(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu hiệu quả chuyển phôi nang trữ đông và một số yếu tố liên quan tại bệnh viện hỗ trợ sinh sản và nam học đức phúc
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1001.05 KB, 83 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN HÀN LÂM
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
PHÙNG THỊ SƠN
Phùng Thị Sơn
SINH HỌC THỰC NGHIỆM
NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ
ĐÔNG VÀ MỘT YẾU TỐ LIÊN QUAN TẠI BỆNH VIỆN
HỖ TRỢ SINH SẢN VÀ NAM HỌC ĐỨC PHÚC
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Sinh học thực nghiệm
2021
Hà Nội - 2021
Luan van
BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
Họ và tên: Phùng Thị Sơn
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
842 0114
TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN
NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ ĐÔNG VÀ
MỘT SỐ YẾU TỐ LIÊN QUAN TẠI BỆNH VIỆN HỖ TRỢ SINH
SẢN VÀ NAM HỌC ĐỨC PHÚC
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH: SINH HỌC
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Cán bộ hướng dẫn 1 : TS. Nguyễn Trung Nam
Cán bộ hướng dẫn 2 : TS. BS. Nguyễn Thị Liên Hương
Hà Nội - 2021
Luan van
LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Phùng Thị Sơn, học viên lớp Cao học - chuyên ngành Sinh học thực
nghiệm, Học viện Hàn Lâm Khoa học Việt Nam, xin cam đoan:
1.
Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dưới sự hướng
dẫn của TS. Nguyễn Trung Nam và TS. Nguyễn Thị Liên Hương
2.
Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kỳ nghiên cứu nào khác đã
được công bố tại Việt Nam.
3.
Các số liệu và thông tin trong nghiên cứu là hồn tồn chính xác,
trung thực và khách quan. Tơi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những cam
kết này.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2021
Học viên
Phùng Thị Sơn
Luan van
LỜI CẢM ƠN
Trong q trình học tập và hồn thành luận văn này, ngồi sự nỗ lực của
bản thân, tơi cịn được sự hướng dẫn giúp đỡ tận tình của các thầy cô, anh chị,
bạn bè và nhà trường cùng những người thân trong gia đình.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS.BS. Nguyễn Thị Liên Hương
Trung tâm Hỗ trợ sinh sản Quốc Gia và TS. Nguyễn Trung Nam, Viện phó
Viện Cơng nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam,
những người thầy trực tiếp, tận tâm hết lòng hướng dẫn, tạo điều kiện và cho
tôi những kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian nghiên cứu và hoàn thành
luận văn.
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu tơi đã được sự hướng dẫn và
giúp đỡ của rất nhiều của thầy cơ và bạn bè để hồn thành đề tài.
Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến:
Tất cả thầy cơ giáo, giảng viên và cán bộ nhân viên Học viện Khoa học
và Công nghệ - Viện hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam đã tạo điều
kiện, hướng dẫn, chỉ bảo tận tình giúp tơi có lượng kiến thức cơ bản nhất định
để hồn thành các mơn học cũng như đề tài luận văn này.
Tập thể cán bộ, nhân viên Bệnh Viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức
Phúc đã tạo điều kiện giúp đỡ tơi trong q trình học tập, thu thập số liệu và
hoàn thành luận văn này .
Cuối cùng, tơi xin cảm ơn gia đình, những người thân và bạn bè đã động
viên, hỗ trợ tôi về mọi mặt trong cuộc sống, học tập và công tác.
Hà Nội, ngày 18 tháng 9 năm 2021
Học viên
Phùng Thị Sơn
Luan van
DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VÀ CHỮ VIẾT TẮT
ART:
Assisted Reproductive Technologies
CI:
Confidence Interval
DS:
Diluent Solution
FET:
Frozen Embryo Transfer
ICM:
Inner Cell Mass (Khối tế bào mầm phơi)
ICSI:
Intra-cytoplasmic Sperm Injection
(Tiêm tinh trùng vào bào tương nỗn)
HTSS:
IVF:
IVM:
Hỗ trợ sinh sản
In-Vitro Fertilizaion (Thụ tinh trong ống nghiệm)
In Vitro Maturation
(Nuôi trứng non trưởng thành trong ống nghiệm)
OR:
Odds Ratio
PVS:
Perivitelline space (Khoang quanh nỗn)
TE:
Trophectoderm (Tế bào lá ni)
TS:
Thawing Solution
TTTON:
Thụ tinh trong ống nghiệm
VS:
Vitrification Solution (thủy tinh hóa)
WS:
Washing Solution
Luan van
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1. Phân loại theo độ nở của khoang phôi nang .................................. 10
Bảng 1. 2. Phân loại theo khối tế bào ICM, TE .............................................. 11
Bảng 1. 3. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nang của tổ chức Alpha .... 12
Bảng 1. 4. Bảng tóm tắt kết quả nghiên cứu của một số tác giả vào chuyển
phôi nang ......................................................................................................... 21
Bảng 2. 1. Phân loại chất lượng hình thái phôi nang ...................................... 29
Bảng 3. 1.So sánh chất lượng phôi trước và sau rã đông................................ 37
Bảng 3. 2. Kết quả sau chuyển phôi nang trữ đông ........................................ 37
Bảng 3. 3. Sự liên quan chất lượng phôi chuyển và thai lâm sàng. ................ 38
Bảng 3. 4. Sự tương quan chất lượng phơi trong nhóm chuyển 2 phơi .......... 38
Bảng 3. 5. Sự tương quan chất lượng phơi trong nhóm chuyển 1 phôi .......... 39
Bảng 3. 6. Sự tương quan giữa chất lượng và số lượng phôi chuyển với thai
lâm sàng........................................................................................................... 40
Bảng 3. 7. So sánh(OR) tương quan của nhóm 1 với nhóm 2,3,4,5 ............... 40
Bảng 3. 8. Sự tương quan giữa tuổi người mẹ với thai lâm sàng ................... 41
Bảng 4. 1. Tỷ lệ thai lâm sàng trong FET ở một số nghiên cứu ..................... 48
Bảng 4. 2. Kết quả chuyển phôi nang của một số trung tâm HTSS .............. 51
Bảng 4. 3. Số lượng phôi nang chuyển theo tuổi ............................................ 53
Luan van
DANH MỤC HÌNH
Hình 2. 1. Phơi thốt khỏi màng bao xung quanh ........................................... 25
Hình 2. 2. Sơ đồ nghiên cứu............................................................................ 26
Hình 2. 3. Quy trình rã đơng phơi ................................................................... 27
Hình 2. 4. Một số hình ảnh phơi nang. ............................................................ 29
Hình 3. 1. Phân bố nhóm tuổi bệnh nhân ........................................................ 33
Hình 3. 2. Chất lượng trước khi đơng ............................................................. 34
Hình 3. 3. Số lượng phơi chuyển .................................................................... 34
Hình 3. 4. Tỷ lệ phơi sống sót ......................................................................... 35
Hình 3. 5. Chất lượng phơi chuyển ................................................................. 35
Hình 3. 6. Hình thái lá ni ............................................................................ 36
Hình 3. 7. Hình thái ICM ................................................................................ 36
Hình 3. 8. Kết quả thai theo nhóm tuổi ........................................................... 39
Luan van
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................... 3
1.1. TRỮ LẠNH PHÔI ................................................................................... 3
1.1.1. Khái niệm trữ lạnh phôi ........................................................................ 3
1.1.2. Một số chỉ định về trữ lạnh phôi .......................................................... 3
1.1.3. Điều kiện của phôi để được trữ lạnh .................................................... 4
1.1.4. Đánh giá hiệu quả trữ lạnh phôi ........................................................... 4
1.2. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHƠI TIỀN LÀM TỔ ............ 4
1.2.1. Phơi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh) .............................. 4
