(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất đa enzyme (α amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn nuôi

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI
VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME
(α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE)
ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NUÔI

LUẬN ÁN TIẾN SĨ

NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2022

luan an


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

DƯƠNG THU HƯƠNG

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CHỦNG NẤM SỢI
VÀ TỐI ƯU ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SẢN XUẤT ĐA ENZYME
(α-AMYLASE, GLUCOAMYLASE, CELLULASE)
ỨNG DỤNG TRONG CHẾ BIẾN THỨC ĂN CHĂN NI

Chun ngành

: Chăn ni

Mã số

: 9.62.01.05

Người hướng dẫn khoa học: 1. PGS. TS. Vũ Văn Hạnh
2. PGS.TS. Phạm Kim Đăng

HÀ NỘI - 2022

luan an


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả nghiên
cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng dùng để bảo vệ
lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám
ơn, các thơng tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm…
Tác giả luận án

Dương Thu Hương

i

luan an


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hồn thành luận án, tơi đã nhận được
sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cơ giáo, sự giúp đỡ, động viên của bạn bè,
đồng nghiệp và gia đình.

Nhân dịp hồn thành luận án, cho phép tơi được bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Văn Hạnh và PGS.TS. Phạm Kim Đăng đã tận tình hướng dẫn,
dành nhiều cơng sức, thời gian và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình học tập và
thực hiện đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ mơn Sinh lý - tập tính động vật, Khoa Chăn nuôi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam
đã tận tình giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thực hiện đề tài và hồn thành luận án.
Tơi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức phịng Các chất chức
năng sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học - Viện Hàn lâm và Khoa học công nghệ Việt Nam
đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tơi trong suốt q trình thực hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tơi về mọi mặt, động viên khuyến khích tơi hoàn thành luận
án./.
Hà Nội, ngày... tháng... năm 20...
Nghiên cứu sinh

Dương Thu Hương

ii

luan an


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục

iii

Danh mục chữ viết tắt

vi

Danh mục bảng

vii

Danh mục hình

ix

Trích Yếu Luận Án

x

Thesis abstract

xii

PHẦN 1. MỞ ĐẦU

1

1.1.

Tính cấp thiết của đề tài

1

1.2.

Mục tiêu của đề tài

2

1.2.1.

Mục tiêu chung

2

1.2.2.

Mục tiêu cụ thể

2

1.3.

Phạm vi nghiên cứu

2

1.3.1.

Đối tượng nghiên cứu

2

1.3.2.

Địa điểm nghiên cứu

2

1.3.3.

Thời gian nghiên cứu

3

1.4.

Những đóng góp mới của đề tài

3

1.5.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

3

1.5.1.

Ý nghĩa khoa học

3

1.5.2.

Ý nghĩa thực tiễn

3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4

2.1.

Tổng quát về enzyme amylase và cellulase

4

2.1.1.

Enzyme amylase

4

2.1.2.

Enzyme cellulase

5

2.1.3.

Nguồn thu nhận enzyme

6

2.1.4.

Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger

7

2.2.

Cải tiến chủng vi sinh vật và lên men sản xuất enzyme

10

2.2.1.

Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật

10

2.2.2.

Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme

10

2.2.3.

Lên men sản xuất enzyme

13

iii

luan an


2.2.4.

Sự cần thiết phải tối ưu môi trường lên men

2.2.5.

Thành tựu về cải tiến chủng và tối ưu môi trường lên men sản xuất amylase

19

và cellulase

19

2.3.

Tình hình sản xuất và sử dụng enzyme trong chăn nuôi

20

2.3.1.

Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi trên thế giới

20

2.3.2.

Nghiên cứu và sử dụng enzyme trong chăn nuôi ở Việt Nam

24

2.4.

Sử dụng thức ăn lên men trong chăn ni

26

2.4.1.

Đặc tính và vai trị của các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn
chăn nuôi

26

2.4.2.

Các vi sinh vật sử dụng trong lên men thức ăn

27

2.4.3.

Hiệu quả của sử dụng thức ăn lên men trong chăn ni

27

2.5.

Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn trong chăn nuôi

28

PHẦN 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

31

3.1.

Nội dung nghiên cứu

31

3.2.

Phương pháp nghiên cứu

31

3.2.1.

Gây đột biến chủng Aspergillus niger A45.1 và tối ưu điều kiện lên men
chủng nấm sợi đột biến chọn lọc để sinh tổng hợp đa enzyme (α- amylase,
glucoamylase và cellulase) cao

3.2.2.

31

Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng bằng công nghệ đường hóa và
lên men đồng thời

3.2.3.

3.2.4.

36

Đánh giá ảnh hưởng của việc sử dụng bã sắn lên men trong khẩu phần ăn
đến năng suất chăn nuôi lợn thịt

38

Xử lý số liệu

41

PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1.

43

Gây đột biến chủng Aspergillus niger a45.1 và tối ưu điều kiện lên men
chủng

đột

biến

chọn

lọc

cho

sinh

tổng

hợp

đa

enzyme

(α-amylase, glucoamylase và cellulase) cao

43

4.1.1.

Hoạt hóa giống

43

4.1.2.

Ảnh hưởng của tia UV và NTG đến khả năng sống sót của chủng nấm sợi
Aspergillus niger A45.1

44

4.1.3.

Hoạt tính enzyme của các các chủng đột biến

47

4.1.4.

Tính ổn định của các chủng đột biến chọn lọc

50

iv

luan an


4.1.5.

Tối ưu điều kiện lên men xốp chủng nấm đột biến chọn lọc cho sinh tổng
hợp đa enzyme (glucoamylase, α-amylase, cellulase)

51

4.2.

Xử lý bã sắn thành thức ăn chăn nuôi bằng đường hóa và lên men đồng thời

64

4.2.1.

Thành phần hóa học của bã sắn tươi

64

4.2.2.

Đường hóa bã sắn

65

4.2.3.

Tối ưu thời gian đường hóa bã sắn

68

4.2.4.

Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng enzyme và vi sinh vật

69

4.2.5.

Đánh giá chất lượng của bã sắn sau lên men

72

4.3.

Ảnh hưởng của bã sắn lên men trong chăn nuôi lợn thịt

75

4.3.1.

Ảnh hưởng của bã sắn lên men đến khả năng sinh trưởng và chuyển hóa
thức ăn của lợn F1 (Landrace x Yorkshire)

4.3.2.

Ảnh hưởng của tương tác giữa khẩu phần ăn và tính biệt đến khả năng sinh
trưởng của lợn F1 (LandracexYorkshire)

4.3.3.

79

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến năng suất thân thịt của lợn thịt
F1 (Landrace x Yorkshire)

4.4.4.

