(Luận văn tốt nghiệp) nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy hóa in vitro của loài gừng đặc hữu tại việt nam (distichochlamys orlowii)

`
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
------------------

ĐẶNG ANH THƯ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA IN VITRO
CỦA LỒI GỪNG ĐẶC HỮU TẠI VIỆT NAM
(Distichochlamys orlowii)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

HÀ NỘI – 2022

Luan van


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
------------------

ĐẶNG ANH THƯ

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HĨA HỌC VÀ
HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HĨA IN VITRO
CỦA LỒI GỪNG ĐẶC HỮU TẠI VIỆT NAM
(Distichochlamys orlowii)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

KHÓA: QH.2017.Y

NGƯỜI HƯỚNG DẪN: TS. LÊ HỒNG LUYẾN
ThS. NGUYỄN XUÂN TÙNG

HÀ NỘI – 2022

Luan van


LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, em xin cảm ơn Ban chủ nhiệm Trường Đại học Y Dược, Đại
học Quốc Gia Hà Nội, Bộ mơn Khoa học cơ sở Dược và tồn thể các thầy cơ
đã tạo điều kiện để em hồn thành khóa luận tốt nghiệp này. Em xin chân thành
cảm ơn các thầy cô đã giảng dạy, giúp đỡ em hồn thành chương trình học tập
suốt 5 năm qua.
Em xin gửi lời cảm ơn đặc biệt đến TS. Lê Hồng Luyến – Trường Đại
học Khoa học và Công nghệ Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam và ThS. Nguyễn Xuân Tùng – Trường Đại học Y dược, Đại học Quốc
Gia Hà Nội đã ln tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện giúp em hồn thành khóa
luận.
Em xin trân trọng cảm ơn Trường Đại học Khoa học và Công nghệ Hà
Nội – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo điều kiện thuận
lợi cho em trong suốt thời gian nghiên cứu tại trường.
Cuối cùng em xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình, các bạn bè và người
thân đã ln quan tâm, khích lệ tinh thần giúp em có thêm quyết tâm hồn thành
khóa luận này.
Dù đã rất cố gắng, nhưng là lần đầu làm nghiên cứu khoa học nên khó
tránh khỏi những sai sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp của thầy cơ
giúp em hồn thiện khóa luận hơn nữa.
Em xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 01 tháng 06 năm 2022

Sinh viên

Đặng Anh Thư

Luan van


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
STT Chữ viết tắt

Ý nghĩa
2,20 -azinobis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic
acid)

1

ABTS• +

2

ADN

Acid deoxyribonucleic

3

ARN

Acid ribonucleic

5

BHA

Butylated hydroxyanisole

4

BHT

Butylated hydroxytoluene

6

DCM/ CH2Cl2

Dichloromethan

7

DC

Cao chiết dichloromethan

8

ET

Cao chiết ethanol

9

EA

Cao chiết ethyl acetat

10

ME

Cao chiết methanol

11

DPPH

2,3-diphenyl-1-picrylhydrazyl

12

EtOAc

Ethyl acetate

13

EtOH

Ethanol

14

GC-MC

Sắc ký khí- khối phổ

15

IC50

16

MeOH

Nồng độ ức chế 50% (50% Inhibitory
Concentration)
Methanol

Luan van


DANH MỤC BẢNG BIỂU
Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh .................................................... 10
Bảng 1.2. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp
......................................................................................................................... 13
Bảng 3.1. Khối lượng cao chiết thu được (mg) và hiệu suất chiết (%) .......... 24
Bảng 3.2. Hàm lượng polyphenol và flavonoid toàn phần trong cao chiết của
cây D. Orlowii (%) .......................................................................................... 26
Bảng 3.3. Hoạt tính trung hịa DPPH (IC50, µg/mL) của cao chiết ................ 29
Bảng 3.4. Hoạt tính trung hòa gốc tự do ABTS+ (IC50) của các cao chiết...... 31

Bảng 3.5. Các thành phần tinh dầu trong dịch chiết n-hexan từ rễ và củ của
D.orlowii ......................................................................................................... 33

Luan van


DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1. Hình ảnh lồi Gừng đen lá tím (D. orlowii ....................................... 5
Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của vitamin A ...................................................... 11
Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của vitamin E ....................................................... 12
Hình 3.1. Đường chuẩn của acid gallic ........................................................... 25
Hình 3.2. Đường chuẩn của quercetin............................................................. 25
Hình 3.3 . Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến hàm lượng polyphenol và
flavonoid toàn phần của rễ củ của cây D. Orlowii tương ứng với các dung môi:
Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D). .............. 27
Hình 3.4. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng khử gốc tự do DPPH
của rễ và củ cây D. orlowii tương ứng với các dung môi: Dichcloromethan (A),
Methanol (B), Ethylacetat (C), Ethanol (D). ................................................... 30
Hình 3.5. Ảnh hưởng của phương pháp chiết đến khả năng trung hòa ABTS+
tương ứng với các dung mơi: Dichcloromethan (A), Methanol (B), Ethylacetat
(C), Ethanol (D)............................................................................................... 32
Hình 3.6. Sắc ký đồ GC-MS của dịch chiết n-hexan từ rễ củ của D. orlowii. 35

Luan van


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
CHƯƠNG 1-TỔNG QUAN............................................................................ 3
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Distichochlamys ............... 3