1.2.2. Phôi dâu (ngày 4 sau thụ tinh) .............................................................. 5
1.2.3. Phôi nang .............................................................................................. 5
1.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI PHƠI NANG ................................. 6
1.3.1. Sự phát triển của khoang phôi nang ..................................................... 7
1.3.2. Hình thái khối tế bào mầm phơi (ICM) ................................................ 8
1.3.3. Hình thái lớp ngun bào lá ni (TE) ................................................. 8
1.3.4. Một số đặc điểm hình thái khác của phơi nang .................................... 9
1.4. NHỮNG TIÊU CHUẨN VÀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CHẤT
LƯỢNG PHÔI NANG .................................................................................... 10
1.4.1. Đồng thuận đánh giá phôi của Gardner D.K (1999) .......................... 10
1.4.2. Đồng thuận phân loại phôi nang của tổ chức Alpha (2011)............... 12
1.5. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG LẠNH PHÔI ....................................... 13
1.5.1. Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)………….………...…….13
1.5.2. Phương pháp hạ nhiệt độ chậm (slow Freezing)…….……………..14
1.5.3. Phương pháp hạ nhiệt độ nhanh (fast cooling)…………...…….…15
1.6. MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KẾT QUẢ CHUYỂN PHÔI
ĐÔNG LẠNH ................................................................................................. 15
1.6.1. Tuổi mẹ ............................................................................................... 15
1.6.2. Chất lượng và số lượng phôi chuyển .................................................. 16
1.6.3. Giai đoạn phát triển của phơi.............................................................. 17
1.6.4. Hỗ trợ phơi thốt màng ....................................................................... 21
1.6.5. Một số yếu tố khác và xu hướng hiện nay .......................................... 21
Luan van
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 23
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU ............................................................... 23
2.1.1. Tiêu chuẩn lựa chọn ........................................................................... 23
2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ .............................................................................. 23
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU ...................................... 23
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 23
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu ............................................................................ 23
2.3.2. Cỡ mẫu nghiên cứu ............................................................................. 23
2.4. QUY TRÌNH CHUYỂN PHƠI ĐÔNG LẠNH..................................... 24
2.4.1. Chuẩn bị niêm mạc tử cung ................................................................ 24
2.4.2. Rã đông phôi ....................................................................................... 24
2.4.3. Kỹ thuật hỗ trợ phơi thốt màng (Hatching Assisted)........................ 24
2.5. CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU .......................................... 26
2.5.4 Quản lý và xử lý số liệu ....................................................................... 31
2.5.5 Sai số và phương pháp khống chế sai số ............................................. 32
2.6. ĐẠO ĐỨC NGHIÊN CỨU ................................................................... 32
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................... 33
3.1. ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN ĐƯỢC CHUYỂN PHÔI NANG TRỮ
LẠNH .............................................................................................................. 33
3.1.1. Tuổi ..................................................................................................... 33
3.1.2. Chất lượng phôi trước đông................................................................ 33
3.1.3. Số lượng phơi chuyển ......................................................................... 34
3.2. KẾT QUẢ Q TRÌNH NGHIÊN CỨU ............................................. 35
3.2.1. Tỷ lệ sống của phôi sau rã đông ......................................................... 35
3.2.2. Chất lượng của phôi sau rã đông ........................................................ 35
3.2.3. Kết quả thai sau chuyển phôi.............................................................. 37
3.3. ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ LÊN KẾT QUẢ CHUYỂN
PHÔI TRỮ ĐƠNG .......................................................................................... 37
3.3.1. Liên quan giữa chất lượng phơi chuyển và tỷ lệ thai lâm sàng. ......... 37
3.3.2. Ảnh hưởng của tuổi người mẹ lên kết quả thai .................................. 39
3.3.3. Sự tương quan giữa chất lượng và số lượng phôi chuyển với thai lâm
sàng................................................................................................................ ..40
3.3.4. Bảng sự tương quan giữa tuổi người mẹ với thai lâm sàng ............... 41
Luan van
Chương 4: BÀN LUẬN .................................................................................. 42
4.1. BÀN LUẬN VỀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................... 42
4.1.1. Bàn luận về đối tượng nghiên cứu...................................................... 42
4.1.2. Bàn luận về phương pháp đánh giá phôi nang ................................... 43
4.1.3. Bàn luận về chất lượng phôi trước đông ............................................ 43
4.2. BÀN LUẬN VỀ TỶ LỆ SỐNG VÀ CHẤT LƯỢNG PHÔI SAU RÃ
ĐÔNG ............................................................................................................. 44
4.2.1. Bàn luận về tỷ lệ sống của phôi sau rã đông ...................................... 44
4.2.2. Bàn luận về chất lượng phôi sau rã đông ........................................... 44
4.3. TỶ LỆ THAI VÀ CÁC YẾU TỐ LIÊN QUAN ẢNH HƯỞNG ĐẾN
HIỆU QUẢ CHUYỂN PHÔI TRỮ ĐÔNG. ................................................... 46
4.3.1. Tỷ lệ thai ............................................................................................. 46
4.3. Ảnh hưởng của các yếu tố liên quan đến hiệu quả chuyển phôi trữ đông
....................................................................................................................... ..48
KẾT LUẬN ..................................................................................................... 55
KIẾN NGHỊ .................................................................................................... 56
DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ CỦATÁC GIẢ CĨ LIÊN
QUAN ĐẾN LUẬN VĂN .............................................................................. 57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 58
PHỤ LỤC ........................................................................................................ 66
HÌNH ẢNH PHƠI NANG THEO ĐỘ NỞ KHOANG PHƠI ........................ 71
HÌNH ẢNH MẦM PHƠI (INNER CELL MASS /ICM) ............................... 72
HÌNH ẢNH NGUYÊN BÀO LÁ NUÔI (TROPHECTODERM CELL /TE) 73
Luan van
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kể từ khi em bé đầu tiên ra đời bằng phương pháp thụ tinh trong ống
nghiệm (TTTON-IVF), ngành hỗ trợ sinh sản đã đạt được rất nhiều thành tựu
đáng kể, biến hy vọng mang thai đứa con của chính mình cho nhiều cặp vợ
chồng hiếm muộn thành hiện thực. Cho đến nay đã có hơn 8 triệu trẻ sơ sinh ra
đời bằng phương pháp này trên toàn thế giới. Nhiều thay đổi đã được thực hiện
trong thực hành lâm sàng trong hơn 40 năm qua.
