Tai lieu thi nghiem vi sinh phan 1

Bài 1: MÔI TRƯỜNG DINH DƯỠNG – CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY VI SINH VẬT
A. Môi trường dinh dưỡng
I. Khái niệm chung
1. Mục đích, ý nghĩa:
Mơi trường dinh dưỡng có ý nghĩa đối với sự bảo tồn và phát triển nịi giống của vi sinh vật. Mơi
trường dinh dưỡng được sử dụng trong khâu phân lập, nhân giống, giữ giống và nghiên cứu các
hoạt động sinh hóa của vi sinh vật.
2. Yêu cầu đối với môi trường dinh dưỡng:
Môi trường dinh dưỡng là một hỗn hợp thức ăn cần thiết cho sự phát triển của vi sinh vật. Trong
thành phần của mơi trường dinh dưỡng cần phải có các ngun tố tạo chất sống (Cacbon, Hydro,
Oxi, Nitơ), các nguyên tố đa lượng (Phốt pho, Lưu Huỳnh, Kali, Canxi, Magie, Sắt,..), một vài
nguyên tố vi lượng (Mangan, Đồng, Natri, Clo, Kẽm, Bor, Molipden,..). Những nguyên tố trên cần
thiết phải ở dạng những hợp chất dễ hấp thu đối với vi sinh vật. Cacbon được các vi sinh vật dị
dưỡng hấp thu dễ hơn cả ở dạng glucoza. Ngoài glucoza, vi sinh vật dị dưỡng còn hấp thu
đường, rượu, axit hữu cơ và các hợp chất khác. Nguồn Nitơ có thể là các chất đạm, pepton, axit
amin, muối amon, nitrat. Các nguyên tố cịn lại dưới dạng muối. Mơi trường dinh dưỡng cịn cần
phải có đủ các chất kích thích sinh trưởng như biotin, vitamin, đặc biệt là các axit amin không
thay thế.
Môi trường dinh dưỡng cần phải cân đối về thành phần (đẳng trương về nồng độ các chất hòa
tan) và có độ ẩm, độ nhớt, pH, áp suất thẩm thấu tối ưu.
Môi trường dinh dưỡng cần phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng.
II. Phân loại môi trường
1. Phân loại môi trường theo thành phần: Căn cứ vào thành phần môi trường, người ta chia
chúng thành các loại sau
a. Môi trường tự nhiên được chế tạo từ các sản phẩm có nguồn gốc động, thực vật như thịt,
trứng, sữa, nước chiết nấm men, nước quả, mạch nha,... Thành phần hóa học của những môi
trường này phức tạp và không được xác định cụ thể. Nó phụ thuộc vào thành phần nguyên liệu
và các điều kiện tiến hành chế tạo môi trường. Người ta sử dụng chúng để nuôi cấy vi sinh vật,
tích lũy sinh khối, giữ các giống thuần sạch, các mục đích dự đốn, chúng khơng lợi cho việc
nghiên cứu sinh lý hoặc các q trình trao đổi chất.
b. Mơi trường tống hợp được chế tạo từ các hợp chất hóa học hữu cơ và vơ cơ với nồng độ

định trước một cách chính xác. Tùy theo bộ các cấu tử, mơi trường tơng hợp có thể phức tạp
(mơi trường nuôi cấy vi khuẩn lactic) hay tương đối đơn giản (môi trường cho các vi khuẩn tự
dưỡng). Người ta dùng chủng để nghiên cứu sự trao đổi chất, quy luật phát triển hay sinh tổng
hợp một chất nào đó (VD: axit amin). Trong thực hành thường sử dụng môi trường tổng hợp
Sapek để nuôi cấy nấm mốc.
c. Môi trường bán tổng hợp là môi trường chung giữa hai loại trên

1


2. Phân loại theo mục đích sử dụng
a. Mơi trường phổ dụng (môi trường cơ sở hay môi trường chuẩn) là những mơi trường thích
hợp để ni cấy nhiều loại vi sinh vật (VD: môi trường thịt pepton, môi trường nước mạch nha,...)
b. Môi trường riêng biệt hay môi trường chọn lọc: đảm bảo sự phát triển ưu thế của một lồi
hay một nhóm vi sinh vật nào đó, ít thuận lợi hoặc hoàn toàn bất lợi đối với sự phát triển của các
vi sinh vật khác. Môi trường chọn lọc có thể có những cơ chất mà chỉ một nhóm vi sinh vật có
khả năng sử dụng mới phát triển được (ví dụ: mơi trường chứa tinh bột là nguồn carbon duy nhất
được dùng để nuôi cấy vi sinh vật có khả năng sản sinh amylase), hoặc chứa các chất ức chế
sự phát triển của một số loài vi sinh vật không mong muốn (chất kháng nấm cycloheximide bổ
sung vào mơi trường có tác dụng ức chế sự phát triển của nấm, mơi trường chứa cycloheximide
có thể được sử dụng để phân lập vi khuẩn). Các môi trường chọn lọc chủ yếu được dùng để
phân lập vi sinh vật từ các môi trường sinh sống tự nhiên của chúng hoặc được dùng để ni
cấy tích lũy. VD: mơi trường tinh bột – ammoniac dùng để nuôi cấy xạ khuẩn.
c. Mơi trường chuẩn đốn phân biệt (mơi trường chỉ thị) cho phép phân biệt khá nhanh chóng
một lồi vi sinh vật này với loài khác và xác định những giống thuần khiết trên cơ sở nghiên cứu
những tính chất sinh hóa của chúng. Các mơi trường chỉ thị được ứng dụng trong vi khuẩn học
lâm sàng, trong nghiên cứu di truyền học và trong việc định tên vi sinh vật. Thông thường trong
các môi trường này người ta cho vào một số thành phần chỉ thị màu và nhờ sự thay đổi của chất
đó mà người ta có thể xác định được từng lồi vi sinh vật.
VD: Trong q trình sống, vi sinh vật thường tiết ra một loại enzyme nhất định. Dưới tác dụng

