Nghiên cứu sản xuất cây giống hương thảo (rosmarinus officinalist l ) bằng kỹ thuật nuôi cấy mô

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ MỸ NHUNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG
HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Đà Nẵng – 2022


ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐINH THỊ MỸ NHUNG

NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CÂY GIỐNG
HƯƠNG THẢO (Rosmarinus officinalist L.)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 8420114

Người hướng dẫn khoa học: TS. Võ Châu Tuấn

Đà Nẵng – 2022

i

LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này, tơi xin chân thành cảm ơn đến thầy
TS. Võ Châu Tuấn, đã hướng dẫn tơi trong suốt q trình làm luận văn. Tôi
cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy, Cô trường Đại học Sư phạm – Đại học
Đà Nẵng đã giảng dạy cho tôi nhiều kiến thức cũng như kinh nghiệm nghiên
cứu quý báu..
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè đã ln động
viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tơi hồn thành q trình học tập và
nghiên cứu.
Đà Nẵng, tháng 6 năm 2022

Đinh Thị Mỹ Nhung


11

LOI CAM DOAN
Toi cam doan day la cong trinh nghien cuu duqc chinh toi thl_rc hi�n duoi
slJ huong d�n cua TS. Vo Chau Tu�n.
Cac s6 li�u, kSt qua neu trong lu�n van la trung thvc va chua tung duqc ai
cong b6 trong b�t ky cong trinh nao khac.
Da Nfmg, thcing 6 nam 2022
H9c vien

E>inh Thi My Nhung

v

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Tính cấp thiết của đề tài ........................................................................ 1
2. Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................. 2
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .............................................. 2
4. Bố cục đề tài .......................................................................................... 3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 4
1.1. Giới thiệu về cây hương thảo . ................................................................... 4
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây hương thảo ............................................ 4
1.1.2. Giá trị sử dụng cây hương thảo ......................................................... 5
1.1.3. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây hương thảo ...... 7
1.2. Nghiên cứu nhân giống in vitro ở thực vật ................................................ 9
1.2.1. Cở sở khoa học nhân giống in vitro .................................................. 9
1.2.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro ................................................... 11
1.2.3. Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro.................................... 13
1.2.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống in vitro ................. 14
1.3. Tình hình nghiên cứu về cây hương thảo................................................. 18
1.3.1. Nghiên cứu ở Việt Nam .................................................................. 18
1.3.2. Nghiên cứu trên Thế Giới ............................................................... 19
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 21
2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 21
2.2. Phạm vi nghiên cứu .................................................................................. 21
2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 22
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 22

2.4.1. Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ đoạn thân ....... 23


vi

2.4.2. Phương pháp nhân chồi in vitro cây hương thảo từ protocorm.......... 23
2.4.3. Phương pháp tạo rễ in vitro cây hương thảo ................................... 23
2.4.4. Phương pháp tạo cây giống hương thảo ngồi vườn ươm .............. 24
2.4.5. Phương pháp xử lí số liệu ............................................................... 25
3.1. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi từ đoạn thân cây
hương thảo in vitro .......................................................................................... 26
3.1.1. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân
......................................................................................................................... 26
3.1.2. Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân
......................................................................................................................... 29
3.1.3. Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi in vitro từ
đoạn thân ......................................................................................................... 31
3.1.4. Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân chồi in vitro từ đoạn thân
......................................................................................................................... 32
3.2. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng nhân chồi in vitro từ protocorm
......................................................................................................................... 35
3.2.1. Ảnh hưởng của BA đến khả năng nhân chồi từ protocorm ............ 35
3.2.2. Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vtro từ protocorm37
3.3. Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo rễ in vitro cây hương thảo
......................................................................................................................... 38
3.3.1. Ảnh hưởng của IBA đến sự tạo rễ in vitro hương thảo .................. 39
3.3.2. Ảnh hưởng của NAA đến sự tạo rễ in vitro .................................... 40
3.4. Ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng sống sót và sinh trưởng của cây
in vitro trong điều kiện vườn ươm .................................................................. 41
3.4.1. Ảnh hưởng của thời gian thích nghi đến khả năng sống sót của cây

in vitro ............................................................................................................. 42


vii

3.4.2. Ảnh hưởng của loại giá thể trồng đến khả năng sinh trưởng của cây
in vitro ............................................................................................................. 43
3.4.3. Ảnh hưởng của lượng nước tưới đến khả năng sinh trưởng của cây
in vitro ............................................................................................................. 45
3.4.4. Ảnh hưởng của che sáng đến khả năng sinh trưởng của cây in vitro
......................................................................................................................... 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 52


viii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ĐHST

: điều hòa sinh trưởng

MS

: Murashige và Skoog (1962)