Để tăng tỷ lệ thành cơng cho các chu kỳ TTTON, kích thích buồng trứng
(KTBT) đã trở thành thường quy nhằm tạo được nhiều nỗn, nhiều phơi, tăng
cơ hội có phơi chuyển cho bệnh nhân. Chuyển nhiều phôi giai đoạn phôi phân
chia được ưu tiên trong những năm đầu của điều trị lâm sàng của ART do điều
kiện nuôi cấy phôi đến giai đoạn phôi nang chưa tối ưu. Mặc dù cải thiện tỷ lệ
mang thai và tỷ lệ trẻ sinh sống, nhưng việc chuyển nhiều phôi dẫn đến đa thai
được coi là một biến chứng của TTTON do có liên quan đáng kể đến việc gia
tăng các kết quả bất lợi về sức khỏe cho cả bà mẹ và trẻ sơ sinh, bao gồm tử
vong mẹ, tiền sản giật, tăng huyết áp do thai nghén và đái tháo đường, sinh non,
trẻ sinh nhẹ cân… [1] [2].
Trong những năm gần đây, hiệu quả của nuôi cấy và chuyển phôi ngày
5 đã được chứng minh trong các nghiên cứu trên thế giới. Một tổng kết dựa trên
27 nghiên cứu được đăng tải trên tạp chí Cochrance Review 2016 cho thấy tỷ
lệ làm tổ, tỷ lệ thai lâm sàng và tỷ lệ sinh sống của chuyển phôi ngày 5, 6 cao
hơn so với chuyển phôi ngày 3 trong khi tỷ lệ thai cộng dồn không khác biệt
[3]. Như vậy có thể thấy việc ni cấy phơi ngày 5 là lựa chọn tốt để rút ngắn
thời gian thành cơng của IVF. Ngồi ra, thành cơng của kỹ thuật trữ lạnh, rã
đông và chuyển phôi đông lạnh với tỷ lệ sống sau rã có thể đạt gần 100% đã
góp phần khơng nhỏ trong việc tiết kiệm được thời gian và nhân sự trong một
đơn vị TTTON, đồng thời giảm chi phí điều trị và nâng cao tỉ lệ thành công cho
người bệnh. Với khả năng nuôi cấy được nhiều phôi nang, kỹ thuật đông rã
phôi nang đạt hiệu quả cao, đồng thời khả năng lựa chọn phôi tốt ngày càng
được cải tiến, đa số các trung tâm có xu hướng chỉ chuyển 1-2 phôi và ưu tiên
chuyển phôi giai đoạn phôi nang. Các nghiên cứu trên thế giới cũng cho thấy
có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới thành công của chu kỳ chuyển phôi nang đông
Luan van
2
lạnh như tuổi của mẹ, chất lượng niêm mạc tử cung của mẹ và số lượng, chất
lượng phôi sau rã đông…vv. Tuy nhiên, tại Việt Nam, kỹ thuật nuôi và chuyển
phơi nang đơng lạnh vẫn cịn chưa được nghiên cứu nhiều, đặc biệt là với một
trung tâm được đầu tư trang thiết bị và nhân lực tốt thì tỷ lệ phơi nang sống sau
rã đơng, kết quả có thai khi chuyển phơi nang có đạt chuẩn cao tương đương
các lab tiên tiến trên thế giới hay không, yếu tố liên quan nhất đến kết quả có
thai khi chuyển phơi nang là yếu tố nào? Để trả lời những câu hỏi này chúng
tôi đã tiến hành nghiên cứu “Nghiên cứu hiệu quả chuyển phôi nang trữ
đông và một số yếu tố liên quan tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học
Đức Phúc” nhằm hai mục tiêu:
1. Xác định được tỷ lệ sống và chất lượng sau rã đông của phôi nang tại
Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc
2. Xác định tỷ lệ có thai và một số yếu tố liên quan hiệu quả chuyển phôi nang
trữ đông tại Bệnh viện Hỗ trợ sinh sản và Nam học Đức Phúc.
Luan van
3
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TRỮ LẠNH PHÔI
1.1.1. Khái niệm trữ lạnh phơi
Với việc sử dụng kỹ thuật kích thích buồng trứng (KTBT) để cải thiện và
đơn giản hóa các quy trình TTTON người ta có thể thu nhận được một số lượng
noãn lớn và kết quả là nhiều phôi được tạo thành cùng một lúc. Tuy nhiên không
thể chuyển vào cơ thể người mẹ quá nhiều phôi, hoặc người mẹ chưa sẵn sàng
để nhận phơi chuyển, vì thế các phơi tốtc ó khả năng làm tổ cao cịn lại đã được
trữ lạnh sau đó rã đơng và chuyển phơi vào 1 chu kỳ khác. Từ đó quy trình trữ
lạnh phơi ra đời đã góp phần nâng cao hiệu quả của các phương pháp thụ tinh
trong ống nghiệm.
Mười năm sau khi Whitingham thành công trên việc trữ lạnh phôi chuột,
năm 1983 Trounson và Mohr đã báo cáo trường hợp có thai đầu tiên từ phơi
người trữ lạnh [4]. Kể từ đó, việc trữ lạnh phơi được biết đến và tiếp tục phát
triển mạnh. Điều này thu hút các nhà khoa học tập trung nghiên cứu vào lĩnh
vực này kéo theo sự thay đổi khơng ít của các trung tâm hỗ trợ sinh sản. Hiện tại
kỹ thuật trữ lạnh – rã đông – chuyển phôi đông lạnh được thực hiện thường quy
với tỷ lệ làm tổ của phôi đông lạnh cũng tương tự như của phơi tươi. Từ đó việc
trữ lạnh phơi người phát triển nhanh chóng và trở thành hướng mở không thể
thiếu trong TTTON.
1.1.2. Một số chỉ định về trữ lạnh phơi
- Cịn dư phơi chất lượng tốt sau chuyển phơi tươi.
- Bệnh nhân có nguy cơ bị hội chứng quá kích buồng trứng nặng.
- Xuất huyết nội.
- Niêm mạc tử cung không thuận lợi để chuyển phôi: nghi ngờ polyp buồng
tử cung, nhân xơ tử cung dưới niêm mạc, niêm mạc quá mỏng hoặc bị
dính buồng tử cung, chu kỳ xin – cho nỗn khơng hợp nhất được vịng
kinh…vv
- Khơng chuyển phơi đúng thời điểm do các lý do cá nhân hoặc các bệnh lý
toàn thân như ung thư, điều trị hóa chất, tia xạ….