1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................. 3
1.1.2. Đặc điểm phân bố ............................................................................. 3
1.2. Tổng quan về loài Distichochlamys orlowii ............................................... 4
1.2.1. Đặc điểm phân bố và thu hái ............................................................ 4
1.2.2. Đặc điểm thực vật ............................................................................. 4
1.2.3. Thành phần hóa học .......................................................................... 5
1.2.4. Công dụng và tác dụng dược lý ........................................................ 6
1.3. Gốc tự do và các chất chống oxy hóa .......................................................... 6
1.3.1. Gốc tự do........................................................................................... 6
1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro ................. 14
1.4.1. Xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH ................................... 14
1.4.2. Thử nghiệm ABTS (TEAC) ........................................................... 14
CHƯƠNG 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......... 16
2.1. Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu ............................................. 16
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................... 16
2.1.2. Nguyên liệu, hóa chất ..................................................................... 16
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị .......................................................................... 16
2.3. Phương pháp nghiên cứu............................................................................. 16
2.3.1. Phương pháp chiết .......................................................................... 16
2.3.2. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các dịch chiết từ củ và rễ của cây.... 18
2.3.3. Phân tích thành phần tinh dầu bằng GC-MS .................................. 23
2.3.4. Định lượng một số các hợp chất tự nhiên ....................................... 18
2.3.4. Xử lý số liệu .................................................................................... 23
CHƯƠNG 3- KẾT QUẢ ............................................................................... 24
3.1. Kết quả chiết xuất và định lượng một số các hợp chất tự nhiên trong rễ
và củ của cây D.orlowii ...................................................................................... 24
3.1.1. Kết quả chiết xuất ........................................................................... 24

Luan van

3.1.2. Định lượng một số các hợp chất tự nhiên ....................................... 24
3.2. Kết quả đánh giá tác dụng chống oxy hóa của cao chiết rễ và củ cây D.
orlowii ................................................................................................................... 28
3.2.1. Theo mơ hình trung hịa gốc tự do DPPH ...................................... 28
3.2.1. Theo mơ hình trung hịa gốc tự do ABTS+ ..................................... 30
3.3. Kết quả phân tích thành phần tinh dầu từ dịch chiết rễ và củ cây D. orlowii
............................................................................................................................... 33

CHƯƠNG 4- BÀN LUẬN ............................................................................ 36
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .......................................................................... 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO

Luan van


MỞ ĐẦU
Trong xã hội tiến bộ và phát triển như ngày nay thì cuộc sống của con
người đã được nâng cao. Do đó, các vấn đề về bảo vệ sức khỏe và sắc đẹp ngày
càng được quan tâm, đặc biệt là những nghiên cứu, thảo luận liên quan đến sự
lão hóa. Ngun nhân chính gây ra q trình lão hóa là do các gốc tự do phân
hủy tế bào cơ thể gây ra các bệnh liên quan đến tim mạch, gan, thần kinh, nội
tiết, thận,... gây tổn hại nghiêm trọng đến sức khỏe con người [35]. Gốc tự do
làm tổn thương màng tế bào, phản ứng mạnh với các phân tử protein, DNA và
các acid béo dẫn đến những biến đổi gây tổn hại, rối loạn và làm chết tế bào
[11]. Tuy nhiên, các gốc tự do này có thể bị phân hủy bởi các chất oxy hóa nội
sinh trong cơ thể con người và các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nguồn gốc
từ thiên nhiên là các thực phẩm như rau củ, trái cây tươi và một số loại dược
liệu [8]. Ngồi ra, có nhiều chất chống oxy hóa tổng hợp đã được nghiên cứu
và đang được sử dụng khá phổ biến. Tuy nhiên, các chất chống oxy hóa tổng

hợp gần đây khơng cịn được ưa chuộng vì các tác dụng có hại được quan sát
như độc tính đối với con người, khả năng gây ung thư và gây ơ nhiễm mơi
trường [6]. Do đó, trong những năm gần đây, việc tìm kiếm các hợp chất kháng
oxy hóa trong tự nhiên đang được đẩy mạnh và nhận được nhiều sự quan tâm.
Cây Gừng Orlow (Distichochlamys orlowii) là một loài thực vật thuộc
chi Gừng đen (Distichochlamys), họ Gừng (Zingiberaceae) là một loài gừng
đặc hữu tại Việt Nam mới được phát hiện [1]. Họ Gừng là một họ cây phổ biến
ở Việt Nam với nhiều công dụng khác nhau. Nhiều nghiên cứu khoa học đã chỉ
ra các tính chất dược lý vượt trội của một số hợp chất tồn tại trong các cây họ
Gừng. Tuy nhiên, hiện nay có rất ít các nghiên cứu trong nước cũng như trên
thế giới về đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và các tác dụng sinh học của
lồi D. orlowii. Do đó, việc tiến hành nghiên cứu thêm về các thành phần hóa
học và các hoạt tính của lồi D. orlowii là rất cần thiết.
Chính vì vậy, với mục đích nghiên cứu sơ bộ thành phần hóa thực vật,
định lượng một số hợp chất và xác định khả năng chống oxy hóa từ củ và rễ
của cây D.orlowii nhằm củng cố và cung cấp thêm các thơng tin khoa học có
giá trị và tin cậy về hoạt tính sinh học; từ đó giúp cho việc khai thác sử dụng

1

Luan van


cây làm nguồn dược liệu trong thực tế có hiệu quả hơn, chúng em đã lựa chọn
và tiến hành đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính chống oxy
hóa in vitro của lồi gừng đặc hữu tại Việt Nam (Distichochlamys orlowii)”
với những mục tiêu sau:
1. Khảo sát hàm lượng flavonoid, polyphenol và thành phần của tinh dầu
có trong cao chiết từ rễ và củ của Distichochlamys orlowii.
2. Đánh giá sơ bộ hoạt tính chống oxy hóa in vitro của các cao chiết từ

rễ và củ của Distichochlamys orlowii.

