(Luận văn thạc sĩ) kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia bungarus, daudin, 1803 ở việt nam
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (1.43 MB, 77 trang )
BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ ĐÀO TẠO
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN QUỐC HUY
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH SINH HỌC
KẾT HỢP HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU CHẨN LOẠI GIỐNG RẮN CẠP NIA BUNGARUS
DAUDIN, 1803 Ở VIỆT NAM
Hà Nội – 2021
Luan van
BỘ GIÁO DỤC
VIỆN HÀN LÂM
VÀ ĐÀO TẠO
KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
NGUYỄN QUỐC HUY
KẾT HỢP HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN
CỨU CHẨN LOẠI GIỐNG RẮN CẠP NIA BUNGARUS DAUDIN,
1803 Ở VIỆT NAM
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:
8 42 01 14
LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Hướng dẫn 1: PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Vĩnh Thanh
Hà Nội - 2021
Luan van
I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là cơng trình
nghiên cứu của tơi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tơi tự tìm hiểu và
nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách
quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên
cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hồn
chịu trách nhiệm.
Hà Nơi, ngày tháng năm 2021
Nguyễn Quốc Huy
Luan van
II
LỜI CẢM ƠN
Lời cảm ơn đến thầy PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo, TS. Nguyễn Vĩnh Thanh
đã hướng dẫn tận tình, chu đáo, giúp đỡ tơi trong q trình khảo sát thực địa,
phân tích số liệu, cơng bố cơng trình khoa học và hoàn thiện luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn GS. TS. Nguyễn Quảng Trường, TS. Phạm Thế Cường,
TS. Lương Mai Anh, ThS. Phan Quang Tiến (Viện Sinh thái và Tài ngun
sinh vật), NCS Ninh Thị Hịa, NCS. Ngơ Ngọc Hải (Bảo tàng Thiên nhiên Việt
Nam) cùng các đồng nghiệp đã hỗ trợ trong quá trình khảo sát thực địa, cung
cấp hình ảnh, số liệu và hỗ trợ cơng tác phân tích mẫu trong phịng thí nghiệm
của luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn Cán bộ thuộc phòng Bảo tồn Thiên nhiên – Bảo tàng
Thiên nhiên Việt Nam và Ban lãnh đạo Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn phòng Động vật – Viện Sinh thái và Tài Nguyên Sinh
vật đã hỗ trợ mẫu vật để tơi có nguồn tư liệu thể hồn thành luận văn.
Xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình và những người thân đã hết lịng giúp
đỡ, động viên tơi trong q trình thực hiện đề tài và hồn thành luận văn
Xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, các phòng chức năng của
Học viện Khoa học và Cơng nghệ để luận văn được hồn thành.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài độc lập cấp quốc gia mã số
ĐTĐLCN.38/21.
Hà Nôi, ngày tháng năm 2021
Nguyễn Quốc Huy
Luan van
III
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1.
Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1
2.
Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2
3.
Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2
4.
Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................... 3
5.
Những đóng góp mới của đề tài .............................................................. 3
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU.....................................4
1.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam ................................................. 4
1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA-barcodes).......................................... 5
1.3. Các nghiên cứu bổ sung dẫn liệu mới về phân loại học ............................ 7
1.4. Tổng quan các nghiên cứu về giống Bungarus .......................................... 8
1.4.1. Trên thế giới .................................................................................... 8
1.4.2. Ở Việt Nam ..................................................................................... 9
1.5. Khái quát về điều kiện tự nhiên ở Việt Nam ........................................... 10
1.5.1. Địa hình ......................................................................................... 10
1.5.2. Khí hậu .......................................................................................... 11
1.5.3. Thủy văn........................................................................................ 11
1.5.4. Thảm thực vật................................................................................ 12
CHƯƠNG 2: THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHƯƠNG PHÁP VÀ TƯ LIỆU
NGHIÊN CỨU..............................................................................................13
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 13
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu .................... 16
2.3.2. Phương pháp kế thừa..................................................................... 16
2.3.3. Phương pháp khảo sát thực địa thu thập mẫu vật nghiên cứu ...... 16
2.3.5. Phương pháp phân tích hính thái .................................................. 17
2.3.6. Phương pháp phân tích sinh học phân tử ...................................... 19
Luan van
IV
2.3.7. Xử lý số liệu .................................................................................. 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................22
3.1. Thành phần loài của giống Bungarus ở Việt Nam .................................. 22
3.1.1. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ..................... 22
3.1.2. Đặc điểm hình thái các lồi Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ....... 23
3.2. Khóa định loại các lồi trong giống Bungarus ở Việt Nam. ................... 41
3.3. Đặc điểm phân tử vùng gen COI của quần thể và các loài Bungarus. .... 41
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus
ở Việt Nam .............................................................................................. 41
3.3.2. Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen COI mẫu giống Rắn cạp nia
Bungarus ở Việt Nam. ............................................................................ 46