Luan van
4
- Chuyển phơi khó do catheter khơng qua được cổ tử cung.
- Hiến phơi.
- Bệnh nhân đơng phơi tồn bộ.
1.1.3. Điều kiện của phôi để được trữ lạnh
Phôi được chọn phải có chất lượng tốt và có khả năng sống sót cao và tiếp
tục phát triển tốt sau khi được rã đơng.
- Phơi có thể đơng ở các giai đoạn khác nhau như phôi ngày 1 (hợp tử zygote), các giai đoạn phân chia sớm hoặc giai đoạn phôi nang (blastocyte). Ở
mỗi giai đoạn có các tiêu chuẩn khác nhau để phôi được trữ lạnh, các tiêu chuẩn
này lại phụ thuộc vào mỗi trung tâm hỗ trợ sinh sản khác nhau.
1.1.4. Đánh giá hiệu quả trữ lạnh phôi
Hiệu quả của việc trữ phôi được đánh giá trước tiên qua khả năng sống
của phôi sau khi rã đông. Cấp độ thứ hai là khả năng phát triển của phôi trong
môi trường nuôi cấy và cấp độ thứ ba là khả năng phát triển của phôi sau khi
được chuyển vào tử cung người mẹ.
- Ít nhất 2 giờ sau rã đơng, kiểm tra và đánh giá phơi trên kính hiển vi
đảo ngược.
- Tính tỷ lệ sống sau rã đơng phơi nang.
-
Theo dõi Beta hCG sau 14 ngày chuyển phôi.
-
Theo dõi thai lâm sàng, thai tiến triển.
1.2. CÁC GIAI ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA PHƠI TIỀN LÀM TỔ
1.2.1. Phơi ở giai đoạn phân chia (ngày 2-3 sau thụ tinh)
Khoảng 24 - 26 giờ sau khi diễn ra sự thụ tinh giữa noãn và tinh trùng,
hợp tử bắt đầu sự phân chia đầu tiên đối xứng qua trục (symmetry). Một mặt
phẳng xích đạo được tạo thành bởi đường thẳng định hướng theo các thể cực
và phân chia phôi thành 2 cực gọi là cực phôi (embryonic pole) và cực đối
phôi (abembryonic pole). Sự phân chia của hợp tử - một tế bào thành phơi có
hai phơi bào xảy ra một cách chính xác để sau khi phân chia, một trong hai tế
bào sẽ định hướng về cực phơi và tế bào cịn lại sẽ định hướng về cực đối phôi.
Tiếp theo, mỗi phôi bào lại phân chia đối xứng qua trục theo cơ chế phân bào
Luan van
5
nguyên phân tạo thành phôi bốn tế bào. Các phôi bào sắp xếp thành hình tứ
diện trong khơng gian hình cầu được tạo thành bởi màng trong suốt (Zona
pellucida-ZP). Cứ mỗi 12 - 15 giờ, các phôi bào lại phân chia để nhân đôi số
lượng. Lần phân bào đầu tiên thường kéo dài hơn những lần phân bào sau đó
[5]. Thông thường, phôi sẽ mất khoảng 72 giờ để đạt đến giai đoạn 8 tế bào [5].
1.2.2. Phôi dâu (ngày 4 sau thụ tinh)
Khoảng đầu ngày thứ 4 sau thụ tinh, khi số lương phơi bào đã nhiều, có từ
12 - 16 phôi bào, bắt đầu xảy ra hiện tượng kết đặc dẫn đến hình thành các liên
kết chặt chẽ giữa các phơi bào. Nhìn mặt ngồi đám phơi bào giai đoạn này là
một khối xù xì, lổn nhổn những phôi bào, trông giống như một quả dâu nên gọi
là phôi dâu. Các tế bào của phôi dâu không chỉ sẽ là nguồn gốc của phôi và các
màng gắn chặt với phơi, mà cịn là nguồn gốc của rau và một số cấu trúc liên
quan. Bổ đôi một phôi dâu, vùng trung tâm chủ yếu là các đại phôi bào và được
bao bọc bởi các tiểu phôi bào sắp xếp ở ngoại vi. Màng trong suốt vẫn tồn tại ở
giai đoạn này, bọc ngồi phơi dâu. Do vậy, trong q trình kết đặc, các phơi bào
và các mảnh vụn tế bào khơng hình thành liên kết với các phơi bào khác sẽ bị
đẩy ra ngồi khối phơi nhưng vẫn ở phía trong màng trong suốt cho tới khi phơi
thốt màng [7].
Quan sát dưới kính hiển vi, khi mới hình thành, hình thái của phơi dâu
được thể hiện bằng sự tăng tiếp xúc giữa các phôi bào, nhưng ranh giới giữa
các phơi bào cịn nhìn thấy. Khi q trình kết đặc tăng dần, ranh giới giữa các
phơi bào trở nên khó phân biệt do các phôi bào dàn phẳng ra và kết liền với
nhau. Phôi dâu lúc ở giai đoạn này hồn tồn trơng như một tế bào có nhiều
nhân [8].
1.2.3. Phôi nang
Vào khoảng cuối ngày thứ 4, đầu ngày thứ 5 (100 giờ) sau thụ tinh, phơi
dâu từ vịi trứng di chuyển vào trong buồng tử cung và bị vùi trong chất dịch
do nội mạc tử cung tiết ra. Chất dịch này thấm qua màng trong suốt, vào tới các
khoảng gian bào xen giữa các tiểu phôi bào và đại phôi bào ở một cực của phôi,
làm cho các khoảng gian bào thông với nhau và hợp thành một khoang ngày
càng rộng gọi là khoang phôi nang. Thời điểm này phôi dâu trở thành phôi nang.
Do áp lực thuỷ tĩnh trong khoang phôi nang ngày càng tăng cao, sẽ đẩy khối
Luan van
6
đại phôi bào về một cực của phôi nang, cực này gọi là cực phơi (embryonic pole),
cịn cực đối lập với cực phôi là cực đối phôi (antiembryonic pole). Thành bên và
khoang phôi nang được cấu tạo bởi một hàng tiểu phôi bào dẹt. Trần của khoang
phôi nang là khối đại phơi bào, các tiểu phơi bào cịn phủ cả mặt ngồi khối đại
phơi bào và hướng về phía cực phơi. Những đại phơi bào sẽ tạo ra phơi chính
thức và một số bộ phận phụ của phôi như màng ối, các túi nỗn hồng ngun
phát, thứ phát và niệu nang, do đó được gọi là ngun bào phơi hay khối tế bào
mầm phơi. Những tế bào dẹt có nguồn gốc từ tiểu phôi bào sẽ tạo thành lá nuôi
và màng đệm, sẽ tham gia vào sự cấu tạo phần rau có nguồn gốc từ trứng thụ
tinh, do đó được gọi là các tế bào lá nuôi [8].