của các enzyme này các hợp chất hữu cơ phức tạp có trong mơi trường bị phân hủy thành các
dạng đơn giản hơn như axit và muối của chúng. Các chất này làm thay đổi độ pH của mơi trường,
do đó dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị màu.
3. Phân loại theo tính chất lý học
Tùy theo độ chắc cứng của môi trường người ta phân biệt môi trường lỏng, đặc, xốp
a. Môi trường lỏng là môi trường thức ăn dưới dạng dung dịch. Nó được ứng dụng để phát hiện
các đặc điểm sinh lý – sinh hóa của vi sinh vật, để tích lũy sinh khối hoặc các sản phẩm trao đổi
chất, để giữ và bảo quản nhiều loại vi sinh vật không phát triển trên các môi trường đặc.
b. Môi trường đặc là mơi trường lỏng có thêm các chất đơng dính, được ứng dụng để tách các
giống thuần khiết (nhận từng khuẩn lạc riêng biệt, nghiên cứu định tên, xác định hình thái khuẩn
lạc, đặc điểm sinh trưởng), để giữ giống.
Để làm đông môi trường người ta dụng thạch, gelatine và silica-gel. Các chất này không làm thay
đổi thành phần môi trường, đồng thời đảm bảo độ trong suet của mơi trường.
Thạch là một loại polysaccarit phức tạp có độ bền vững cao, nhận từ một số loại tảo biển họ
Floridae. Hầu hết vi sinh vật không sử dụng thạch như nguồn cơ chất dinh dưỡng. Trong nước,
thạch tạo thành dạng gel, nóng chảy ở 1000C và đơng ở gần 400C. Thạch có tính trung tính,
khơng làm thay đổi pH của mơi trường song nó bị ảnh hưởng pH mơi trường, những mơi trường
có độ axit pH thấp thạch khó đơng đặc hơn hơn bởi nó bị thủy phân từng phần. Thạch thường
được bổ sung vào môi trường với số lượng 1,5 – 2%. Trong trường hợp cần thiết có thể nâng
nồng độ thạch lên 3%.

2


Gelatin là loại protein nhận được khi ninh xương và sụn của động vật dễ bị vi sinh vật sử dụng
nên dễ vữa hơn so với thạch. Mặt khác gelatine dễ làm ảnh hưởng tới pH mơi trường nên ít được
sử dụng hơn thạch, Nhiệt độ nóng chảy của gelatine 25-27oC và đông đặc ở 18-20oC. Thường
để thu nhận những khuẩn lạc lớn trong phân loại nấm men.
Bản silica-gel được dùng làm chất nền đặc cho các môi trường tổng hợp có thành phần xác định
chặt chẽ bởi vì nó có bản chất vơ cơ.

Mơi trường xốp được ứng dụng trong vi sinh vật học công nghiệp. Thuộc loại này có kê nấu nhừ,
cám, cát thạch anh thấm dung dịch dinh dưỡng.
III. Cách làm mơi trường
Q trình tiến hành gồm các bước sau:
1. Pha chế
Cân đong chính xác theo đơn.
Cho vào bình sạch đã sấy khơ 1/3 lượng nước cần thiết, hịa tan trước các chất có khối lượng
nhỏ hơn các chất có khối lượng lớn hơn rồi sau cùng là các chất đơng dính. Thử pH mơi trường.
Dùng lượng nước cịn lại tráng rửa cổ bình, phễu, v.v. Thể tích mơi trường phải nhỏ hơn 1/2 thể
tích bình. Đóng miệng bình bằng nút bơng rồi bọc giấy để tránh bị ướt lúc thanh trùng. Dán nhãn,
ghi tên lên môi trường, pH, ngày và người chuẩn bị.
2. Lọc
Môi trường cần trong suốt nên sau khi pha chế phải tách cặn bã, bụi bẩn bằng một trong những
phương pháp sau:
- Lọc qua bơng, vải màu, giấy lọc
- Lọc bằng lịng trắng trứng
- Dùng phễu lọc nóng
3. Phân phối mơi trường
Mơi trường được phân phối vào bình cầu, bình tam giác, ống nghiệm, v.v.
Thạch nghiêng khoảng 5ml
Thạch đứng 1/2 thể tích ống nghiệm
Hộp Petri tráng đều dầy 3mm.
4. Khử trùng môi trường
Tất cả môi trường đều phải vô trùng, tùy loại môi trường, tùy yêu cầu thí nghiệm mà chọn chế độ
thanh trùng.
a. Phương pháp Pasteur
Chủ yếu dùng để diệt những vi sinh vật khơng sinh bào tử bằng cách đun nóng phân đoạn ở
nhiệt độ 60-75oC trong 15 đến 30 phút hay ở 80oC trong thời gian 10-15 phút. Phương pháp
Pasteur ứng dụng cho những sản phẩm hay môi trường dưới tác động của nhiệt độ cao bị ảnh
3

hưởng sâu sắc, mất đi những phẩm chất và giá trị dinh dưỡng. Nó được dùng rộng rãi trong cơng
nghiệp thực phẩm
b. Phương pháp Tinđan
Tiến hành thanh trùng ở nhiệt độ cao liên tục trong 3-4 ngày liền, mỗi ngày một lần, mỗi lần cách
nhau 24 giờ. Trong thời gian giữa hai lần hấp cần để môi trường ở nhiệt độ thích hợp cho các
bào tử cịn sống sót có thể phát triển thành dàng tế bào dinh dưỡng. Trong lần thanh trùng tiếp
theo các tế bào dinh dưỡng này sẽ bị tiêu diệt. Phương pháp này cho hiệu suất vô trùng cao hơn
phương pháp Pasteur.
c. Phương pháp thanh trùng bằng hơi nước bão hòa áp suất.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc làm gia nhiệt các vật bằng hơi nước bão hòa dưới một
áp suất lớn hơn áp suất của khí quyển. Khi áp suất hơi nước tăng lên thì nhiệt độ cũng tăng theo.
Nồi hấp áp lực là một thiết bị hai vỏ, có khả năng chịu áp suất cao. Nước được chứa trong một
khoang riêng, được cấp nhiệt trực tiếp nhờ sợi đốt để chuyển hóa thành hơi có áp suất cao di
chuyển vào buồng hấp. Hơi nước tiếp xúc với bề mặt vật liệu cần được khử trùng, truyền nhiệt
cho vật liệu cần khử trùng và ngưng tụ lại, nước ngưng cuối cùng được xả qua van xả nước
ngưng dưới đáy nồi.
Sơ đồ nguyên lý cấu tạo của nồi hấp áp lực:

4


Các giai đoạn hoạt động trong quá trình khử trùng bằng nồi hấp áp lực:

Gia nhiệt

Khử trùng

1

Áp suất (atm)

Nhiệt độ (oC)

121

100

25

Làm nguội

Đóng van
xả đáy
Thời gian

Giới thiệu cách vận hành nồi hấp áp lực:
+ Bật nguồn, đặt điều kiện khử trùng (áp suất, thời gian, v.v.)
+ Đưa vật liệu, môi trường cần khử trùng vào nồi hấp, các vật liệu cần được bao gói hợp lý. Chỉ
những vật liệu, mơi trường chịu được áp lực và áp suất cao mới được khử trùng bằng phương
pháp này.
+ Đóng nắp nồi hấp, mở van xả đáy
+ Khi hơi nước thoát ra nhiều từ van xả đáy khoảng 1-2 phút thì đóng van xả đáy lại. Lúc này,
khí khơng ngưng thốt hết khỏi khơng gian buồng hấp. Khí khơng ngưng làm cản trở q trình
truyền nhiệt từ hơi nước bão hịa vào dụng cụ cần khử trùng, do đó cần được loại bỏ trước khi
bắt đầu khử trùng.
+ Khi van xả đáy đóng, hơi nước đi vào buồng hấp được giữ lại, áp suất tăng cao đến áp suất
đặt trước thì bắt đầu tính thời gian khử trùng. Trong suốt thời gian khử trùng, áp suất hơi nước
bão hịa được duy trì ở áp suất đặt trước đó.