3.3.3. Xác định trình tự nucleotide vùng gen COI của các lồi trong
giống Bungarus tại Việt Nam ................................................................. 46
a. Trình tự đoạn gen COI của loài B. candidus ....................................... 46
3.3.4 Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Bungarus tại Việt
Nam ......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................55
Luan van
V
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.2. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống
Bungarus ......................................................................................................... 20
Bảng 3.1. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ..................... 233
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các lồi Bungarus trong nghiên cứu này ...... 399
Bảng 3.3. Độ sạch và hàm lượng ADN của 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus
ở Việt Nam ...................................................................................................... 42
Bảng 3.4. Thơng tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu .................. 443
Luan van
VI
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Địa điểm thu thập mẫu vật các lồi thuộc giống Bungarus ở Việt Nam
....................................................................................................................... 144
Hình 2.2. Vị trí các vảy trên tồn cơ thể của lồi rắn cạp nia ...................... 199
Hình 3.1. Rắn cạp nia nam/B. candidus: IEBR/NT.2016.94 ........................ 277
Hình 3.2.Các đặc điểm hình thái của B. multicinctus và lồi B. “wanghaotingi”
và B. candidus ............................................................................................... 278
Hình 3.3. Bản đồ phân bố loài B. candidus ở Việt Nam............................... 288
Hình 3.4. Rắn cạp nia sơng hồng/B. slowinskii: ♂IEBR/K233 .................. 3131
Hình 3.5. Bản đồ phân bố lồi B. slowinskii ở Việt Nam ........................... 3232
Hình 3.6. Rắn cạp nong/B. fasciatus: ♂ VMNN. 07958 .............................. 355
Hình 3.7 Bản đồ phân bố lồi B. fasciatus ở Việt Nam ................................ 366
Hình 3.8 Bản đồ phân bố loài B. flaviceps ở Việt Nam ................................ 388
Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở
Việt Nam trên gel agarose 1% (các giếng từ 1-9 là thứ tự các mẫu tương ứng
với số thứ tự trong bảng 3.2). .......................................................................... 42
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của 09 mẫu mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt
Nam phân tích với cặp mồi COI điện di trên gel agarose 1% (M: Marker phân
tử 100bp; VQN1-9: ký hiệu mẫu) ................................................................. 466
Hình 3.11. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của lồi Rắn cạp
nia nam B. candidus ...................................................................................... 477
Hình 3.12. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của lồi Rắn cạp
nia sơng hồng B. slowinskii ........................................................................... 488
Hình 3.13. Cây quan hệ di truyền của các lồi thuộc giống Bungarus xây dựng
trên mơ hình BI ............................................................................................... 52
Luan van
VII
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu
Nội dung
cs.
Cộng sự
NCBI
National Center for Biotechnology Information
OD
Mật độ quang học (Optical Density)
PCR
Polymerase Chain Reaction
bp
Cặp bazơ (base pair)
BLAST
Basic Local Alignment Search Tool
TAE
Tris Acetate EDTA
IEBR
Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
IUCN
Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế
KBTTN
Khu Bảo tồn thiên nhiên
Max
Giá trị lớn nhất
Min
Giá trị nhỏ nhất
VQG
Vườn Quốc gia
VNMN
Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam
♂
Con đực
♀
Con cái
Luan van
1
MỞ ĐẦU
1.
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Việt Nam là một trong trong 25 quốc gia có mức độ dạng sinh học cao
nhất thế giới (Myers và cs. 2000) [Error! Reference source not found.] trong
trong đó có khu hệ bị sát. Số lượng loài tăng nhanh trong thập kỷ gần đây: từ
ghi nhận 258 vào năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc lên đến 368
loài vào năm 2009 (Nguyễn và cs. 2009) [2], và 420 loài vào năm 2013. Cho
tới nay là hơn 500 lồi (tính đến tháng 10-2021 theo Uetz & Hošek 2021 [3].
Nhiều loài mới được phát hiện mô tả và ghi nhận mới được phát hiện ở Việt
Nam trong hai thập kỷ gần đây, trong đó giống Bungarus có lồi mới Bungarus
slowinskii được Kuch và cs phát hiện và mô tả năm 2005 [4].
Giống rắn cạp nia Bungarus, Daudin 1803 thuộc họ rắn hổ Elapidae, F.
Boie, 1827 là nhóm rắn có nọc độc, hiện ghi nhận 16 lồi trên thế giới có vùng
phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á từ Pakistan, Ấn Độ và Afghanistan ở
phía tây, và phía đơng nhiệt đới Đơng Nam Á, tồn bộ tiểu vùng Ấn Trung và
phần cịn lại của Châu Á (Slowinski, 1994; Kharin và cs. 2011; Uetz & Hošek,
2020) [5, 6, 3]. Ở Việt Nam đã ghi nhận 6 loài thuộc giống này bao gồm:
Bungarus bungaroides, B. candidus, B. fasciatus, B. flaviceps, B. multicinctus,
B. slowinskii [3]. Về mặt phân loại học, nhiều loài trong giống Bungarus có
hình thái giống nhau khó định loại (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch 2007;
Abtin và cs. 2014) [7, 5, 8,9], các khu vực phân bố của lồi thì chồng chéo, và
một số loài phân biệt dựa trên vùng địa lý [4, 3]. Ví dụ như: khoanh đen, khoanh
trắng Rắn cạp nia đông bắc (Bungarus bungaroides), Rắn cạp nia bắc
(Bungarus multicinctus), Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) và Rắn cạp
nia sông Hồng (Bungarus slowinskii). Ngoài ra, một số loài thường bị nhầm
lẫn với giống rắn giả cạp nia Lygodon về hình thái [8]. Việc định loại và xác
định phân bố tự nhiên các lồi trong nhóm rắn độc Bungarus là cơ sở khoa học
quan trọng trong việc nghiên cứu độc tố và độc điều trị rắn độc cắn (Fry và cs.
2003; Williams và cs. 2011) [10, 11].
