(Luận văn thạc sĩ) Kết hợp hình thái và sinh học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia Bungarus, Daudin, 1803 ở Việt Nam

BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ ĐÀO TẠO

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------

NGUYỄN QUỐC HUY

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH SINH HỌC
KẾT HỢP HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG
NGHIÊN CỨU CHẨN LOẠI GIỐNG RẮN CẠP NIA BUNGARUS
DAUDIN, 1803 Ở VIỆT NAM

Hà Nội – 2021


BỘ GIÁO DỤC

VIỆN HÀN LÂM

VÀ ĐÀO TẠO

KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VN

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

NGUYỄN QUỐC HUY

KẾT HỢP HÌNH THÁI VÀ SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NGHIÊN
CỨU CHẨN LOẠI GIỐNG RẮN CẠP NIA BUNGARUS DAUDIN,
1803 Ở VIỆT NAM

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số:

8 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ
NGÀNH SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC :
Hướng dẫn 1: PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo
Hướng dẫn 2: TS. Nguyễn Vĩnh Thanh
Hà Nội - 2021


I
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài nghiên cứu trong luận văn này là cơng trình
nghiên cứu của tơi dựa trên những tài liệu, số liệu do chính tơi tự tìm hiểu và
nghiên cứu. Chính vì vậy, các kết quả nghiên cứu đảm bảo trung thực và khách
quan nhất. Đồng thời, kết quả này chưa từng xuất hiện trong bất cứ một nghiên
cứu nào. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực nếu sai tôi hồn
chịu trách nhiệm.

Hà Nơi, ngày tháng năm 2021

Nguyễn Quốc Huy


II
LỜI CẢM ƠN
Lời cảm ơn đến thầy PGS. TS. Nguyễn Thiên Tạo, TS. Nguyễn Vĩnh Thanh
đã hướng dẫn tận tình, chu đáo, giúp đỡ tơi trong q trình khảo sát thực địa,
phân tích số liệu, cơng bố cơng trình khoa học và hoàn thiện luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn GS. TS. Nguyễn Quảng Trường, TS. Phạm Thế Cường,
TS. Lương Mai Anh, ThS. Phan Quang Tiến (Viện Sinh thái và Tài ngun
sinh vật), NCS Ninh Thị Hịa, NCS. Ngơ Ngọc Hải (Bảo tàng Thiên nhiên Việt
Nam) cùng các đồng nghiệp đã hỗ trợ trong quá trình khảo sát thực địa, cung
cấp hình ảnh, số liệu và hỗ trợ cơng tác phân tích mẫu trong phịng thí nghiệm
của luận văn.
Xin trân trọng cảm ơn Cán bộ thuộc phòng Bảo tồn Thiên nhiên – Bảo tàng
Thiên nhiên Việt Nam và Ban lãnh đạo Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam đã tạo
điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu.
Xin trân trọng cảm ơn phòng Động vật – Viện Sinh thái và Tài Nguyên Sinh
vật đã hỗ trợ mẫu vật để tơi có nguồn tư liệu thể hồn thành luận văn.
Xin tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới gia đình và những người thân đã hết lịng giúp
đỡ, động viên tơi trong q trình thực hiện đề tài và hồn thành luận văn
Xin trân trọng cảm ơn ban Lãnh đạo, phòng Đào tạo, các phòng chức năng của
Học viện Khoa học và Cơng nghệ để luận văn được hồn thành.
Nghiên cứu này được tài trợ bởi đề tài độc lập cấp quốc gia mã số
ĐTĐLCN.38/21.
Hà Nôi, ngày tháng năm 2021

Nguyễn Quốc Huy

III
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................1
1.

Tính cấp thiết của đề tài .......................................................................... 1

2.

Mục tiêu nghiên cứu ............................................................................... 2

3.

Nội dung nghiên cứu ............................................................................... 2

4.

Ý nghĩa khoa học của đề tài .................................................................... 3

5.

Những đóng góp mới của đề tài .............................................................. 3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VỀ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU.....................................4
1.1. Lịch sử nghiên cứu về bò sát ở Việt Nam ................................................. 4
1.2. Tổng quan về mã vạch ADN (DNA-barcodes).......................................... 5
1.3. Các nghiên cứu bổ sung dẫn liệu mới về phân loại học ............................ 7
1.4. Tổng quan các nghiên cứu về giống Bungarus .......................................... 8

1.4.1. Trên thế giới .................................................................................... 8
1.4.2. Ở Việt Nam ..................................................................................... 9
1.5. Khái quát về điều kiện tự nhiên ở Việt Nam ........................................... 10
1.5.1. Địa hình ......................................................................................... 10
1.5.2. Khí hậu .......................................................................................... 11
1.5.3. Thủy văn........................................................................................ 11
1.5.4. Thảm thực vật................................................................................ 12
CHƯƠNG 2: THỜI GIAN, ĐỊA ĐIỂM, PHƯƠNG PHÁP VÀ TƯ LIỆU
NGHIÊN CỨU..............................................................................................13
2.1. Đối tượng nghiên cứu............................................................................... 13
2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu ............................................................ 13
2.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 16
2.3.1. Phương pháp tiếp cận giải quyết vấn đề nghiên cứu .................... 16
2.3.2. Phương pháp kế thừa..................................................................... 16
2.3.3. Phương pháp khảo sát thực địa thu thập mẫu vật nghiên cứu ...... 16
2.3.5. Phương pháp phân tích hính thái .................................................. 17
2.3.6. Phương pháp phân tích sinh học phân tử ...................................... 19