+ Kết thúc thời gian khử trùng, tắt nồi hấp, đợi áp suất trong buồng hấp giảm về 0, mở van xả
đáy, đợi nhiệt độ giảm xuống còn 70 – 80oC rồi mở nắp nồi hấp và lấy dụng cụ, môi trường cần
khử trùng ra.
Chú ý: trong trường hợp chuẩn bị môi trường trong hộp Petri, người ta thường pha và chứa mơi
trường trong bình tam giác, khử trùng (như mô tả ở bước 4) rồi mới đổ môi trường vào các hộp
Petri (như mô tả ở bước 3) khi mơi trường cịn ở trạng thái lỏng.

5


5. Bảo quản và kiểm tra môi trường
Giữ môi trường ở nhiệt độ thấp 0-5oC tránh q khơ, nóng, nhiều ánh sáng. Kiểm tra bằng cách
để môi trường vào tủ ấm có nhiệt độ 30-32oC trong vài ngày. Nếu thấy mơi trường bị vẩn đục
hoặc có khuẩn lạc phát triển thì loại bỏ.

B. Các phương pháp gieo cấy vi sinh vật
1. Định nghĩa: Gieo cấy là quá trình đưa các vật liệu nghiên cứu vào môi trường thức ăn với mục
đích phát hiện các loại vi sinh vật có mặt trong đó và thu nhận các canh trường cần thiết cho
nghiên cứu. Cấy chuyền là quá trình chuyển các canh trường vi sinh vật từ môi trường này sang
môi trường khác với mục đích nhận giống và giữ giống.
Khi gieo cấy cần đảm bảo vô trùng tuyệt đối bằng cách thao tác xung quanh ngọn lửa đèn cồn
hoặc trong các tủ cấy vơ trùng.
Ngọn lửa đèn cồn tạo dịng khơng khí nóng vơ trùng đối lưu trong phạm vi khoảng 20 cm quanh
ngọn lửa đèn cồn như trong hình sau:

Tủ cấy vơ trùng có 3 loại với độ bảo vệ cho người thao tác và cho mẫu vật ở các mức độ khác
nhau: tủ cấy cấp 1, cấp 2 và cấp 3. Các tủ cấy được sử dụng trong phòng thí nghiệm vi sinh của
viện CNSH-CNTP bao gồm tủ cấy cấp 1 và cấp 2, khơng khí được đi qua màng lọc HEPA lọc
sạch vi khuẩn. Tủ cấy cấp 1 bảo vệ mẫu không bị nhiễm tạp khi thao tác, nhưng không bảo vệ
người thao tác nên không được sử dụng để gieo cấy vi sinh vật gây bệnh. Tủ cấy cấp 2 bảo vệ

cả mẫu vật và người thao tác, có thể sử dụng được khi thao tác vi sinh vật gây bệnh.

6


2. Một số phương pháp gieo cấy
Vật liệu : canh trường chứa vi sinh vật, môi trường dinh dưỡng vô trùng
Dụng cụ: Que cấy vòng, que cấy thẳng, que cấy móc, que trang
Khi gieo cấy vi sinh vật từ canh trường giống sang mội trường dinh dưỡng vô trùng, tùy vào mục
đích thí nghiệm, loại canh trường giống (lỏng hoặc đặc), loại và dụng cụ chứa môi trường dinh
dưỡng (thạch đứng, thạch nghiêng, môi trường trong hộp Petri, môi trường lỏng trong ống
nghiệm, mơi trường lỏng trong bình tam giác) mà các dụng cụ cấy và kỹ thuật cấy khác nhau
được sử dụng. Các bước cấy được thực hiện như sau :
+ Vệ sinh khu vực cấy, bật ngọn lửa đèn cồn (hoặc đèn khí nếu thao tác trong tủ cấy)
+ Khử trùng que cấy bằng cách đốt nóng đỏ đầu que cấy, lướt nhẹ phần thân que cấy qua ngọn
lửa đèn cồn.
+ Chờ que cấy nguội, đưa que cấy đã vô trùng vào ống nghiệm chứa canh trường giống, chạm
nhẹ đầu que cấy vào phần không chứa canh trường của ống giống để làm nguội que cấy. Lấy
canh trường từ ống giống và chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường vô trùng và thực hiện thao
tác cấy như mô tả chi tiết ở dưới đây.
+ Lấy que cấy ra, khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và đặt tất cả lên giá.
Chú ý : sau khi mở ống nghiệm và trước khi đóng lại, hơ miệng ống trên ngọn lửa đèn cồn.
a. Gieo cấy vào môi trường lỏng :
Từ canh trường đặc, sử dụng que cấy vòng hoặc que cấy thẳng lấy một lượng nhỏ canh trường,
chuyển sang môi trường dinh dưỡng lỏng lắc que cấy hoặc cọ vào thành ống nghiệm hoặc bình
tam giác chứa mơi trường dinh dưỡng lỏng để sinh khối từ que cấy đi vào môi trường.
Từ canh trường lỏng, sử dụng pipette (với đầu tip vô trùng) hút một lượng canh trường lỏng rồi
bơm vào môi trường lỏng vô trùng.
b. Gieo cấy trên mặt thạch nghiêng :
Thạch nghiêng thường được sử dụng để lưu giữ vi sinh vật trong thời gian dài do thạch nghiêng

có lớp thạch dày và bề mặt bay hơi thấp, hơi nước thất thốt trong q trình bảo quản lâu dài ít
hơn so với canh trường trong hộp Petri. Khi gieo cấy vi sinh vật lên thạch nghiêng, que cấy vịng
hoặc que cấy thẳng có thể được sử dụng, đưa que cấy có sinh khối vi sinh vật từ canh trường
giống xuống đáy thạch nghiêng, dịch chuyển que cấy dần trên mặt thạch đến khi cách phần thạch
ở gần miệng ống nghiệm khoảng 0.5 – 1 cm. Khi cấy, đưa que cấy theo đường zigzag dày để
canh trường sau đó phủ kín mặt thạch, hoặc có thể theo đường thẳng, hoặc những đường song
song.
c. Dùng que cấy đâm sâu vào thạch đứng :
Thạch đứng dùng để nuôi cấy vi sinh vật kỵ khí tùy tiện hoặc vi sinh vật vi hiếu khí (đối với vi sinh
vật kỵ khí bắt buộc, các dụng cụ nuôi cấy và các kỹ thuật nuôi cấy đặc biệt cần được sử dụng),
vi sinh vật kỵ khí có xu hướng phát triển ở đáy sâu của lớp thạch, vi sinh vật hiếu khí phát triển
trên bề mặt thạch, nơi có oxy khuếch tán nhiều hơn. Thạch đứng cũng được sử dụng để xác định
khả năng di chuyển của vi sinh vật cần nghiên cứu. Vi sinh vật khơng có khả năng di động có xu
7


hướng phát triển ngay ở đường cấy thẳng đứng. Vi sinh vật có khả năng di chuyển (nhờ có tiên
mao) có xu hướng phát triển từ đường cấy thẳng đứng ra phía thành ống nghiệm.