75

81

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến chất lượng thịt và thành phần hóa
học của thịt lợn F1 (Landrace x Yorkshire)

PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

84
90

5.1.

Kết luận

90

5.2.

Kiến nghị

91

Danh mục các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án

92

Tài liệu tham khảo

92

Phụ lục

108

v

luan an


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt

Nghĩa tiếng Việt

ADF (Acid detergent fiber)

Xơ khơng hịa tan trong axit

ADG (Average daily gain)

Tăng trọng bình quân hàng ngày

ADN

Axit deoxyribonucleic

ARN

Axit ribonucleic

Aspergillus

A.

BQ

Bảo quản

BSLM

Bã sắn lên men

CB

Chế biến

cs.

Cộng sự

CMCase

Carboxymethyl cellulase

DNS

3,5 dinitrosalysilic

ĐC

Đối chứng

ĐVT

Đơn vị tính

FCR (Feed conversion ratio)

Hệ số chuyển hóa thức ăn

KL

Khối lượng

LSM (Least Square Mean)

Trung bình bình phương nhỏ nhất

LY

Landrace x Yorkshire

NDF (Neutral Detergent Fiber)

Xơ khơng tan trong dung dịch trung tính

NLTĐ

Năng lượng trao đổi

NRC (National Research Council)

Hội đồng nghiên cứu Quốc gia

NTG

N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine

PDA

Potatose Dextrose Agar

SE (Standard error)

Sai số tiêu chuẩn

SmF (submerged fermentation)

Lên men chìm

SSF (Solid state fermentation)

Lên men xốp

TACN

Thức ăn chăn ni

TN

Thí nghiệm

U

Unit

UV

Ultraviolet

VCK

Vật chất khơ

vi

luan an


DANH MỤC BẢNG
STT

Tên bảng

Trang

2.1.

Một số enzyme công nghiệp và nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme

2.2.

Các tác nhân gây đột biến để phát triển chủng

12

3.1.

Xác định hoạt tính enzyme

34

3.2.

Sơ đồ bố trí thí nghiệm

39

3.3.

Thành phần và giá trị dinh dưỡng khẩu phần thí nghiệm

39

4.1.

Hoạt tính enzyme của các chủng đột biến

47

4.2.

Hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase của chủng đột biến
Aspergillus niger GA15 qua các thế hệ ni cấy

4.3.

51

Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các độ
ẩm cơ chất khác nhau

4.5.

53

Hoạt tính enzyme của chủng đột biến Aspergillus niger GA15 ở các nhiệt
độ lên men khác nhau

4.6.

55

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 trên mơi trường có
pH khác nhau

4.7.

57

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men xốp ở
các thời gian khác nhau

4.8.

58

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi lên men với các
tuổi giống khác nhau

4.9.

60

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các
nguồn carbon khác nhau vào môi trường lên men xốp

4.10.

50

Ảnh hưởng của loại cơ chất đến khả năng sản xuất enzyme của chủng đột
biến Aspergillus niger GA15

4.4.

7

61

Hoạt tính enzyme của chủng Aspergillus niger GA15 khi bổ sung các
nguồn nitơ khác nhau vào môi trường lên men xốp

62

4.11.

Thành phần hóa học của bã sắn tươi

64

4.12.

Hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ của bã sắn ở các nồng độ enzyme
khác nhau

67

4.13.

Hàm lượng đường khử khi đường hóa bã sắn ở thời gian khác nhau

68

4.14.

Hàm lượng Protein của bã sắn sau lên men khi bổ sung (NH4)2SO4 ở các
nồng độ khác nhau

70

vii

luan an


4.15.

Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau (n=3)

71

4.16.

Thành phần dinh dưỡng và cảm quan của bã sắn lên men và không lên men

73

4.17.

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM đến sinh trưởng và chuyển hóa

thức

ăn của lợn thí nghiệm
4.18.

76

Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính
biệt đến khả năng sinh trưởng của lợn F1 (LxY) giai đoạn từ 20 kg đến
xuất bán

4.19.

80

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến năng suất thân
thịt của lợn F1 (Landrace x Yorkshire)

4.20.

Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính
biệt đến năng suất thân thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire)

4.21.

87

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến thành phần hoá
học (LSM) thịt lợn F1(LandracexYorkshire)

4.24.

84

Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính
biệt đến chất lượng thịt (LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire)

4.23.

83

Ảnh hưởng của mức sử dụng BSLM trong khẩu phần đến chất lượng thịt
(LSM) của lợn F1(LandracexYorkshire)

4.22.

81

88

Ảnh hưởng tương tác giữa khẩu phần với các mức sử dụng BSLM và tính
biệt đến thành phần hố học (LSM) của thịt lợn F1(LandracexYorkshire)

viii

luan an

88


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình

Trang

4.1a.

Giống hoạt hóa sau 5 ngày (A), 10 ngày (B) và 15 ngày (C)

4.1b.

Hình ảnh hiển vi cấu tạo bào tử và sợi nấm của chủng nấm sợi Aspergillus

43

niger A45.1 (dưới vật kính 40X).
4.2.

44

Mối quan hệ giữa tỷ lệ (%) bào tử nấm Aspergillus niger A45.1 còn sống
sót và thời gian chiếu tia UV và xử lý NTG

4.3.

45

Các khuẩn lạc chủng Aspergillus niger A45.1 sau xử lý bởi tia UV và NTG
(A: 0 phút; B: 30 phút; C: 60 phút; D: 90 phút; E: 120 phút; F: 180 phút)

4.4.

46

Ảnh hưởng của loại cơ chất đến sinh tổng hợp enzyme của chủng đột biến
Aspergillus niger GA15

4.5.

52

Ảnh hưởng của độ ẩm cơ chất đến sinh tổng hợp glucoamylase α-amylase
và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

4.6.

54

Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase
và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

4.7.

Ảnh hưởng của pH môi trường đến sinh tổng hợp glucoamylase,

55
α-

amylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15
4.8.

Ảnh hưởng của thời gian lên men đến sinh tổng hợp glucoamylase, αamylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

4.9.

61

Ảnh hưởng của nguồn nitơ bổ sung đến sinh tổng hợp glucoamylase, αamylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

4.12.

60

Ảnh hưởng của nguồn carbon bổ sung đến sinh tổng hợp glucoamylase, αamylase và cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

4.11.

59

Ảnh hưởng của tuổi giống đến sinh tổng hợp glucoamylase, α-amylase và
cellulase của chủng đột biến Aspergillus niger GA15

4.10.

57

63

Hàm lượng đường khử, tinh bột và xơ của bã sắn ở các nồng độ enzyme
khác nhau

67

4.13.