Từ ngày thứ 5, phơi nang thốt ra khỏi màng trong suốt nhờ sự tác động
của enzym tiêu hủy. Phôi nang bộc lộ hồn tồn khối tế bào phơi ngun thủy
đang tiếp tục phân chia và tiếp xúc trực tiếp với nội mạc tử cung. Sau một
khoảng thời gian ngắn lọt vào buồng tử cung, phơi nang dính chặt vào lớp biểu
mơ của nội mạc tử cung để bắt đầu giai đoạn làm tổ phơi từ ngày thứ sáu đến
ngày thứ chín, cùng lúc các tế bào liên kết của lớp đệm nội mạc tử cung chịu sự
biến đổi do sự hiện diện của phôi nang và sự tác động của progesteron do hồng
thể tiết ra bằng cách biệt hóa thành những tế bào chế tiết hay tế bào rụng. Phản
ứng của lớp đệm được gọi là phản ứng màng rụng [9].
Để đảm bảo phôi phát triển và làm tổ, số lượng phôi bào của phôi nang và
tỷ lệ giữa số lượng nguyên bào phôi và số lượng các tế bào lá nuôi được chi phối
và điều hòa bởi hệ thống gen. Ở người, tốc độ phân chia của các tế bào lá nuôi
nhanh hơn so với tốc độ phân chia của nguyên bào phơi. Phơi nang ngày 5 có
khoảng 60 phơi bào, tăng đến 160 vào ngày 6 và trên 200 sau khi thoát màng
vào ngày 7 [10].
1.3. MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI PHƠI NANG
Trong vài năm gần đây, cùng với sự phát triển của hệ thống nuôi cấy phôi
hiện đại dựa trên những hiểu biết đầy đủ về sự phát triển của phôi giai đoạn sau
nén đã cho phép kéo dài thời gian nuôi cấy phôi trong ống nghiệm đến giai
đoạn phơi nang. Bên cạnh đó, lý do mà đa số các nghiên cứu ủng hộ cho việc
nuôi cấy phôi kéo dài và chuyển phôi giai đoạn phôi nang là có thể lựa chọn
được phơi có sức sống tốt nhất, tiềm năng làm tổ cao nhất và khả năng đồng bộ
với niêm mạc tử cung của mẹ để tăng kết quả của một chu kỳ thụ tinh trong ống
Luan van
7
nghiệm đồng thời giảm số lượng phôi chuyển, giảm nguy cơ đa thai. Hiện nay,
trên thế giới đã có những hướng nghiên cứu kết hợp sử dụng các đặc điểm hình
thái của phơi nang và xét nghiệm sàng lọc di truyền của phơi với mục đích lựa
chọn phơi tiềm năng nhất sử dụng chuyển phôi nhằm tăng hiệu quả của chu kỳ
IVF [11]. Đa phần các nghiên cứu vẫn ủng hộ cho chuyển phôi giai đoạn phôi
nang và chủ yếu sử dụng những tiêu chuẩn hình thái để lựa chọn phôi chuyển
[12], [13]. Năm 2011, Maheshwari A. và cộng sự trong một nghiên cứu tổng
hợp các kết quả chuyển phôi ở các quốc gia thuộc châu Âu và châu Mỹ, cũng
nhận thấy có sự gia tăng tỉ lệ chuyển phơi giai đoạn phôi nang và đặc biệt là
chuyển phôi đơn [14]. Hệ thống đánh giá hình thái phơi giai đoạn phôi nang
được 2 tác giả là Gardner D. K. và Schoolcraft W. B. Đề cập lần đầu tiên vào
năm 1999 đã nhanh chóng được áp dụng tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong
ống nghiệm trên thế giới dựa trên 3 tiêu chí: sự phát triển của khoang phơi nang,
đặc điểm của khối tế bào mầm phôi (ICM - Inner Cell Mass) và đặc điểm của
nguyên bào lá nuôi (TE - Trophectoderm) [15].
1.3.1. Sự phát triển của khoang phôi nang
Sự phát triển của phôi nang được xác định khi bắt đầu xuất hiện những
khoang chứa dịch của bản thân khối phơi. Lượng dịch tiết ngày một nhiều và
tích tụ lại để hình thành một khoang, sau này sẽ phát triển thành khoang phôi
nang. Cùng thời điểm này, khối tế bào trong phơi cũng có những thay đổi quan
trọng, biệt hóa để hình thành 2 loại tế bào và số lượng tế bào cũng tăng lên
nhanh chóng. Việc nghiên cứu thời điểm và mức độ phát triển của khoang phôi
nang có vai trị rất quan trọng, các kết quả nghiên cứu của Gardner D. K. và
cộng sự năm 2000; Ahlstrom A. và cộng sự năm 2011, đều cho cùng một kết
luận về vai trị của khoang phơi nang gắn với tiềm năng phát triển của phôi nang
[16] [17]. Năm 2013, Van den Abbeel E và cộng sự nghiên cứu ảnh hưởng của
các tiêu chuẩn về hình thái phơi nang đến khả năng tiên lượng thành công của
kỹ thuật thụ tinh trong ống nghiệm, cũng nhận thấy có mối tương quan giữa độ
giãn rộng của khoang phôi nang với tỉ lệ có thai sinh sống [18]. Cùng năm 2013,
Thompson S. M. và cộng sự đã nghiên cứu đánh giá độ giãn rộng của khoang
phơi nang có liên quan đến việc tiên lượng tỉ lệ thai lâm sàng và thai sinh sống
của một chu kỳ thụ tinh trong ống nghiệm [19]. Như vậy, đã có rất nhiều nghiên
cứu đánh giá và kết luận vai trị của tốc độ phát triển khoang phơi nang đến kết
Luan van
8
quả của quá trình tiên lượng cũng như dự kiến kết quả thành công của một chu
kỳ chuyển phôi nang.
1.3.2. Hình thái khối tế bào mầm phơi (ICM)
Ngay khi phơi nang phát triển đầy đủ, thể tích khoang chiếm tồn bộ thể
tích khối phơi, cần có thêm những tiêu chí để phân loại chất lượng phơi nang
rõ ràng hơn. Vì lúc này phơi nang đã hình thành 2 loại tế bào với các đặc trưng
hình thái khác nhau. Các tế bào ở lớp phía ngồi của phơi nang sẽ có đặc điểm
giống như một lớp tế bào biểu mô dạng dẹt. Chúng có xu thế dẹt lại để hình
thành lớp "biểu mô" làm ranh giới của phôi nang với môi trường xung quanh.
