(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu quy trình chiết xuất curcuminoid từ củ nghệ vàng (curcuma longa l ) bằng công nghệ enzyme

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

ĐÀO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID
TỪ CỦ NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)
BẰNG CÔNG NGHỆ ENZYME

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2021

Luan van


Luan van


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

ĐÀO THỊ MAI

NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT CURCUMINOID
TỪ CỦ NGHỆ VÀNG (CURCUMA LONGA L.)
BẰNG CƠNG NGHỆ ENZYME
Chun ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8440114

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Lê Tất Thành

Hà Nội – 2021

Luan van


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của cá nhân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Lê Tất Thành. Các số liệu nghiên cứu khoa học, kết quả
nghiên cứu trong luận văn là trung thực và tài liệu tham khảo đã được ghi rõ nguồn
trích dẫn. Kết quả nghiên cứu này không trùng với bất cứ cơng trình nào đã được
cơng bố trước đó.
Nếu phát hiện bất kỳ sự sao chép nào từ kết quả nghiên cứu khác hoặc sai
sót về số liệu nghiên cứu, tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước nhà trường và
hội đồng.
Hà Nội, tháng năm 2021
Tác giả

Đào Thị Mai

Luan van


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cơ giáo trong khoa
Hóa học, Học viện Khoa học và Cơng nghệ đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho
tôi những kiến thức, kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian học tập.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Lê Tất Thành - Viện nghiên
cứu hệ Gen, Viện Hàn Lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình hướng
dẫn, hết lòng chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện
đề tài luận văn.
Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể cán bộ nhóm Nghiên cứu phát
triển Cơng nghệ sinh – dược, phòng Hệ gen học chức năng - Viện Nghiên cứu hệ
gen, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã luôn động viên, giúp đỡ
và tạo điều kiện thuận lợi để tơi có thể hồn thành luận văn này. Trong q trình
làm việc, tơi khơng chỉ tiếp thu thêm nhiều kiến thức chun mơn bổ ích mà còn
học tập được tinh thần làm việc, thái độ nghiên cứu khoa học nghiêm túc, hiệu
quả, đây là những điều q giá trong q trình học tập và cơng tác sau này.
Sau cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã khích lệ
tinh thần, đóng góp ý kiến, giúp đỡ tơi trong q trình học tập, nghiên cứu và
hồn thành luận văn tốt nghiệp.
Tơi xin chân thành cảm ơn!
HỌC VIÊN CAO HỌC

Đào Thị Mai

Luan van

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT .................................... III
DANH MỤC BẢNG .......................................................................................... IV
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ........................................................... V
MỞ ĐẦU .............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 2
1.1. Giới thiệu về củ nghệ ........................................................................................2
1.1.1. Cây nghệ vàng ............................................................................................. 2
1.1.2. Thành phần hóa học của củ nghệ vàng ....................................................... 2
1.1.3. Hoạt tính sinh học của củ nghệ vàng .......................................................... 4
1.2. Hợp chất curcuminoid trong củ nghệ vàng ...................................................6
1.2.1. Cấu trúc hóa học của curcuminoid .............................................................. 6
1.2.2. Hoạt tính sinh học của curcuminoid ........................................................... 7
1.2.3. Ứng dụng của curcuminoid trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm .... 8
1.3. Các phương pháp phân lập curcuminoid ......................................................8
1.4. Ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên 12
1.4.1. Công nghệ enzyme .................................................................................... 12
1.4.2. Amylase ..................................................................................................... 13
1.4.3. Cellulase .................................................................................................... 14
1.4.4. Năng lượng phản ứng xúc tác enzyme ...................................................... 14
1.4.5. Ứng dụng công nghệ enzyme chiết xuất hợp chất thiên nhiên ................. 15
1.4.3. Ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất curcuminoid từ củ nghệ .. 18
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............. 20
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................20
2.2. Hóa chất và thiết bị .........................................................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ...............................................................................20
2.3.1. Thu mẫu thực vật....................................................................................... 20
2.3.2. Phương pháp xác định độ ẩm .................................................................... 20
2.3.3. Phương pháp xác định hàm lượng tro toàn phần ...................................... 21

2.3.4. Xác định hàm lượng carbohydrate ............................................................ 22
2.3.5. Xác định hàm lượng và thành phần curcuminoid bằng HPLC ................. 22
2.3.6. Phương pháp định lượng đường khử và tinh bột ...................................... 24
2.3.7. Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme .............................................. 25
I

Luan van


2.3.8. Phương pháp thủy phân nghệ bằng enzyme ............................................. 26
2.3.9. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm tâm trực giao bậc 2 Box-Wilson .. 26
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................... 28
3.1. Đánh giá chất lượng mẫu củ nghệ vàng tại Nghệ An, Việt Nam ..............28
3.1.1. Đánh giá cảm quan củ nghệ vàng tại Nghệ An ......................................... 28
3.1.2. Phân tích chất lượng mẫu nghệ tại Nghệ An ............................................ 29
3.1.3. Đánh giá hàm lượng curcuminoid trong củ nghệ vàng ở Nghệ An .......... 29
3.2. Kết quả nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất curcuminoid bằng
cơng nghệ enzyme quy mơ PTN ...........................................................................31
3.2.1. Kết quả lựa chọn enzyme .......................................................................... 31
3.2.2. Kết quả khảo sát các điều kiện thủy phân nghệ ........................................ 34
3.2.3. Tối ưu hóa quy trình thủy phân củ nghệ bằng enzyme ............................. 36
3.2.4. Quy trình chiết xuất curcuminoid bằng cơng nghệ enzyme quy mô PTN 41
3.3. Đánh giá hiệu suất chiết xuất curcuminoid kết hợp với thủy phân bằng
enzyme .....................................................................................................................43
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................... 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................ 55
PHỤ LỤC ........................................................................................................... 64