TDZ

: thidiazuron

KIN

: kinetin

BAP

: benzylaminopurine

NAA

: naphthalene axit axetic

IBA

: auxin Indole - 3 - butyric acid

PBLs:

: protocorm like body


ix

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Số hiệu

Tên hình

Trang

Hình 2.1

Cây hương thảo

21

Hình 2.2

Sơ đồ thí nghiệm

22

Hình 3.1

Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên mơi trường MS có bổ
sung 1,5 mg/L BAP sau 2 tháng ni cấy

27

Hình 3.2

Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên mơi trường MS có bổ
sung 0,75 mg/L KIN sau 2 tháng ni cấy

30

Hình 3.3

Cụm chồi in vitro sinh trưởng trên mơi trường MS có bổ
sung 1,5 mg/L BAP và 0,5 NAA sau 2 tháng ni cấy

32

Hình 3.4

Chồi in vitro và thể protocorm sinh trưởng trên các mơi
trường có 1 mg/L TDZ sau 2 tháng ni cấy.

33

Hình 3.5

Chồi in vitro hình thành từ protocorm sau 6 tuần nuôi cấy
trên môi trường MS có bổ sung 1,5 mg/L BAP

36

Hình 3.6

Chồi in vitro hình thành từ protocorm sau 8 tuần ni cấy
trên mơi trường MS có bổ sung 1,0 mg/L KIN

38

Hình 3.7

Chồi in vitro hình thành rễ sau 4 tuần ni cấy trên mơi
trường MS có bổ sung 1,0 mg/L IBA

40

Hình 3.8

Chồi in vitro hình thành rễ sau 4 tuần ni cấy trên mơi
trường MS có bổ sung 0,5 mg/L NAA

41

Hình 3.9

Sinh trưởng của cây con hương thảo nuôi cây mô trồng
trên cơ chất Xơ dừa: đất cát: phân chuồng hoai mục (1:1:1)
trong vườn ươm sau 2 tháng

45

Hình 3.1.

Sinh trưởng sau 2 tháng của cây con hương thảo in vitro
trong vườn ươm, tưới phun sương 2 lần/ngày

47

Hình 3.1

Sinh trưởng của cây con hương thảo nuôi cây mô được
ươm trồng độ che sáng 30%; trong vườn ươm sau 2 tháng

48

x

DANH MỤC BẢNG
Số hiệu

Tên bảng

Trang

Bảng 3.1

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ
đoạn thân có mắt lá

27

Bảng 3.2

Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro từ
đoạn thân có mắt lá

29

Bảng 3.3

Ảnh hưởng của BAP và NAA đến khả năng nhân chồi in
vitro từ đoạn thân có mắt lá

31

Bảng 3.4

Ảnh hưởng của TDZ đến khả năng nhân chồi in vitro từ
đoạn thân có mắt lá

33

Bảng 3.5

Ảnh hưởng của BAP đến khả năng nhân chồi in vitro từ
protocorm

35

Bảng 3.6

Ảnh hưởng của KIN đến khả năng nhân chồi in vitro từ
protocorm sau 8 tuần nuôi cấy

37

Bảng 3.7

Ảnh hưởng của IBA đến khả năng tạo rễ in vitro

39

Bảng 3.8

Ảnh hưởng của NAA đến khả năng tạo rễ in vitro

40

Bảng 3.9

Ảnh hưởng của thời gian thích nghi đến khả năng sống
sót của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

42

Bảng 3.10

Ảnh hưởng của giá thể trồng đến khả năng sinh trưởng
của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

44

Bảng 3.11

Ảnh hưởng của chế độ nước tưới đến khả năng sinh
trưởng của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

46

Bảng 3.12

Ảnh hưởng của độ che sáng đến khả năng sinh trưởng
của cây in vitro trồng trong điều kiên vườn ươm

