Đánh giá độc tính của chất bảo quản thực phẩm trên phôi cá ngựa vằn

BÁO CÁO
ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CỦA CHẤT BẢO QUẢN THỰC PHẨM (PROPYL
GALLTE & SODIUM BENZOAT)
TRÊN PHÔI CÁ NGỰA VẰN

1


I.

Mở đầu
1. Lí do chọn đề tài
-

Hiện nay, vấn đề sử dụng hóa chất nói chung và chất bảo quản nói riêng
trong sản xuất hàng hóa, đặc biệt trong thực phẩm, rất phổ biến mà khơng
được hoặc được kiểm sốt rất lỏng lẻo. Cần có các kiểm chứng những độc hại
của chúng có thể gây nên đối với sức khỏe người tiêu dùng và cả đối với môi

-

trường.
Sodium Benzoate và Propyl Gallate là 2 chất thường xuyên được sử dụng
trong đời sống tuy nhiên 1 số nghiên cứu cho thấy độc tính của chúng khơng
hề thấp, cần nghiên cứu là xác định giới hạn cho phép sử dụng hàng ngày.

2. Đặc điểm cơ bản về Sodium Benzoate và Propyl Gallate
Đặc điểm

Sodium Benzoate
𝐶6 𝐻5 𝐶𝑂𝑂𝑁𝑎

Propyl Gallate
𝐶12 𝐻12 05

144,1 đvC

212,2 đvC

E211
Muối từ Natri hydroxit
+ Axit Benzoic

E310
Ester n-propyl của 3,4,5trihydroxylbenzoic hay
axit galic
- Chất bột màu
trắng hoặc xám
- Chịu nhiệt kém
- Tan kém trong
chất béo, tan
trong nước

Cơng thức hóa
học

Khối lượng phân
tử
Ký hiệu
Bản chất

Tính chất vật lý

-

Tinh thể bột
trắng
Khơng mùi
Tan tốt trong
nước

Nhóm chất, cơng
dụng

Chất kháng sinh, kìm
hãm sự phát triển của
vi khuẩn, nấm trong
mơi trường axit, bảo
quản thực phẩm

Chất chống oxi hóa
trong thực phẩm có hàm
lượng chất béo cao,
dược phẩm, mỹ phẩm

ADI
(Aceptable Daily
Intake)

5 mg/kg/ngày

0,5 mg/kg/ngày

3. Ý nghĩa đề tài

2


-

Khoa học: cung cấp những tư liệu thực nghiệm về độc tính của Sodium
Benzoate và Propyl Gallate.
Thực tiễn: Khuyến cáo sử dụng chất bảo quản hợp lí để khơng gây ảnh hưởng
tới sức khỏe con người.

II.

Nội dung nghiên cứu
1. Đối tượng
-

Thí nghiệm tiến hành trên phơi cá ngựa vằn, ở giai đoạn càng sớm càng tốt
sau thụ tinh

Phôi/ấu thể
-

-

Cá trưởng thành
(Nguồn ảnh: Internet)

Phân loại cá ngựa vằn:


Danh pháp 2 phần: Hippocampus comes (Cantor, 1850)



Loài: H. comes



Chi: Hippocampus



Họ: Syngnathidae



Bộ: Gasterosteiformes



Lớp: Actinopterygii



Ngành: Chrodata

 Giới: Amimalia
Đặc điểm: Cá trưởng thành dài khoảng 3-4 cm, có các sọc vằn song song
chạy dọc cơ thể, có các màu sắc khác nhau (xanh, đen, đỏ…). Trứng cá ngựa
vằn đường kích trung bình 1 mm. Phơi và ấu thể trong suốt.

-

Cá ngựa vằn là sinh vật mô hình phổ biến được sử dụng ở nhiều phịng thí
nghiệm trên thế giới với nhiều đặc điểm thuận lợi cho nghiên cứu.Số lượng
phôi lớn nhờ cá trưởng thành sinh sản nhiều và thường xuyên. Phôi được bao
bọc bởi 1 lớp vỏ trong suốt, giúp dễ dàng quan sát những thay đổi trong hình
thái của ấu thể cá. Trình tự hệ gen cá ngựa vằn đã được giải mã đầy đủ, trong
đó có trên 12 nghìn gen tương đồng với hệ gen người và khoảng 70% gen của
người có ít nhất một gen tương đồng trên cá ngựa vằn.

