dẫn đến phù màng tim)
+Làm hệ cơ xương phát triển không đồng đều (dẫn đến bị cong đuôi)
-Thuốc lá Vinataba (đến nồng độ 60mg/l) ít gây ảnh hưởng đến sự phát triển hình
thái của ấu thể cá ngựa vằn