2

Luan van


CHƯƠNG 1 – TỔNG QUAN
1.1. Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Distichochlamys
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo hệ thống phân loại thực vật có hoa [21], chi Distichochlamys có vị
trí phân loại như sau:
Giới: Thực vật (Plantae)
Phân giới: Thực vật có mạch (Tracheophyta)
Ngành: Thực vật có hoa/ Ngành Ngọc lan/ Hạt kín
(Magnoliophyta)
Lớp: Liliopsida
Bộ: Zingiberales
Họ: Zingiberaceae
Chi: Distichochlamys
1.1.2. Đặc điểm phân bố
Giống gừng nhỏ Distichochlamys MF Newman là một chi đặc hữu của
Việt Nam thuộc họ Zingiberaceae, được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1995
bởi Newman [26]. Chi Distichochlamys ở Việt Nam đã xác định được bốn lồi
phân bố ở một số nơi.
D. citrea MF Newman cịn được gọi là Gừng đen, là loài
Distichochlamys đầu tiên được tìm thấy ở Vườn Quốc gia Bạch Mã, tỉnh Thừa
Thiên Huế, Việt Nam (Newman 1995; Nguyen and Leong-Škorničková 2012).
Sự xuất hiện của D. citrea cũng đã được báo cáo ở các vùng khác của Việt
Nam, bao gồm Quảng Bình, Quảng Trị, Quảng Nam và Nghệ An [38].

D. orlowii K. Larsen & MF Newman phân bố ở một khu vực hạn hẹp
thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai và mới ghi nhận thêm vùng phân bố mới ở
Trà Bui - Nam Trà Mi - Quảng Nam [21].
D. rubrostriata WJKress & Rehse phân bố ở một số tỉnh miền Bắc Việt
Nam và Vườn Quốc gia Cúc Phương [30].

3

Luan van


D. benenica phân bố ở Vườn quốc gia Bến En, Huyện Như Thanh, Tỉnh
Thanh Hóa, Việt Nam [27].
1.2. Tổng quan về loài Distichochlamys orlowii
1.2.1. Đặc điểm phân bố và thu hái
Distichochlamys orlowii là một lồi thực vật có hoa thuộc chi
Distichochlamys, họ Gừng. Loài này được K. Larsen & M.F. Newman mô tả
khoa học đầu tiên năm 2001, tên Việt Nam là gừng orlow hay gừng đen lá tím
[1]. Nó phân bố ở một khu vực hạn hẹp thuộc huyện An Khê, tỉnh Gia Lai và
mới ghi nhận thêm vùng phân bố mới ở Trà Bui - Nam Trà Mi - Quảng Nam
[21].
D. orlowii là cây chịu bóng, sống dưới tán rừng thường xanh ở độ cao
trung bình khoảng 350 – 400 m so với mực nước biển. Các loài cây họ Gừng
chủ yếu ưa độ ẩm cao và phát triển tốt hơn ở điều kiện chiếu sáng thấp nên
chúng thường được phát hiện ở các khu vực ven suối, rừng nguyên sinh, rừng
thứ sinh và các trảng cây bụi [1].
1.2.2. Đặc điểm thực vật
D. orlowii là loài thực vật có hoa, thân rễ thuộc chi Gừng đen
(Distichochlamys) trong họ Gừng (Zingiberaceae). Thân rễ leo, dài 8 – 10 mm,
màu đỏ; khi khô chuyển sang màu nâu [20]. Lá mọc thẳng từ thân rễ; bẹ lá dài

4 – 7 cm, mép mỏng, hơi đỏ. Lá có mặt trên xanh đậm, mặt dưới đỏ tím sẫm.
Cuống lá dài 15 – 20 cm, khía 4 mm, màu xanh lục, có rãnh ở mặt lưng. Phiến
lá rộng, hình elip, nhẵn ở cả hai mặt. Gân chính ở giữa, mỗi bên của gân chính
có 12 – 18 gân nhỏ nổi rõ ở trên song song nhau. Gân lá bậc hai và bậc ba mỏng
hơn, kích thước 15 – 27 x 8,5 – 13 cm [19]. Mùa hoa từ tháng 3 đến tháng 4
hằng năm. Cụm hoa đơn tính mọc từ các bẹ lá phía dưới. Cuống hoa dài 1 cm.
Lá bắc lớn áp vào chùm hoa, màu xanh lục với mép đỏ, dài 30 – 40 x 8 – 10
mm, mỗi lá bắc phụ có một lá mầm với 2 – 3 hoa màu vàng. Lá bắc có màng,
hình ống, kích thước 25 – 30 x 8 – 10 mm. Noãn dài 3 – 4 mm. Đài hoa hình
ống dài 10 mm, đỉnh có 3 răng cưa. Ống tràng hoa dài 30 mm, rộng 3 mm, ở
đỉnh tràng hoa có thùy 10 mm [19, 30]. Bao phấn hoa màu vàng, dạng sợi dài
4 mm, không phủ lông tuyến. Các nhị bên rộng dưới 6 mm, màu vàng thuần;

4

Luan van


cánh hoa màu vàng với các vân tím và các dải ở giữa màu vàng sẫm [19, 30,
38]. Quả và hạt khơng xác định [19].