Mã vạch ADN (DNA barcoding) sử dụng đoạn ADN ngắn để phân biệt
giữa các loài [12, 13, Error! Reference source not found.] là công cụ phục
Luan van
2
vụ có hiệu quả cho cơng tác giám định, phân loại, đánh giá quan hệ di truyền,
phát hiện loài mới, quản lý chất lượng, nguồn gốc, xuất xứ, bản quyền của sản
phẩm từ sinh vật [14, 16, 13, Error! Reference source not found.]. Ở động
vật, một số vùng gen ty thể (Cyt b, ND4 và COI...) đang được ứng dụng rộng
rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại (phylogeny), phân
loại (taxonomy) và nhận dạng loài (identity) [17, 18 ]. Nhiều phân tích phát
sinh lồi phân tử đã được tiến hành ở trên giống Bungarus hay lớn hơn là trên
phân họ Bungarinae trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ti thể (Cyt
b, ND4 và COI) [4, 19, 20, 21]. Những nghiên cứu phát sinh loài này đã nâng
cao hiểu biết của chúng ta về các mối quan hệ tiến hóa trong giống.
Do đó, việc nghiên cứu về phân loại học, phân bố, quan hệ di truyền của
các loài thuộc giống Bungarus là rất cần thiết để giải quyết các vấn đề về chẩn
loại. Nghiên cứu này sẽ tập trung làm rõ tên khoa học và vị trí phân loại của
chúng trong hệ thống phân loại dựa trên những dẫn liệu về hình thái, sinh học
phân tử. Chính vì vậy, tơi đề xuất thực hiện đề tài “Kết hợp hình thái và sinh
học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia Bungarus
Daudin, 1803 ở Việt Nam”.
2.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Đánh giá sự đa dạng thành phần loài, đặc điểm phân bố của các lồi thuộc
giống Bungarus ở Việt Nam
Kết hợp hình thái và di truyền phân tử trong việc định loại và xác định
mối quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.
3.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Nội dung 1: Nghiên cứu đa dạng thành loài rắn thuộc giống cạp nia
Bungarus ở Việt Nam.
Danh sách loài
Ghi nhận các địa điểm phân bố mới của các loài giống Bungarusi ở Việt
Nam.
Mơ tả, phân tích, so sánh đặc điểm hình thái.
Xây dựng khố định loại
Luan van
3
Nội dung 2: Đánh giá tính đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các
quần thể và giữa các loài trong giống.
So sánh sự đa dạng di truyền giữa các loài và giữa các quần thể của một
số loài phân bố rộng
Xây dựng cây phát sinh chủng loại.
4.
Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới
về đa dạng thành phần loài và phân bố của các loài thuộc giống Bungarus
ở Việt Nam.
Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các loài thuộc
giống Bungarus ở Việt Nam.
Xây dựng dữ liệu về hình thái và di truyền phân tử giống Bungarus ở
Việt Nam, từ đó làm cơ sở khoa học cho việc giám định, bảo tồn và phát
triển lồi này ở ngồi tự nhiên.
5.
NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Cập nhật về phân bố của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.
Đánh giá mối quan hệ di truyền của các loài trong giống Bungarus ở
Việt Nam.
Luan van
4
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU
1.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam
Theo Nguyễn Quảng Trường năm 2009, nghiên cứu Bò sát ở Việt Nam
có lịch sử khá lâu đời nhưng phát triển mạnh vào các giai đoạn cuối thế kỷ XIX,
giữa và cuối thế kỷ XX và đặc biệt là những năm đầu thế kỷ XXI [22]. Có hàng
loạt cơng trình cơng bố về thành phần loài được các tác giả nước ngoài công bố
vào nửa đầu thế kỷ 20 nhưng đáng chú ý có hai cơng trình của Bourret gồm:
Les Serpents de l’Indochine mơ tả 189 lồi và phân lồi rắn xuất bản năm 1936
[23], Les Tortues l’Indochine mơ tả 44 lồi và phân loài rùa xuất bản năm 1941
[24]. Đây được coi là những tài liệu đầy đủ nhất về lưỡng cư bị sát của vùng
Đơng Dương (Việt Nam, Lào và Campuchia) ở nửa đầu thế kỷ XX;
Nửa sau thế kỷ XX, có nhiều cơng trình nghiên cứu về khu hệ Bò sát do
các tác giả trong nước thực hiện. Đào Văn Tiến đã công bố 4 bài báo: Về định
loại rùa và cá sấu Việt Nam (1978) [25], Về định loại thằn lằn Việt Nam (1979)
[26], Về định loại rắn Việt Nam (1981, 1982) [27, 28] trên tạp chí Sinh vật Địa học (nay là Tạp chí Sinh học). Theo đó, tác giả đã thống kê ở Việt Nam có
77 loài thằn lằn, 165 loài rắn, 32 loài rùa và 2 loài cá sấu. Cùng thời gian (1980),
Trần Kiên và Nguyễn Quốc Thắng xuất bản cuốn Các loài rắn độc Việt Nam,
trong đó đã giới thiệu về đặc điểm của 31 lồi rắn [29]. Số lượng lồi Bị sát
ghi nhận ở Việt Nam tăng lên nhanh chóng từ 258 lồi vào năm 1996 [30] lên
tới 296 loài vào năm 2005 [31] và 368 loài vào năm 2009 [2] và hiện nay ghi
nhận khoảng hơn 500 loài (Uetz and Hošek 2021) [3]. Có 3 giống mới và
khoảng 180 lồi mới đã được phát hiện ở Việt Nam kể từ năm 1980 trở lại đây.
Trong thời kỳ 1975-1986, chỉ có 6 lồi mới cho khoa học được phát hiện ở
nước ta, trong đó chỉ có 3 lồi có tác giả là người Việt Nam. Trong giai đoạn
1987-2014, số loài phát hiện mới cho khoa học tăng lên khoảng 170 lồi, trong
đó có khoảng 40% số cơng trình cơng bố do các nhà khoa học Việt Nam là tác
giả chính [2, 32, 3, 33].