Mơi trường

+ VSV khơng di động + VSV di động

Sử dụng que cấy thẳng lấy canh trường rồi đưa vào ống nghiệm chứa môi trường thạch đứng
vơ trùng, tại vị trí trung tâm của mặt thạch, rồi đâm sâu xuống đáy ống nghiệm bằng động tác dứt
khoát rồi rút nhanh que cấy khỏi ống nghiệm.
d. Cấy trên thạch hộp
Hộp Petri chứa một lớp mỏng môi trường dinh dưỡng (3 – 5 mm). Nhờ có bề mặt nuôi cấy lớn,
hộp Petri được sử dụng để phân lập vi sinh vật (kỹ thuật yêu cầu tách các vi sinh vật khỏi nhau
và phát triển thành những khuẩn lạc riêng biệt). Tuy nhiên do lớp môi trường mỏng và bề mặt

bay hơi lớn, hộp Petri không được sử dụng để giữ vi sinh vật trong một thời gian dài như canh
trường trong thạch nghiêng.
Khi gieo cấy vi sinh vật lên hộp Petri, có thể sử dụng các cách sau :
+ Sử dụng que cấy vòng (que cấy thẳng sẽ cào xước mặt thạch nên không được sử dụng), cấy
theo bốn đường zigzag ở bốn góc hộp, hoặc theo các đường song song, sao cho mật độ tế bào
vi sinh vật được cấy giảm dần từ góc cấy đầu tiên đến góc cấy cuối cùng. Nếu cần thiết, có thể
cần đốt nóng que cấy để diệt bớt vi sinh vật sau mỗi góc cấy, que cấy vơ trùng sau đó dùng để
kéo vi sinh vật từ góc cấy trước đó sang góc cấy tiếp theo (Streak technique).

+ Khi canh trường được cấy là nấm mốc, có thể sử dụng que cấy móc, lấy canh trường giống rồi
cấy chấm điểm lên 3, 4 hoặc 5 điểm trên môi trường trong hộp Petri thành 3 cạnh của tam giác
đều, 4 đỉnh của hình vng, hoặc 4 đỉnh của hình vng và một điểm tâm hình vng.
8


+ Dùng que trang : khi cấy từ canh trường lỏng sang môi trường thạch trong hộp Petri, dùng
pipette hút một lượng canh trường (50 – 100 µl) lên mặt thạch, rồi dùng que trang vô trùng dàn
đều đến khi mặt thạch se lại.
Canh trường mới được cấy cần được ni trong điều kiện thích hợp (về nhiệt độ, độ ẩm, nồng
độ oxy) một thời gian để vi sinh vật phát triển. Kiểm tra canh trường trước khi cất bảo quản ở
nhiệt độ thấp (4- 10oC).

Phụ lục : Thành phần một số môi trường dinh dưỡng
Môi trường Tryptic Soy Agar
Pancreatic Digest of Casein
Peptic Digest of Soybean Meal
NaCl
Agar
Nước
pH 7.3 ± 0.2

15 g
5g
5g
15 g
1L

Môi trường Czapek
Saccharose
30 g
NaNO3
2g
KCl
0.5 g
KH2PO4
1g
MgSO4
0.5 g
FeSO4
0.01 g
Nước
1L
Môi trường Czapek có thể được bổ sung peptone với hàm lượng 5%
Mơi trường MRS
Proteose peptone
Beef extract
Yeast extract
Dextrose (glucose)
Polysorbate 80
Ammonium citrate

Natri acetate
MgSO4
MnSO4
K2HPO4
Agar
Nước
pH 6.5 ± 0.2

10 g
10 g
5g
20 g
1g
2g
5g
0.1 g
0.05 g
2g
12 g
1L

9


Bài 2: PHÂN LẬP VI SINH VẬT
Vi sinh vật thường tồn tại trong thiên nhiên hoặc trong các vật phẩm nghiên cứu dưới dạng một
hỗn hợp gồm nhiều loại khác nhau. Muốn nghiên cứu hoặc sử dụng vào thực tế bất kỳ loài nào
ta phải phân lập để thu được canh trường chỉ chứa lồi đó. Q trình tách một vi sinh vật ra khỏi
hỗn hợp gọi là phân lập. Tùy mức độ thuần khiết mà người ta phân biệt canh trường tập trung
hay canh trường thuần khiết.

I. Canh trường tập trung
1. Định nghĩa
Canh trường tập trung là canh trường trong đó một lồi (hoặc vài lồi) vi sinh vật xác định chiếm
tỷ lệ cao hơn hẳn về số lượng.
Từ canh trường tập trung ta có thể phân lập canh trường thuần khiết hoặc có thể sử dụng nó
trong sản xuất hoặc thí nghiệm.
2. Phương pháp phân lập canh trường tập trung
Sử dụng môi trường chọn lọc hoặc điều kiện chọn lọc, tức mơi trường hoặc điều kiện chỉ thích
hợp cho một lồi vi sinh vật nhất định, cịn các lồi khác thì khơng thể hoặc khó phát triển.
Để có mơi trường chọn lọc, ta có thể thay đổi thành phần, nguồn các bon, nitơ, độ pH, nhiệt độ
môi trường, lưu lượng khí được cấp. Ví dụ: để tạo canh trường tập trung chỉ chứa những vi sinh
vật có khả năng phân hủy cellulose, môi trường dinh đưỡng dùng để tạo canh trường tập trung
này chỉ chứa cellulose làm nguồn carbon duy nhất, không chứa những thành phần chứa carbon
dễ sử dụng như glucose, saccharose, aminoacids có trong peptone và các sản phẩm thủy phân
của peptone.
Tách vi sinh vật ưa nóng hoặc lạnh bằng cách ni ở nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của
chúng 50-600C hoặc 10-150, để tách các vi sinh vật yếm khí khỏi các vi sinh vật hiếu khí, ta ni
trong điều kiện yếm khí. Tuỳ đặc tính sinh lý của từng lồi mà ta có những mơi trường và điều
kiện chọn lọc khác nhau.
II. Canh trường thuần khiết
1. Định nghĩa
Canh trường thuần khiết là canh trường mà tất cả các vi sinh vật trong đó đều sinh ra từ một tế
bào ban đầu. Việc phân lập canh trường thuần khiết thường thực hiện từ canh trường tập trung.
Nguyên tắc của việc phân lập vi sinh vật tạo canh trường thuần khiết là tách các tế bào ra khỏi
hỗn hợp tế bào trong mẫu vật nghiên cứu, để từ một tế bào riêng biệt đó phát triển thành canh
trường thuần khiết chỉ chứa những tế bào do nó sinh ra. Việc tách tế bào và để tế bào riêng lẻ
đó phát triển thành canh trường thuần khiết được thực hiện bằng một trong những phương pháp
dưới đây.
2. Các phương pháp phân lập canh trường thuần khiết.
a. Phương pháp pha lỗng mơi trường lỏng