3


Phôi cá ngựa vằn 4-5 ngày sau thụ tinh vẫn chưa được coi là động vật do đó
khơng gặp phải vấn đề đạo đức và các ràng buộc trong quy định với động vật
thí nghiệm.

-

2. Dụng cụ và hóa chất
STT
1
2
3

Tên
Hóa
chất

4
5
6

Dụng
cụ

9

Cơng dụng

Soium Benzoat
Propyl Gallte
Nước sạch
Kính hiển vi soi
nổi
Máy ảnh

1 cái

Pipet 5ml, 10 ml

2
cái/loại
2 cái
13 đĩa

14 ống

Bơm pipet
Đĩa 24 giếng
Ống Falcon 15ml

7
8

Số
lượng

Pha lỗng
hóa chất
Kiểm tra
mẫu
Chụp kết
quả
Hút mơi
trường

1 cái

Ni mẫu
Đựng hóa
chất đã pha

3. Phương pháp tiến hành và quy trình thí nghiệm
Gồm các giai đoạn:
-

Ghép cá bố mẹ : (Chiều ngày 25/11/2017) Ghép cặp cá bố mẹ: Chọn cặp cá
đực cái khỏe mạnh, có khả năng sinh sản bình thường (qua q trình theo
dõi). Chúng tôi chọn 2 cặp cá bố mẹ để đảm bảo đủ số lượng trứng cho thí
nghiệm trên 2 chất. Các cặp cá được để riêng trong 1 bể nhỏ, có 1 lưới/rổ
thưa, ngăn cá bố mẹ ăn trứng.

-

Thu phôi: (Sáng 26/11/2017) Đưa cá bố mẹ quay về bể nuôi cũ, thu phôi.

-

Rửa sạch phôi 3-5 lần bằng nước sạch.
Chọn lọc các phôi sạch, khỏe mạnh, ở giai đoạn 8 tế bào

-

Phơi nhiễm hóa chất: Chọn 1 phơi/1 giếng/1 nồng độ/1 đĩa với mỗi giếng 1ml
môi trường đã pha trước. Đây được xem là giai đoạn 0h sau thụ tinh. Theo
bảng sau:
ĐC
ĐC
ĐC
ĐC

H
H
H
H

H
H
H
H
H
H
H
H
Đĩa 24 giếng

H
H
H
H

H
H
H
H

Với ĐC: đối chứng; H: Hóa chất
-

Kiểm tra mẫu và thay môi trường: (sau mỗi 24h) Qua các giai đoạn sau 24h 48h-72h-96h, kiểm tra sự phát triển của phơi dưới kính hiển vi soi nổi, gồm

4


khả năng sống chết và các dị dạng xuất hiện. Sau đó thay mơi trường cho các

giếng, hút bỏ ~ 0,5 ml môi trường cũ, bổ sung ~0,5ml môi trường mới.
Tiêu chí kiểm tra:
Thời gian sau thụ
tinh
0h
24h

Mẫu

48h

Bình
thường

72h
96h
24h-48h

Chết

72h-96h

Dị dạng

-

48h-96h

Đặc điểm nhận biết
Phơi sạch, giai đoạn 8 tế bào

Đi tách khỏi nỗn hồng
Sắc tố hình thành, tập trung
nhiều ở mắt
Ấu thể nở, bơi tự do, quan sát
thấy tim đập
Tim đập, quan sát rõ hình dạng
bình thường của các cơ quan
Phơi đơng tụ, màu trắng đục
hoặc đen, không rõ cấu trúc
Tim không đập
- Hoại tử nỗn hồng
- Hoại tử đầu
- Phù màng bao tim
- Tụ máu
- Cong cột sống
- Dị tật đuôi

Đánh giá, phân tích kết quả.