Hàm lượng đường khử theo thời gian đường hóa bã sắn bằng enzyme

69

4.14.

Hàm lượng protein thực ở các thời điểm lên men khác nhau

71

ix

luan an


TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Dương Thu Hương

Tên Luận án: Nghiên cứu phát triển chủng nấm sợi và tối ưu điều kiện lên men sản xuất
đa enzyme (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế biến thức ăn chăn
nuôi.
Chuyên ngành: Chăn nuôi

Mã số: 9 62 01 05

Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nơng nghiệp Việt Nam
Mục đích nghiên cứu
Mục tiêu chung
Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng ứng
dụng chế phẩm sinh học.
Mục tiêu cụ thể
Chọn lọc được 1 dòng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có khả
năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
Tìm được điều kiện lên men xốp tối ưu cho sản xuất đa enzyme (α-amylase,
glucoamylase và cellulase) của dòng đột biến chọn lọc.
Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng chế phẩm đa enzyme (α-amylase,
glucoamylase và cellulase) trong chế biến bã sắn làm thức ăn chăn nuôi lợn thịt.
Phương pháp nghiên cứu
1. Gây đột biến ngẫu nhiên chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 đồng thời bằng
NTG và tia UV. Lựa chọn chủng có khả năng sinh α-amylase, glucoamylase và cellulase
với hoạt tính cao nhất.
2. Tối ưu điều kiện lên men xốp của chủng đột biến chọn lọc: Các thông số tối
ưu: Cơ chất (cám mì, cám gạo, vỏ trấu, mùn cưa). Độ ẩm cơ chất (20, 30, 40, 50, 60 và
70%, w/v). Nhiệt độ lên men (20, 25, 30, 35, 40 và 45oC). pH ban đầu của cơ chất lên
men (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 và 7). Thời gian lên men (từ 2 đến 8 ngày), tuổi
giống (1 đến 4 ngày). Nguồn cacbon (glucose, maltose, tinh bột gạo, sucrose), nguồn nitơ
(ure, cao nấm men, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3).
3. Đường hóa và lên men đồng thời bã sắn bằng chế phẩm đa enzyme (α-amylase,

glucoamylase và cellulase) và probitic: Bã sắn tươi hòa vào nước với tỷ lệ 30%, bổ sung
chế phẩm enzyme thô với tỷ lệ 8%, 0,5% chế phẩm probiotic (S. cerevisiae, Lactobacillus
sp. và Bacillus sp. mật độ 107cfu/g mỗi loại). Nguồn nitơ (NH4)2SO4 được bổ sung với hàm
lượng từ 0 đến 1,5%. Thời gian lên men thích hợp được chọn lựa. Một số thành phần hóa

x

luan an


học và sinh học của bã sắn sau lên men được xác định.
4. Các thí nghiệm được bố trí để đánh giá ảnh hưởng của sử dụng BSLM vào khẩu
phần ăn cho 144 lợn thịt F1 (LxY) giai đoạn từ 20kg đến xuất chuồng. Các chỉ tiêu về
sinh trưởng, tiêu tốn thức ăn, năng suất thân thịt và thành phần hóa học của thịt lợn được
nghiên cứu.
Kết quả chính và kết luận
- Chủng Aspergillus niger GA15 có hoạt tính glucoamylase, α-amylase và cellulase
cao nhất được tạo ra bằng gây đột biến đồng thời bởi tia UV và NTG từ chủng hoang dại
Aspergillus niger A45.1. So với hoạt tính enzyme của chủng hoang dại, hoạt tính của αamylase cao gấp 1,97 lần, glucoamylase cao gấp 2,2 lần, cellulase cao gấp 1,9 lần
- Điều kiện lên men xốp thích hợp đối với chủng Aspergillus niger GA15 là: cơ chất
cám mì, độ ẩm 50%, pH 5,5, nhiệt độ lên men 30oC, thời gian lên men 5 ngày, giống 2 ngày
tuổi, glucose 1%, ure 1%, với hoạt tính α-amylase, glucoamylase và cellulase đạt lần lượt
là 76,75 ; 50 và 40,11 (U/g), hoạt tính này cao gấp 2; 1,9 và 3,3 lần so với lên men xốp ở
điều kiện chưa được tối ưu.
- Giá trị dinh dưỡng của bã sắn sau khi đường hóa và lên men đồng thời bằng lên
men lỏng với tỷ lệ 30% cơ chất, 8% đa enzyme thô, 0,5% chế phẩm probiotic, 1%
(NH4)2SO4, thời gian lên men 48 giờ được cải thiện rõ rệt, protein thô tăng 7,3 lần, protein
thực tăng 5,5 lần so với bã sắn tươi không lên men, đồng thời HCN giảm còn 1,4 g/kg, hàm
lượng axit hữu cơ tăng 5,9 lần, pH 3,7. Bã sắn có màu vàng tương đỗ, mùi thơm, độ chua
vừa phải, khơng có độc tố aflatoxin B1. Vì vậy, bã sắn sau đường hóa và lên men có thể

được sử dụng làm thức ăn cho gia súc.
- Sử dụng BSLM trong khẩu phần ăn đã cải thiện tốc độ sinh trưởng, hiệu quả sử
dụng thức ăn của lợn. Ở mức sử dụng 20% BSLM cho hiệu quả tốt nhất, ADG (g/con/ngày)
tăng lên 8,97% và 34,46% so với lô đối chứng ở giai đoạn 1 và 2. FCR ở 2 giai đoạn tương
ứng là 2,1 và 2,45. Khối lượng móc hàm và khối lượng thịt xẻ tăng lên 11,15% và 11,19 %
so với lô ĐC. Việc sử dụng BSLM trong khẩu phần ăn không ảnh hưởng đến năng suất
thân thịt, chất lượng thịt và thành phần hóa học của thịt lợn.
Đề nghị
Thử nghiệm lên men một số nguồn phụ phẩm nông nghiệp khác bằng chế phẩm
đa enzyme của đề tài để làm thức ăn cho các đối tượng vật nuôi khác nhau.Tiến hành trên
quy mô rộng hơn và xác định hiệu quả kinh tế trong việc sử dụng phụ phẩm làm thức ăn
chăn nuôi.

xi

luan an


THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Duong Thu Huong
Title: Research on strain development of filamentous fungi and optimization of fermentation
conditions to produce multi- enzymes (α-amylase, glucoamylase, cellulase) for processing of
animal feed.
Major: Animal Science
Code: 9 62 01 05
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
General objective: Improving the efficiency of using crop by-products and
processing agricultural products by applying probiotics.
Specific objective:

Selecting a mutant of Aspergillus niger A45.1 which can produce highly active multienzymes (α-amylase, glucoamylase and cellulase).
Investigating the optimal soild state fermentation conditions for the selected mutant
strain to produce multi enzymes.
Evaluating the effect of a multi enzymes preperation consisting α-amylase,
glucoamylase and cellulase to degrade byproducts of cassava starch processing as pig
feeding.
Materials and methods
1. Inducing random mutagenesis of Aspergillus niger A45.1 by simultaneous
treatment of NTG and UV rays. Isolating a mutant of Aspergillus niger A45.1 which can
produce multi enzymes (α-amylase, glucoamylase and cellulase) having high activity.
2. Optimizing solid state fermentation conditions for the selected mutant strain:
Optimal parameters: Substrate (wheat bran, rice bran, rice husk, sawdust). Substrate humidity
(20, 30, 40, 50, 60, 70 and 80%, v/w). Fermentation temperature (20, 25, 30, 35, 40 and 45oC).
Initial pH of the fermentation substrate (3,0; 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 6,0; 6,5 and 7). Culture time
(from 2 to 8 days), age of the wild strain (1÷4 days). Carbon source (glucose, maltose, rice
starch, sucrose), nitrogen source (ure, yeast extract, tryptone, peptone, NH4Cl, NH4NO3).
3. Simultaneous saccharification and fermentation of cassava by products by a multi
enzymes preparation and microorganisms: Fresh cassava by products were mixed with water
at the rate of 30% (w/v), then the crude multi enzymes preparation was added at an
appropriate concentration. 0,5% probiotic (S. cerevisiae, Lactobacillus sp. and Bacillus sp.
at a concentration of 107cfu/ml) were added to the mixture. Nitrogen source (NH4)2SO4 was
added at a specific concentration and the suitable fermentation time was selected. The
chemical compositions of cassava by-products after fermentation were analysed.
4. Experimental design: Effect fermented cassava starch processing by-products

xii

luan an

(BSLM) supplementation to the diet of 144 crossbred pigs F1 (LxY) from 20 kg to slaughter.
Recored growth parameters, feed consumption, carcass yield, quality and chemical
compostions of the carcass.
Main findings and conclusions
- A mutant of Aspergillus niger A45.1 was obtained by simultaneous treatment of
NTG and UV rays, named Aspergillus niger GA15, with the enhanced ability to produce
multi enzymes (α-amylase, glucoamylase and cellulase) having the highest activity. The
activity of the α-amylase, glucoamylase and cellulase were 1,97; 2,2 and 1,9 times,
respectively higher than that of the wild strain.
- Suitable soild state fermentation conditions for a mutant Aspergillus niger GA15
were wheat bran, moisture 50%, pH 5,5, fermentation temperature 30oC, fermentation period
5 days, the age of the wild strain: 2 days old, glucose 1%, ure 1%. At these fermentation
conditions, the activity of the α-glucoamylase, α-amylase and cellulase were 76,75; 50 and
40,11 (U/g), respectively. These values were 1,97; 1,85 and 3,3 folds higher compared to
those recorded under the fermentation conditions are not optimal.
- Simultaneous saccharification and fermentation cassava by-products by liquid
fermentation for 48h (30% cassava by-products, 8% a multi enzymes preparation, 0,5%
probiotic, 1% (NH4)2SO4) improved the quality of fermented cassava by-products. Crude
and real protein increased by 7,3 and 5,5 times, respectively compared to those of the
unfermented cassava by-products. Similarly, organic acids concentration increased 5,9
times. However, the HCN concentration reduced to 1,4 g/kg. The sensory quality of the
fermented cassava by-products was yellow-brown, fragrant, sour, without aflatoxin B1.
Therefore, the fermented cassava by-products could be use as animal feed.
- Using of BSLM to the diet enhanced the growth performance and FCR of pigs.
Supplemented at 20% BSLM to the diet resulted in the highest improvement. At the stage 1
and 2, the ADG (g/head/day) increased by 8,97% and 34,46%, respectively compared to the
control group. At the 2 feeding stages, the FCR of the BSLM group was 2,1 and 2,45
respectively. Slaughter weight and carcass weight of the BSLM group increased by 11,15%
and 11,19% compared to the control. Supplementation of BSLM to the diet did not alter the
quality and chemical composition of carcass.

Recommendation: Further work is warranted to explore the potential impacts of the
multi enzymes preparation to ferment others agricultural by-products, which can be used as
animal feed. Large-scale experiments should be conducted to determine the economic
efficiency of using agricultural by-products as animal feed.

xiii

luan an


PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Ở nước ta, chăn ni lợn đóng vai trị vơ cùng quan trọng trong hệ thống
sản xuất nông nghiệp cũng như đối với nền kinh tế. Trong nhiều năm trở lại đây,
ngành chăn nuôi nước ta đã và đang đẩy mạnh phát triển chăn nuôi lợn, nhưng
thực trạng ngành chăn nuôi lợn ở Việt Nam vẫn cịn gặp rất nhiều khó khăn, đặc
biệt là giá thức ăn cao và thường xuyên biến động do phải phụ thuộc nguồn nguyên
liệu nhập khẩu, vì vậy đã ảnh hưởng bất lợi cho phát triển chăn ni lợn. Trong
khi đó, Việt Nam là một nước nông nghiệp với nguồn phụ phẩm dồi dào từ trồng
trọt, chế biến nông sản như rơm rạ, bã sắn, bã dong riềng, bã mía…Hiện nay Việt
Nam có khoảng 100 nhà máy chế biến tinh bột sắn có quy mơ lớn với sản lượng
từ 1,8 tấn đến 2 triệu tấn tinh bột/ngày, lượng chất thải rắn thải ra từ các nhà máy
này khoảng 0,6 triệu tấn/ngày (Nguyễn Thị Hằng Nga & cs., 2016). Lượng bã sắn
này phần lớn được thải ra ngồi mơi trường, gây lãng phí và ơ nhiễm nghiêm trọng.
Một số ít được phơi khơ hoặc ủ chua làm thức ăn cho gia súc, nhưng hiệu sử dụng
thức ăn chưa cao, do trong bã sắn có hàm lượng protein thấp, còn chứa nhiều chất
xơ và chất kháng dinh dưỡng như hydrogen cyanide (HCN). Vì vậy nếu xử lý
được những hạn chế đó, chế biến đúng cách thì bã sắn có thể trở thành nguồn thức
ăn chăn ni có giá trị, góp phần quan trọng vào việc giảm phụ thuộc nguyên liệu
nhập khẩu và giảm giá thành sản xuất từ đó nâng cao khả năng cạnh tranh của