Hình 1.1. Hình ảnh lồi Gừng đen lá tím (D. orlowii)
1.2.3. Thành phần hóa học
Cho đến nay, các nghiên cứu về thành phần hóa học của cây D. orlowii
còn rất hạn chế và chưa được nghiên cứu nhiều. Năm 2017, bằng kỹ thuật sắc
ký khí ngọn lửa ion hóa (GC-FID) và sắc ký khí khối phổ (GC-MS), Lê Thị
Hương và cộng sự đã xác định được các thành phần hóa học của tinh dầu chưng

5

Luan van


cất từ thân rễ của cây D. orlowii thu thập từ Vườn quốc gia Pù Mát, tỉnh Nghệ
An, Việt Nam. Nghiên cứu này đã định lượng được một lượng đáng kể các
hydrocarbon monoterpene (23,9%), monoterpen oxy hóa (29,4%), hydrocarbon
sesquiterpene (33,7%), sesquiterpenes oxy hóa (11,2%) và xuất hiện một lượng
diterpenes rất nhỏ (0,3%). Người ta quan sát thấy rằng geranyl axetat (16,5%),
β-elemene (9,2%), β-pinene (9,0%) và β-caryophyllene (7,9%) là các thành
phần chủ yếu của D. orlowii. Bên cạnh đó có các hợp chất định tính khác bao
gồm α-humulene (4,9%), (Z) -citral (4,6%), bicyclogermacrene (3,6%), γgurjunene (3,4%), linalool (3,1%) và limonene (3,1% ),… [9]
1.2.4. Công dụng và tác dụng dược lý
Zingiberaceae là một họ cây chứa nhiều tinh dầu nên hầu hết các loài
cũng như các bộ phận trong cùng một loài đều có sự tích lũy tinh dầu; do đó có
giá trị sử dụng là cây cho tinh dầu [1].
Hiện nay, các hiểu biết về lồi Distichochlamys orlowii cịn rất là sơ khai.
Các thành phần hóa học trong thân rễ của cây có nhiều tiềm năng về tác dụng
dược lý. Geranyl acetate có tác dụng chống viêm, chống nấm mạnh mẽ [13].
Các thử nghiệm in vitro cho thấy β-elemene hoạt động như một chất ức chế
Rhokinase [40] và có tác dụng chống tăng sinh đối với một số loại tế bào ung
thư [43]; từ đó cho thấy tiềm năng cao sử dụng trong hóa trị liệu. βCaryophyllene đã được chứng minh là có tác dụng chống viêm liên quan đến
hoạt động của thụ thể cannabinoid loại 2 [3]. Citral cho thấy hoạt tính kháng
khuẩn đáng kể chống lại vi khuẩn Gram dương và Gram âm cũng như nấm
[28]. Citral đã được chứng minh là có tác dụng chống oxy hóa, ngừa ung thư,
kháng khuẩn và tẩy giun sán [16]. β-linalool được nghiên cứu là có khả năng
hỗ trợ hoạt động chống oxy hóa, giảm độc tế bào… [18]
1.3. Gốc tự do và các chất chống oxy hóa
1.3.1. Gốc tự do
1.3.1.1. Khái niệm
Khái niệm về gốc tự do (Free Radical) được đề xướng lần đầu tiên vào

năm 1954 trong luận thuyết về sự lão hóa (Free Radical Theory of Aging) [14].
Một gốc tự do là một nguyên tử, phân tử hay ion có các điện tử (electron) hóa

6

Luan van


trị lẻ. Như vậy, gốc tự do là các mảnh phân tử ( •OH...), phân tử ( •NO, •NO2,
CO2-•...), nguyên tử tự do ( •Cl, •Br..) hay ion ( O2•-...) trung tính hay mang điện
tích, có lớp điện tử ngồi cùng chứa một điện tử không ghép cặp (điện tử đơn
độc). Chúng có thể mang điện tích dương, âm hoặc không mang điện và cả ba
loại này đều giữ vai trị quan trọng trong hệ thống sinh học. Do có điện tử khơng
ghép cặp ở lớp ngồi cùng nên gốc tự do rất không ổn định về cả năng lượng
cũng như điện học. Chúng ln có xu hướng lấy điện tử từ các nguyên tử hay
phân tử khác để trở về trạng thái ổn định, nhưng lại biến các nguyên tử, phân
tử này thành gốc tự do. Phản ứng dây chuyền tiếp diễn làm cấu trúc và chức
năng của các thành phần tế bào bị phá hủy dẫn tới sự lão hóa, nếu nặng tế bào
sẽ bị chết [11].
1.3.1.2. Nguồn sinh gốc tự do
Các gốc tự do luôn luôn được hình thành từ nhiều con đường khác nhau,
từ chính cơ thể sinh vật sinh ra hay từ các yếu tố như mơi trường, khói bụi ơ
nhiễm, thức ăn độc hại, thuốc lá ... Vì vậy, gốc tự do được chia thành hai loại
chính là gốc tự do nội sinh và ngoại sinh [15].
Gốc tự do nội sinh
Gốc tự do có nguồn gốc nội sinh được hình thành do những quá trình
chuyển hóa tự nhiên trong cơ thể. Chẳng hạn như trong chuỗi chuyển điện tử
của hô hấp tế bào, một số điện tử có thể bị rị rỉ. Sau đó, chúng tương tác với
oxy và hình thành nên gốc superoxide. Khoảng 2 – 5% oxy sử dụng cho trao
đổi chất hiếu khí trong ty thể chuyển hóa thành gốc tự do có nhóm oxy hoạt

động (reactive oxygen species – ROS). Bên cạnh đó, q trình thực bào của các
tế bào bạch cầu khi có các sinh vật lạ xâm nhập vào cơ thể cũng sinh ra các gốc
tự do thông qua việc hoạt hóa enzyme NADPH oxidases ở màng bạch cầu.
Enzyme này xúc tác cho phản ứng giữa O2 và NADPH tạo nên gốc tự do
superoxide O2•-, từ đó tạo ra nhiều gốc tự do khác nhằm tiêu diệt các sinh vật
lạ xâm nhập vào cơ thể [41].
Các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể cịn có thể tham gia vào các
phản ứng tạo gốc tự do, ion sắt hoặc đồng phân giải lipid hydroperoxide tạo
gốc tự do peroxide. Sau đó, gốc tự do này tham gia vào phản ứng dây chuyền