II

Luan van


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Tên viết tắt

PTN

Phịng thí nghiệm

DMC

Demethoxy-curcumin

BDMC
LTR

Bis-demethoxy-curcumin
Long terminal reion

BMGS

Butyl mono glycol sulfate

PTSA

Para-toluen sulfonate acid

HPLC

High-performance liquid chromatography

LPS

Lipopolysaccharide

NO

Oxit nitric

DPCARB
GC-MS

N,N-dipropyl ammonium N,N-dipropylcarbamate
Gas chromatography-mass spectrometry

DH

Độ thủy phân (Degree of Hydrolyaste)

DW

Khối lượng khô (Dry weight)

III

Luan van

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các thành phần cơ bản trong củ nghệ vàng C. longa . ........................ 3
Bảng 1.2. Bảng các chất lưỡng cực dùng để phân lập curcuminoid .................. 11
Bảng 3.1. Các mẫu nghệ vàng từ một số vùng trồng nguyên liệu...................... 28
Bảng 3.2. Một số chỉ tiêu chất lượng củ nghệ trồng tại Nghệ An ...................... 29
Bảng 3.3. Hàm lượng curcuminoid trong củ nghệ vàng ở Nghệ An .................. 29
Bảng 3.4. Giá trị ở các mức của các yếu tố ảnh hưởng ...................................... 36
Bảng 3.5. Ma trận kế hoạch thực nghiệm ........................................................... 37
Bảng 3.6. Bảng phân tích phương sai các hàm mục tiêu Y ................................ 38
Bảng 3.7. Kết quả tối ưu hóa các biến cơng nghệ .............................................. 41
Bảng 3.8. Kết quả thực nghiệm của các hàm mục tiêu tại điều kiện tối ưu ....... 41
Bảng 3.9. Kết quả hàm lượng cao chiết toàn phần mẫu nghệ ............................ 43
Bảng 3.10. Đánh giá hiệu suất chiết xuất curcuminoid ...................................... 44

IV

Luan van


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hình ảnh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.) ...................................... 2
Hình 1.2. Một số thành phần hóa học của củ nghệ và sắc ký đồ HPLC của
curcuminoids tổng (I), curcumin (II), DMC (III) và BDMC (III) . ...................... 4
Hình 1.3. Các chất đồng phân keto-enol của curcumin ....................................... 6
Hình 1.4. Sơ đồ quy trình phân lập curcuminoid bằng dung mơi dễ bay hơi .... 10
Hình 1.5. Quy trình phân lập curcuminoid bằng dung dịch lưỡng cực .............. 12
Hình 1.6. Sơ đồ phân loại cellulase .................................................................... 14
Hình 1.7. So sánh năng lượng phản ứng có và khơng có xúc tác enzyme ........ 15
Hình 1.8. Chiết xuất các hoạt chất liên kết với mạng lưới lignocellulose ........ 18

Hình 2.1. Củ nghệ vàng (Curcuma longa L.) ..................................................... 20
Hình 2.2. Sắc ký đồ của các đồng phân curcuminoid ........................................ 24
Hình 2.3. Đồ thị biểu diễn đường chuẩn glucose (µg/ml) .................................. 25
Hình 2.4. Sơ đồ kế hoạch thực nghiệm bậc 2 với k=3 ....................................... 27
Hình 3.1. Sắc ký đồ của các mẫu nghệ Tương Dương ....................................... 30
Hình 3.2. Sắc ký đồ của các mẫu nghệ trồng trên đất đồi Nam Đàn ................. 31
Hình 3.3. So sánh sự thủy phân cellulase với tỷ lệ E/S khác nhau .................... 32
Hình 3.4. So sánh sự thủy phân α-amylase với tỷ lệ E/S khác nhau .................. 33
Hình 3.5. Đồ thị biểu diễn độ thủy phân của các loại enzyme khác nhau ......... 33
Hình 3.6. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân ............ 34
Hình 3.7. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ thủy phân................ 34
Hình 3.8. Tối ưu hóa tỷ lệ nước và nguyên liệu ................................................. 35
Hình 3.9. Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của thời gian lên độ thủy phân .............. 36
Hình 3.10. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán phân bố ngẫu nhiên của hàm mục
tiêu Y ................................................................................................................... 39
Hình 3.11. Bề mặt đáp ứng của hàm mục tiêu Y ............................................... 40
Hình 3.12. Kết quả tối ưu các biến công nghệ của quá trình thủy phân nghệ ... 41
Hình 3.13. Sơ đồ quy trình chiết xuất cao chiết nghệ bằng cơng nghệ enzyme quy
mô PTN ............................................................................................................... 42