Phương pháp này do Pasteur đưa ra đầu tiên, tiến hành như sau:
- Lấy một số ống nghiệm chứa môi trường lỏng đã vô khuẩn
10


- Dùng que cấy hoặc pipette cấy vật phẩm nghiên cứu vào ống nghiệm thứ nhất
- Đánh tan và lắc đều rồi cấy chuyển tiếp sang ống nghiệm thứ hai
- Lặp lại như vậy với ống nghiệm thứ hai, ba, bốn...
Cuối cùng ta có thể thu được ống nghiệm chỉ chứa 1 tế bào duy nhất. Tế bào này sẽ là tổ tiên
cho canh trường thuần khiết.
Phương pháp này đơn giản dễ làm nhưng không phải bao giờ cũng bảo đảm, vì vậy nó thường
được dùng như giai đoạn đầu của các phương pháp phân lập khác.
b. Phương pháp gieo cấy trên môi trường đặc
Nguyên tắc của phương pháp này là tách tế bào trong mẫu vật ra thành từng tế bào riêng lẻ trên
mơi trường đặc, sau đó từ một tế bào phát triển thành khuẩn lạc mọc riêng lẻ. Cách tiến hành
như sau:
- Đem vật phẩm nghiên cứu nghiền nhỏ, hồ tan và pha lỗng dần đến mức độ nhất định trong
các ống nghiệm chứa nước muối sinh lý (0.85%) đã vô trùng. Tuỳ trường hợp mà pha lỗng
nhiều hay ít hoặc khơng pha lỗng. Nói chung nên pha loãng để các tế bào tách rời nhau và khi
gieo cấy các khuẩn lạc mọc tách biệt.

Đem vật phẩm đã pha lỗng cấy trên mơi trường thạch hộp đã vô khuẩn theo một trong các cách
sau:
+ Dùng que cấy vịng cấy cấy như được mơ tả ở bài 1
+ Dùng pipet đưa một lượng canh trường nhất định vào hộp petri, sau đó dùng que trang dàn
đều vật gieo cấy trên mặt thạch hộp, như đã được mô tả ở bài 1
+ Trộn vật gieo cấy vào ống thạch đã vơ trùng và làm nguội đến 450C, sau đó đổ vào hộp Petri.
Phương pháp này, các khuẩn lạc phát triển cả trên bề mặt thạch và trong lớp thạch, có thể áp
11

dụng để phân lập vi sinh vật có nhu cầu oxy thấp. Hạn chế của phương pháp này là không dùng
để phân lập những vi sinh vật nhạy cảm với nhiệt độ.
Trong ba cách trên thì hai cách sau hay dùng vì nó thường cho các khuẩn lạc riêng biệt.
Gieo cấy xong, ni ở điều kiện thích hợp nhất cho loài vi sinh vật định phân lập. Sau 1 - 2 ngày,
đem quan sát và chọn những khuẩn lạc đứng riêng biệt, dùng que cấy lấy một ít vi sinh vật ở
khuẩn lạc riêng biệt cấy chuyền lên ống thạch. Mỗi khuẩn lạc cấy lên một ống. Sau đó ni ở
nhiệt độ thích hợp ta sẽ được canh trường thuần khiết.
- Ưu điểm: Phổ biến, dễ làm, kết quả tương đối đảm bảo.
- Nhược điểm và cách khắc phục: Khuẩn lạc có thể khơng phải phát sinh từ một tế bào ban đầu
mà nhiều tế bào đã dính với nhau từ lúc đầu. Các khuẩn lạc lúc mới mọc thì riêng lẻ nhưng để
để quá thời gian chúng lại dính liền nhau. có thể khắc phục bằng cách phân lập như trên vài lần,
đồng thời làm tiêu bản để kiểm tra sự đồng nhất của khuẩn lạc đã tách.
Khi nuôi vi sinh vật trên đĩa Petri, đĩa Petri được đặt sao cho phần đáy nhỏ chứa thạch hướng
lên trên vì nếu để ở vị trí ngược lại, hơi nước sinh ra trong q trình ni ngưng tụ trên nắp đĩa
Petri rơi xuống bề mặt thạch, có thể làm loang khuẩn lạc ra khắp mặt thạch và khơng cịn là
những khuẩn lạc riêng biệt nữa.
c. Phương pháp tách từng tế bào
Thường dùng để tách các vi sinh vật mà tế bào có kích thước tương đối lớn như nấm men, bào
tử nấm mốc. Có thể thực hiện theo cách sau:
+ Tách từng giọt chỉ chứa một tế bào có kiểm tra bằng kính hiển vi:
+ Pha lỗng canh trường vi sinh vật bằng các ống nghiệm chứa môi trường lỏng vô khuẩn. Pha
loãng đến mức là trong mỗi giọt nhỏ chỉ có một hoặc hai tế bào vi sinh vật.
+ Tách từng tế bào nhờ dụng cụ vi thao tác (micromanipulator)
Micromanipulator là một dụng cụ tương đối phức tạp, làm việc dưới sự kiểm tra trực tiếp qua kính
hiển vi. Nó bao gồm các kim nhỏ, micropipet, giá đỡ và các bộ phận cơ học tinh vi có thể di
chuyển các kim và pipet để lấy riêng ra từng tế bào vi sinh vật trong giọt canh trường rồi đem
nuôi cấy riêng biệt ta sẽ được canh trường thuần khiết.
Ưu điểm: Phương pháp này tương đối nhanh chóng, chính xác nhưng đòi hỏi cẩn thận, khéo léo.
III. Phân lập vi sinh vật yếm khí

1. Có thể phân lập theo các phương pháp trên rồi ni ở điều kiện yếm khí.
2. Dùng pipet Pasteur
- Pha loãng vật phẩm nghiên cứu đến mức độ nhất định
- Lấy một giọt của canh trường pha loãng cuối cùng cho vào ống thạch (đã đun chảy trước và
làm nguội đến 45 – 500C lắc đều.
- Hút một ít mơi trường đã trộn vi sinh vật nói trên vào pipet Pasteur rồi dùng đèn cồn hàn kín đầu
nhỏ của pipet, để vào tủ ấm có nhiệt độ thích hợp
12