7

Luan van


peroxide hóa lipid gây hại cho cơ thể. Ngồi ra, việc vận động gắng sức cũng
phát sinh nhiều gốc tự do trong cơ bắp và cơ tim [41].
Gốc tự do ngoại sinh
Gốc tự do ngoại sinh có thể được tạo ra từ chất ơ nhiễm, thuốc lá, khói
bụi, các chất độc hóa học hoặc phóng xạ. Các phóng xạ ion hóa có thể phản
ứng với nước và gây nên tổn thương ngay lập tức cho sinh vật với một quá trình
được gọi là sự phân ly do phóng xạ. Vì nước chiếm tới 55 – 60% cơ thể nên
khả năng xảy ra sự phân ly do phóng xạ là rất cao trong trường hợp có sự hiện
diện của các phóng xạ ion hóa. Trong q trình này, nước bị mất một electron
và trở nên rất hoạt động. Sau đó, một chuỗi phản ứng 3 bước xảy ra. Nước được
chuyển thành gốc hydroxy (-OH), hydrogen peroxide (H₂O₂), gốc superoxide
(O₂•-), oxygen phân tử (O2). Gốc hydroxy rất hoạt động, có thể di chuyển
electron ở bất kỳ phân tử nào nằm trên đường đi của nó, chuyển phân tử này
thành tự do và vì vậy hoạt hóa một chuỗi phản ứng tiếp tục. Hydrogen peroxide
nguy hiểm với DNA hơn là gốc hydroxy vì khả năng hoạt động của H2 hơn OH nên H2O2 có đủ thời gian di chuyển vào nhân, rồi sau đó tiến hành phá hủy

các đại phân tử DNA [36].
1.3.1.3. Ảnh hưởng của gốc tự do đến cơ thể
Lợi ích của gốc tự do
Gốc tự do là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể, tạo ra chất melanine
cho thị giác, góp phần sản xuất prostaglandins có cơng dụng ngừa nhiễm trùng,
tăng cường tính miễn dịch, làm cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, sự co bóp
của cơ xương dễ dàng hơn. Gốc tự do được tạo ra một cách tất yếu trong quá
trình trao đổi chất và tùy thuộc vào nồng độ mà chúng có tác động tốt hoặc xấu
đến cơ thể. Ở nồng độ thấp, các gốc tự do là các tín hiệu làm nhiệm vụ điều hịa
phân ly tế bào; kích hoạt các yếu tố phiên mã cho gene tham gia quá trình miễn
dịch, kháng viêm và điều hịa biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme kháng
oxy hóa [42].

8

Luan van


Tác hại của gốc tự do
Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người
mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi
ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể mạnh, trấn áp được chúng. Nhưng khi tuổi cao,
sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần so với người trẻ. Nếu
khơng được kiểm sốt, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thối hóa như ung
thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh đái tháo đường, cao huyết
áp không nguyên nhân, xơ gan [35].
Gốc tự do thường xảy ra trong q trình chuyển hóa. Đơi khi chính hệ
miễn dịch của cơ thể cũng tạo ra gốc tự do để tiêu diệt virus và vi khuẩn. Tuy
nhiên, gốc tự do gây lo ngại nhất là những gốc tự do được hình thành do sự ơ
nhiễm mơi trường, phóng xạ, khói thuốc, thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ,... [15]

Gốc tự do là nguyên nhân phá vỡ màng tế bào khiến dinh dưỡng thất
thốt. Tế bào khơng tăng trưởng, phát triển rồi dẫn đến chết. Mặt khác, những
gốc tự do tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da tạo những vết đồi mồi trên mặt,
bàn tay. Những gốc tự do cũng ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm,
đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào, gây đột gene ở nhiễm sắc thể, DNA, RNA;
làm chất collagen, elastin mất sự đàn hồi, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp
cứng nhắc [37].
Gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do
oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực
phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp
năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố,
enzyme, khiến cơ thể khơng tăng trưởng được. Trong tiến trình hóa già, gốc tự
do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một
tích tụ những đổi thay trong mơ và tế bào [10].
1.3.2. Chống oxy hóa
1.3.2.1. Khái niệm về chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa (hay chất kháng oxy hóa) là chất trực tiếp hoặc gián
tiếp ngăn cản, trung hòa, loại bỏ tác dụng có hại của các gốc tự do với cơ thể.
Những chất kháng oxy hố ngồi tác dụng trung hoà các gốc tự do bằng cách

9

Luan van


nhường một điện tử của mình cho chúng, qua đó có thể cắt đứt phản ứng dây
chuyền, ngăn chặn tổn thương DNA do các độc chất gây ra; chúng còn có thể
khống chế sự phát triển của các tế bào ung thư [7].
1.3.2.2. Phân loại chất chống oxy hóa
Các chất chống oxy hóa nội sinh

Các chất chống oxy hóa nội sinh gồm có 2 loại là các chất có bản chất là
enzyme và các chất không phải enzyme. Chúng đều có tác dụng ngăn chặn sự
hình thành hoặc trung hịa các gốc tự do trong cơ thể. Các chất chống oxy hóa
nội sinh khơng phải là enzyme được tổng hợp trong cơ thể nhưng rất ít, chủ yếu
đến từ thực phẩm bổ sung [8]. Các nhóm chất như flavonoid, carotenoid... đến
từ thực vật có khả năng chống oxy hóa rất tốt. Các chất chống oxy hóa nội sinh
có thể tác dụng độc lập hoặc hiệp đồng với nhau để chống lại các gốc tự do.
Nhờ vậy mà quá trình oxy hóa trong cơ thể chỉ xảy ra ở mức độ nhất định, duy
trì được cân bằng trao đổi chất. Hiện nay, các nghiên cứu tìm kiếm các hợp chất
chống oxy hóa mới trong thảo dược có thể hỗ trợ điều trị các bệnh có liên quan
đến sự oxy hóa trong cơ thể đang nhận được nhiều sự quan tâm.
Bảng 1.1. Các chất chống oxy hóa nội sinh
Bản chất là enzyme