V

Luan van


MỞ ĐẦU
Cây nghệ vàng có tên khoa học là Curcuma longa L., thuộc họ gừng
(Zingiberaceae) có nguồn gốc từ Đơng Nam Á. Trong Đông Y, củ nghệ được sử
dụng từ lâu như một thảo dược để chữa trị các chứng viêm loét dạ dày, viêm gan,
vàng da, thấp khớp...; dùng ngoài để trị chấn thương tụ máu, mụn nhọt, ghẻ lở,

giúp mau lành vết thương, liền sẹo, dùng bột nghệ vàng trộn với mật ong để chữa
bệnh về dạ dày, viêm túi mật, sỏi mật…
Những năm gần đây, các nhà khoa học đã xác định và chiết tách được các
hợp chất curcuminoid có hàm lượng từ 2,5 – 5,4% so với khối lượng khô củ nghệ
vàng, đồng thời, chứng minh được curcuminoid là hoạt chất chính có hoạt tính
sinh học của củ nghệ vàng. Các hoạt chất chính trong nhóm này gồm 3 thành phần
chính: curcumin, demethoxycurcumin và bis-demethoxycurcumin. Các hợp chất
curcuminoid có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn, phịng và hỗ trợ điều trị nhiều
loại bệnh ung thư, chống viêm, bảo vệ gan, chống oxy hóa...
Các cơng nghệ sản xuất curcuminoid ở nước ta chủ yếu trên nền tảng chiết
xuất bằng dung mơi hữu cơ nên chi phí sản xuất lớn, giá thành sản xuất cao khó
cạnh tranh với các sản phẩm cùng loại của Ấn Độ, Trung Quốc. Nhằm tìm kiếm
các giải pháp cơng nghệ mới xanh – sạch trong khuôn khổ luận văn Thạc sĩ, tôi
đề xuất thực hiện đề tài: “Nghiên cứu quy trình chiết xuất curcuminoid từ củ
nghệ vàng (Curcuma longa L.) bằng công nghệ enzyme” với mục tiêu xây dựng
được quy trình chiết xuất curcuminoid bằng cơng nghệ enzyme quy mơ phịng thí
nghiệm (PTN).
Nội dung nghiên cứu:
- Thu thập mẫu và đánh giá chất lượng củ nghệ vàng C. longa tại Nghệ An.
- Nghiên cứu lựa chọn enzyme phục vụ cho quá trình chiết xuất.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân củ nghệ bằng
enzyme lựa chọn.
- Nghiên cứu chiết xuất curcuminoid sau khi thủy phân enzyme.
- Xây dựng và tối ưu quy trình chiết xuất curcuminoid bằng cơng nghệ
enzyme quy mô PTN.

1

Luan van

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về củ nghệ
1.1.1. Cây nghệ vàng
Củ nghệ là thân rễ hoặc thân ngầm của cây nghệ vàng có tên khoa học là
Curcuma longa L. (C. longa), thuộc họ gừng (Zingiberaceae). Cây thuộc loại thân
thảo mọc đối, cao 60-90 cm với một thân ngắn lá có tua. Hoa của cây nghệ màu
vàng, dài từ 10-15 cm và nhóm lại với nhau thành những gai dày đặc. Thân rễ
màu vàng nâu với phần bên trong màu đỏ đến vàng cam (Hình 1.1). Thân rễ có
chiều dài 2,5-7,0 cm và đường kính khoảng 2,5 cm với củ nhỏ phân nhánh [1].
Trong Đông Y, củ nghệ được sử dụng từ lâu như một thảo dược để chữa trị các
chứng viêm loét dạ dày, viêm gan, vàng da, thấp khớp...; dùng ngoài để trị chấn
thương tụ máu, mụn nhọt, ghẻ lở, giúp mau lành vết thương, liền sẹo, dùng bột
nghệ vàng trộn với mật ong để chữa bệnh viêm loét dạ dày - tá tràng, các bệnh về
viêm túi mật, sỏi mật…
Củ nghệ được trồng ở nhiều vùng nóng trên thế giới, chủ yếu ở Ấn Độ là nơi sản xuất, tiêu dùng và xuất khẩu lớn nhất [2, 3]. Ở Ấn Độ, nghệ được trồng
trên khoảng 180.000 ha, sản lượng 25 triệu tấn mỗi năm [3]. Các sản phẩm từ củ
nghệ được xuất khẩu sang Hoa Kỳ, Vương quốc Anh, Nhật Bản, Iran, Các Tiểu
vương quốc Ả Rập Thống nhất, Ả Rập Xê Út, Hà Lan, Nam Phi và Singapore ở
dạng thân rễ khô, bột nghệ, nhựa dầu, tinh dầu, bột cà ri hoặc curcumin [4, 5].

Hình 1.1. Hình ảnh cây nghệ vàng (Curcuma longa L.)
1.1.2. Thành phần hóa học của củ nghệ vàng
Thành phần hóa học của nghệ bao gồm khoảng 70% carbohydrate (theo
khối lượng khô), 75% độ ẩm (theo khối lượng tươi), 6% protein (theo khối lượng
khô), 6% tinh dầu (chứa các hợp chất phellandrene, sabinene, cineol, borneol,
2

Luan van

zingiberene và sesquiterpenes) (theo khối lượng khô), 5% chất béo (theo khối
lượng khơ), 3% chất khống (kali, canxi, phốt pho, sắt và natri) (theo khối lượng
khô), 3–5% curcuminoid (theo khối lượng khô), và một lượng vi lượng vitamin
(B1, B2, C và niacin) (Bảng 1.1) [6, 7, 8]. Trong đó, thành phần có hoạt tính sinh
học được chú ý nhất của củ nghệ vàng là các curcuminoid và tinh dầu nghệ (gồm
các turmerone thơm (ar-turmerone), α-turmerone và β-turmerone). Các
curcuminoid, bao gồm curcumin (1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyfenil)-1,6heptadiene-3,5-dione), demethoxycurcumin (DMC) và bis-demethoxy-curcumin
(BDMC) là các chất có hoạt tính chính trong củ nghệ [1]. Cơng thức hóa học của
một số thành phần được biểu diễn tương ứng trong sắc ký đồ HPLC được mơ tả
trong hình 1.2.
Bảng 1.1. Các thành phần cơ bản trong củ nghệ vàng C. longa [9].
STT