48


1

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Hiện nay, nhu cầu thị trường về cây thuốc và cây cảnh đang gia tăng.
Người tiêu dùng đang hướng đến các sản phẩm có giá trị dinh dưỡng, dược
liệu cao để nâng cao sức khỏe. Bên cạnh những cây có giá trị về làm thuốc,
thì cây cảnh có mùi hương thơm, tạo cảm giác thoải mái cho người sử dụng
đang rất được ưa chuộng.
Cây hương thảo (Rosmarinus officinalis L.) là một loài thực vật có hoa
thuộc họ Hoa mơi, có nguồn gốc từ vùng Địa Trung Hải. Đây là một loại cây
được dùng thường xuyên trong cảnh quan và các ngành công nghiệp thực
phẩm, dược phẩm (Mehrabani và cs, 2016). Khi trồng, cây tỏa ra mùi hương
thơm ngát, dễ chịu, khuếch tán rộng trong khơng khí. Mùi hương của cây
hương thảo giúp con người có tinh thần thoải mái, giải tỏa căng thẳng. Ngồi
ra, cây cịn được sử dụng trong sản xuất nước hoa, dược liệu và là một loại
gia vị, chất chống oxy hóa trong chế biến thực phẩm (Dellacassa và cs, 1999;
Porte và cs, 2000). Tinh dầu của cây hương thảo hỗ trợ tăng cường tuần hồn
máu, giúp máu lưu thơng tốt và cải thiện trí nhớ.
Tại Việt Nam, cây hương thảo là một loài cây mới được nhập nội và trồng
ở một số tỉnh của miền Trung và miền Nam. Nguồn cây giống đang được
trồng tại Việt Nam chủ yếu từ hạt, tỉ lệ nảy mầm rất thấp (10 - 20%) (Kiuru
và cs, 2015) và phải nhập khẩu nên giá thành cao. Bên cạnh đó, cây giống
hương thảo cũng được sản xuất giâm cành (Mehrabani và cs, 2016). Tuy
nhiên, giâm cành hương thảo cho hệ số nhân giống thấp, số lượng cây giống ít
và cây giống có chất lượng khơng cao. Vì vậy vấn đề cần thiết đang đặt ra là
phải tìm ra phương thức sản xuất cây giống hương thảo hữu hiệu hơn để có

thể sản xuất cây hương thảo trên quy mô lớn nhằm đáp ứng nhu cầu ngày


2

càng cao về nguồn dược phẩm, hương liệu và cây cảnh từ loài cây này.
Việc ứng dụng các tiến bộ khoa học kĩ thuật nhằm duy trì sự đa dạng và
phát triển bền vững các loài cây đã được thực hiện từ nhiều năm nay ở các
nước. Công nghệ sinh học thực vật là một công cụ rất quan trọng trong nhân
giống và phát triển nhiều lồi cây trồng có giá trị kinh tế cao. Công nghệ nuôi
cấy mô và tế bào thực vật được xem là phương thức có tiềm năng nhất để
chọn lựa, nhân nhanh, bảo tồn và phát triển các loại cây trồng có giá trị tại
Việt Nam.Trong những năm qua, nhu cầu về cây hương thảo sử dụng trong
dược liệu và cây cảnh ngày càng cao, tuy nhiên việc nghiên cứu để sản xuất
cây giống hầu như chưa được quan tâm đúng mức.
Xuất phát từ các cơ sở trên đây, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
Nghiên cứu sản xuất cây giống hương thảo (Rosmarinus officinalis L.)
bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.
2. Mục tiêu nghiên cứu
2.1. Mục tiêu tổng quát
Xây dựng được quy trình sản xuất cây giống hương thảo nuôi cấy mô
với hệ số nhân cao, chất lượng cây giống tốt.
2.2. Mục tiêu cụ thể
- Xác định được loại và nồng độ chất ĐHST thích hợp cho nhân nhanh
chồi, tạo rễ in vitro cây hương thảo.
- Xác định được điều kiện thích hợp để ươm trồng, tạo cây giống
hương thảo nuôi cấy mô trong vườn ươm.
3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài
3.1. Ý nghĩa khoa học
- Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp những dẫn liệu khoa học về

sản xuất cây giống hương thảo ni cấy mơ, góp phần làm phong phú hơn cơ


3

sở dữ liệu về kĩ thuật nhân giống để phát triển cây dược liệu và cây cảnh.
- Là nguồn tài liệu tham khảo có giá trị cho cơng tác giảng dạy, học tập
và nghiên cứu khoa học trong lĩnh vực công nghệ sinh học, sinh học, nông
nghiệp.
3.2. Ý nghĩa thực tiễn
- Kết quả nghiên cứu của đề tài là cơ sở để chủ động sản xuất nhanh,
liên tục cây giống hương thảo có chất lượng tốt, giá thành rẻ.
- Kết quả nghiên cứu là cơ sở cho việc chủ động mở rộng sản xuất cây
hương thảo trong tự nhiên, đáp ứng kịp thời và đầy đủ yêu cầu phát triển các
sản phẩm làm thuốc, thực phẩm và trang trí ở Việt Nam.
4. Bố cục đề tài
Luận văn gồm 3 chương:
Chương 1. Tổng quan tài liệu
Chương 2. Đối tượng, nội dung và phương pháp nghiên cứu
Chương 3. Kết quả nghiên cứu và thảo luận