Trong những năm gần đây việc áp dụng sinh học phân tử kết hợp với các
phân tích hình thái trong phân loại học, số lượng loài mới được ghi nhận
tăng lên đáng kể, đã có hơn 30 lồi Bị sát mới được mô tả tại Việt Nam:
Acanthosaura
phongdienensis Nguyen
Luan van
và
cs.
2019;
Achalinus
5
emilyae Ziegler và cs. 2019; A. juliani Ziegler và cs. 2019; A.
timi Ziegler và cs. 2019; Calamaria dominici Ziegler, Tran & Nguyen,
2019;
C.
strigiventris Poyarkov
và
cs.
2019;
Cyrtodactylus
septimontium Murdoch và cs. 2019; C. taybacensis Pham và cs. 2019;
Liopeltis pallidonuchalis Poyarkov, Nguyen & Vogel 2019; Lipinia
trivittata PoyarkoV và cs. 2019; L. vassilievi Poyarkov và cs. 2019;
Lycodon namdongensis Luu và cs. 2019; L. pictus Janssen và cs. 2019;
Opisthotropis haihaensis Ziegler 2019; Pelodiscus variegatus Farkas và
cs. 2019; Scincella badenensis Nguyen và cs. 2019; Acanthosaura
prasina Ananjeva và cs. 2020; Achalinus tranganensis Luu và cs. 2020;
Achalinus
zugorum Miller
và
cs.
2020;
Cyrtodactylus
culaochamensis Tri và cs. 2020; Cyrtodactylus phumyensis Ostrowski
và cs. 2020; Hemiphyllodactylus bonkowskii Nguyen và cs. 2020; H.
nahangensis Do và cs. 2020; H. ngocsonensis Nguyen và cs. 2020;
Oligodon rostralis Nguyen và cs. 2020; Scincella baraensis Nguyen và
cs 2020; Sinomicrurus peinani Liu và cs. 2020; Sphenomorphus
phuquocensis Grismer và cs. 2020 Ahaetulla rufusoculara Lam và cs.
2021; Cyrtodactylus chungi Ostrowski và cs. 2021; C. ngati Le và cs.
2021; C. orlovi Do, và cs. 2021; C. raglai Nguyen và cs. 2021; Gekko
phuyenensis Nguyen và cs. 2021; Hebius igneus David và cs. 2021;
Hemiphyllodactylus dalatensis Do và cs. Nguyen 2021; Pareas
temporalis Le, và cs. 2021; Subdoluseps vietnamensis LE và cs. 2021;
Trimeresurus guoi Chen và cs. 2021.
1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA-barcodes)
Trong quá trình nghiên cứu về giới thực vật thì phương pháp phân loại
thực vật dựa trên những đặc điểm hình thái từ lâu đã chứng minh được vai trò
quan trọng trong việc làm nền tảng cho các nghiên cứu về sinh thái, tiến hóa và
đa dạng thực vật. Phân loại đông vật căn cứ vào đặc điểm sai khác hình thái
của các cơ quan bộ phận, chủ yếu dựa vào sự khác biệt hình thái của các cơ
quan đặc biệt là cơ quan sinh sản và các cơ quan có tính bảo thủ ít thay đổi qua
các thế hệ, đây là cách thức phân loại truyền thống đã được xây dựng và phát
triển từ rất xưa cho tới ngày nay. Tuy nhiên, thực tế đã cho thấy đó chưa phải
Luan van
6
là phương pháp hiệu quả trong việc phân loại các mẫu đang trong giai đoạn
phát triển, các mẫu có đặc điểm giống nhau, hay các mẫu không đủ các bộ phận
[34]. Bên cạnh đó, các phương pháp phân loại hình thái thường chỉ được thực
hiện bởi các chuyên gia về hình thái học, việc phân loại cần nhiều năm kinh
nghiệm và khó thực hiện đối với những sinh viên ít kinh nghiệm hoặc những
nhà nghiên cứu không chuyên [35, 36].
Một phương pháp định loại mới dựa trên các dữ liệu sinh học phân tử đã
được ra đời từ những năm 1990, đã hỗ trợ đắc lực phương pháp phân loại học
động vật truyền thống dựa trên hình thái được gọi với thuật ngữ “ADN mã
vạch” lần đầu tiên được sử dụng vào những năm 1993. Đó là phương pháp dựa
trên các dữ liệu thông tin về hệ gen trong và ngồi nhân (hay ADN). Tùy mục
đích hoặc đối tượng nghiên cứu, người ta có thể lựa chọn các gen hoặc các vùng
gen khác nhau trong hệ gen [37].
Thực tiễn đã chứng minh mã vạch ADN bắt đầu có tầm ảnh hưởng từ
những nghiên cứu của Herbert và cs. (2003b) [36]. Kết quả nhóm nghiên cứu
chỉ ra rằng các cá thể từ bộ sưu tập của 200 lồi có quan hệ gần gũi với nhau
thuộc bộ cánh vảy có thể xác định với độ chính xác 100% bằng cách này sử
dụng gen ty thể Cytochrome coxidase tiểu đơn vị I (COI) (đây là enzyme cuối
cùng trong chuỗi vận chuyển hô hấp của ty thể, màng).
Mã vạch ADN là trình tự nucleotide của một chuỗi ADN ngắn, có cùng
nguồn gốc tổ tiên, trong đó có vùng ít bị thay đổi (vùng bảo thủ) và vùng thay
đổi theo q trình tiến hóa [35, 38]. Ngồi ra việc lựa chọn một vùng làm trình
tự mã vạch ADN còn cần phải mang những đặc điểm sau: có độ dài thích hợp
(khơng q ngắn để có độ đa hình về trình tự giữa các taxon, khơng q dài để
có thể giải trình tự theo cách thơng thường, thậm chí cả trong khi điều kiện
chưa được tối ưu); thuận lợi trong việc so sánh trình tự dựa trên vị trí khác biệt
các nucleotide và khơng có đoạn trình tự chưa chắc chắn như một vài đoạn lặp
lại microsatellite làm giảm chất lượng trình tự [39].