Khơng phải enzyme

Catalase

Vitamin A, vitamin C, vitamin E

Superoxide dismutase Glutathione
peroxidase

Coenzyme Q10
Hợp chất chứa nitơ (non-protein): acid
uric

Glutathione reductase

Glucose – 6 phosphate dehydrogenase Hợp chất chứa lưu huỳnh: Glutathion

Các chất chống oxy hóa có nguồn gốc từ thực vật
Một số thực phẩm, đặc biệt là các thực vật, rất giàu chất chống oxy hóa
thuộc nhiều nhóm khác nhau. Trong đó, đáng chú ý nhất là các dẫn xuất của
phenol và các vitamin.
- Vitamin A:

10

Luan van


Vitamin A chỉ có trong thức ăn từ nguồn động vật, đặc biệt có nhiều
trong gan cá, gan, thận các động vật có sừng, trong bơ, sữa, lịng đỏ trứng,...
Cịn carotene (tiền chất của vitamin A) có trong các phần xanh của cây, trong
rau quả có màu vàng đỏ như carot, cà chua, ớt, quả mơ, quả gấc, bí đỏ,.... Các
caroten nhờ có hệ kết nối luân phiên trên mạch cacbon dài, một phân tử caroten
có thể hấp thu năng lượng của hàng ngàn phân tử O2 rồi giải phóng năng lượng
dưới dạng nhiệt vơ hại [39].

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của vitamin A
Acid ascorbic (Vitamin C) có trong tất cả tế bào sống động vật cũng như
thực vật. Vitamin C cần cho sự tạo thành collagen, tham gia trong một số phản
ứng oxy hoá khử. Vitamin C tham gia trong q trình chuyển hố
phenilalamine, tyrosine, acid folic, norepinephrine, histamine, sắt và một số hệ
thống enzyme chuyển hoá thuốc [20].
Vitamin C cịn có tính chất kháng oxy hóa ở môi trường nước như loại
hydrogen peroxide, loại bỏ các gốc tự do superoxide (O2•- ), gốc hydroxy (•-OH)
và chặn đứng các phản ứng dây chuyền theo cơ chế gốc tự do. Vitamin C có
khả năng vơ hoạt gốc tự do vì có thể chuyển hai hydro cho các gốc tự do và
chuyển thành dehydroascorbic [20, 25].

- Vitamin E:
Vitamin E là chất kháng oxy hố hồ tan trong lipid và phân bố rộng
khắp tế bào, được coi như chất bảo vệ của màng sinh học vì nó ngăn cản q
trình oxy hố các acid béo chưa bão hồ của màng. Vitamin E có nhiều trong
mầm ngũ cốc (lúa mạch), mầm đậu tương, giá đỗ, các loại dầu thực vật, xà lách,
rau xanh, cà chua, gan động vật, lòng đỏ trứng [5]...

11

Luan van


Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của vitamin E
Cơ chế kháng oxy hóa: Vitamin E bị oxy hóa, trở thành gốc tocopherol
khơng bền vững và bị bẻ gãy dị vịng tạo nên tocopherol quinone. Đây không
phải là chất kháng oxy hố trong cơ thể sống và khơng biến đổi trở lại thành
vitamin E [5, 22]. Vitamin E có thể liên kết với phần hydrocarbon của acid béo
chưa bão hoà nhiều nối đơi và vì vậy tiếp cận gần vị trí của q trình peroxide
hố, những phản ứng chuỗi gốc tự do.
- Flavonoid:
Flavonoid là một nhóm các hợp chất chống oxy hóa bao gồm flavonol,
flavanol, anthocyanin, isoflavonoid, flavanone và flavones. Các nhóm hydroxyl
phenolic của flavonoid có cấu trúc vịng, có đặc tính chống oxy hóa, hoạt động
như các chất khử, cho hydro, chất khử oxy nhóm đơn, thu dọn gốc superoxide
và tạo phức chelat. Chúng cũng kích hoạt các enzyme chống oxy hóa, giảm các
gốc α-tocopherol (tocopheroxyls), ức chế các enzyme xúc tác cho phản ứng
oxy hóa khử, giảm nitro hóa, tăng mức acid uric và các phân tử trọng lượng
phân tử thấp. Một số flavonoid có hoạt tính chống oxy hóa cao là catechin,
catechin-gallate, quercetin, kaempferol, genistein trong đậu nành [8, 15].
Ngồi ra cịn có nhiều dẫn chất khác thuộc nhóm các phenolic tự nhiên

cũng có tác dụng chống oxy hóa như acid phenolic, lingin, carotenoid...
Các chất chống oxy hóa tổng hợp
Các chất chống oxy hóa tổng hợp đã được chiết xuất trong phịng thí
nghiệm để sử dụng trong hệ thống đo lường tiêu chuẩn chống oxy hóa, so sánh
với các chất chống oxy hóa tự nhiên và sử dụng trong ngành thực phẩm. Bảng
1.2 biểu thị các chất chống oxy hóa tổng hợp quan trọng nhất và có sẵn rộng
rãi cũng như công dụng của chúng; cho thấy trọng tâm chính của chất chống
oxy hóa tổng hợp là ngăn ngừa q trình oxy hóa thực phẩm, đặc biệt là acid

12

Luan van


béo. BHT (butylated hydroxytoluene) và BHA (butylated hydroxyanisole) là
những chất chống oxy hóa hóa học được sử dụng rộng rãi nhất [8].
Bảng 1.2. Cấu trúc hóa học, ứng dụng của một số chất chống oxy hóa tổng hợp
Tên hợp chất