Lớp tế bào này là nguyên bào lá ni (TE - Trophectoderm). Những tế bào nằm
trong lịng khoang phơi nang thường có kích thước lớn hơn, tập trung thành
một cụm và nằm lệch về một cực của phôi nang, được gọi là khối tế bào mầm
phôi (ICM - Inner Cell Mass) [9]. Nghiên cứu của Balaban B. Năm 2000, chỉ
ra có mối liên hệ chặt chẽ giữa đặc điểm về hình thái của ICM với kết quả có
thai lâm sàng. Nếu ICM càng lớn và các tế bào liên kết càng chặt thì tỉ lệ thành
cơng khi chuyển những phôi này sẽ cao hơn [20].
Năm 2011, Ahlstrom A. và cộng sự đã tiến hành hồi cứu đánh giá vai trò
độc lập của từng yếu tố ảnh hưởng đến việc đánh giá tiên lượng tỉ lệ có thai [16].
Kết quả cho thấy vai trị quan trọng của hình thái ICM trong việc đánh giá tiên
lượng kết quả tỉ lệ thai sinh sống. Khi chuyển phơi nang có ICM tốt thì tỉ lệ thai
sinh sống lên tới 45,3% và tỉ lệ này giảm dần khi chất lượng ICM kém đi.
Tương tự trong nghiên cứu của Van den Abbeel E. và cộng sự về mối liên hệ
giữa các đặc điểm hình thái của phôi nang và kết quả của chu kỳ chuyển phơi
đơn, nhận thấy vai trị của việc phân loại ICM trong khả năng tiên lượng sảy
thai sớm, phơi có ICM xấu cho tỉ lệ sảy thai cao hơn so với phơi có ICM tốt.
1.3.3. Hình thái lớp ngun bào lá nuôi (TE)
Nguyên bào lá nuôi (Trophectoderm - TE) là những tế bào có kích thước
nhỏ hơn so với tế bào mầm phơi, nằm bọc phía ngồi ngay sát màng trong suốt.
Ngun bào lá ni có thể dễ dàng phân biệt so với khối tế bào mầm phôi khi
phôi nang bắt đầu giãn rộng. Về mặt phôi thai học, TE giữ vai trị quan trọng
trong việc giúp cho phơi làm tổ vào niêm mạc tử cung của mẹ. Đặc biệt những
hiểu biết gần đây về vai trò của lớp TE tại cực phôi. Chúng tiết ra một số yếu
Luan van
9
tố hỗ trợ, hoạt hóa với niêm mạc tử cung tại vị trí phơi làm tổ. Các tế bào lá
ni này cịn thực hiện chức năng giúp cho phơi thốt ra khỏi màng trong suốt
vẫn bao bọc phôi trong suốt giai đoạn phơi phân chia và biệt hóa trước đó [8].
Năm 2012, Honnma H. và cộng sự đã công bố nghiên cứu trên 1087 chu kỳ rã
đông và chuyển phôi nuôi cấy ngày 5 sau rã đông, khẳng định lại vai trị quan
trọng của tế bào lá ni chứ khơng phải khối tế bào mầm phôi trong việc xem
xét đánh giá lựa chọn phơi để chuyển. Phải chăng có sự vơ lý khi đánh giá vai
trị của TE quan trọng hơn so với ICM trong quá trình phát triển của phôi nang
ở giai đoạn sớm [21]. Năm 2013, De Paepe C. và cộng sự, trong nghiên cứu
của mình, đã phần nào giải thích vai trị quan trọng của tế bào lá nuôi ở giai
đoạn phát triển sớm của phôi nang. Ngồi ra tác giả cịn nhận thấy khi ni cấy
độc lập phơi nang chỉ có các tế bào lá ni (đã tách bỏ khối tế bào phôi), các tế
bào này sẽ tiếp tục biệt hóa để hình thành ICM mới [22]. Đây là một quan niệm
mới và khác biệt với những hiểu biết trước đây về việc hình thành 2 khối tế bào
có kích thước khác nhau ngay từ những ngày đầu của q trình phân cắt phơi.
1.3.4. Một số đặc điểm hình thái khác của phơi nang
Thối hóa phơi bào: Phơi bào bị thối hóa có thể do tổn thương không hồi
phục (hoại tử) hoặc do chết theo chương trình (apoptosis). Các tế bào thối hóa
do hoại tử thường trương phồng, màng tế bào mất tính liên tục. Trong khi đó,
tế bào chết theo chương trình thường teo đét lại, nhân tế bào vỡ ra thành nhiều
mảnh, sau đó tế bào cũng phân rã làm nhiều mảnh nhỏ [8].
Nghiên cứu của Hardy năm 1989 cho thấy tỷ lệ tế bào thối hóa xấp xỉ
nhau ở TE và ICM, khoảng <10% ở phôi tốt và rất tốt ngày 5 và 6. Tỷ lệ này
tăng lên khi nuôi cấy kéo dài đến ngày 7, phơi có chất lượng xấu, tỷ lệ thối
hóa phơi bào cũng tăng (38,6%) [23].
Các tế bào khơng tham gia hình thành phơi nang: Trong q trình phát
triển của phôi, một số tế bào dừng phát triển ở giai đoạn phơi nén (compact) sẽ
bị loại khỏi q trình hình thành phơi nang và bị đẩy ra ngồi khoang PVS.
Những tế bào dừng phát triển ở giai đoạn muộn hơn, thường bị đẩy ra khoang
phơi nang thay vì khoang PVS. Những tế bào này thường có ít liên kết khe với
các tế bào lân cận hơn so với những tế bào bình thường [8].
Nghiên cứu của Kovacic năm 2004, đánh giá tỉ lệ trẻ sinh sống từ những
phôi mang những bất thường hình thái khác nhau cho thấy: so với nhóm chứng
Luan van
10
(nhóm phơi có chất lượng tốt, tỷ lệ trẻ sinh sống là 45,2%), các nhóm phơi
mang bất thường hình thái đem lại tỷ lệ sinh sống giảm. Cụ thể: phôi nang có
mảnh vỡ bào tương và có tế bào TE thối hóa tỷ lệ trẻ sinh sống là: 32,8%; phơi
có tỷ lệ tế bào không tham gia vào khối phôi nang ≤20%: 16,7%; phơi có tế bào
TE và ICM thối hóa: 7,7% và phơi nang có kích thước rất nhỏ với tỷ lệ tế bào
không tham gia tạo cấu trúc phôi nang >20% đem lại tỷ lệ sinh sống chỉ 1,2%
[24].
1.4. NHỮNG TIÊU CHUẨN VÀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI CHẤT
LƯỢNG PHƠI NANG
Dựa vào những đặc điểm của phơi nang: sự phát triển của khoang phơi
nang, hình thái khối tế bào mầm phơi và hình thái của lớp tế bào lá nuôi, nhiều
tiêu chuẩn phân loại chất lượng phôi nang đã ra đời và được áp dụng rộng rãi
tại nhiều trung tâm hỗ trợ sinh sản trên thế giới.
Hệ thống đánh giá hình thái phơi giai đoạn phơi nang được 2 tác giả là
Gardner D. K. và Schoolcraft W. B. đề cập lần đầu tiên vào năm 1999 đã nhanh
chóng được áp dụng tại hầu hết các trung tâm thụ tinh trong ống nghiệm trên
thế giới [15].