Việc giải mã tồn bộ hệ gen của sinh vật gặp nhiều khó khăn, tốn kém
nhiều cơng sức và kinh phí nên khơng phải phịng thí nghiệm nào cũng có thể
thực hiện được. Thay vào đó, việc xác định một đoạn ADN đã biết, đặc trưng
cho loài là giải pháp hiệu quả trong phân tích, đánh giá đa dạng di truyền nguồn
Luan van
7
gen, xác định nguồn gốc, xuất xứ của sinh vật, bản quyền các sản phẩm sinh
học. Vì vậy, hướng nghiên cứu mã vạch ADN đang được phát triển mạnh mẽ
và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: nghiên cứu về đa
dạng sinh vật, giám định loài, giám định mẫu vật, xét nghiệm bệnh, bản quyền
sản phẩm (giống cây trồng, vật nuôi, sản phẩm nông - lâm - thủy sản,…) [40].
Mã vạch ADN là một công cụ mới, rất hiệu quả cho các nghiên cứu về
phân loại, giám định sinh vật, gồm cả động vật, thực vật, nấm, vi sinh vật và
virus [41], [35], [36], [42], [43]. Việc xác định lồi bằng mã vạch ADN có hiệu
quả cao trong việc phân biệt các loài sinh vật khi những quan sát hình thái, sinh
trưởng và phát triển chưa đủ cơ sở để định danh hoặc phân biệt loài [43].
Việc sử dụng ADN mã vạch để nhận dạng các lồi trên quy mơ tồn cầu
có ý nghĩa ngày càng lớn. Cho đến nay, đã có trên 6000 cơng trình khoa học
được cơng bố với khoảng 5 triệu trình tự mã vạch ADN ở các lồi sinh vật. Để
chuẩn hóa ở mức độ quốc tế về việc sử dụng mã vạch ADN, cộng đồng khoa
học đã nỗ lực trong việc tìm kiếm các vùng trình tự ADN làm mã vạch có thể
phân biệt đồng thời nhiều lồi [44, 45, 46].
1.3. Các nghiên cứu bổ sung dẫn liệu mới về phân loại học
Nhiều nghiên cứu về phân loại học dựa trên kết quả so sánh hình thái và
sinh học phân tử đã góp phần hồn thiện hơn hệ thống phân loại, ngồi việc hỗ
trợ các phương pháp phân tích hình thái để mơ tả lồi mới ra, sinh học phân tử
cịn khắc phục, chỉnh sửa các nhẫm lẫn trong hệ thống học trước đây. Ví dụ
như: Các phân họ rắn Natricinae, Pareatinae và Pseudoxenodontinae đã được
nâng cấp và tách ra thành 4 họ Lamprophiidae, Natricidae, Pareatidae,
Pseudoxenodontidae theo tài liệu của Pyron và cs. (2013) [47] và Zaher và cs.
(2009) [48]; giống Ophisaurus đổi sang Dopasia [10, 49]; Guo và cs. 2014 dựa
trên kết quả phân tích phân tử đã tu chỉnh phân loại giống Amphiesma sang
giống Hebius [50]; Takeuchi và cs. 2018 đã nhóm 3 giống Rhabdophis,
Macropisthodon Balanophis thành một giống Rhabdophis [51]; Purkayastha
đổi giống Xenochrophis về Rhabdophis [52]; Ren và cs. (2019) đổi giống
Sinonatrix thành Trimerodytes [53].
Luan van
8
Tuy nhiên, việc áp dụng sinh học phân tử trong giải quyết mối quan hệ
di truyền của các loài thuộc giống Bungarus cịn chưa nhiều. Một số cơng trình
cơng bố có liên quan như: Ulrich Kuch & Dietrich Mebs (2007), Pyron và cs.
(2013), Laopichienpong và cs. (2016), Ashraf MR và cs. 2019 mới chỉ phân
tích mối quan hệ di truyền của một số loài trong giống Bungarus ở Java, Sri
Lanka, Thái Lan, Pakistan [8, 54, 55, 56].
1.4. Tổng quan các nghiên cứu về giống Bungarus
1.4.1. Trên thế giới
Giống cạp nia Bungarus Daudin, 1803 thuộc phân họ Rắn hổ
(Elapidae), họ Rắn nước (Colubridae), phân bộ Rắn (Serpentes), bộ Có vảy
(Squamata), lớp Bị sát (Reptilia), ngành Có dây sống (Chordata), giới Động
vật (Animalia).
Giống cạp nia Bungarus có vùng phân bố rộng, chủ yếu ở khu vực Đông
Nam Á từ Pakistan, Ấn Độ và Afghanistan ở phía tây, và phía đơng nhiệt đới
Đơng Nam Á, toàn bộ tiểu vùng Ấn Trung và phần cịn lại của Châu Á, hiện
ghi nhận 16 lồi trên thế giới (Slowinski. 1994; Kharin và cs. 2011; Abtin và
cs. 2014; Ahsan and Rahman 2017; Uetz and Hošek. 2021) [5, 6, 57, 56, 3].