4

Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu về cây hương thảo
1.1.1. Đặc điểm sinh học của cây hương thảo
Hương thảo, cái tên Rosmarinus được đặt theo tiếng Latin, trong đó
Ros nghĩa là sương, marinus có nghĩa là biển, gọi đầy đủ là Sương của biển, ý

nói về nguồn gốc của loại cây này là trên bờ biển vùng Địa Trung Hải. Sau
này cây được trồng nhiều ở Bắc Phi, Tây Á và Nam châu Âu. Ở nước ta được
trồng nhiều ởmiền Nam và miền Trung. Khi trồng hương thảo tỏa ra mùi
hương thơm ngát, mùi tinh dầu cực thơm và dễ chịu. Mùi thơm của hương
thảo có thể khuyếch tán trong phòng rộng 15 m2 vẫn ngửi thấy. Mùi thơm cây
hương thảo có thể giúp tinh thần thoải mái, giải tỏa stress nhanh nhất, giúp
chống buồn ngủ đối với nhân viên văn phòng hoặc đối với phụ nữ sau sinh
con thì tinh dầu của hương thảo sẽ làm cho các mẹ thấy thoải mái thư giãn
hơn khi chăm sóc con nhỏ và gia đình.
Theo Kohler (1887) trong cuốn cây cỏ làm thuốc: Cây hương thảo xuất
xứ từ vùng Địa Trung Hải, là dạng cây thân gỗ, thẳng đứng có phân cành,
chiều cao cây có thể đạt từ 1,5 – 2 m. Lá thường màu xanh ở trên, phần dưới
lá trắng giống như có lớp phấn lốm đốm bao phủ, chiều dài lá 2 – 4 cm và
rộng 2 – 5 mm. Hoa có màu trắng, hồng, tím hoặc màu xanh. Hương thảo
mọc thành bụi, lá kim và xung quanh năm thưởng nở hoa vào 2 mùa xuân và
hạ. Hương thảo nở hoa nhỏ li ti màu tim tím, xinh xắn nhẹ nhàng như tên gọi
“hương thảo”. Cây thuộc họ bạc hà, mùi thơm thoang thoảng hương cay.
Cây hương thảo dễ dàng trồng và chăm sóc. Đất trồng hương thảo địi
hỏi phải tơi xốp, thoáng nước, tốt nhất là trồng trên đất cát pha. Cây thích hợp
trồng ở nơi có nhiều ánh sáng (ít nhất phải 6 – 8 giờ có ánh sáng mặt trời),


5

phát triển mạnh trong môi trưởng ẩm, không thể chịu được nhiệt độ quá lạnh
(hương thảo không thể chịu được mùa đơng dưới -10C). Cây có khả năng
chịu hạn nhưng khơng chịu được úng nước.
Ngồi ra hương thảo mới trồng cần được tưới nước thường xuyên trong
tuần đầu tiên hoặc tuần thứ 2 để giúp nó phát triển, nhưng sau khi đã thích
nghi cây cần được tưới ít nước hơn. trong giai đoạn phát triển cây có thể chịu

được điều kiện khô hạn trong thời gian dài. Cây thường bị thối rễ và sẽ chết
trong môi trường quá ẩm ướt. Do đó, những nơi trồng hương thảo người ta
thường chọn cách trồng cây trong các thùng, khay hoặc chậu. Cây trồng trên
các vật dụng này có thể đặt cách mặt đất một khoảng khơng gian để cây có
thể thốt nước nhanh khi tưới, khơng duy trì độ ẩm cao dưới rễ cây và khi
mùa đơng đến có thể duy chuyển vào nơi tránh lạnh.
1.1.2. Giá trị sử dụng cây hương thảo
- Giá trị văn hóa
Hương thảo nói đến lịng trung thành, tình u và trí nhớ, tượng trưng
cho tình u phụ nữ vững bền, mạnh mẽ dù rằng tình yêu đến chậm. Ngày
xưa, các chàng trai Hy Lạp thường tặng lá hương thảo cho người mình yêu.
Hiện nay, tại Anh cũng như tại vài xứ ở châu Âu, cô dâu trong ngày cưới vẫn
cịn dắt lên tóc lá hương thảo. Các bác sĩ thời La Mã khuyên bệnh nhân buộc
một bó hương thảo đặt dưới gối khi cần phải quyết định, suy nghĩ những việc
khó khăn. Từ thời xưa, người cổ đại của nhiều nền văn hóa khác nhau coi
hương thảo là một loại cây thiêng liêng, có thể kết nối sự sống và cái chết.
Người Hy Lạp và người La Mã đốt lá hương thảo tại các đền thờ và xem
hương thảo như là biểu tượng của sự tri ân và ghi nhận lòng trung thành.
Trong suốt thời trung cổ, người ta đeo vòng hoa hương thảo để mang lại may
mắn và bảo vệ họ khỏi những linh hồn ma quỷ, ma thuật và phù thủy. Hương
thảo cũng giúp bảo vệ chống lại bệnh dịch và các bệnh truyền nhiễm. Người