1.4.1. Đồng thuận đánh giá phôi của Gardner D.K (1999)
* Đánh giá bước 1 dựa vào khoang phơi nang và hiện tượng thốt màng.
(Hình ảnh ở phụ lục 1).
Bảng 1.1. Phân loại theo độ nở của khoang phôi nang
Độ
nở
Đặc điểm
Phôi nang giai đoạn sớm (early blastocyst) khi khoang dịch
1
chiếm dưới 50% tổng thể tích của phôi
Phôi nang (blastocyst) khi khoang dịch chiếm từ trên 50%
2
3
tổng thể tích của phơi.
Phơi nang đầy: khoang dịch chiếm hầu hết thể tích của phơi
Luan van
11
4
Phôi nang nở rộng: khoang dịch phát triển rộng làm cho
màng ZP bắt đầu mỏng dần.
5
Phơi nang đang thốt màng: khi TE bắt đầu thốt ra khỏi
màng trong suốt.
6
Phơi nang đã thốt màng: khi phơi nang đã thốt TE ra khỏi
màng trong suốt.
* Đánh giá bước 2 (hình ảnh phụ lục 1): Đối với phôi nang từ giai đoạn 2 đến
giai đoạn 6, cần phải đánh giá bước 2 dưới kính hiển vi đảo ngược về đặc điểm
mầm phơi (ICM) và nguyên bào lá nuôi (TE) theo hệ thống đánh giá này thì
cũng chia lá ni và nụ phơi thành 3 loại dựa trên số lượng và sự gắn kết của
các tế bào như sau:
Bảng 1.2. Phân loại theo khối tế bào ICM, TE
Khối tế bào
mầm phôi
(ICM)
A
Nổi bật, quan sát rõ, có nhiều tế bào kết khối và
liên kết chặt.
B
Có thể quan sát rõ, nhiều tế bào nhưng không liên
kết chặt.
C
Khi có rất ít tế bào, khó quan sát.
A
Lớp tế bào lá
ni (TE)
B
C
Có nhiều tế bào biểu mơ liên kết chặt chẽ với
nhau thành 1 lớp liên tục.
Có ít tế bào, liên kết lỏng lẻo hơn, rời rạc.
Có rất ít tế bào tạo nên một biểu mô lỏng lẻo.
Với cách đánh giá như vậy các số liệu nghiên cứu sẽ áp dụng theo cùng
hệ quy chiếu đã được thống nhất trên quy mô cả nước cũng như trên phạm vi
thế giới để đánh giá chất lượng của phôi nuôi cấy trong ống nghiệm.
Mặc dù cách đánh giá hình thái của Gardner D. K. chưa bao hàm trọn vẹn
các đặc điểm về hình thái của phơi nang, đặc biệt là những trường hợp có các
yếu tố khơng theo quy luật, nhưng ưu điểm của cách phân loại này là rất dễ áp
dụng và đã phân loại được phôi nang dựa trên 3 tiêu chí quan trọng. Đây cũng
là 3 thành phần cấu tạo chính của phơi nang, đó là:
Luan van
12
- Sự phát triển hay độ nở của khoang phôi nang
- Đặc điểm của tế bào lá nuôi (TE- Trophectoderm)
- Khối tế bào mầm phôi (ICM - Inner Cell Mass). Trong đó, mức độ phát
triển của khoang phơi nang được chia thành 6 giai đoạn. Khi khoang phôi nang
phát triển từ giai đoạn 2 trở lên, thì có thêm những mô tả chi tiết về tế bào lá
nuôi (TE) và khối tế bào mầm phôi (ICM). Theo hệ thống phân loại này thì tế
bào lá ni và khối tế bào mầm phôi được chia thành 3 loại dựa trên số lượng và
sự gắn kết của các tế bào[25].
1.4.2. Đồng thuận phân loại phôi nang của tổ chức Alpha (2011)
Về căn bản cách đánh giá chất lượng phôi nang này cũng dựa theo tác giả
Gardner D. K. Năm 1999 nhưng có một số điều chỉnh để có thể đánh giá độ giãn
rộng của phơi theo 4 cấp độ thay vì 6 cấp độ. Từ đó, cho phép thống nhất cách
đánh giá chất lượng phôi nang dễ dàng hơn, để phân chia phơi nang thành 3
loại tốt, trung bình và xấu.
Bảng 1.3. Đồng thuận đánh giá chất lượng phôi nang của tổ chức Alpha
Chỉ tiêu đánh giá
Tốc độ phát triển
Khối tế bào mầm
phôi (ICM)
Phân loại
Đặc điểm
1
Phôi nang sớm
2
Phôi nang
3
Phôi nang nở rộng
4
Phôi nang thốt màng (đã hồn tất
hoặc đang thốt màng)
A
Nổi bật, quan sát rõ, có nhiều tế bào
kết khối và liên kết chặt
B
Có thể quan sát rõ, nhiều tế bào
nhưng khơng liên kết chặt
C
Khó quan sát, có ít tế bào
Luan van
13
Lớp tế bào lá nuôi
(TE)
A
Nhiều tế bào, liên kết chặt với nhau
thành một lớp liên tục
B
Ít tế bào, liên kết rời rạc
C
Rất ít tế bào
(Nguồn: Theo đồng thuận đánh giá phân loại nỗn và phơi năm 2011) [26].
Ngồi ra, cịn rất nhiều cách phân loại phôi, tùy từng trung tâm có lab phân
phơi thành 3 độ: độ 1, độ 2, độ 3 nhưng lab khác phân phôi thành 4 độ: độ 1,
độ 2, độ 3, độ 4 và điểm giống nhau đều dựa vào chất lượng của khối tế bào
mầm (ICM), lớp tế bào lá nuôi (TE) và độ nở của phơi.
1.5.
CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐƠNG LẠNH PHƠI
Hiện nay, kỹ thuật trữ lạnh có thể được chia thành ba nhóm chính: hạ nhiệt
độ chậm (slow freezing), hạ nhiệt độ nhanh và hạ nhiệt độ cực nhanh hay thủy
tinh hóa (vitrification).
1.5.1. Phương pháp thủy tinh hóa (Vitrification)
Thủy tinh hóa (Vitrification) là quá trình làm lạnh phơi với thời gian rất
nhanh, trong suốt q trình hạ nhiệt độ tồn bộ khối vật chất bên trong và bên
ngoài tế bào chuyển dạng thành khối đặc, trong suốt giống thủy tinh (glasslike) mà khơng có sự tạo thành tinh thể đá bên trong mẫu tế bào. Hiện tượng
này cần tốc độ làm lạnh cực nhanh hoặc sử dụng dung dịch có nồng độ cao,
điều này làm giảm sự hình thành tinh thể đá và tăng tính nhớt ở nhiệt độ thấp.