Tuy nhiên, lịch sử nghiên cứu phân loại của giống Bungarus trên thế giới rất
phức tạp do đây là nhóm có nhiều lồi có hình thái tương đồng cao và sự phân
bố rời rạc trên một diện tích khu vực lớn (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch
2007) [7, 5, 4]; Giống cạp nia Bungarus Daudin 1803 là một trong những giống
rắn có ý nghĩa quan trong về mặt khoa học lớn trong họ Elapidae ở châu Á.
Việc cung cấp các thơng tin về phân loại học các lồi trong giống Bungarus
giúp cung cấp cơ sở thực tiễn trong việc nghiên cứu kháng nguyên nọc độc và
điều trị rắn cắn thích hợp (Fry và cs. 2003; Williams và cs. 2011) [10, 11].
Trong số 16 lồi hiện được mơ tả, Bungarus với các dải chéo đen trắng là nhóm
có vấn đề về phân loại nhất của giống và rất khó xác định trên thực địa do các
đặc điểm trùng lặp về hình thái (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch 2007; Abtin
và cs. 2014) [7, 5, 4, 57]. Hầu hết các loài Bungarus đen trắng này được xác
định theo phương pháp truyền thống bằng cách phân biệt số lượng các dải chéo
ở lưng trên thân và đuôi (Slowinski 1994; Leviton và cs. 2003; Zhao 2006) [5,
Luan van
9
58, 33]. Tuy nhiên, những đặc điểm này trên các lồi có sự trùng lặp và có thể
dẫn đến nhận dạng sai.
Slowinski 1994, Kuch và Mebs 2007 đưa ra nhận định rằng: Rắn cạp nia
nam (Bungarus candidus) rất dễ nhầm lẫn với B. javanicus, Lycodon subcinctus
chưa trưởng thành hoặc với L. stormi, chúng cũng có dải màu đen và trắng xen
kẽ. [5, 8]. Leviton (2003) đã đưa ra nhận định: Rắn cạp nia bắc Bungarus
multicinctus có quan hệ chặt chẽ với nhóm lồi đồng hình B. wanghaotingi và
cần tiếp tục nhiều các nghiên cứu về phân tích sinh học phân tử để tách biệt hai
loài [58]
Một số nghiên cứu gần đây của Abtin Chen và cs. (2014) và Chen và cs.
2021) đã mơ tả lồi Bungarus persicus tại Iran [57] và lồi B. suzhenae tại
Trung Quốc [19] cho khoa học.
Tính đến tháng 8 năm 2021, trên thế giới ghi nhận có 16 lồi rắn thuộc
giống Bungarus. Trong 30 năm gần đây có 03 lồi (chiếm 18,75% số lồi) thuộc
giống Bungarus được mơ tả là lồi mới, trong đó: 01 lồi ở Việt Nam [3].
Các nghiên cứu liên quan đến phân loại các loài trong giống
Bungarus ở các nước giáp ranh với Việt Nam, có một số cơng bố như:
Ở Lào: ghi nhận 4 loài B. candidus (Linnaeus, 1758); B. fasciatus
(Schneider, 1801), B. multicinctus Blyth, 1861, B. slowinskii Kuch, Kizirian,
Nguyen, Lawson, Donnelly & Mebs, 2005 [3].
Ở Cam-pu-chia: ghi nhận 3 loài B. candidus (Linnaeus, 1758), B.
fasciatus (Schneider, 1801), B.s flaviceps Reinhardt, 1843 [3].
Ở Thái Lan: ghi nhận 5 loài B. candidus (Linnaeus, 1758), B. fasciatus
(Schneider, 1801), B. flaviceps Reinhardt, 1843, B. multicinctus Blyth, 1861,
B. slowinskii Kuch, Kizirian, Nguyen, Lawson, Donnelly & Mebs, 2005 [3].
Ở Trung Quốc: ghi nhận 4 loài B. bungaroides (Cantor, 1839), B.
fasciatus (Schneider, 1801), B. multicinctus Blyth, 1861, B. suzhenae Chen,
Shi, Vogel, Ding & Shi, 2021 [3].
1.4.2. Ở Việt Nam
Việt Nam nằm trong vùng Indo-Burma, một trong trong 25 điểm nóng
có mức độ đa dạng sinh học cao trên thế giới [59] với rất nhiều các lồi Bị sát
Luan van
10
đặc hữu [Error! Reference source not found.]. Nghiên cứu sinh thái học các
loài rắn của Việt Nam đã được nhiều tác giả tiến hành và đã được tổng kết lại
một cách hệ thống (Nguyễn và cs., 1996, 2007, 2009; Nguyễn và cs. 2005,
2009) [60, 30, 2, 31, 22].
Năm 2005, Kuch và các cộng sự đã mơ tả lồi mới Bungarus slowinskii
thu tại xã Văn Yên của tỉnh Yên Bái, Việt Nam [4].
Ở Việt Nam đã ghi nhận 6 loài thuộc giống Rắn cạp nia (giống
Bungarus), trong đó bốn lồi có hình dạng “khúc đen, khúc trắng” là dễ nhầm
với nhau nhất là: Rắn cạp nia đông bắc - Bungarus bungaroides (Cantor,
1839), Rắn cạp nia bắc - Bungarus multicinctus Blyth, 1861), Rắn cạp nia
nam - Bungarus candidus Linnaeus, 1758)) Rắn cạp nia sông Hồng Bungarus slowinskii Kuch, Kizirian, Nguyễn, Lawson, Donnelly & Mebs,
2005) khác với Rắn cạp nong - Bungarus fasciatus (Schneider, 1801) có hình
thái “ngồi khúc vàng, khúc đen” và Rắn cạp nong đầu đỏ - Bungarus
flaviceps Reinhardt, 1843 dễ nhận biết hơn.