6

Anh đeo hương thảo xung quanh cổ họ để ngăn ngừa cảm lạnh hoặc bao bọc
xung quanh cánh tay phải họ để nâng cao tinh thần. Ở Hoa Kỳ, người người
cịn trồng hương thảo trong sân vườn gia đình vừa để làm cảnh, vừa để sử
dụng như một loại gia vị trong các món ăn.
- Giá trị thực phẩm, tạo hương liệu

Ngày nay, hương thảo là một loại thảo dược ẩm thực phổ biến được sử
dụng trong nhiều món ăn ngon. Lá tươi và khô thường được sử dụng trong
các món ăn truyền thống ở Địa Trung Hải. Trong cây hương thảo có hương vị
cay, se và rất thơm, được bổ sung vào nhiều loại thực phẩm. Khi bị đốt cháy,
lá cây tạo ra một mùi mù tạt riêng biệt, mùi tương tự như gỗ đốt, có thể sử
dụng làm gia vị để ướp thực phẩm khi làm món nướng. Cây hương thảo tươi
không thể cung cấp một cách dễ dàng cho tất cả các địa điểm trên toàn thế
giới. Tuy nhiên, cây khô mất chất lượng chậm, làm cho việc lưu trữ và vận
chuyển dễ dàng hơn so với cây tươi.
- Giá trị trong y học
Hương thảo là một loại thảo dược có nhiều cơng hiệu với sức khỏe.
Cây được sử dụng như một loại thuốc đông y với các tác dụng chống viêm,
chống béo phì, điều trị bệnh đau dạ dày, rối loạn tiêu hóa, chống lại tình trạng
co giật cơ dẫn đến co rút các bắp thịt sau mỗi lần gắng sức tập thể thao, làm
ấm cơ thể, giúp cân bằng trí óc, giảm căng thẳng, làm tươi mát khơng khí và
cịn có tác dụng chống muỗi.
Trong y học dân gian, các bộ phận của cây Hương thảo chủ yếu được
dùng để uống có tác dụng chống viêm, đau đầu, đau bụng, chống co thắt,
viêm khớp, bệnh gút, dạ dày, chữa lành vết thương, lợi tiểu, giảm đau, chống
thấp khớp và là thuốc trầm cảm (Holmes, 1999; Martínez và cs, 2012;
Karakurum và cs, 2014; Sasikumar, 2012).


7

Chiết xuất Hương thảo có hoạt tính chống oxy hóa tốt hơn so với chất
oxy tổng hợp butylated hydroxyanisole, trolox và axit ascorbic. Hơn nữa, axit
carnosic và axit rosmarinic có hoạt tính chống oxy hóa cao hơn đáng kể so
với hydroxytoluene butylated và α-tocophenol (Romano và cs, 2009). Họ
Lamiaceae có các hợp chất quan trọng để sản xuất phụ gia thực phẩm và có

thể được sử dụng khơng chỉ cho hương vị thực phẩm mà còn để cải thiện chất
lượng tổng thể của sản phẩm và kéo dài thời hạn sử dụng của thực phẩm.
Hợp chất dễ bay hơi chẳng hạn như 1,8-cineol, long não và α-Pinene
của cây thơm này cũng cho thấy sự nổi bật về hoạt động chống đông máu,
chống ung thư vú và ung thư tuyến tiền liệt (Hussain và cs, 2010).
1.1.3. Thành phần hóa học có hoạt tính dược học của cây hương
thảo
Thành phần hóa học của Hương thảo cho thấy sự hiện diện của nhiều
chất có chất chống oxy hóa và các hoạt động chống lipoperoxidant đã được
chứng minh, cụ thể là axit rosmarinic (RA), acid caffeic (CA), acid
chlorogenic, axit carnosolic, rosmanol, carnosol và diterpenes khác nhau,
rosmari-diphenol, rosmariquinonevà nhiều chất chống oxy hóa tự nhiên khác.
Dầu hương thảo có chứa este (2-6%) chủ yếu là borneol, cineoles và một số
tecpen (al- Sereiti và cs, 1999).
Trong số các hợp chất này, CA và RA trở thành tâm điểm của sự chú ý
của các nhà nghiên cứu là tác nhân điều trị tiềm năng. RA là este của CA và
axit 3,4- dihydroxyphenyllactic và được xác định rộng rãi trong các loài thực
vật khác nhau. RA là một hợp chất có bản chất là polyphenol có khả năng
kháng khuẩn, chống viêm, kháng virus, chống oxy hóa, chống dị ứng, viêm
khớp, hen suyễn…và một số nghiên cứu bước đầu cho thấy nó có tác dụng
trong điều trị bệnh Alzheimer. Trong cơng nghiệp thực phẩm, RA là thành
phần có vai trò ngăn ngừa và hỗ trợ chữa dị ứng, viêm loét dạ dày, là chất bảo


8

quản tự nhiên, chất chống oxi hóa có thể kéo dài thời gian bảo quản hải sản
tươi sống, một số sản phẩm lên men, là gia vị cần thiết trong nhiều món ăn (
Trần Hồng Qun, 2010). Hoạt động chống oxy hóa của RA mạnh hơn so
với vitamin E.