Cơng thức cấu tạo

Ứng dụng

BHA (butylated
hydroxyanisole)

Chống oxy hóa
thực phẩm

BHT (butylated

hydroxytoluene)

Chống oxy hóa
thực phẩm

TBHQ (tertbutylhydroquinone)

Chống oxy hóa
thực phẩm chế
biến từ động vật

PG (propyl gallate)

Chống oxy hóa
thực phẩm
Chống oxy hóa
thực phẩm và
mỹ phẩm

OG (octyl gallate)

Kháng nấm
2,4,5-Trihydroxy
butyrophenone

Chống oxy hóa
thực phẩm

NDGA
(nordihydroguaiaretic

acid)

Chống oxy hóa
thực phẩm

13

Luan van


Ngăn ngừa thực
phẩm bị thâm
đen

4-Hexylresorcinol

1.4. Các phương pháp đánh giá tác dụng chống oxy hóa in vitro
Ngày nay, các nhà khoa học trong và ngoài nước đã tiến hành nhiều
phương pháp thử nghiệm để xác định hoạt tính chống oxy hóa, chia làm 2 loại
là phương pháp in vitro và phương pháp in vivo. Một số thử nghiệm đánh giá
in vitro thường được sử dụng như: Thu dọn gốc tự do DPPH, Thử nghiệm
TEAC/ABTS, dọn gốc tự do hydroxyl OH•-, ... [24]
1.4.1. Xác định khả năng loại bỏ gốc tự do DPPH
DPPH (2,3-diphenyl-1-picrylhydrazyl) là một gốc tự do ổn định và xét
nghiệm dựa trên phép đo khả năng thu gom của các chất chống oxy hóa. Điện
tử lẻ của nguyên tử nitơ trong DPPH bị khử bởi một nguyên tử hydro để tạo
thành chất chống oxy hóa là hydrazine tương ứng [32].
- Nguyên tắc: Dựa vào phản ứng giữa gốc tự do DPPH (màu tím đỏ) với
chất chống oxy hóa để tạo ra hợp chất của DPPH có màu vàng và khơng hấp
thụ ánh sáng tử ngoại tại bước sóng 517 nm. Đo độ hấp thụ quang tại bước sóng

517 nm của dung dịch sau phản ứng để tính lượng DPPH còn lại sau phản ứng
[24, 32].
- Ưu, nhược điểm: Phổ biến nhất, nhanh, cho kết quả khá chính xác, chi
phí thấp, dễ thực hiện các thí nghiệm, khả năng tái tạo, khả năng áp dụng ở
nhiệt độ phòng, cũng như khả năng tự động hóa [24]. Tuy nhiên, phép thử này
chỉ mang ý nghĩa xác định khả năng loại bỏ gốc tự do của mẫu cần thử vì DPPH
khơng tồn tại trong cơ thể sống. Phương pháp này dùng trong sàng lọc các mẫu
dược liệu [24].
1.4.2. Thử nghiệm ABTS (TEAC)
- Nguyên tắc: Thử nghiệm đo khả năng trung hòa cation gốc bền 2,20 azinobis (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS• +) của chất chống oxy
hóa, mang màu xanh lam – xanh lục, hấp thụ cực đại ở bước sóng 734 nm, có
cường độ giảm ở sự hiện diện của chất chống oxy hóa. ABTS• + có thể được tạo

14

Luan van


ra từ ABTS với sự hiện diện của các chất chống oxy hóa mạnh. Mức độ mất
màu của màu xanh lam - xanh lục được định lượng khi độ hấp thụ giảm đột
ngột tại bước sóng 734 nm. Phương pháp này phụ thuộc vào thời gian phản
ứng, hoạt tính chống oxy hóa nội tại và nồng độ mẫu [24].
- Ưu, nhược điểm: Thử nghiệm TEAC/ABTS cho phép xác định nhiều
chất chống oxy hóa khác nhau vì gốc ABTS• + phản ứng nhanh với cả chất
chống oxy hóa tổng hợp và tự nhiên (ví dụ: phenol, acid amin, peptit, vitamin
E và vitamin C). ABTS • + có khả năng hịa tan trong môi trường đệm và hữu
cơ giúp thuận lợi cho các phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa ưa
nước và ưa béo. Xét nghiệm TEAC rẻ và vận hành đơn giản. Tuy nhiên, thử
nghiệm TEAC thiếu tính phù hợp về mặt sinh học do sử dụng cation gốc ABTS
nhân tạo khơng được tìm thấy trong thực phẩm hoặc hệ thống sinh học [24].

1.4.3. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid O2•
- Nguyên tắc: Gốc tự do O2• được hình thành trong q trình oxy hóa
xanthin thành acid uric, được xúc tác bởi enzyme xanthinoxidase. Gốc O2• tạo
thành phản ứng với nitrobule tetrazolium sẽ tạo ra chất có màu xanh đậm, hấp
thụ cực đại tại bước sóng 560 nm. Tiến hành đo hấp thụ quang của dung dịch
phản ứng tại bước sóng này sẽ biết lượng O2• tham gia phản ứng [24].
- Ưu, nhược điểm: Nhanh, dễ thực hiện, u cầu ít máy móc, kết quả thu
được tương đổi ổn định và chính xác [24].
1.4.4. Thử tác dụng dọn gốc tự do superoxid OH•- Nguyên tắc: Phương pháp dựa trên phản ứng đường 2 - deoxyribose
của gốc •OH. Khi hoạt động sẽ oxy hóa đường deoxyribose để tạo ra sản phẩm
cuối cùng là MDA (maloydialdehyd). Phân tử MDA khi phản ứng với acid
thiobarbituric (TBA) ở nhiệt độ cao sẽ có màu hồng, hấp thụ ánh sáng cực đại
ở bước sóng 532 nm. Đo độ hấp thụ quang của dung dịch tại bước sóng này sẽ
cho biết nồng độ MDA được tạo ra sau q trình oxy hóa. Từ đó tính được mức
độ deoxyribose bị oxy hóa và mức độ dọn gốc tự do •OH của mẫu thử [24].
- Ưu, nhược điểm: Nhanh, dễ thực hiện, chi phí thấp. Tuy nhiên gốc •OH
có hoạt tính rất mạnh nên rất khó để đánh giá mức độ tác dụng và kết quá ít
chính xác hơn các thử nghiệm trên [24].