Các nghiên cứu đều dựa trên so sánh trình tự của đoạn gen ty thể COI và
Cytb đã góp phần phân biệt các quần thể có đặc điểm hình thái giống nhau từ
đó mơ tả thành các lồi riêng biệt nhằm tránh nhầm lẫn trong việc phân loại.
Cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về mối quan hệ di truyền
của giống này tại Việt Nam, đồng thời sự đa dạng và vị trí phân loại của một
số loài trong giống Bungarus ở Việt Nam vẫn có nhiều vấn đề chưa rõ ràng
(Nguyễn và cs. 2017; Xie và cs. 2018) [80, 21].
1.5. Khái quát về điều kiện tự nhiên ở Việt Nam
1.5.1. Địa hình
Địa hình của Việt Nam nói chung bao gồm miền núi và vùng đất thấp.
Miền Bắc bao gồm vùng Đông Bắc, Tây Bắc và đồng bằng sông Hồng. Vùng
Đông Bắc trải dài từ thung lũng sơng Hồng đến Vịnh Bắc bộ có nhiều diện tích
miền núi nằm rải rác ở độ cao từ 300-1600 m; trong đó Tây Cơn Lĩnh là đỉnh
cao nhất với độ cao 2341 m. Vùng Tây Bắc bao gồm các ngọn núi chạy từ phía
bắc biên giới Trung Quốc về phía tây của tỉnh Thanh Hóa, trong đó Fansipan
là đỉnh núi cao nhất với độ cao 3143 m. Miền Trung với dãy Trường Sơn kéo
Luan van
11
dài, có thể chia làm 3 vùng (thường được sử dụng cách phân chia này để khoanh
vùng phân bố của các loài động, thực vật). Bắc Trường Sơn bắt đầu từ tỉnh
Nghệ An đến khu vực Khe Sanh, vùng này khá thấp, ít có đỉnh cao q 1300
m; mặc dù về phía Tây sang đất Lào, núi có thể cao hơn 2800 m. Trung tâm
dãy Trường Sơn bắt đầu từ bên dưới Khe Sanh gần đèo Hải Vân chạy về phía
Nam dọc theo biên giới Việt-Lào tới sơng Ba-Đà Rằng. Nam Trường Sơn bao
gồm khu vực từ sông Ba-Đà Rằng, dãy Trường Sơn kéo dài xuống phía Nam
và bao gồm các vùng núi còn lại của Việt Nam, là một loạt các cao nguyên
bằng đá granit và bazan có các đỉnh núi nằm rải rác và cô lập. Miền Nam nổi
tiếng với vùng đồng bằng sơng Cửu Long, diện tích khoảng 40000 km2 với độ
cao trung bình dưới 10 m [61, 62]
1.5.2. Khí hậu
Khí hậu Việt Nam có thể chia làm 7 kiểu: (1) Nhiệt đới gió mùa với mùa
đơng lạnh và mùa hè mưa; (2) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đơng lạnh và
mưa mùa thu; (3) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đơng ấm áp-mùa đơng
ấm áp-mùa đơng mưa; (4) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đơng ấm áp-mùa
thu-mùa đơng mưa; (5) Khí hậu nhiệt đới gió mùa với mùa đơng ấm áp và mưa
mùa hè; (6) Mưa phùn gió mùa khí hậu với những cơn mưa mùa hè; (7) Khí
hậu nhiệt đới gió mùa kết hợp với núi [61].
Theo Nguyễn và cs. (2000), nhiệt độ trung bình hàng năm của Việt Nam
dao động từ 18oC-26,8oC; lượng mưa trung bình hàng năm thay đổi đáng kể từ
1324,4 mm (tỉnh Khánh Hòa) đến 3024,1 mm (tỉnh Kiên Giang) và độ ẩm trung
bình hàng năm dao động trong khoảng 79-87% [63].
1.5.3. Thủy văn
Việt Nam có một bộ phận lớn lưu vực các sơng, suối nằm ngồi lãnh thổ
như sơng Hồng chiếm 57,3%, sơng Mã là 38%, sông Cả là 34% và sông Cửu
Long chiếm đến 91%. Trong tổng lượng nước của Việt Nam là 839 tỉ m3/năm
thì phần từ bên ngồi chảy vào lên tới 501 tỉ m3/năm chiếm 59,7%, riêng sơng
Cửu Long thì tỉ lệ này lên đến 89% (451 tỉ m3/năm trong tổng lượng nước 507
tỉ m3/năm của sơng). Diện tích sơng, suối lớn góp phần tạo nên những vùng địa
lý sinh vật đặc thù cho Việt Nam [62].
Luan van
12
1.5.4. Thảm thực vật
Thảm thực vật Việt Nam thuộc vùng thực vật Đông Dương, bao gồm 6
khu vực: Sikang-Vân Nam, Nam Trung Quốc, Bắc khu vực Đông Dương,
Trung tâm dãy Trường Sơn, Nam dãy Trường Sơn và Đông khu vực Đông
Dương [61].
Luan van
13
CHƯƠNG 2: THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHƯƠNG PHÁP VÀ TƯ LIỆU
NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Các loài Rắn cạp nia thuộc giống Bungarus Daudin, 1803 ở Việt Nam
2.2. ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU
Thời gian khảo sát thực địa được tiến hành từ 10/2019 đến năm 08/2021
với 05 đợt khảo sát và 42 ngày thực địa ở các tỉnh: Bắc Giang, Đăk Lăk, Gia
Lai, Hà Giang, Hà Nội, Kon Tum, Lai Châu, Lạng Sơn, Ninh Thuận, Quảng
Bình, Quảng Ninh, Quảng Trị, Thái Nguyên, Vĩnh Phúc.