Axit carnosic là một chất chống oxy hóa tự nhiên, được sử dụng
rộng rãi thực phẩm, y sinh học ngành công nghiệp, ngành công nghiệp mỹ
phẩm... Là một phụ gia thực phẩm, chất tạo màu tự nhiên tạo ra màu xanh lá
cây. Lipton S. A. và Cs thuộc Viện Nghiên cứu Y học Sanford-Burnham
cho rằng axit carnosic - một thành phần có trong cây Hương thảo axit carnosic có thể có những ứng dụng lâm sàng cho bệnh ảnh hưởng đến
võng mạc, bao gồm thối hóa điểm vàng liên quan đến tuổi, các bệnh về mắt.
Axit carnosic bảo vệ võng mạc khỏi thối hóa và tổn thương ánh sáng gây ra
trong ni cấy tế bào và trong các mơ hình động vật gặm nhấm. Trong vài
năm, nhóm của Lipton đã phát hiện axit carnosic chống tổn thương các gốc
tự do trong não. Lipton và các đồng nghiệp đã thử nghiệm axit carnosic trong
một mơ hình động vật bị tổn thương thụ thể cảm nhận ánh sáng - là phần mắt
chuyển ánh sáng thành tín hiệu điện tử, cho phép nhìn mọi vật. Nghiên
cứu cho thấy rằng loài gặm nhấm được điều trị trước bằng axit carnosic đã
lưu giữ lớp võng mạc của mắt dày hơn, chứng tỏ các thụ thể cảm nhận ánh
sáng đã được bảo vệ ( Lipton và cs, 2012).
Axit ursolic là triterpenoid pentacyclic, có trong các loại trái cây và
rau quả khác nhau. Nhiều nghiên cứu gần đây cho thấy rằng axit ursolic có
tác động chống ung thư, tác dụng chống viêm, và cảm ứng apoptosis trong
một số tế bào ung thư ở người. Đặc biệt, axit ursolic ức chế sự phát triển ung
thư vú bằng cách gây di động G1/G2 bắt giữ và điều chỉnh sự biểu hiện của
protein quan trọng trong con đường truyền tín hiệu (Yin và cs, 2016).


9

1.2. Nghiên cứu nhân giống in vitro ở thực vật
1.2.1. Cở sở khoa học nhân giống in vitro
Nuôi cấy in vitro hiện đang được sử dụng như một công cụ để nghiên
cứu các vấn đề cơ bản trong khoa học thực vật. Hiện nay, có thể thực hiện với
tất cả các cây có giá trị kinh tế với số lượng lớn bằng kỹ thuật nuôi cấy mô.

Nuôi cấy mô là thuật ngữ dùng để chỉ q trình ni cấy vơ trùng in vitro các
bộ phận tách rời khác nhau của thực vật. Kỹ thuật nuôi cấy mô dùng cho cả
hai mục đích nhân giống và cải thiện di truyền, sản xuất sinh khối các sản
phẩm hóa sinh, bệnh học thực vật, duy trì và bảo quản các nguồn gen quý….
Các hoạt động này được bao hàm trong thuật ngữ công nghệ sinh học (Lê Văn
Hoàng, 2007).
Thuật ngữ nhân giống in vitro hay còn gọi là vi nhân giống được sử
dụng đặc biệt cho việc ứng dụng các kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân giống thực
vật, bắt đầu bằng nhiều bộ phận khác nhau của thực vật có kích thước nhỏ,
sinh trưởng ở điều kiện khử trùng trong các ống nghiệm hoặc trong các loại
bình ni cấy khác (Lê Văn Hồng, 2007). Mặc dù chi phí đầu tư ban đầu
cao, nhưng mang lại hiệu quả rất lớn cho sản xuất. Tạo ra chính xác số lượng
chồi tái sinh, từ đó tạo tiền đề để nhân nhanh số lượng cây trưởng thành một
cách nhanh chóng, giúp tạo ra các loại hoa, quả sạch bệnh, chất lượng cao và
có những tính trạng mong muốn khác.
Trong thực tế, các nhà vi nhân giống dùng thuật ngữ nhân giống in vitro
và nuôi cấy mô thay đổi cho nhau để chỉ mọi phương thức nhân giống thực
vật trong điều kiện khử trùng. Thuật ngữ đồng nghĩa là nuôi cấy in vitro (Trần
Văn Minh, 1994). Nhân giống in vitro và nuôi cấy mô bắt đầu bằng các mảnh
cắt nhỏ của thực vật, sạch vi sinh vật, và được nuôi cấy vô trùng. Thuật ngữ
đầu tiên dùng trong quá trình nhân giống là explant (mẫu vật) tương đương
với các phương thức nhân giống khác là cutting (cành giâm), layer (cành