15

Luan van


CHƯƠNG 2 – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng, nguyên liệu, thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
Cây Gừng đen lá tím (D. Orlowii) được thu mua vào tháng 11 năm 2021
tại Nghệ An và được xác định bởi Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện
Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST). Sau khi được giám định, rễ và củ

của cây được rửa sạch để loại bỏ hết bùn đất, cắt thành từng đoạn nhỏ rồi phơi
khơ trong bóng mát, nhiệt độ khơng q 30oC.
2.1.2. Ngun liệu, hố chất
- Các dung mơi dùng để chiết xuất và phân lập: Ethanol (EtOH), ethyl
acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM / CH2Cl2),
n-Hexan, DMSO (dimethyl sulfoxide) đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Các thuốc thử: 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 2,20-azinobis (3ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) (ABTS• +), thuốc thử Folin –
Ciocalteu.
- Các chất hóa học tham gia phản ứng: Kali persulfat, acid gallic,
quercetin, Na2CO3, NaNO2 , nước cất (H2O), AlCl3, NaOH đạt tiêu chuẩn
dược điển Việt Nam V và Dược điển Mỹ (USP) 42.
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
- Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi, Đức); Máy siêu âm,
máy lắc; Máy quang phổ Microplate (xMark, Bio-Rad); Máy GC-MS
(Thermo scientific-ISQ 7000) ( Trường Đại học Khoa học và Công nghệ
Hà Nội, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
- Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, giếng 96, bình định mức, bình nón, bình chiết,
cốc có mỏ, bình gạn, bình cầu, ống đong...
- Các thiết bị khác: Tủ sấy, tủ hút, cân phân tích...
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Phương pháp chiết
2.2.1.1. Phương pháp chiết Soxhlet

16

Luan van


Cho 10 g mẫu rễ và củ của D. orlowii sau khi được sơ chế, phơi khô ᴠào
trong một đầu lọᴄ (thimble). Đầu lọᴄ nàу ѕẽ đượᴄ đặt ᴠào trong ống ᴄhiết. Lắp

bình cầu đã sấy khơ vào máy. Qua cổ ống sinh hàn rót dung mơi vào bình cầu.
Các loại dung môi được sử dụng gồm: Methanol, Ethanol, Ethylacetat,
Dichloromethan. Lượng dung mơi rót vào khoảng 2/3 thể tích bình cầu hoặc
hai lần dung tích ống chiết. Cho nước chảy liên tục vào ống làm lạnh của bộ
sinh hàn.
Đun từ từ dung mơi trong bình cầu bằng bếp cách thủy. Khi đun nóng
bình ᴄầu, dung mơi ѕẽ baу hơi lên trên ᴠề phía ống ѕinh hàn. Tại đâу, dung mơi
ѕẽ ᴄhuуển ѕang trạng thái lỏng ᴠà rơi хuống mẫu nằm trong đầu lọᴄ. Ống ᴄhiết
ᴄhứa mẫu ѕẽ dần dần đượᴄ làm đầу bằng dung mơi ᴄịn ấm, ᴄho đến khi đầу thì
tồn bộ dịch chiết ѕẽ đượᴄ ᴄhuуển ᴠề lại bình ᴄhứa thơng qua ống ѕiphon. Q
trình này sẽ lặp lại liên tục thành các chu kì. Để tránh tổn thất dung mơi, dung
mơi trong bình cầu khơng được sơi mạnh, đảm bảo khoảng 5 - 6 chu trình trong
1 giờ. Bổ sung dung môi nếu bị hao hụt.
Sau thời gian chiết 6 tiếng, tháo bộ ᴄhiết Soхhlet ᴠà phần dung môi ᴄhứa
ᴄhất ᴄhiết ѕẽ đượᴄ lọc qua giấy lọc. Các dịch lọc này được đem đi cất loại dung
môi dưới áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được các cao chiết
tương ứng.
2.2.1.2. Phương pháp chiết siêu âm
Sau khi sơ chế, ngâm ngập khoảng 10 g mẫu rễ và củ của D. orlowii
trong 200 ml các loại dung mơi gồm: Methanol, Ethanol, Ethylacetat,
Dichloromethan. Sau đó tiến hành chiết xuất bằng. Dịch chiết thu được lọc qua
giấy lọc; sau đó được đem đi cất phương pháp siêu âm với sự hỗ trợ của sóng
siêu âm tần số 20KHz trong thời gian 2 tiếng ở 37- 40ºC loại dung môi dưới áp
suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được các cao chiết tương ứng.
2.2.1.3. Phương pháp chiết lắc
Sau giai đoạn sơ chế, lấy khoảng 10 g mẫu rễ và củ của D. orlowii và
ngâm ngập trong 200 ml các loại dung môi gồm: Methanol, Ethanol,
Ethylacetat, Dichloromethan. Tiến hành chiết xuất bằng phương pháp lắc ở
nhiệt độ phòng với tốc độ lắc 200 vòng/ phút liên tục trong vòng 6 tiếng. Dịch

17

Luan van