- Sau 1 - 2 ngày các khuẩn lạc của vi sinh vật sẽ mọc trong ống thạch
- Lấy pipet ra, đánh vỡ và lấy các cục thạch có khuẩn lạc riêng biệt cho vào mơi trường ni cấy
thích hợp.
Động tác này phải tiến hành trong điều kiện hoàn toàn vơ trùng, ngồi ra, để nhận biết vùng có
vi sinh vật yếm khí phát triển người ta thêm vào ống thạch 0,2% indigocacmin. Những vùng có vi
sinh vật phát triển indigocacmin bị khử và chuyển thành màu vàng.
3. Dùng hộp petri lộn ngược
- Pha loãng rồi cho vào ống thạch như trên
- Lắc đều rồi đổ ra hộp petri và đậy ngược đáy nhỏ của hộp lên lớp thạch, sau đó dùng paraphin
bơi xung quanh mép hộp. (Hộp petri đã vô trùng và đặt lộn ngược trước).
- Đặt vào tủ ấm, sau 1 - 2 ngày lấy ra và tách thạch có khuẩn lạc đem cấy vào mơi trường thích
hợp

13


Bài 3 – 4 – 6. ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT
Định nghĩa: Định lượng vi sinh vật là xác định số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên cứu.
Có hai nhóm phương pháp dùng để định lượng vi sinh vật: định lượng trực tiếp và định lượng
gián tiếp.

I. Định lượng trực tiếp
Định nghĩa: Định lượng trực tiếp là những phương pháp đếm trực tiếp số tế bào vi sinh vật có
trên tiêu bản làm từ vật phẩm nghiên cứu
Ưu điểm: Cho kết quả nhanh chóng
Nhược điểm: Kém chính xác vì khi đếm nhữ vậy ta đếm cả những tế bào đã chết trước lúc làm
tiêu bản.
Các phương pháp định lượng trực tiếp
1. Phương pháp dùng buồng đếm hồng cầu
Phạm vi sử dụng: thường dùng để đếm vi sinh vật mà tế bào có kích thước lớn như nấm men,
bào tử nấm mốc.
Mô tả buồng đếm hồng cầu: Đó là một phiến kính dày có đục bốn rãnh chia thành ba khoang
ngang, khoang giữa thấp hơn hai khoang bên 0,1 mm và được chia thành hai khoang nhỏ nhờ
một rãnh dọc; trên mỗi khoang nhỏ này có kẻ một lưới đếm gồm nhiều ô vuông lớn, một số ô
vuông lớn lại được chia thành các ô vuông nhỏ (thường là 16) có cạnh dài 1/20 mm. diện tích
1/400 mm2; nếu chiều cao 0,1 mm thì thể tích là 1/4000 mm3. Mỗi buồng đếm có kèm theo một
lá kính.

Cấu tạo của buồng đếm hồng cầu và kích thước của lưới đếm

14


Cách tiến hành:
- Lắc đều canh trường, dùng pipet chia độ pha loãng canh trường (với H2SO4 10% hoặc NaOH
10%), tùy canh trường mà mức độ pha loãng nhiều hay ít (10, 100...lần)
- Dùng bông thấm nước, tẩm nước cất và phết nhẹ lên hai khoang bên của buồng đếm, đặt lá
kính lên rồi dùng ngón tay ấn nhẹ cho lá kính dính chặt vào phiến kính.
- Dùng pipet lấy canh trường đã pha loãng cho canh trường chảy từ từ vào khoảng trống giữa
lưới đếm và lá kính (nên bỏ đi vài giọt đầu).
Chú ý không để canh trường tràn ra ngoài khoang đếm, rơi xuống các rãnh và tránh tạo thành

bọt khí.
- Đặt buồng đếm lên khay kính, để yên trong 3 - 5 phút rồi tiến hành đếm trong 5 ô lớn chéo nhau
tức là 80 ô vng nhỏ. Hoặc có thể đếm 4 ơ vng lớn tức là 100 ô vuông nhỏ (chú ý chọn mỗi
ô ở vị trí khác nhau). Tính số tế bào trung bình trong mỗi ơ.
Chú ý:
- Cần làm lặp lại 3-4 lần
- Với những tế bào nằm trên đường gạch thì chỉ đếm những tế bào có hơn 1/2 phần nằm trong
ô đang đếm.
- Trước và sau khi dùng, buồng đếm và lá kính phải được rửa kỹ bằng nước cất rồi dùng bông
lau sạch để khô.
- Khi số tế bào trong một ô lớn nằm trong khoảng 25 – 250 thì độ pha lỗng canh trường là hợp
lý.
Tính tốn:
Số tế bào trong 1 ml canh trường là:
trong đó:

𝑎 ×1000 ×𝑓
ℎ ×𝑆

a là số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ
f là hệ số pha loãng của canh trường
h là bề sâu của lưới đếm
S là diện tích một ô nhỏ

1000 là hệ số chuyển đổi 1ml = 1000 mm3.
2. Phương pháp Brit
Phạm vi sử dụng: Phương pháp này dùng để định lượng vi sinh vật có trong sữa hay một số
vật phẩm lỏng.
Cách tiến hành:
- Đo đường kính kính trường của hệ thống kính định dùng khi quan sát.

15


- Dùng micropipet đã vơ trùng lấy chính xác 0,01 ml vật phẩm nghiên cứu. Cho dàn đều lên phiến
kính sạch với diện tích nhất định (2 - 4 cm2).
- Để khô, cố định và nhuộm đơn bằng xanh metylen.
- Để khơ và quan sát dưới kính hiển vi. Đếm số tế bào trong 5 - 10 kính trường, lấy trung bình rồi
suy ra số tế bào trên một đơn vị diện tích vết bơi và cuối cùng là số tế bào trong một đơn vị vật
phẩm nghiên cứu.
3. Phương pháp Vinogratxki - Sungina
Phạm vi sử dụng: Phương pháp này thường dùng để định lượng vi sinh vật trong đất hay vật
phẩm đặc, rắn.
Cách tiến hành:
- Cân một lượng nhất định (1g hay 5g) vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ trong cối thủy tinh rồi
chuyển tất cả vào bình định mức 100 ml, thêm nước đến vạch. Lắc đều trong 5 phút và để yên
trong 1 - 2 giây.
- Dùng micropipet đã vơ trùng lấy chính xác 0,01 ml hỗn dịch đã chuẩn bị dàn đều trên một diện
tích nhất định của phiến kính sạch (4 - 8 cm2). để tránh vi sinh vật dồn lại đầu pipet, động tác này
phải làm nhanh, lượng hỗn dịch hút vào pipet không nên nhiều quá và lúc chưa dàn kịp thì phải
giữ pipet ở vị trí nằm ngang.
- Để khơ rồi đổ lên vết bơi một lớp thạch mỏng, lỗng (0,1%). Lại để khô và cố định bằng cồn
tuyệt đối trong 5 phút.
- Nhuộm bằng dung dịch eritrozinphenol từ 0,5 - 3 giờ. Trong quá trình nhuộm phải theo dõi để
thuốc nhuộm trên vết bôi không bị khô đi.
- Rửa sạch, để khơ và đem quan sát bằng vật kính dầu. Cách đếm và tính kết quả gần giống như
phương pháp Brit.
II. Định lượng gián tiếp
Định nghĩa: Định lượng gián tiếp là những phương pháp định lượng vi sinh vật bằng cách gieo
cấy một lượng nhất định vật phẩm nghiên cứu lên mơi trường thức ăn thích hợp, ni trong 36 48 giờ, sau đó đếm số khuẩn lạc rồi suy ra số tế bào có trong một đơn vị vật phẩm ban đầu.