III. Kết quả và thảo luận
1. Mẫu đối chứng:

1-2 mm

1-2mm

24h

0h
1 cm

1 cm

48h

72h

1,5 cm
5


96h
2. Các mẫu phơi nhiễm hóa chất chết qua các thời gian:

1-2 mm

1-2 mm

24h

48h

1-2 mm

1-2 mm

72h

96h

3. Sodium Benzoat
- Thí nghiệm phơi nhiễm với Sodium Benzoat thực hiện tại các nồng độ: 100
mg/l, 500 mg/l, 1000 mg/l, 1500 mg/l, 2500 mg/l (mỗi đĩa 24 giếng 1 nồng
-

độ)
Sau mỗi 24h sau thụ tinh, soi kính, kiểm tra và ghi lại số lượng ấu thể chết,
đặc điểm dị dạng (24h, 48h, 72h, 96h)
Bảng thể hiện số lượng ấu thể chết khi phơi nhiễm với
Sodium Benzoat

0h
24h
48h
72h
96h

100
mg/l
0
2
4
6
10

500
mg/l
0
3
5

8
12

1000
mg/l
0
4
8
11
15

1500
mg/l
0
5
10
13
17

2500
mg/l
0
7
12
20
20

6

120%

Biểu đồ thể hiện % ấu thể cá chết theo thời gian
phơi nhiễm Sodium Benoat tại các nồng độ

100%

% chết

80%
60%

50%

40%
20%

0%
0h

24h

48h

72h

96h

Thời gian
100 mg/l

500 mg/l

1500 mg/l

2500 mg/l

1000 mg/l

Bảng thể hiện số lượng ấu thể dị dạng khi phơi nhiễm với
Sodium Benzoat
Nồng
độ
100
mg/l
500
mg/l
1000
mg/l
1500
mg/l
2500
mg/l

Dị
dạng
Sống
Dị
dạng
Sống

Dị
dạng
Sống
Dị
dạng
Sống
Dị
dạng
Sống

0h

24h

48h

72h

96h

0

0

3

6

6

20
0

18
0

16
4

14
8

10
6

20
0

17
0

15
5

12
6

8
5

20
0

16
0

12
5

9
5

5
3

20
0

15
0

10
8

7
0

3
0

20

13

8

0

0

7


Biểu đồ thể hiện tỷ lệ dị dạng/sống của ấu thể khi phơi
nhiễm Sodium Benzoat
25

Số ấu thể

20
15
10
5
0
Dị dạ ng

Sống

Dị dạ ng

100 mg/l

Sống

500 mg/l

Dị dạ ng

Sống

Dị dạ ng

1000 mg/l

Sống

Dị dạ ng

1500 mg/l

Sống

2500 mg/l

Nồng độ
0h

-

24h

48h

72h

96h

Các dạng dị dạng phổ biến:


48h sau thụ tinh: Hoại tử nỗn hồng, hoại tử đầu:

1 cm

1 cm

100 mg/l
1000 mg/l

Hoại tử nỗn hồng
1 cm

1500 mg/l

1 cm

1 cm

1000 mg/l

Hoại tử đầu

2500 mg/l

Hoại tử đầu + nỗn hồng
8




72h: Hoại tử nỗn hồng:

1 cm

1 cm

1500 mg/l

1000 mg/l


96h: Cong đuôi, cong cột sống, phù mang bao tim, tụ máu, hoại tử
nỗn hồng:

1 cm

1 cm

500 mg/l

Phù màng tim

1500 mg/l

1 cm 1000 mg/l

Phù màng tim + tụ máu

1500 mg/l

1 cm

1 cm

Cong đi

1000 mg/l

Cong cột sống + hoại tử nỗn hồng

1500 mg/l

Hoại tử nỗn hồng
9


-

Nhận xét: Tác động của Sodium Bezoat:
o Gây chết : 24h sau phơi nhiễm đã ảnh hưởng đến khả năng sống sót

của phơi. Tỷ lệ chết càng cao ở càng nồng độ cao và thời gian theo
dõi kéo dài. Sau 72h, ở nồng độ 2500 mg/l tỷ lệ chết là 100%
o Gây dị dạng: Dị dạng xuất hiện rõ từ sau 48h phơi nhiễm ở tất cả các
nồng độ, gồm hoại tử nỗn hồng, hoại tử đầu → Phù màng tim, cong
đuôi → Tụ máu. Tỷ lệ dị dạng cao khi nồng độ càng cao và thời gian
theo dõi càng dài
o Ở nồng độ càng cao, liều lượng gây chết 1 nửa tác động tại thời gian
phơi nhiễm càng ngắn

4. Propyl gallate
- Q trình thí nghiệm được tiến hành 2 lần : lần 1 có 4 nồng độ lần lượt là
100mg/l 500mg/l 1000mg/l 2000mg/l. Sau mỗi 24h kiểm tra và ghi lại kết
quả, ngay trong 24h đầu các phôi ở nồng độ từ 500mg/l trở lên đã đều chết
hết thể hiện ở bảng sau:

Đối chứng

Hóa chất

Nồng độ
Sống

Chết

Sống

Chết

100mg/l

100%

0%

95%

5%

500mg/l

100%

0%

0%

100%

1000mg/l

100%

0%

0%

100%

2000mg/l

100%

0%

0%

100%

10


Biểu đồ thể hiện tỷ lệ chết khi phơi nhiễm với Propyl Gallte
(lần 1)
1.2
1

Tỷ lệ chết

0.8
0.6

0.4
0.2
0

0h

24h

100 mg/l

500 mg/l

48h
Thời gian

72h

1000 mg/l

96h

2000 mg/l

Phôi chết sau 24h các nồng độ >=500mg/l

11


Phôi phát triển tốt ở nồng độ 100mg/l
-

Tiếp tục theo dõi đến 48h 72h và 96h thì nồng độ 100mg/l phơi phát triển
bình thường khơng có dị dạng xảy ra.

Đối chứng sau 96h

12

Nồng độ 100mg/l sau 96h
-

Từ kết quả phía trên ta có thể nhận thấy cần tiếp tục tiến hành thí nghiệm lần
2 để xác định được chính xác hơn khoảng nồng độ bắt đồ gây chết hết phôi.
Lần 2 các nồng độ thử nghiệm là 100mg/l 200mg/l 400mg/l và 500mg/l và
kết quả thu được sau 24h đầu là:

Đối chứng

Hóa chất

Nồng
độ

Sống

Chết

Sống

Chết

100mg/l

100%

0%

95%

5%

200mg/l

100%

0%

5%

95%

400mg/l

100%

0%

0%

100%

500mg/l

100%

0%

0%

100%

13


Biểu đồ thể hiện tỷ lệ chết khi phơi nhiễm với Propyl Gallate
(lần 2)
1.2

Tỷ lệ chết

1
0.8
0.6
0.4
0.2
0

0h

100 mg/l

24h

200 mg/l

48h
Thời gian
400 mg/l

72h

96h

500 mg/l

Phôi chết ở nồng độ >=200mg/l

14


Nồng độ 100mg/l sau 24h

Nồng độ 200mg/l phôi sống duy nhất

-

Tiếp tục quan sát sau 48h thì phơi cịn lại của nồng độ 200mg/l cũng chết nốt
cịn các phơi của nồng độ 100mg/l vẫn sống tốt và phát triển bình thường
khơng thấy xuất hiện dị dạng.

-

Nhận xét: propyl gallate có khả năng gây độc lớn cho phôi cá dù nồng độ
thấp, chưa xác định được chính xác nồng độ thấp nhất bắt đầu gây chết hết
chỉ biết nằm trong khoảng 100 đến 200 mg/l và không gây xuất hiện dị dạng.

VI. Kiến nghị và lời cảm ơn
1. Kiến nghị

-

Thiết kế các thí nghiệm chuyên sâu hơn với số lượng mẫu lớn và lặp lại trên
các giai đoạn phát triển khác nhau của phôi/ấu thể cá ngựa vằn để đánh giá
chi tiết hơn về tác động của các chất phụ gia thực phẩm

-

Có quy định chặt chẽ hơn trong việc sử dụng Sodium Benzoat và Propyl
Gallate, đặc biệt là Propyl Gallte với mức độ tác động rất nghiêm trọng.

15


2. Lời cảm ơn
- Chúng em xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Lai Thành – Trưởng bộ môn Tế bào học,
khoa Sinh học, trường Đại học KHTN – Giảng viên môn Sinh học Phát triển. Cảm
ơn thầy đã dạy cho chúng em những kiến thức bổ ích trong mơn học, và đã tạo
điều kiện để chúng em được làm quen với cách thiết kế một thí nghiệm từ đầu đến
cuối.
-

Chúng em cảm ơn anh Kiều Trung Kiên và các anh chị trong nhóm Cơng nghệ Tế
bào Động vật đã hướng dẫn chúng em các thao tác, trực tiếp giải đáp các thắc mắc
trong q trình làm thí nghiệm.

-

Xin cảm ơn các bạn lớp K60TNSH đã cùng hỗ trợ nhau để nhóm có thể sắp xếp
được lịch thí nghiệm phù hợp.

16