ngành Chăn ni Việt Nam.
Lên men được xác định là một trong số ít các phương pháp hiệu quả trong
việc chế biến, bảo quản phụ phẩm thành thức ăn chăn nuôi giàu dinh dưỡng
(Ubalua, 2007; Aro, 2008). Tuy nhiên, thực tế nghiên cứu đã chỉ ra phần lớn các
nguồn phụ phẩm đều chứa hàm lượng xơ cao, hầu hết các vi sinh vật khơng thể sử
dụng trực tiếp. Vì vậy, để nâng cao hiệu quả của quá trình lên men cần bổ sung
thêm các enzyme phân giải tinh bột và xơ như amylase, glucoamylase, cellulase,
hoặc các chủng vi sinh vật có khả năng sản sinh các enzyme này để dịch hóa, tạo
cơ chất cho sự sinh trưởng, phát triển của các vi sinh vật và loại bỏ các yếu tố
kháng dinh dưỡng, phân hủy các thành phần thức ăn để cải thiện giá trị dinh dưỡng
của nguyên liệu làm thức ăn chăn nuôi.
Hiện nay, enzyme amylase và cellulase thương mại chủ yếu được thu nhận
từ nguồn nấm mốc với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola, Penicillium,

1

luan an


Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs., 2013). Do
nhu cầu về sử dụng enzyme trong chăn nuôi cũng như các lĩnh vực công, nông
nghiệp và thực phẩm ngày càng tăng nên việc nghiên cứu nhằm tăng cường, cải
thiện chất lượng cũng như nâng cao sản lượng thông qua việc cải tiến chủng, tối
ưu thành phần môi trường, điều kiện lên men hiệu quả và giảm chi phí sản xuất là
rất cần thiết. Xuất phát từ những lý do trên, nghiên cứu này tiến hành phát triển
chủng nấm sợi, tối ưu thành phần môi trường và điều kiện lên men để nâng cao
hiệu quả sinh tổng hợp (α-amylase, glucoamylase, cellulase) ứng dụng trong chế
biến thức ăn chăn nuôi.
1.2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
1.2.1. Mục tiêu chung

Nâng cao hiệu quả sử dụng phụ phẩm trồng trọt và chế biến nông sản bằng
ứng dụng chế phẩm sinh học.
1.2.2. Mục tiêu cụ thể
Chọn lọc được 1 chủng đột biến từ chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 có
khả năng sinh đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
Tối ưu được điều kiện lên men xốp cho sản xuất đa enzyme (α-amylase,
glucoamylase và cellulase) của chủng đột biến chọn lọc.
Đánh giá được hiệu quả của việc sử dụng thức ăn lên men tạo ra từ bã thải
chế biến tinh bột được xử lý bằng đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và
cellulase) ở lợn thịt.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
1.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Chủng nấm sợi Aspergillus niger A45.1 được sàng lọc từ bộ giống của
phòng Các chất chức năng Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Bã sắn tươi: được thu gom trực tiếp từ các cơ sở chế biến tinh bột thuộc xã
Cát Quế, huyện Hoài Đức, Hà Nội.
Lợn lai F1 (Landrace x Yorkshire): 72 lợn cái và 72 lợn đực thiến giai đoạn
20 kg đến xuất chuồng.
1.3.2. Địa điểm nghiên cứu
Phòng Các chất chức năng sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2

luan an


Phịng Thí nghiệm trung tâm, Khoa Chăn ni, Học Viện Nơng nghiệp
Việt Nam.
Phịng thí nghiệm bộ mơn Di truyền giống, khoa Chăn nuôi, Học Viện Nông

nghiệp Việt Nam.
Trung tâm Giống lợn chất lượng cao, Học viện Nông nghiệp Việt Nam.
1.3.3. Thời gian nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: tháng 6 năm 2015 - tháng 6 năm 2019
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đề tài đã cải tiến chủng dại Aspergillus niger A45.1 bằng đột biến ngẫu
nhiên và chọn lọc được 1 chủng đột biến Aspergillus niger GA15 có khả năng sinh
đa enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao.
Chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng cho chăn
ni lợn thịt bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm chứa đa
enzyme từ chủng đột biến và lợi khuẩn.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Đề tài đã tạo ra được một chủng nấm sợi đột biến có khả năng sinh đa
enzyme (α-amylase, glucoamylase và cellulase) với hoạt tính cao và tối ưu mơi
trường lên men xốp cho sản xuất đa enzyme.
Đề tài đã chế biến được bã thải tinh bột sắn thành thức ăn giàu dinh dưỡng
cho gia súc bằng đường hóa và lên men đồng thời sử dụng chế phẩm đa enzyme
và vi sinh vật probiotic.
Kết quả nghiên cứu góp phần cung cấp thêm tư liệu phục vụ cho giảng dạy
và nghiên cứu về phát triển chủng bằng kỹ thuật đột biến, chế biến thức ăn chăn
nuôi giàu dinh dưỡng từ bã thải tinh bột bằng đa enzyme và lợi khuẩn.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Có thể cung cấp chủng giống đột biến cho sản xuất enzyme cơng nghiệp,
giảm thiểu chi phí, đáp ứng nhu cầu sử dụng enzyme ngày càng tăng trong chăn
nuôi cũng như các lĩnh vực công nghiệp.
Tận dụng được nguồn phụ phẩm rẻ tiền từ các cơ sở sản xuất tinh bột sắn
thành nguồn nguyên liệu giàu dinh dưỡng làm thức ăn chăn ni, góp phần giảm
chi phí về thức ăn trong chăn nuôi và ô nhiễm môi trường.

3

luan an


PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUÁT VỀ ENZYME AMYLASE VÀ CELLULASE
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có nguồn gốc từ
sinh vật. Nó không chỉ tham gia xúc tác nhanh các phản ứng hóa học bên trong cơ
thể mà cịn có thể xúc tác cho các phản ứng bên ngoài tế bào.
Enzyme đã được nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực của các
ngành công nghiệp, xử lý môi trường, công nghệ thực phẩm.... Ngày nay với xu
hướng phát triển của công nghệ sinh học đã tạo ra nhiều ứng dụng mới của enzyme
(Sharada & cs., 2013)
2.1.1. Enzyme amylase
Amylase là tên gọi của một nhóm enzym thủy phân, xúc tác phân giải các
liên kết glucoside của polysaccharide với sự tham gia của nước. Cơ chất tác dụng
của amylase là tinh bột và glycogen. Sản phẩm tạo thành của quá trình thủy phân
là glucose, maltose và dextrin là các chất có phân tử lượng thấp.
Các loại amylase có nguồn gốc khác nhau thì thường khác nhau về tính
chất, cơ chế tác dụng cũng như sản phẩm cuối cùng của sự thủy phân. Các amylase chủ
yếu thủy phân tinh bột thường gặp là: α-amylase, β-amylase và γ-amylase, trong đó 2
nhóm quan trong nhất là α-amylase và γ-amylase (Singh & cs., 2011)
2.1.1.1. α-Amylase (EC 3.2.1.1)
-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử -amylase đều có chứa từ 1
đến 30 nguyên tử gam Ca/mol, Ca tham gia vào sự hình thành, ổn định cấu trúc
bậc 3 và duy trì hoạt động của enzyme. Enzyme -amylase có khả năng phân cắt
các liên kết α-1,4 glucoside trong mạch amylose và amylopectin của tinh bột hoặc
glycogen một cách ngẫu nhiên khơng theo trật tự nào cả, nó khơng tấn cơng liên
kết α-1,6 glucoside của amylopectin, sản phẩm thủy phân cuối cùng của -amylase