Hàm lượng (%)

Thành phần

1

Nước

74-76

2

Curcuminoid (DW)

0,5-6

3

Chất xơ (DW)

4

Dầu (DW)

5

Khoáng chất (DW)

3,5-5

6

Protein (DW)

6,3-7

7

Chất béo (DW)

8

Carbohydrates (DW)

3,5-4,3
4-5

5,1-7,5
61,5-69,4

Trong thành phần của các sản phẩm chứa curcuminoid (cịn gọi là curcumin
mix) có chứa khoảng 77% curcumin tinh sạch, 17% DMC và 3% BDMC [10]. Kết
quả nghiên cứu của Naama và cộng sự (2013) cho thấy, curcumin và DMC kém
bền hơn BDMC [11]. Xét về hoạt tính chống oxy hóa và ức chế khối u thì curcumin
là chất có hoạt tính mạnh nhất, tiếp theo là DMC và cuối cùng là BDMC [10, 12].
Ngoài curcuminoid, nghệ cũng chứa dầu nghệ có tác dụng kháng nấm,
kháng khuẩn, diệt cơn trùng, diệt muỗi, chống oxy hóa, chống đột quỵ và chống
ung thư [3, 13, 14]. Dầu nghệ bao gồm turmerone thơm (ar-turmerone), αturmerone và β-turmerone (Hình 1.2).

3

Luan van


Hình 1.2. Một số thành phần hóa học của củ nghệ và sắc ký đồ HPLC của
curcuminoid tổng (I), curcumin (II), DMC (III) và BDMC (III) [10].
1.1.3. Hoạt tính sinh học của củ nghệ vàng
Thành phần có hoạt tính sinh học quan trọng nhất của nghệ là hợp chất
curcuminoid của lớp phenolic (2-9% tổng thành phần) bao gồm curcumin (70–
80%), DMC (10–25%) và BDMC (5–10%) [15, 16]. Các hợp chất này cũng là
thành phần tạo ra màu vàng đặc trưng của củ nghệ và thành phần này có thể thay
đổi tùy thuộc vào điều kiện của đất, khí hậu và nguồn nước nơi nó được trồng,
cũng như quy trình chế biến khác nhau [17, 18].
Bột nghệ chứa các hợp chất phenolic có nhiều ứng dụng dược lý quan trọng
trong việc bảo vệ sức khỏe con người [19], chống lại bệnh ngoài da [20], bệnh
Crohn và viêm loét đại tràng [21], cũng như chống oxy hóa, chống viêm [7, 22],

kháng khuẩn [23], kháng nấm [24], chống đái tháo đường [18], diệt cơn trùng và
diệt ấu trùng [3].
Củ nghệ có chứa hàm lượng carbohydrate cao 61,5-69,4% (Bảng 1.1) làm
cho nó trở thành nguồn năng lượng tốt và góp phần vào q trình tiêu hóa và đồng
hóa các chất dinh dưỡng khác [25]. Trong số các loại carbohydrate này có 22%
tinh bột tự nhiên được tìm thấy ở C. longa tương tự như lượng tinh bột được tìm
thấy trong khoai tây và có cấu trúc tinh thể dạng hình tam giác với bề mặt nhẵn
[26]. Lượng khoáng chất và vitamin trong nghệ (trong 100 g chất khô) bao gồm
200 mg canxi, 260 mg phốt pho, 2500 mg kali, 47,5 mg sắt, 0,9 mg thiamine (B1),
0,19 mg riboflavin (B2), 4,8 mg niacin (B3) và 50 mg axit ascorbic [27]. Củ nghệ

4

Luan van


bổ sung sắt làm tăng hệ miễn dịch, phát triển nhận thức, điều hòa và trao đổi chất
[28].
Trong củ nghệ cịn chứa thành phần tinh dầu có hoạt tính sinh học cao. Một
số nghiên cứu về tinh dầu trong C. longa có các hoạt tính sinh học như xua đuổi
và diệt ấu trùng, kháng khuẩn, chống oxy hóa, chống viêm và chống ung thư [4,
25], khả năng diệt ấu trùng, diệt côn trùng và xua đuổi của tinh dầu C. longa cũng
đã được báo cáo [3, 13, 14]. Hoạt tính diệt ấu trùng của tinh dầu C. longa có liên
quan đến α-phellandrene, thành phần chính của tinh dầu [3]. Hợp chất curturmerone – thành phần chính của tinh dầu C. longa đã được chứng minh tiềm
năng làm thuốc chống côn trùng [14] và thuốc trừ sâu [29].
Tinh dầu C. longa đã được chứng minh hoạt tính chống khối u trên tế bào
ung thư tuyến tiền liệt (LNCaP) và u ác tính (B16) [23]. Một số hợp chất trong
tinh dầu đã được xác định có hoạt tính như α-zingiberene, β-turmerone, αzingiberene, ar-turmerone, β-elemenene, germacrone và β-sesquiphellandrene
[30, 31]. Ngoài ra, tinh dầu C. longa cũng được chứng minh có hoạt tính kháng
viêm [23] thơng qua q trình điều hịa các cytokine gây viêm. Chuột được chiếu