10

chiết), scion (cành ghép) hoặc seed (hạt) (Trần Văn Minh, 1994).
Haberlant (1902) là người đầu tiên đề xướng ra phương pháp nuôi cấy
mô tế bào thực vật để chứng minh cho tính tồn năng của tế bào. Theo ơng
mỗi một tế bào bất kì của một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm

năng để phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh (Nguyễn Như Khanh, 2002).
Như vậy, mỗi tế bào riêng rẽ của một cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ lượng
thông tin di truyền cần thiết của cả sinh vật và nếu gặp điều kiện thích hợp thì
mỗi tế bào có thể phát triển thành một cơ thể sinh vật hoàn chỉnh (Nguyễn
Như Khanh, 2002). Nuôi cấy mô tế bào thực vật in vitro được thực hiện dựa
trên tính tồn năng của tế bào, được thể hiện khi nuôi cấy mô và các tế bào
riêng biệt, trong mơi trường thích hợp thì có khả năng phát triển thành cây
hoàn chỉnh, đặc trưng cho loài và có thể phát triển bình thường. Do trong
nhân tế bào có chứa bộ ADN hồn chỉnh chứa tồn bộ thơng tin di truyền cho
một chu kì sống hồn chỉnh.
Q trình phát sinh hình thái trong ni cấy mơ tế bào in vitro là kết quả
của q trình phân hóa và phản phân hóa tế bào (Nguyễn Như Khanh, 2002).
Trong đó, tính phân hóa của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh
thành các tế bào của các mơ chun hóa đảm nhận các chức năng khác nhau.
Trong cơ thể thực vật khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhận các chức năng
khác nhau (mô giậu, mơ dẫn, mơ bì, mơ khuyết…) nhưng chúng đều có
nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hóa để hình thành
các mơ riêng biệt (Nguyễn Như Khanh, 2002).
Tính phản phân hóa của tế bào: tế bào khi đã được phân hóa thành các
mơ có chức năng riêng biệt, nhưng trong những điều kiện nhất định chúng
vẫn có thể quay lại trạng thái phơi sinh và phân chia tế bào mạnh mẽ (Nguyễn
Như Khanh, 2002). Trên thực tế đã chứng minh khả năng tái sinh của một cơ
thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã


11

được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy chúng trong
môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây (Nguyễn Như
Khanh, 2002). Trong kĩ thuật nuôi cấy cơ quan dinh dưỡng của cây như thân,

rễ, lá… thì giai đoạn tạo mơ sẹo (callus) chính là những tế bào đã quay trở lại
trạng thái phôi sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của
cơ quan sinh dưỡng (Vuylsteke, 1990). Tùy vào từng tế bào, từng mơ, từng
thời kì sinh trưởng, phát triển mà các gen phù hợp hoạt động; các gen không
cùng hoạt động như nhau trong các giai đoạn phát triển của cơ thể (cơ chế
điều hòa hoạt động của gen) (Vuylsteke, 1990).
Về bản chất của sự phân hóa và phản phân hóa là q trình hoạt hóa gen.
Do thơng tin về vị trí của tế bào, tương quan dinh dưỡng và tương quan
hormone quy định. Trong đó quan trọng nhất là thơng tin về vị trí của tế bào,
khi nằm trong một cơ thể các tế bào có sự ức chế lẫn nhau, khi được tách rời
và trong điều kiện nhất định thì các gen được hoạt hóa dễ dàng hơn. Đó là cơ
sở nền tảng cho việc nuôi cấy mô, tế bào (Nguyễn Như Khanh, 2002).
1.2.2. Các giai đoạn nhân giống in vitro
* Giai đoạn 1: Khử trùng mô nuôi cấy
Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định tồn bộ q trình nhân giống in
vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống
cao, mẫu tồn tại vô trùng và sinh trưởng tốt.
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào ni cấy bằng hóa chất
khử trùng để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng
phương pháp khử trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn mơi trường dinh
dưỡng thích hợp sẽ đạt được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các
chất: HgCl2 0,1% xử lý trong 5 – 10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5 – 7% xử
lý trong 15 – 20 phút, hoặc H2O2, dung dịch Br2….
* Giai đoạn 2: Tái sinh mẫu nuôi cấy mô