là tạo ra maltotriose và maltose từ amylose, hoặc maltose, glucose và dextrin tới
hạn phân nhánh từ amylopectin. α-amylase có khuynh hướng hoạt động nhanh hơn
β-amylase vì nó có thể hoạt động bất cứ nơi nào trên cơ chất. Khả năng dextrin
hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi
loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Trong cơ thể người,
cả amylases nước bọt và tuyến tụy đều là α-amylase. -amylase cũng tìm thấy
trong thực vật, nấm (Ascomycetes và Basidiomycetes) và vi khuẩn (Bacillus)
(Singh & cs., 2011).

4

luan an


2.1.1.2. β-Amylase (EC 3.2.1.2)
β-amylase là một dạng khác của amylase được tổng hợp bởi vi khuẩn,
nấm và thực vật. β-amylase xúc tác quá trình thủy phân liên kết β-1,4 glycosidic
thứ hai, làm việc từ đầu không khử, tách hai đơn vị glucose (maltose) một lần.
Trong q trình chín quả, β-amylase phá vỡ tinh bột thành maltose, dẫn đến
hương vị ngọt của trái chín. Cả -amylase và β-amylase đều có trong hạt; βamylase có mặt ở dạng khơng hoạt động trước khi nảy mầm, trong khi αamylase xuất hiện khi quá trình nảy mầm bắt đầu. Các mơ động vật khơng chứa
β-amylase (Singh & cs., 2011).
2.1.1.3. γ-Amylase hay glucoamylase (EC 3.2.1.3)
Đây là enzyme đường hóa quan trọng nhất trong hệ amylase. γ-amylase cắt
các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside bắt đầu từ đầu không khử trên mạch amilose
và amilopectin tạo sản phẩm cuối cùng là glucose. γ-amylase có khả năng thủy
phân hoàn toàn tinh bột, glucogen, dextrin và maltose thành glucose. Khơng giống
như các dạng amylase khác, γ-amylase có hiệu quả nhất trong mơi trường axit và
có độ pH tối ưu là 3. Trong số các vi sinh vật có khả năng sinh γ-amylase đã được
biết cho đến nay, chi Aspergillus là chi được biết đến nhiều nhất bởi khả năng sinh
glucoamylase rất cao, đặc biệt là loài Aspergillus niger (Singh & cs., 2011).

2.1.2. Enzyme cellulase
Cellulase thủy phân cellulose, cắt liên kết 1,4 - β - glycosidic trong cellulose
và các dẫn xuất oligosaccharide liên quan. Cellulase là một phức hệ enzyme bao
gồm 3 loại chính là: C1 [(EC 3.2.1.9), (Exo- β-1-4, glucanase)], Cx [(EC 3.2.1.4),
(Endo-β-1-4, glucanase, carboxymethyl cellulase, hay CMCase)] và Cb [(EC
3.2.1.21), (β- glucosidase)], chúng tham gia vào những phản ứng kế tiếp nhau để
thủy phân cellulose tạo thành oligosaccharides và glucose (Hameed & cs., 2005;
Sharada & cs., 2013).
Enzyme (exo- 1,4-β-D- glucanase) (EC 3.2.1.9): Có tác dụng cắt đứt liên kết
hydro ở đầu không khử của chuỗi cellulose và liên tục loại bỏ các đơn vị glucose đơn,
biến cellulose tự nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vơ định hình).
Enzyme endo-1,4-β-D-glucanase ((EC3.2.1.4): Tấn công ngẫu nhiên vào
các liên kết β-1-4 ở bên trong, thủy phân cellulose phản ứng thành cellobiose.
Enzym này được chia thành hai loại là: Endocellulase hay Endoglucanase (EG)
có tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucoside tại các điểm bất kỳ trên mạch phân
tử cellulose. Exocellulase hay exoglucanase (CBH) có khả năng phân giải chuỗi

5

luan an


trên thành disaccaride gọi là cellobiose từ đầu không khử. Bao gồm hai loại CBHI
và CBHII.
β-glucosidase (EC 3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành glucose. Là nhóm
enzym khá phức tạp, có khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng
lượng phân tử 50- 95 KD, có thể hoạt động ở nhiệt độ cao.
2.1.3. Nguồn thu nhận enzyme
Amylase, celullase cũng như các enzyme khác có thể được thu nhận từ
nhiều nguồn khác nhau như dịch tiêu hóa động vật, hạt nẩy mầm và các vi sinh

vật. Việc sản xuất, thu nhận enzyme từ động vật và thực vật rất phức tạp do nguồn
thu nhận nguyên liệu khó khăn, hiệu suất thấp, giá thành cao. Ngày nay đa số các
enzyme công nghiệp đều được thu nhận từ vi sinh vật do các ưu điểm của nó mang
lại như sau: Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng, phát triển ngắn, q trình tổng hợp
enzyme diễn ra rất nhanh, do đó rút ngắn thời gian thu nhận enzyme và làm giảm
giá thành sản xuất. Hoạt tính enzyme từ vi sinh vật rất cao, chỉ cần sử dụng một
lượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng cơ chất lớn. Hệ enzyme của vi
sinh vật rất phong phú, có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong
đó một số enzyme động vật và thực vật không tổng hợp được. Vi sinh vật khơng
địi hỏi nghiêm ngặt về mặt dinh dưỡng, có thể sinh trưởng trên nhiều nguồn cơ
chất đơn giản, rẻ tiền do đó có thể tận dùng các nguồn phế thải nông nghiệp làm
nguồn cơ chất để sản xuất enzyme làm giảm giá thành sản xuất. Vi sinh vật chịu
ảnh hưởng lớn của thành phần môi trường dinh dưỡng và các tác nhân lý hóa của
mơi trường. Do đó, người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng của mơi trường
ni cấy hoặc các tác nhân lý hóa của môi trường, nhằm tạo ra các chủng vi sinh
vật sản xuất ra enzyme với hàm lượng lớn và có hoạt tính xúc tác cao. Có thể cải
tiến và phát triển chủng để tạo ra các chủng đột biến sản xuất enzyme cao sản bằng
nhiều phương pháp. Dễ dàng sản xuất hàng loạt trên quy mô công nghiệp (Singh
& cs., 2011; Ciloci & cs., 2012).
Các loại vi sinh vật được sử dụng rộng rãi và phổ biến cho việc thu nhận và
sản xuất các enzyme công nghiệp bao gồm: vi khuẩn, nấm sợi và nấm men. Một
số enzyme công nghiệp phổ biến được sản xuất bởi các vi sinh vật như bảng 2.1.