tia UVB, sau đó được điều trị bằng tinh dầu C. longa cho thấy giảm đáng kể mức
độ của các cytokine gây viêm (IL-1β và TNF-α) trong các mô. Điều này cho thấy
rằng điều trị tại chỗ với tinh dầu nghệ có thể ngăn chặn tình trạng viêm phản ứng
trên da do tia UVB gây ra [32]. Hai hợp chất trong tinh dầu là β-turmerone và arturmerone có khả năng ức chế lipopolysaccharide (LPS), làm giảm sự sản sinh
oxit nitric (NO) do LPS gây ra [32], từ đó, có khả năng làm giảm phản ứng viêm.
Hoạt tính chống lão hóa của tinh dầu C. longa đã được báo cáo thơng qua
hình ảnh giảm nếp nhăn trên da chuột được chiếu xạ bằng tia UVB [32]. Theo các
tác giả, các hợp chất ar-turmerone, curlone và β-turmerone là những thành phần
đóng góp chính vào tác dụng chống lão hóa da.
Tóm lại, củ nghệ có hàm lượng cao các thành phần cacbohydrat, chất xơ,
protein, và lipit (chủ yếu là axit oleic). Tinh dầu và curcuminoid của C. longa có
một số hoạt tính sinh học như chống oxy hóa, ngăn ngừa hình thành khối u, kháng
khuẩn, xua đuổi và diệt cơn trùng, ấu trùng, chống ung thư, chống viêm và chữa
các bệnh liên quan đến dạ dày. Có thể thấy, củ nghệ là một nguyên liệu tiềm năng
để phát triển dược phẩm, thực phẩm chức năng và nguyên liệu thực phẩm.

5

Luan van


1.2. Hợp chất curcuminoid trong củ nghệ vàng
1.2.1. Cấu trúc hóa học của curcuminoid
Hợp chất curcuminoid bao gồm curcumin chiếm 70-80%, DMC chiếm 1025% và BMC chiếm 5-10% [34, 35].

Hình 1.3. Các chất đồng phân keto-enol của curcumin
Curcumin lần đầu tiên được Vogel và Pelletier phân lập vào năm 1815 từ
thân rễ của C. longa [36, 37]. Năm 1842, Vogel Jr lần đầu tiên tinh chế được
curcumin [36]. Sau vài thập kỷ vào năm 1910, Melabedzka et al. đã báo cáo cấu
trúc của curcumin là diferuloylmethane hoặc 1,6-heptadiene-3,5-dione-1,7-bis (4hydroxy-3-methoxyphenyl) - (1 E , 6 E ) (Hình 1.2) [36]. Ba năm sau, vào năm

1913, Lampe và Melobedzka đã báo cáo một phương pháp tổng hợp curcumin
[36, 34, 35]. Năm 1953, Srinivasan báo cáo về việc tách và định lượng các thành
phần curcumin bằng phương pháp sắc ký [36, 38].
Curcumin có cấu trúc đối xứng với hai vòng benzenmethoxy, liên kết với
nhau bằng một gốc hydrocacbon khơng no. Curcumin có ba nhóm chức chính:
nhóm methoxy phenolic thơm, liên kết α, β-khơng no và β-diketone. Curcumin có
hai dạng đồng phân là keto- và enol- (Hình 1.3) và được chuyển hóa qua lại lẫn
nhau tùy vào điều kiện mơi trường. Các nhóm thơm và cấu trúc đồng phân tạo ra
tính kỵ nước và tính phân cực của curcumin.
Curcumin thực tế khơng hịa tan trong nước ở nhiệt độ phòng. Độ hòa tan
của curcumin trong nước tăng lên trong điều kiện kiềm, đồng thời curcumin phân
hủy nhanh chóng trong điều kiện này. Do bản chất cấu trúc ít phân cực với giá
trị ẟP ~ 3,0, curcumin có thể hịa tan trong các dung mơi hữu cơ như methanol,
ethanol, aceton. Ở pH trung tính và axit, dạng đồng phân keto bền vững hơn, đồng
phân enol bền trong mơi trường kiềm (pH>10), có thể được giải thích bằng liên
kết hydro nội phân tử ở dạng enol [34, 39, 40]. Curcumin hấp thụ cực đại ở bước
sóng 430 nm trong methanol và 415–420 nm trong aceton [41, 42]. Trong mơi
trường kiềm, curcumin bị khử hồn tồn và hấp thụ cực đại ở bước sóng 467 nm.

6

Luan van


Demethoxycurcumin là một beta-diketone có cấu trúc tương tự curcumin
trong đó một nhóm methoxy được thay thế bằng hydro. Bisdemethoxycurcumin
là một beta-diketone có cấu trúc tương tự curcumin trong đó các nhóm methoxy
được thay thế bằng hydro (Hình 1.2).
1.2.2. Hoạt tính sinh học của curcuminoid
Tính đến nay đã có khoảng 4000 cơng trình nghiên cứu liên quan đến hoạt