12

Mục đích của các giai đoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mơ
ni cấy.Q trình này được điều khiển chủ yếu dựa vào tỷ lệ của các hợp chất

auxin, cytokynin ngoại sinh đưa vào môi trường ni cấy.Tuy nhiên, bên cạnh
điều kiện đó cũng cần quan tâm tới tuổi sinh lý của mẫu cấy. Thường mô non,
chưa phân hố có khả năng tái sinh cao hơn các mơ trưởng thành. Người ta cịn
nhận thấy rằng mẫu nuôi cấy trong thời gian sinh trưởng nhanh của cây cho kết
quả rất khả quan trong tái sinh chồi.
Một số dạng mơi trường dinh dưỡng phổ biến: Muối khống: theo White
(1943), Heller (1953), Murashige và Skoog (1962); Chất hữu cơ: đường
sarcaroza; Vitamin: B, B6, inositol, nicotin axit; Hoocmon: auxin (IAA, IBA,
NAA…), Cytokinin (BA, Kin, 2P…), Gibberelin (GA3) (Trần Văn Minh,
1994).
* Giai đoạn 3: Giai đoạn nhân nhanh chồi, cụm chồi
Đây là giai đoạn then chốt của tồn bộ q trình nhằm tạo ra hệ số nhân
cao nhất. Mục đích của giai đoạn này là kích thích sự phát triển hình thái và
tăng nhanh số lượng chồi trên một đơn vị mẫu cấy trong thời gian nhất định
nhằm cung cấp cho các lần cấy chuyển và tạo cây con hoàn chỉnh tiếp theo.
Mẫu tái sinh được chuyển sang môi trường nhân nhanh có bổ sung chất
điều hịa sinh trưởng nhóm cytokinin để tái sinh từ một chồi thành nhiều chồi,
cụm chồi. Hệ số nhân phụ thuộc vào số lượng chồi tạo ra trong ống nghiệm.Và
quan trọng là phải xác định được mơi trường và điều kiện ngoại cảnh thích hợp
để có hiệu quả cao nhất. Chế độ nuôi cấy thường là 25 - 27°C và 16 giờ chiếu
sáng/ ngày, cường độ ánh sáng 2000 – 4000 Lux, ánh sáng tím là thành quan
trọng để kích thích phân hóa chồi (Weiss và Jaffe, 1969). Tuy nhiên với mỗi
đối tượng ni cấy địi hỏi chế độ nuôi cấy khác nhau: nhân nhanh súp lơ cần
chu kỳ chiếu sáng 9 giờ/ ngày, nhân phong lan Phalenopsis ở giai đoạn đầu cần
che tối… (Trần Văn Minh, 1994).


13

* Giai đoạn 4: Tạo cây hoàn chỉnh

Kết thúc quá trình nhân nhanh chồi thì sẽ có được một lượng chồi lớn
nhưng lại chưa hình thành cây hồn chỉnh vì chưa có rễ. Cần chuyển từ mơi
trường nhân nhanh chồi sang môi trường tạo rễ. Tách các chồi riêng cấy
chuyển vào mơi trường có bổ sung chất điều hịa sinh trường nhóm auxin.
Trong giai đoạn này, nồng độ cytokinin được giảm xuống và tăng nồng độ
auxin nhằm kích thích sự hình thành rễ. Một số loại cây có thể phát sinh rễ
ngay sau khi chuyển từ môi trường nhân nhanh giàu cytokinin sang mơi trường
khơng chứa chất điều hịa sinh trưởng. Đối với các phơi vơ tính chỉ cần cấy
chúng trên mơi trường khơng có chất điều hịa sinh trưởng hoặc mơi trường
chứa cytokinin nồng độ thấp thì phơi phát triển thành cây hoàn chỉnh (Trần
Văn Minh, 1994).
* Giai đoạn 5: Đưa cây ra đất
Đây là giai đoạn cây được chuyển từ cây in vitro ở trạng thái sống dị
dưỡng sang sống hồn tồn tự dưỡng và tự thích nghi với điều kiện ngoài
tự nhiên.
Trước khi đưa cây in vitro ra ngoài tự nhiên cần phải lựa chọn những cây
đã đạt những hình thái nhất định (số lá, số rễ, chiều cao cây…); phải có thời
gian để cây thích nghi với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh; và phải
có giá thể thích hợp để tiếp nhận cây in vitro. Phải chủ động điều chỉnh được
độ ẩm, sự chiếu sáng của vườn ươm cũng như chế độ chiếu sáng thích hợp
(Trần Văn Minh, 1994).
1.2.3. Ưu điểm và hạn chế của nhân giống in vitro
* Những ưu điểm
Theo Nguyễn Đức Thành (2000), ưu điểm của nhân giống in vitro
- Phương pháp nhân giống in vitro có khả năng hình thành một số lượng
lớn cây giống từ một mơ, cơ quan có kích thước nhỏ 0,1 – 10 mm.