Ưu điểm: Chỉ đếm những tế bào vi sinh vật cịn sống nên kết quả chính xác hơn
Nhược điểm:
- Tốn thời gian, công sức
- Khi cấy từ các vật phẩm pha lỗng chênh nhau 10 lần khơng bao giờ thấy số khuẩn lạc chênh
nhau 10 lần; vì thế để kết quả kiểm tra vi sinh vật có giá trị so sánh tốt nên sử dụng một độ pha
loãng thống nhất đối với từng loại vật phẩm.
- Đối với những vi sinh vật mà bào tử thường dính chặt với nhau thành từng chuỗi, từng đơi, từng
khối thì khi phát triển trên mơi trường, mỗi chuỗi, mỗi khối đó chỉ tạo thành một khuẩn lạc. Vì thế,
số khuẩn lạc chưa phản ánh được chính xác số tế bào vi sinh vật có trong vật phẩm nghiên cớu.

16


- Khơng có loại mơi trường dinh dưỡng nào cho phép tất cả các nhóm vi sinh vật cùng phát triển.
1. Phương pháp đếm số khuẩn lạc phát triển trên môi trường thạch
Nguyên tắc: Gieo cấy một lượng vật phẩm nhất định lên môi trường đặc trong hộp Petri, nuôi ở
nhiệt độ thích hợp. Sau đó đếm số khuẩn lạc mọc lên rồi suy ra kết quả.
Cách tiến hành:
+ Đối với vật phẩm nghiên cứu lỏng tiến hành pha loãng theo tỷ lệ 1/10 như phương pháp pha
loãng Pasteur.
+ Đối với vật phẩm nghiên cứu đặc hoặc rắn trước tiên cần chuyển thành dạng lỏng bằng cách:
Cân 1 g vật phẩm nghiên cứu, nghiền nhỏ rồi chuyển tất cả vào bình tam giác dung tích 250 ml
đã chứa sẵn 99 ml nước vô trùng. Lắc đều trong 5 phút, để lắng trong 30 giây rồi tiếp tục pha
loãng như trên.
+ Gieo cấy một lượng vật phẩm nghiên cứu nhất định (0,1 ml) từ ống nghiệm pha loãng cuối cùng
lên hộp petri đã chứa sẵn môi trường vô trùng.
+ Nuôi ở nhiệt độ thích hợp để vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc.
+ Đọc kết quả
- Nếu số khuẩn lạc không nhiều lắm ta đếm trực tiếp tất cả các khuẩn lạc có trong hộp
- Nếu số khuẩn lạc nhiều q ta dùng kính đếm Lafa. đó là một tấm kính hình vng có kích

thước 15 x 15 cm. Mặt kính được chia ra thành những ơ có diện tích bằng nhau (1 cm2). Đếm số
khuẩn lạc trên 5 - 10 ơ. Lấy trung bình cho 1 ơ (ký hiệu là a tế bào). Đếm xong đo đường kính
trong của đáy hộp (ký hiệu là D). Suy ra số khuẩn lạc trong toàn hộp là a x D2/4.
+ Để các giá trị tính tốn có ý nghĩa về xác suất thống kê, các đĩa thạnh có số lượng khuẩn lạc
nằm trong khoảng 30 – 300 được dùng để tính tốn mật độ vi sinh vật trong mẫu vật ban đầu
2. Định lượng vi sinh vật trong khơng khí bằng phương pháp lắng của Omelianxki
Nguyên tắc: Theo Omelianxki ước tính: trên một diện tích rộng 100 cm2, mở ra trong 5 phút thì
lượng vi sinh vật rơI xuống tương đương với lượng vi sinh vật có trong 10 lít khơng khí.
Ưu điểm: Đây là phương pháp đơn giản nhất thường dùng.
Nhược điểm: Khơng thật chính xác vì dựa trên cách ước tính.
Cách tiến hành: Đặt hộp petri có mơi trường đặc đã vơ trùng ra chỗ khơng khí định nghiên cứu.
Mở nắp hộp trong thời gian xác đinh (thường là 5 phút) rồi đậy nắp hộp và để vào tủ ấm. Sau 24
– 48 giờ đem ra, đếm số khuẩn lạc.
Tính tốn: Đo đường kính hộp petri (D cm) để tính diện tích (D2/4) rồi suy ra lượng vi sinh vật
trong 1 lít hay 1 m3 khơng khí theo ước tính của Omelianxki.
Ngồi ra cịn có thể ước tính như sau: Hộp petri có diện tích 60 cm2. Sau 1 giờ sẽ có một lượng
vi sinh vật lắng xuống bằng lượng vi sinh vật có trong 6 lít khơng khí.

17


3. Định lượng nhóm vi khuẩn Coliform trong mẫu nước tự nhiên bằng phương pháp nhiều
ống (số có xác suất lớn nhất) (MPN – Most Probable Number)
Cơ sở lý thuyết:
Nước tự nhiên (sông, hồ) là môi trường sống của nhiều loài vi sinh vật khác nhau như tảo, động
vật nguyên sinh, vi khuẩn quang hợp, vi khuẩn dị dưỡng, v.v. Nước tự nhiên có thể bị ơ nhiễm
phân (faecal contamination) bằng nhiều con đường khác nhau, trong đó có việc tiếp nhận nước
thải sinh hoạt chưa qua xử lý, sẽ trở nên đặc biệt nguy hiểm nếu được sử dụng làm nước sinh
hoạt hoặc dành cho các hoạt động thể dục thể thao. Để đánh giá sự ô nhiễm phân của nước tự
nhiên, việc xác định sự có mặt của vi sinh vật chỉ thị được tiến hành. Coliform được xem là vi