tính sinh học của curcuminoid. Trong đó nổi bật là các hoạt tính chống oxy hóa,
kháng viêm và chống ung thư. Ngồi ra, hợp chất tự nhiên này còn được phát hiện
là có hoạt tính điều biến các phân tử truyền tín hiệu trong cơ thể như các
chemokine, cytokine, các gene ức chế khối u, các phân tử kết dính, microRNA,
v.v. [43].
Trong đó, khả năng chống ung thư của curcumin đã thu hút được sự chú ý
rất lớn của các nhà khoa học [44]. Khi dùng curcumin riêng rẽ để điều trị hoặc kết
hợp với các dược chất như carboplatin, paclitaxel đều có thể làm giảm mật độ các
vi sợi và khối u gan cũng như tế bào ung thư cổ tử cung in vitro và in vivo [45].
Khi áp dụng liệu pháp kết hợp giữa curcumin và paclitaxel trên chuột bị gây ung
thư thực nghiệm thì thu được kết quả là các khối u khơng những giảm về mật độ
mà cịn giảm cả về độ lớn, điều này liên quan đến khả năng điều hoà giảm của các
con đường NF-κB, Akt và MAPK của curcumin [45].
Hợp chất curcumin cũng biểu hiện hoạt tính kháng vi sinh vật khá mạnh.
Một nghiên cứu in vitro đã cho thấy, curcumin kháng tất cả 14 chủng nấm men
kiểm định thuộc chi Candida [46]. Trong nghiên cứu thí nghiệm trên chuột, hoạt
chất này cũng biểu hiện khả năng kháng vi khuẩn Helicobacter pylori khá mạnh
[46]. Hiệu quả kháng virus của curcumin cũng đã được nghiên cứu và kiểm chứng.
Theo đó, curcumin có tác dụng ngăn virus HIV-1 tự sao chép và nhân lên thông
qua cơ chế làm phong tỏa q trình hoạt hóa phiên mã vùng LTR [47].
Bên cạnh đó, curcumin cịn thể hiện hoạt tính kháng viêm mạnh mẽ. Hợp
chất này có thể ức chế phiên mã và dịch mã của các cytokine tiền viêm và ức chế
sự hoạt hóa NF-κB trong mơ lợi của chuột thí nghiệm bị viêm nướu [48]. Ngồi
ra, curcumin cịn làm giảm sự lây lan của tế bào viêm, làm tăng hàm lượng
collagen và tăng số lượng các nguyên bào sợi trong mơ lợi của chuột [48].
Như vậy, curcumin có rất nhiều hoạt tính sinh học tiềm năng có thể khai
thác để ứng dụng vào dược phẩm, thực phẩm chức năng và mỹ phẩm.

7

Luan van


1.2.3. Ứng dụng của curcuminoid trong thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm
Thực phẩm
Khi người tiêu dùng ngày càng chú ý đến chế độ ăn uống lành mạnh thì
việc tăng cường bổ sung các sản phẩm thực phẩm chứa các hợp chất có hoạt tính
sinh học như curcumin thu hút sự quan tâm đặc biệt của cơng dân tồn cầu. [49,
50]. Curcumin đã được Ủy ban Khoa học Thực phẩm của Cộng đồng Châu Âu
phê duyệt nằm trong danh sách các chất phụ gia. Curcumin có thể được sử dụng
như một chất chống oxy hóa, chất tạo hương vị (vị đắng, ấm) và chất tạo màu tự
nhiên (màu vàng tươi) trong các loại thực phẩm khác nhau [51].
Dược phẩm
Curcumin có giá trị lịch sử trong các ứng dụng y học và đã được sử dụng
như một liệu pháp truyền thống trong các bài thuốc y học cổ truyền của phương
Đông [52]. Curcumin có cấu trúc polyphenol và độ an tồn cao nên được biết đến
như một dược liệu tiềm năng với các hoạt tính dược lý đa dạng [53; 54]. Các ứng
dụng điều trị của curcumin rất đa dạng bao gồm các hoạt tính chống oxy hóa,
chống ung thư, kháng khuẩn, chống tiểu đường và kháng viêm; trong khi nó
được chứng minh là có tác dụng tích cực trong điều trị bệnh tim mạch và bệnh
Alzheimer, xơ gan và chữa lành vết thương [55; 56; 57; 58].
Mỹ phẩm
Curcumin đã được xem xét trong các ứng dụng mỹ phẩm do tác dụng
chống oxy hóa và chống viêm trên da. Curcumin có tác dụng chống lão hóa, chống
nhăn, chống nắng và tái tạo da và giúp da đẹp hơn. Curcumin có thể được sử
dụng như một chất tạo màu trong các sản phẩm chăm sóc móng và chăm sóc
mơi. Các dạng bào chế nano của curcumin có thể nâng cao hiệu quả của
curcumin, nhờ khả năng thẩm thấu và lưu giữ trên da tốt hơn [59].
1.3. Các phương pháp phân lập curcuminoid
Phương pháp tạo phức với chì acetate

Phương pháp tạo phức với chì acetate là quy trình sử dụng từ lâu, được mô
tả trong tư liệu kinh điển Beilstein cùng nhiều tư liệu khác. Hiệu suất chung của
quy trình đạt > 40% so với lý thuyết.
Theo công nghệ này, bột nghệ khô được chiết thô bằng ethanol. Cao ethanol
cô đặc được xử lý trong dung dịch chì acetate 10% để tách curcuminoid ra khỏi

8

Luan van


phần nhựa, lọc lấy phần dung dịch để thu được dung dịch hịa tan của phức chìcurcuminoid.
Xử lý phức chì-curcuminoid bằng dung dịch axit sunfuric loãng, lọc lấy kết
tủa rồi hịa tan lại bằng ethanol để thu được curcuminoid thơ. Tinh chế lại sản
phẩm bằng dietyl ete và CS2 để thu được curcuminoid tinh sạch. Quá trình tinh
sạch được thực hiện theo phương trình sau:
[Curcuminoid-Pb(OR)2] + H2SO4 -> Curcuminoid + PbSO4 + 2HOR
Hiện nay, công nghệ này không được sử dụng để chiết xuất curcuminoid
do độc tính cao của chì.
Phương pháp sử dụng các dung môi dễ bay hơi
Củ nghệ sau thu hoạch được sấy khơ trong lị với khơng khí tuần hồn ở
nhiệt độ 60°C, đến khi đạt độ ẩm ≤ 12%. Củ nghệ khơ được nghiền bột kích thước
hạt bột được quyết định bằng sàng rây Tyler, kích thước 3mm. Thực chất của quá
trình là phân lập tinh dầu trước bằng ether dầu hỏa nhằm loại tinh dầu, sau đó mới
tiếp tục phân lập curcuminoid. Q trình phân lập được thực hiện với máy lắc MA
830. Bình trịn có cổ, bít kín bằng nút cao su, chứa 4g bột nghệ và 50ml ether dầu
hỏa, được đem cân trước và sau q trình phân lập nhằm xác định có sự hao hụt
dung môi trong khi phân lập hay không. Hỗn hợp chất rắn và dung môi này được
khuấy trộn trong suốt q trình phân lập. Sau đó, hỗn hợp được lọc bằng giấy lọc
có chân khơng.