6

luan an


Bảng 2.1. Một số enzyme công nghiệp và nguồn vi sinh vật sản xuất enzyme
Nguồn

Vi khuẩn

Nấm men

Nấm sợi

Enzyme

Vi sinh vật

Protease

Bacillus subtilis

Amylase

Bacillus subtilis

Pencilinase

Bacillus subtilis

Lactase

Saccharomyces flagilis

Invertase

Saccharomyces cerevisiae

Protease

Aspergillus niger

Amylase

Aspergillus oryzae

Cellulase

Aspergillus niger

Pectinase

Aspergillus niger

Catalase

Aspergillus niger

Glucose oxidase

Penicillium notatum

Glucosidases

Aspergillus flavus
Nguồn: Vittaladevaram & cs. (2017)

2.1.4. Tổng quan về nấm sợi Aspergillus niger
2.1.4.1. Đặc điểm sinh thái và phân loại của Asperillus niger
Chi Aspergillus được chia thành các nhóm theo màu sắc của bào tử.
Aspergilli có bào tử từ nâu đến đen được xếp vào nhóm Aspergillus niger (A.
niger). Mặc dù các lồi trong nhóm này khác nhau đáng kể, chỉ có một vài khác
biệt rõ ràng để phân loại các lồi riêng biệt (Schuster & cs., 2002). Nhóm
Aspergillus niger (Aspergilli đen) bao gồm 18 lồi, trong đó A. niger, A.
tubingensis, A. brasiliensis, A. acidus, A. carbonarius, và A. ibericus là phổ biến
nhất, các lồi cịn lại rất hiếm và được tìm thấy chủ yếu ở các vùng nhiệt đới
(Nielsen & cs., 2009). Nhiều loài của Aspergilli đã được phân lập từ khắp nơi
trên thế giới. A. niger là một loại nấm sợi sinh trưởng hiếu khí trên cơ chất hữu
cơ. Trong tự nhiên, nó được tìm thấy trong đất, chất độn chuồng và thực vật đang
phân hủy. A. niger có thể phát triển trong khoảng nhiệt độ rộng từ 6-47°C, nhiệt
độ tối ưu tương đối cao ở 35-37°C. Hoạt độ nước giới hạn cho sự phát triển là
0,88, tương đối cao so với các loài Aspergillus khác. A. niger có thể phát triển
trong phạm vi pH cực kỳ rộng: 1,4-9,8. Với những đặc điểm đó và khả năng sinh
và phát tán bào tử trong khơng khí, làm cho chúng có khả năng xuất hiện nhiều
và phổ biến với tần suất cao ở khắp mọi nơi, đặc biệt là ở những ấm ấp và ẩm ướt
(Schuster & cs., 2002).

7

luan an


2.1.4.2. Ứng dụng của Asperillus niger
A.niger có khả năng trao đổi chất mạnh, vì vậy nó được coi là một trong
những sinh vật quan trọng được sử dụng trong công nghệ lên men. Từ năm 1923,
A.niger đã được khai thác thương mại cho sản xuất axit citric, hầu hết sử dụng
trong thực phẩm, mỹ phẩm và dược phẩm. Ngoài việc sản sinh ra axit citric, A.niger

còn là nguồn phong phú các enzyme. Pectinase, protease và amyloglucosidase là
những enzyme đầu tiên được khai thác bằng nuôi cấy bề mặt. Để sản xuất nhiều
sản phẩm, tinh bột - một trong những nguồn cacbon dồi dào nhất phải được thủy
phân thành glucose, maltose và các dextrin phân tử lượng thấp. Amyglucosidase
còn được gọi là glucosamylase có khả năng xúc tác, cắt các đơn vị glucose từ đầu
không khử của tinh bột. Các ngành cơng nghiệp sản xuất siro và rượu sử dụng
chính các amyglucosidase do A.niger sản xuất. Pectin là một heteropolysaccharide,
là thành phần chính trong rau củ và trái cây. Một số enzyme được sản xuất bởi
A.niger như pectin esterases, endo và exo-polygalacturonidases và pectin có khả
năng phân hủy pectin; chúng được sử dụng trong sản xuất rượu vang, nước trái cây
để làm giảm độ nhớt của trái cây trước khi chế biến và cải thiện độ trong của sản
phẩm (Schuster & cs., 2002).
Các chuyên gia của FAO/WHO đã công nhận các chế phẩm enzyme từ
A.niger gồm chính các sinh vật (FAO/WHO 1972, 1978, 1981, 1987, 1990). FDA
Hoa Kỳ đã chấp nhận nhiều enzyme sử dụng cho thực phẩm: vào đầu những năm
1960 FDA đã thừa nhận rằng α-amylase, cellulase, amyloglucosidase, catalase,
glucose oxidase, lipase và pectinase từ A. niger có thể được coi là an toàn (GRAS
- generally regarded as safe), với điều kiện các chủng không gây bệnh, không độc,
hoạt động tốt trong điều kiện sản xuất. Tiếp sau đó, một loạt các enzyme từ A.niger
được cơng nhận là an tồn và sử dụng cho các lĩnh vực thực phẩm, công nghiệp,
dược phẩm như: Carbohydrase, cellulase từ A. niger (Schuster & cs., 2002).
Với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc sản xuất enzyme của A.niger
được cải thiện rõ rệt. Sản xuất phytase tăng 1000 lần nhờ công nghệ tái tổ hợp và
nhiều sản phẩm enzyme có sẵn trên thị trường từ các chủng A. niger tái tổ hợp như
α-amylase, arabinofuranosidase, catalase, chymosin, glucoamylase, glucose
oxidase, pectin esterase, phospholipase A2, phytase và xylanase (Pariza &
Johnson, 2001).
Ngày nay trong sản xuất amylase và cellulase thương mại, người ta chủ yếu