sinh vật chỉ thị ô nhiễm phân do: (1) chúng thường khơng có mặt trong mơi trường nước tự nhiên,
môi trường sống tự nhiên của chúng là hệ đường ruột của động vật máu nóng, trong đó có con
người, (2) Chúng có khả năng sống lâu trong mơi trường nước tự nhiên hơn các loài vi sinh vật
khác có nguồn gốc từ đường ruột, (3) đa số các chủng coliform không phải là vi sinh vật gây
bệnh, và (4) việc phát hiện chúng bằng kỹ thuật nuôi cấy khá đơn giản. Coliform là nhóm các vi
khuẩn hiếu khí tùy tiện, Gram âm, hình que, khơng sinh bào tử, và có khả năng lên men lactose
sinh ra acid và giải phóng khí ở 35°C sau 48h.
Việc xác định sự có mặt của coliform trong mẫu nước phải trải qua ba xét nghiệm: (1) thí nghiệm
giả định, (2) thí nghiệm xác nhận, và (3) thí nghiệm hồn thành.
+ Thí nghiệm giả định (presumed test): cấy mẫu nước vào môi trường lactose để xác định sự
có mặt của vi khuẩn coliform có khả năng lên men lactose sinh acid và khí sau 48h ở nhiệt độ
35°C.
+ Thí nghiệm xác nhận (confirmed test): canh trường trong ống dương tính ở thí nghiệm giả
định được cấy chuyển sang môi trường chọn lọc đặc hiệu cho vi khuẩn Gram âm (ví dụ: mơi
trường thạch Eosin Methylene Blue - EMB) để xác nhận việc lên men sinh khí khơng phải do vi
khuẩn Gram dương (những lồi cũng có khả năng lên men sinh khí như Clostridium và Bacillus).
+ Thí nghiệm hồn thành (completed test): Các khuẩn lạc phát triển trên mơi trường ở thí
nghiệm xác nhận sẽ được kiểm tra đặc tính hình thái kỹ hơn để xác định chúng có phải vi khuẩn
Gram âm, hình que, và khơng sinh bào tử (đặc điểm của vi khuẩn coliform).
Trong bài thí nghiệm này, thí nghiệm giả định được tiến hành để định lượng vi khuẩn lên men
lactose sinh khí bằng phương pháp số có xác suất lớn nhất (MPN-Most Probable Number).
Phương pháp MPN xác định sự có mặt của vi khuẩn lên men lactose sinh khí dựa vào việc cấy
mẫu nước với thể tích giảm dần theo hệ số 10 vào tổ hợp 3-5 ống chứa môi trường dinh dưỡng
chứa lactose, số lượng ống cho kết quả dương tính được xác định và đối chiếu với bảng tính
thống kê tiêu chuẩn. MPN cũng có thể được sử dụng để định lượng các loại vi sinh vật khác trong
các mẫu môi trường khác nhau, phương pháp này có ưu điểm so với phương pháp đếm trực tiếp
hoặc phương pháp đo quang là các thành phần rắn lơ lửng không ảnh hưởng đến kết quả định
lượng.
Nguyên liệu và dụng cụ:
Mẫu nước

Môi trường lỏng lactose nồng độ kép: 30 mL
18


Môi trường lỏng lactose nồng độ đơn: 60 mL
Môi trường được chứa trong các ống nghiệm có sẵn ống Durham úp ngược để thu khí
sinh ra trong q trình lên men lactose
Quy trình thí nghiệm
Chuẩn bị mơi trường
Mơi trường lỏng lactose: môi trường được chuẩn bị ở nồng độ đơn và nồng độ kép theo công
thức sau
Bảng 1. Thành phần mơi trường
Thành phần
Nồng độ kép
Nồng độ đơn
Peptone
10g
5g
Lactose
10g
5g
Cao thịt bị
6g
3g
Nước
1000 mL
1000 mL
pH được điều chỉnh đến 6.8 ± 0.2, phân phối vào các ống nghiệm có chứa sẵn ống Durham úp
ngược theo hướng dẫn trong bảng sau:
Bảng 2. Phân phối môi trường vào các ống nghiệm

Tổ hợp ống
F1
F2
F3

Môi trường
Nồng độ kép
Nồng độ đơn
Nồng độ đơn

Thể tích phân phối
10 mL
10 mL
10 mL

Số lượng ống
3
3
3

Các ống chứa mơi trường được đóng nắp, khử trùng ở nhiệt độ 115°C trong 40 phút.
Lấy mẫu:
Các mẫu nước cần xác định số lượng vi sinh vật bằng phương pháp MPN được thu thập theo
tiêu chuẩn Việt Nam hoặc quốc tế (WHO – World Health Organization) về lấy mẫu nước. Nước
được chứa trong các bình được khử trùng trước, có nắp kín, vận chuyển về phịng thí nghiệm và
lưu giữ trong tủ lạnh cho đến khi phân tích. Tùy vào loại nước và mức độ ô nhiễm dự đốn của
nước mà chúng được pha lỗng khác nhau trước khi được cấy vào môi trường nuôi cấy.
Cấy mẫu:
Trước khi cấy vào mơi trường vơ trùng, bình chứa mẫu nước được lắc đều để đảm bảo vi sinh
vật phân bố đồng đều.

Dùng pipette 10 mL cấy 10 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ
hợp 3 ống F1.
Dùng micropipette cấy 1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp
3 ống F2.
Dùng micropipette cấy 0.1 mL mẫu nước cần kiểm tra vào mỗi ống chứa môi trường trong tổ hợp
3 ống F3.

19


Nuôi các ống đã cấy mẫu nước trong tủ ấm 35oC trong 48h.

Sơ đồ pha loãng và cấy mẫu nước vào các tổ hợp ống chứa môi trường lactose
Kiểm tra kết quả và xác định mật độ vi khuẩn coliform trong mẫu nước:
Sau 48h, kiểm tra số lượng các ống dương tính trong mỗi tổ hợp ống. Các ống được coi là dương
tính nếu ít nhất 3 mm khí được quan sát trong ống Durham. Ghi lại số lượng ống dương tính
trong mỗi tổ hợp ống, ta có bộ gồm 3 số. Ví dụ: nếu số ống dương tính trong tổ hợp F1 là 3, tổ
hợp ống F2 là 2 và tổ hợp ống F3 là 2, ta có bộ ba số 3-2-2.
Đối chiếu bộ số này với bảng thống kê MPN tiêu chuẩn sau đây, giá trị MPN trên 100 mL nước
sẽ được xác định. Nếu mẫu nước được pha loãng trước khi cấy mẫu, giá trị MPN của mẫu nước
thu thập sẽ được tính tốn dựa vào hệ số pha loãng ban đầu.
Bảng 3. Giá trị MPN trên 100 mL nước và giới hạn độ tin cậy 95% khi bộ ba ống được cấy
với 10 mL, 1 mL, và 0.1 mL mẫu nước
Số lượng ống cho kết quả dương tính
3 ống cấy
10 mL
0
0
0
1

1
1
1
2

3 ống cấy
1 mL
0
1
0
0
1
1
2
0

3 ống cấy
0.1 mL
1
0
0
1
0
1
0
0

MPN/100 mL
3
3

4
7
7
11
11
9

Giới hạn MPN ở độ tin cậy
95%
Dưới

Trên

<1
<1
<1
1
1
3
3
1

9
13
20
21
23
36
36
36

20