9

Luan van


Hình 1.4. Sơ đồ quy trình phân lập curcuminoid bằng dung môi dễ bay hơi
Phương pháp phân lập curcuminoid sử dụng các dung dịch lưỡng cực
Chất lưỡng cực (hydrotrope): là những hợp chất alkyl mạch ngắn tan được
trong nước, có tính lưỡng cực – có chứa cả phần tử ưa nước và phần tử kị nước.
Tính chọn lọc của chất lưỡng cực đối với curcuminoid trong tế bào có thể
là do cấu trúc phenolic của chúng. Mức độ xáo trộn thành tế bào của củ nghệ cũng
phụ thuộc vào tính chất của chất lưỡng cực: cumene sulfonate hầu như làm phá
hủy hoàn toàn lớp thành tế bào, butyl mono glycol sulfate (BMGS) thì phá hủy ít
hơn nhưng làm xoắn các sợi nhiều hơn, trong khi với Natri salicylate hay paratoluen sulfonate acid (PTSA) hay natri saccharine thì ảnh hưởng khơng nổi bật.
Khả năng xâm nhập hiệu quả cũng phụ thuộc vào bản chất chất lưỡng cực: cumene
sulfonate thâm nhập vào tế bào nghệ tốt nhất, sau đó là BMGS, natri salicylate,
PTSA và natri saccharine. Cumene sulfonate thâm nhập tốt nhất nhưng lại ít tính
chọn lọc, trong khi BMGS cho thấy khả năng xâm nhập cao và tính chọn lọc với

10

Luan van


curcumin cao hơn. Điều này giải thích sự khác nhau về hiệu quả phân lập của các
chất lưỡng cực khác nhau: BMGS cho lượng curcuminoid thu hồi với độ tinh khiết
cao nhất, tiếp theo là Natri salicylate và cumene sulfonate. PTSA và Natri
saccharine cho mức thâm nhập và tính chọn lọc vừa phải, cho lượng sản phẩm
thấp hơn.

Bảng 1.2. Bảng các chất lưỡng cực dùng để phân lập curcuminoid
Các chất lưỡng cực khác nhau dùng để phân lập
Chất lưỡng cực (muối của Natri)

Curcuminoid
% Phân lập

% Độ tinh khiết

Butyl mono glycol sulfate (Na-BMGS)

51,50

97,0

Cumene sulfonate (Na-CS)

38,56

90,70

Salicylate (Na-S)

50,79

89,20

p-Toluen sulfonate acid (Na-PTSA)

13,79

79,30

Trong phương pháp này, quá trình nghiền củ nghệ làm xáo trộn lớp biểu bì,
lớp dưới biểu bì và lớp tế bào hóa bần. Do màng tế bào có chứa thành phần
phospholipid, chất lưỡng cực sẽ phá hủy lớp chất này và thâm nhập vào nội bào,
làm curcuminoid có khả năng tan nhanh hơn trong dung dịch chất lưỡng cực. Lớp
tế bào vỏ được cấu tạo gồm lớp cellulose ngồi, lớp chất khơ ở giữa và lớp
cellulose trong cùng. Dung dịch chất lưỡng cực phá vỡ lớp chất khơ giữa này và
sau đó tới tế bào bần. Lớp tế bào bần bị xáo trộn, bị xoắn lại và chất lưỡng cực
xâm nhập vào các phần bên trong củ nghệ. Khi đó, chất lưỡng cực khơng chỉ làm
tế bào căng lên, mà cịn giải phóng tế bào khỏi các cấu trúc kết nối của nó, giúp
việc chiết xuất curcuminoid dễ dàng hơn.

11

Luan van


Hình 1.5. Quy trình phân lập curcuminoid bằng dung dịch lưỡng cực
1.4. Ứng dụng công nghệ enzyme trong chiết xuất các hợp chất thiên nhiên
1.4.1. Cơng nghệ enzyme
Enzyme là nhóm protein chun biệt hóa cao có vai trị và chức năng sinh
học quan trọng bậc nhất đối với tế bào và cơ thể sống. Enzyme có khả năng xúc
tác cho các phản ứng hóa học với độ đặc hiệu cao [60].
Enzyme có tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học, có hoạt độ
xúc tác lớn. Ở điều kiện thích hợp, hầu hết các enzyme xảy ra với tốc độ nhanh
gấp 108-1011 lần so với phản ứng khơng có chất xúc tác. Bên cạnh đó, enzyme có
12