Với kỹ thuật này, sự thành công phụ thuộc vào việc loại bỏ nước được hình
thành trong các tế bào của phơi trong q trình trữ lạnh. Để tránh sự hình thành
tinh thể nước đá trong phôi, kỹ thuật trữ lạnh phôi bằng phương pháp thủy tinh
hóa có chất bảo quản lạnh được thêm vào để thay thế hầu hết nước có trong
phơi. Chất bảo quản lạnh sẽ ngăn ngừa hình thành tinh thể nước đá, nên phơi
sẽ được an tồn trong q trìnhh trữ lạnh. Khi phôi được lấy ra từ các thùng trữ
lạnh để sử dụng, chất bảo quản lạnh sẽ được loại bỏ khỏi tế bào phôi để thay
thế bằng nước.
Phương pháp thủy tinh hóa bao gồm sử dụng nồng độ chất bảo quản đông
lạnh cao (5-7M) và tốc độ làm lạnh cực nhanh (2000-2500°C/phút). Tế bào bị
khử nước nhờ tiếp xúc với nồng độ chất bảo quản đông lạnh cao. Sự chuyển
Luan van
14
sang trạng thái thủy tinh xảy ra ở khoảng -130 oc nhưng dao động phụ thuộc
vào thành phần trong dung dịch thủy tinh hóa.
Trong q trình thủy tinh hóa, thời gian tiếp xúc với dung dịch bảo quản
của mẫu phải ngắn do ảnh hưởng độc tính của dung dịch bảo quản có nồng độ
cao. Tuy nhiên, nếu thời gian tiếp xúc quá ngắn, các chất bảo quản chưa thấm
vào đủ và tinh thể nội bào có thể hình thành, thậm chí cịn có cả tinh thể đá
ngoại bào. Cách để ngăn ngừa độc tính của chất bảo quản trong quá trình thủy
tinh hóa là sử dụng nồng độ chất bảo quản cao trong thời gian ngắn hoặc tăng
thời gian cân bằng với dung dịch bảo quản có nồng độ thấp hơn.
Năm 1937, Luyet là người đầu tiên đã mô tả đơng lạnh mơ bằng phương
pháp thủy tinh hóa. Người ta có thể nhận thấy rằng phương pháp thủy tinh hóa
tỏ ra có nhiều ưu thế hơn so với phương pháp đơng lạnh chậm: ngồi ưu điểm
tiết kiệm về thời gian, giảm bớt chi phí cho một trường hợp đơng lạnh trứng
hoặc phôi, khả năng sống sau rã đông của trứng/phôi khi được đơng lạnh bằng
kỹ thuật thủy tinh hóa cao hơn rất nhiều so với kỹ thuật đông lạnh chậm [27].
Nghiên cứu tổng quan năm 2008 đã chỉ ra rằng phương pháp thủy tinh hóa
cho tỷ lệ sống sót sau rã đơng cao hơn có ý nghĩa thống kê so với phương pháp
hạ nhiệt độ chậm, tuy nhiên tỷ lệ làm tổ thì khơng có sự khác biệt giữa hai nhóm
[28].
1.5.2. Phương pháp hạ nhiệt độ chậm (slow freezing)
Phương pháp hạ nhiệt độ chậm với chất bảo quản đông lạnh
(Cryoprotectant) là PROH, với môi trường cơ bản là môi trường đệm phosphate
(PBS) hoặc mơi trường cấy phơi có bổ sung thêm 20% huyết thanh ngày càng
ít được sử dụng. Trước khi làm lạnh, phôi được cho tiếp xúc với môi trường có
chất bảo quản để rút bớt nước ra khỏi tế bào. Nồng độ PROH và sucrose trong
từng môi trường là: giai đoạn làm lạnh 1(15 phút): 1,5M PROH và giai đoạn
làm lạnh 2 (5 phút): 1,5M PROH + 0,1M sucrose. Sau đó phơi được cho vào
các ống trữ có thể tích khoảng 0,25ml và trữ theo chương trình.
Với phác đồ này, quá trình mất nước cần được diễn ra từ từ để hạn chế sự
thành lập tinh thể nước đá, địi hỏi phải mất nhiều thời gian và có máy móc.
Luan van
15
Qui trình đơng lạnh này có thể áp dụng cho đông lạnh phôi ở bất cứ giai đoạn
nào.
1.5.3. Phương pháp hạ nhiệt độ nhanh (fast cooling)
Phương pháp làm lạnh nhanh (khoảng -30 oC /phút) không phụ thuộc vào
sự cân bằng giữa sự hình thành tinh thể đá và sự khử nước của tế bào, mà chỉ
phụ thuộc vào nồng độ cao của chất bảo quản lạnh và sự đi vào của chất bảo
quản làm giảm lượng nước của tế bào, nhờ đó làm giảm sự hình thành tinh thể
đá nội bào. Khi trữ lạnh bằng phương pháp làm lạnh nhanh nếu mơi trường chất
trữ lạnh có nồng độ cao (40% tổng thể tích) thì khi trữ lạnh sẽ khơng có sự hình
thành tinh thể đá, cịn nếu nồng độ mơi trường chất trữ lạnh thấp thì tinh thể đá
được hình thành. Phần lớn những phương pháp làm lạnh nhanh đều rất đơn
giản. Đơn giản nhất là phương pháp cho phôi hoặc trứng trực tiếp vào môi
trường chứa chất bảo quản rồi cho vào nitơ lỏng sau khi đã cân bằng áp suất
thẩm thấu. Cịn phương pháp rã đơng đơn giản nhất là cho straw vào trong nước
ấm rồi từng bước loại bỏ chất trữ lạnh.
Ưu điểm của phương pháp làm lạnh nhanh là khá đơn giản, có sự thay
đổi trong thành phần của chất bảo quản lạnh giúp sự mất nước nhanh hơn từ tế
bào, thời gian tiến hành trữ lạnh và rã đông ngắn, không nhất thiết sử dụng đến
thiết bị làm lạnh (máy trữ phơi). Tuy nhiên, có nhiều bằng chứng cho thấy về
tính gây độc của chất trữ lạnh đối với phôi, cụ thể khi nhiệt độ cân bằng trên
20 oC. Để giảm ảnh hưởng độc này có thể đặt phơi tiếp xúc với chất bảo quản
xung quanh 0 oC nhưng điều kiện này lại làm giảm tốc độ khuếch tán của chất
bảo quản qua màng tế bào [29].
1.6.
MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KẾT QUẢ CHUYỂN
PHƠI ĐƠNG LẠNH
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng có nhiều yếu tố ảnh hưởng tới tỷ lệ thành
công của chu kỳ chuyển phôi đông lạnh.
1.6.1. Tuổi mẹ
Tuổi mẹ lúc được chọc hút trứng trong chu kỳ thụ tinh ống nghiệm và tuổi
Luan van