Địa điểm
Thời gian
Số ngày
Số người
khảo sát
tham gia
Vùng núi Putaleng, tỉnh Lai Châu
10-18/1/2019
9
2
Quản Bạ, Hà Giang
3-10/4/2020
8
4
Võ Nhai, Thái Nguyên
8-17/3/ 2021
10
2
Huyện Sông Hinh, Tỉnh Phú Yên
5-13/4/2021
9
3
12-17/5/2021
6
2
Khu bảo tồn thiên nhiên Krông
Trai, Phú Yên
Tham khảo mẫu vật lưu giữ tại các Bộ sưu tập mẫu của Bảo tàng thiên
nhiên Việt Nam (VMNN) và Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (IEBR)
thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và cơng nghệ Việt Nam. Phân tích sinh học phân
tử được thực hiện tại Bảo tàng thiên nhiên Việt Nam (VMNN).
Như vậy, mẫu vật 40 mẫu vật Bungarus đã sử dụng để phân tích hình thái
và 09 mẫu vật lựa chọn phân tích DNA trong nghiên cứu này được trình bày ở
bảng 3.2 và được thu thập từ 25 tỉnh gồm: Bắc Kạn, Bình Định, Bình Phước,
Đăk Lăk, Đăk Nơng, Gia Lai, Hà Giang, Hà Nội, Hà Tĩnh, Khánh Hòa, Kon
Tum, Lai Châu, Lạng Sơn, Lào Cai, Nghệ An, Ninh Thuận, Quảng Bình, Quảng
Nam, Quảng Ninh, Quảng Trị, Sơn La, Tây Ninh, Thái Ngun, Thanh Hóa,
Vĩnh Phúc (Hình 2.1)
Luan van
14
Hình 2.1. Địa điểm thu thập mẫu vật các lồi thuộc giống Bungarus ở
Việt Nam
Ghi Chú: 1) Bắc Kạn, 2) Bình Định, 3) Bình Phước, 4) Đăk Lăk, 5) Đăk
Nơng, 6) Gia Lai, 7) Hà Giang, 8) Hà Nội, 9) Hà Tĩnh, 10) Khánh Hòa, 11)
Kon Tum, 12) Lai Châu, 13) Lạng Sơn, 14) Lào Cai, 15) Nghệ An, 16) Ninh
Luan van
15
Thuận, 17) Quảng Bình, 18) Quảng Nam, 19) Quảng Ninh, 20) Quảng Trị, 21)
Sơn La, 22) Tây Ninh, 23) Thái Ngun, 24) Thanh Hóa, 25) Vĩnh Phúc.
Nghiên cứu phân tích mẫu vật:
Ngoài các mẫu vật được thu thập tại các cuộc điều tra khảo sát thực địa,
luận văn còn sử dụng các mẫu vật được lưu giữ và bảo quản tại Bảo tàng Thiên
nhiên Việt Nam, Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật và một số cơ quan khác
- Thời gian nghiên cứu: Luận văn thực hiện từ tháng 10/2019 đến năm
05/2021
Luan van
16
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu
Tiếp cận theo lồi: phân tích hình thái mẫu vật để định loại
Tiếp cận theo hướng sinh thái học: Các đặc điểm sinh thái học sẽ được
ghi nhận thông qua quan sát trực tiếp trong thiên nhiên.
Tiếp cận theo hướng sinh học phân tử: Tiến hành phân tích mối quan
hệ di truyền dựa trên việc giải mã và so sánh trình tự DNA giữa các quần thể
và các lồi.
2.3.2. Phương pháp kế thừa
Mục đích của phương pháp này là kế thừa các kết quả nghiên cứu của
các cơng trình có trước để nghiên cứu chi tiết, chuyên sâu tiếp theo những vấn
đề quan tâm liên quan. Đề tài sẽ thu thập, tổng hợp các tài liệu điều tra nghiên
cứu, tài liệu liên quan đến đa dạng các loài trong giống rắn cạp nia
Bungarus,…Chúng sẽ được tổng hợp, phân tích để kế thừa, điều tra nghiên cứu
chuyên môn của đề tài.
2.3.3. Phương pháp khảo sát thực địa thu thập mẫu vật nghiên cứu
Các phương pháp nghiên cứu ngoài thực địa
* Dụng cụ nghiên cứu: Máy ảnh Canon 550D, gậy bắt rắn, kẹp, đèn pin,
túi vải, lọ đựng mẫu, ống nhựa lấy mẫu ADN, phiếu phỏng vấn, sổ ghi chép,
bút, hóa chất bảo quản (cồn) và các dồ dùng cá nhân cần thiết.
* Địa điểm thu thập mẫu: Tập trung vào các khu vực ven suối, vũng
nước, khu vực đường mòn trong rừng, dưới gốc cây mục trong rừng, chúng tôi
cũng tiến hành khảo sát ven các cửa hang và vách đá. Tọa độ các điểm nghiên
cứu được xác định bằng máy định vị vệ tinh GPS Garmin 60s.
* Thời gian thu mẫu: Các loài rắn Bungarus hầu hết hoạt động vào ban
đêm, do đó thường thu mẫu và quan sát vào buổi tối từ 18:00 đến 24:00.
* Thu thập số liệu về đặc điểm sinh thái: Thông tin về sinh cảnh sống,
nơi thu thập mẫu và điều kiện môi trường (nhiệt độ, độ ẩm) được ghi chép thu
mẫu đề phục vụ việc phân tích đặc điểm phân bố của từng loài.
* Phương pháp thu mẫu: Chủ yếu thu thập bằng tay hoặc gậy bắt rắn
chuyên dụng.
Luan van