Luan van


tính đặc hiệu cao và tác dụng trong điều kiện đơn giản, nhiệt độ thích hợp để
enzyme hoạt động 30-50oC, pH trung tính và áp suất thường. Đặc biệt, hầu hết
các enzyme có nguồn gốc tự nhiên khơng độc. Điều này có ý nghĩa quan trọng
trong cơng nghiệp thực phẩm và y học [61].
Sinh vật thường được cấu tạo từ những đại phân tử tương đối trơ
(polypeptid, polysaccharide) khơng có khả năng hịa tan [62]. Các hợp chất thiên
nhiên có hoạt tính sinh học thường tồn tại ở dạng khơng tan, lưu giữ trong các bào
quan dự trữ hoặc tồn tại ở dạng keo kết hợp với các thành phần vách tế bào [63].
Về lý thuyết, tốc độ phản ứng hóa học được xác định bởi giá trị năng lượng hoạt
hóa. Năng lượng hoạt hóa càng lớn thì tốc độ phản ứng càng nhanh và ngược lại.
Bất kì enzyme nào cũng xúc tác theo trình tự sau:
E + S ↔ ES ↔ EP → E + P
Trong đó, E là enzyme, S là cơ chất, P là sản phẩm phản ứng. ES và EP là
phức hợp enzyme với cơ chất và sản phẩm.
1.4.2. Amylase
Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới vi sinh vật. Các
enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải nội phân tử trong
nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước.
RR’ + H-OH → RH + R’OH
Amylase thủy phân tinh bột, glycogen thành glucose, maltose và dextrin.
Amylase có trong nước bọt (ptyalin), dịch tiêu hóa của người và động vật, trong
hạt nảy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn.
Hiện nay, có sáu loại amylase được xếp vào hai nhóm: endoamylase và
exoamylase.
- Endoamylase: Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi
polysaccharide, gồm có:
+ α-amylase

+ pullulanase (hay α-dextrin 6-glucanohydrolase) là enzyme khử trực tiếp
+ transglucosylase (hay oligo-1,6-glucosidase) là enzyme khử gián tiếp
+ amylo-1,6-glucosidase.
- Exoamylase: Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu khử của
chuỗi polysaccharide. Nhóm này gồm có:
+ β-amylase
+ Amyloglucosidase (gluco-amylase hay γ-amylase)
13

Luan van


α-amylase là protein có phân tử lượng thấp, thường nằm trong khoảng
50.000 đến 60.000 Dal. Có một số trường hợp đặc biệt như α-amylase từ lồi vi
khuẩn Bacillus macerans có phân tử lượng lên đến 130.000 Dal.
1.4.3. Cellulase
Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành
cellobiose và cuối cùng là glucose. Thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân
liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose.
Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase, và
β-glucosidase hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose.
Cellulase

Endo-β-1,4-glucanase

β -glucosidase

Exo-β-1,4-glucanase

EC 3.2.1.4

1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase

1,4- β-D-glucan cellobiohydrolase

EC 3.2.1.74

EC.3.2.1.91

Hình 1.6. Sơ đồ phân loại cellulase
Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các
loại oligosaccharide có chiều dài khác nhau. Exoglucanase thủy phân các liên kết
ở đầu khử và đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose
(glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase).
1.4.4. Năng lượng phản ứng xúc tác enzyme
Năng lượng tự do Gibbs là thước đo cho q trình xảy ra phản ứng hóa học
ở nhiệt độ và áp suất không đổi. Năng lượng này được đưa ra bởi Josiah Willard
Gibbs vào năm 1876 để dự đốn q trình phản ứng xảy trong cùng điều kiện
nhiệt độ và áp suất. Năng lượng Gibbs (G) được tính bằng cơng thức:
G = H – T.S
Trong đó:
H, T và S là entanpy, nhiệt độ và entropy.

14

Luan van


Sơ đồ trên Hình 1.7 cho thấy đường cong của năng lượng phản ứng có và
khơng có xúc tác enzyme.

∆G khơng xúc tác

∆G có xúc tác

Hình 1.7. So sánh năng lượng phản ứng có và khơng có xúc tác enzyme [64]
Ghi chú: TSc1, TSc2, TSc3 là các trạng thái chuyển (transition state)
[ES]: tổ hợp phức hệ enzyme-cơ chất
[EP]: tổ hợp phức hệ enzyme-sản phẩm
Q trình phản ứng khơng có xúc tác chỉ đi qua trạng thái chuyển tiếp TS*
với năng lượng tự do ∆Gkhông xúc tác cao, cần mức năng lượng hoạt hóa cao hơn.
Q trình phản ứng xúc tác enzyme đi qua các trạng thái chuyển tiếp TSc1,
TSc2, TSc3 với năng lượng tự do ∆Gcó xúc tác thấp. Chất xúc tác làm giảm năng lượng
hoạt hóa của phản ứng hóa học, nó chỉ tham gia vào các giai đoạn trung gian mà
không tham gia trực tiếp vào phản ứng. Năng lượng liên kết do các tương tác yếu
tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng để làm căng hoặc uốn gấp khúc cơ
chất, tạo điều kiện cho enzyme tiếp xúc với cơ chất dễ dàng. Chính vì vậy, enzyme
tạo được thế năng đặc biệt có lợi nhất về mặt năng lượng để thực hiện phản ứng,
tạo ra vô số sản phẩm trong điều kiện nhiệt độ thấp, áp suất thường.
1.4.5. Ứng dụng công nghệ enzyme chiết xuất hợp chất thiên nhiên
Các nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới có rất nhiều cơng trình nghiên cứu cơng nghệ enzyme chiết
xuất hợp chất thiên nhiên. Gần đây, một số ứng dụng enzyme được sử dụng hỗ
trợ tách tinh dầu và các thành phần dễ bay hơi như:

15

Luan van