8

luan an


thu nhận nguồn enzyme này nấm sợi với các loài thuộc chi Trichoderma, Humicola,
Penicillium, Aspergillus (Sukumaran & cs., 2005; Ariffin & cs., 2006; Ghani & cs.,
2013). Nhiều loài nấm sợi có khả năng sản sinh các loại enzyme như α-amylase,
glucoamylase và cellulase ở các điều kiện và công nghệ lên men khác nhau. Các loài
thường được sử dụng là Aspergillus niger, Rhizopus oryzae, Aspergillus awamori và
Aspergillus oryzae (Ciloci & cs., 2012; Imran & cs., 2012; Ho & Ho, 2015).
Công nghệ enzyme nhằm mục đích sản xuất các enzyme bởi các chủng vi
khuẩn và nấm khác nhau bằng phương pháp lên men lỏng và rắn. Trong những năm
gần đây, việc sản xuất enzyme cellulase, α-amylase và glucoamylase bằng lên men
rắn đang được quan tâm vì chi phí thấp, hiệu suất cao và có triển vọng trong việc sử
dụng nhiều loại phụ phẩm công - nông nghiệp làm cơ chất (Park & cs., 2002). Các
phụ phẩm nông nghiệp khác nhau như cám lúa mì, cám gạo, vỏ trấu, bã mía, cám yến
mạch, bột hạt bơng có thể dùng được cho việc chuyển hóa chúng thành các sản phẩm
có giá trị kinh tế bởi đa enzyme từ nấm sợi (Parbat & Singhal, 2011).
Phức hợp cellulase của Aspergillus niger đã được nghiên cứu đầy đủ nhất.
Nó có thể chuyển đổi cellulose tự nhiên cũng như cellulose tổng hợp thành glucose
(Devi & Kumar, 2017). Devi & Kumar (2017) đã tối ưu điều kiện môi trường, thu
nhận và tinh sạch được cellulase của A.niger bằng lên men trên mùn cưa và bã thải
giấy và cho rằng các chủng A.niger có khả năng phân hủy các bã thải
lignocellulosic sinh học. A.niger tạo ra cellulase hoạt tính cao khi nuôi trong môi
trường lỏng bằng cả phương pháp lên men bề mặt và lên men chìm, gần đây là
bằng lên men bề mặt rắn (Ikram-Ul-Haq & cs., 2005).
Nhiều nghiên cứu trong nước cũng cho biết các chủng nấm sợi Aspergillus
có khả năng sinh ra nhiều loại enzyme và được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh
vực công nghiệp khác nhau. Nhóm enzym amylase (α-amylase, glucoamylase)
được tạo ra bởi Aspergillus oryzae và Aspergillus niger được ứng dụng trong làm

bánh mì, ủ bia rượu và bánh kẹo. Enzym cellulase, β-glucanase được tiết ra
bởi Aspergillus niger ứng dụng để thúc đẩy sự tiêu hố của thực phẩm có sợi, sự
tinh lọc nước trái cây và bia. Glucose oxidase được tạo ra bởi Aspergillus niger đã
có nhiều ứng dụng trong thực phẩm và y học (Hoàng Kim Anh, 2012). Dương Thị
Hương & Nguyễn Hiền Trang (2018) đã tạo ra chế phẩm hỗn hợp Aspergillus
oryzae KZ3 và Aspergillus awamori HK1 có khả năng sinh protease cao trên môi
trường bán rắn. Đỗ Thị Hiền & Huỳnh Phan Phương Trang (2019) đã tạo ra chế
phẩm pectinase dạng bột từ Aspergillus niger bằng phương pháp sấy phun. Đặng

9

luan an


Minh Nhật & Bùi Viết Cường (2012) nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme
glucose oxidase từ Aspergillus niger ở dạng đơng khơ có hoạt độ riêng 7000 UI/g.
2.2. CẢI TIẾN CHỦNG VI SINH VẬT VÀ LÊN MEN SẢN XUẤT ENZYME
2.2.1. Sự cần thiết phải cải tiến các chủng vi sinh vật
Trong những thập kỷ gần đây với sự tăng lên theo cấp số nhân về ứng dụng
của enzyme trong nhiều lĩnh vực khác nhau đã đặt ra yêu cầu cấp thiết là phải mở
rộng và tăng cường cả việc cải tiến chất lượng và nâng cao về số lượng thông qua
việc cải tiến chủng, tối ưu mơi trường, và tìm kiếm quá trình lên men hiệu quả để
tăng sản lượng enzyme.
Tăng sản lượng enzyme có thể đạt được bằng tối ưu môi trường nuôi cấy
và điều kiện sinh trưởng nhưng cách tiếp cận này bị giới hạn trong khả năng tổng
hợp sản phẩm của cơ thể. Việc cải tiến chủng được thực hiện để giảm giá thành
bằng cách tăng năng suất hay giảm chi phí sản xuất vì vậy nó có vai trị quan trọng
trong cơng nghiệp lên men. Cải thiện chủng là quá trình cải tiến và thao tác trên
các chủng vi sinh vật để tăng cường khả năng trao đổi chất cho các ứng dụng của
công nghệ sinh học (Gonzalez & cs., 2003). Do hệ thống kiểm soát vốn có của

mình, các vi sinh vật thường sản sinh ra các chất trao đổi thương mại ở nồng độ
rất thấp chỉ đủ có lợi cho chúng, do đó việc tăng cường sản xuất các chất trao đổi
hiếm khi xảy ra và mặc dù năng suất có thể tăng lên bởi việc tối ưu hóa điều kiện
mơi trường, tuy nhiên năng suất cuối cùng vẫn được kiểm soát bởi bộ gen (genome)
của sinh vật (Pathak & cs., 2015). Việc cải tiến chủng chủ yếu tập trung vào sự gia
tăng hiệu suất của q trình lên men, giảm chi phí và tăng các lợi ích kinh tế và
cũng có thể có thêm một số đặc tính mong muốn khác (Prabakaran & cs., 2009;
Singh & cs., 2011).
Nghiên cứu về biến đổi gen trong những năm qua đã đóng góp lớn để hiểu
cơ chế ổn định và hoạt động cho cải tiến của enzyme cơng nghiệp. Hầu hết các
chủng dại mà có tiềm năng sử dụng trong q trình lên men cơng nghiệp bắt buộc
phải cải tiến để việc lên men đạt hiệu quả kinh tế cao (Mishra & cs., 2014).
2.2.2. Phương pháp cải tiến chủng vi sinh vật để tăng sản xuất enzyme
Việc tăng cường sản xuất các sản phẩm của vi sinh vật có thể đạt được thơng
qua gây đột biến, chọn lọc/sàng lọc và ứng dụng của kỹ thuật tái tổ hợp ADN. Cải
tiến các chủng vi sinh vật quan trọng cho công nghiệp được thực hiện bằng nhiều
phương pháp khác nhau như đột biến, dung hợp tế bào trần, công nghệ tái tổ hợp

10

luan an