IV
2.3.7. Xử lý số liệu .................................................................................. 20
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .............................22
3.1. Thành phần loài của giống Bungarus ở Việt Nam .................................. 22
3.1.1. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ..................... 22
3.1.2. Đặc điểm hình thái các lồi Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ....... 23
3.2. Khóa định loại các lồi trong giống Bungarus ở Việt Nam. ................... 41
3.3. Đặc điểm phân tử vùng gen COI của quần thể và các loài Bungarus. .... 41
3.3.1. Kết quả tách chiết ADN tổng số mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus
ở Việt Nam .............................................................................................. 41
3.3.2. Nhân bản trình tự ADN đích vùng gen COI mẫu giống Rắn cạp nia

Bungarus ở Việt Nam. ............................................................................ 46
3.3.3. Xác định trình tự nucleotide vùng gen COI của các lồi trong
giống Bungarus tại Việt Nam ................................................................. 46
a. Trình tự đoạn gen COI của loài B. candidus ....................................... 46
3.3.4 Mối quan hệ di truyền giữa các loài trong giống Bungarus tại Việt
Nam ......................................................................................................... 49
TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................55


V
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.2. Cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu quan hệ di truyền của giống
Bungarus ......................................................................................................... 20
Bảng 3.1. Danh sách các loài Bungarus ghi nhận ở Việt Nam ..................... 233
Bảng 3.2: Đặc điểm hình thái các lồi Bungarus trong nghiên cứu này ...... 399
Bảng 3.3. Độ sạch và hàm lượng ADN của 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus
ở Việt Nam ...................................................................................................... 42
Bảng 3.4. Thơng tin các trình tự gen sử dụng trong nghiên cứu .................. 443


VI
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1. Địa điểm thu thập mẫu vật các lồi thuộc giống Bungarus ở Việt Nam
....................................................................................................................... 144
Hình 2.2. Vị trí các vảy trên tồn cơ thể của lồi rắn cạp nia ...................... 199
Hình 3.1. Rắn cạp nia nam/B. candidus: IEBR/NT.2016.94 ........................ 277
Hình 3.2.Các đặc điểm hình thái của B. multicinctus và lồi B. “wanghaotingi”
và B. candidus ............................................................................................... 278
Hình 3.3. Bản đồ phân bố loài B. candidus ở Việt Nam............................... 288
Hình 3.4. Rắn cạp nia sơng hồng/B. slowinskii: ♂IEBR/K233 .................. 3131

Hình 3.5. Bản đồ phân bố lồi B. slowinskii ở Việt Nam ........................... 3232
Hình 3.6. Rắn cạp nong/B. fasciatus: ♂ VMNN. 07958 .............................. 355
Hình 3.7 Bản đồ phân bố lồi B. fasciatus ở Việt Nam ................................ 366
Hình 3.8 Bản đồ phân bố loài B. flaviceps ở Việt Nam ................................ 388
Hình 3.9. Kết quả điện di DNA tổng số 09 mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở
Việt Nam trên gel agarose 1% (các giếng từ 1-9 là thứ tự các mẫu tương ứng
với số thứ tự trong bảng 3.2). .......................................................................... 42
Hình 3.10. Sản phẩm PCR của 09 mẫu mẫu giống Rắn cạp nia Bungarus ở Việt
Nam phân tích với cặp mồi COI điện di trên gel agarose 1% (M: Marker phân
tử 100bp; VQN1-9: ký hiệu mẫu) ................................................................. 466
Hình 3.11. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của lồi Rắn cạp
nia nam B. candidus ...................................................................................... 477
Hình 3.12. Sơ đồ các peak trong giải trình tự vùng gen COI của lồi Rắn cạp
nia sơng hồng B. slowinskii ........................................................................... 488
Hình 3.13. Cây quan hệ di truyền của các lồi thuộc giống Bungarus xây dựng
trên mơ hình BI ............................................................................................... 52


VII
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CÁC TỪ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Nội dung

cs.

Cộng sự

NCBI

National Center for Biotechnology Information

OD

Mật độ quang học (Optical Density)

PCR

Polymerase Chain Reaction

bp

Cặp bazơ (base pair)

BLAST

Basic Local Alignment Search Tool

TAE

Tris Acetate EDTA

IEBR

Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

IUCN

Tổ chức Bảo tồn Thiên nhiên Quốc tế

KBTTN

Khu Bảo tồn thiên nhiên

Max

Giá trị lớn nhất

Min

Giá trị nhỏ nhất

VQG

Vườn Quốc gia

VNMN

Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam

♂

Con đực

♀

Con cái


1

MỞ ĐẦU
1.

TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Việt Nam là một trong trong 25 quốc gia có mức độ dạng sinh học cao

nhất thế giới (Myers và cs. 2000) [Error! Reference source not found.] trong
trong đó có khu hệ bị sát. Số lượng loài tăng nhanh trong thập kỷ gần đây: từ
ghi nhận 258 vào năm 1996, Nguyễn Văn Sáng và Hồ Thu Cúc lên đến 368
loài vào năm 2009 (Nguyễn và cs. 2009) [2], và 420 loài vào năm 2013. Cho
tới nay là hơn 500 lồi (tính đến tháng 10-2021 theo Uetz & Hošek 2021 [3].
Nhiều loài mới được phát hiện mô tả và ghi nhận mới được phát hiện ở Việt
Nam trong hai thập kỷ gần đây, trong đó giống Bungarus có lồi mới Bungarus
slowinskii được Kuch và cs phát hiện và mô tả năm 2005 [4].
Giống rắn cạp nia Bungarus, Daudin 1803 thuộc họ rắn hổ Elapidae, F.
Boie, 1827 là nhóm rắn có nọc độc, hiện ghi nhận 16 lồi trên thế giới có vùng
phân bố chủ yếu ở khu vực Đông Nam Á từ Pakistan, Ấn Độ và Afghanistan ở
phía tây, và phía đơng nhiệt đới Đơng Nam Á, tồn bộ tiểu vùng Ấn Trung và
phần cịn lại của Châu Á (Slowinski, 1994; Kharin và cs. 2011; Uetz & Hošek,
2020) [5, 6, 3]. Ở Việt Nam đã ghi nhận 6 loài thuộc giống này bao gồm:
Bungarus bungaroides, B. candidus, B. fasciatus, B. flaviceps, B. multicinctus,
B. slowinskii [3]. Về mặt phân loại học, nhiều loài trong giống Bungarus có
hình thái giống nhau khó định loại (Wall 1907; Slowinski 1994; Kuch 2007;
Abtin và cs. 2014) [7, 5, 8,9], các khu vực phân bố của lồi thì chồng chéo, và
một số loài phân biệt dựa trên vùng địa lý [4, 3]. Ví dụ như: khoanh đen, khoanh
trắng Rắn cạp nia đông bắc (Bungarus bungaroides), Rắn cạp nia bắc
(Bungarus multicinctus), Rắn cạp nia nam (Bungarus candidus) và Rắn cạp
nia sông Hồng (Bungarus slowinskii). Ngoài ra, một số loài thường bị nhầm
lẫn với giống rắn giả cạp nia Lygodon về hình thái [8]. Việc định loại và xác
định phân bố tự nhiên các lồi trong nhóm rắn độc Bungarus là cơ sở khoa học

quan trọng trong việc nghiên cứu độc tố và độc điều trị rắn độc cắn (Fry và cs.
2003; Williams và cs. 2011) [10, 11].
Mã vạch ADN (DNA barcoding) sử dụng đoạn ADN ngắn để phân biệt
giữa các loài [12, 13, Error! Reference source not found.] là công cụ phục


2
vụ có hiệu quả cho cơng tác giám định, phân loại, đánh giá quan hệ di truyền,
phát hiện loài mới, quản lý chất lượng, nguồn gốc, xuất xứ, bản quyền của sản
phẩm từ sinh vật [14, 16, 13, Error! Reference source not found.]. Ở động
vật, một số vùng gen ty thể (Cyt b, ND4 và COI...) đang được ứng dụng rộng
rãi trong các nghiên cứu mối quan hệ phát sinh chủng loại (phylogeny), phân
loại (taxonomy) và nhận dạng loài (identity) [17, 18 ]. Nhiều phân tích phát
sinh lồi phân tử đã được tiến hành ở trên giống Bungarus hay lớn hơn là trên
phân họ Bungarinae trên cơ sở phân tích trình tự nucleotide vùng gen ti thể (Cyt
b, ND4 và COI) [4, 19, 20, 21]. Những nghiên cứu phát sinh loài này đã nâng
cao hiểu biết của chúng ta về các mối quan hệ tiến hóa trong giống.
Do đó, việc nghiên cứu về phân loại học, phân bố, quan hệ di truyền của
các loài thuộc giống Bungarus là rất cần thiết để giải quyết các vấn đề về chẩn
loại. Nghiên cứu này sẽ tập trung làm rõ tên khoa học và vị trí phân loại của
chúng trong hệ thống phân loại dựa trên những dẫn liệu về hình thái, sinh học
phân tử. Chính vì vậy, tơi đề xuất thực hiện đề tài “Kết hợp hình thái và sinh
học phân tử trong nghiên cứu chẩn loại giống rắn cạp nia Bungarus
Daudin, 1803 ở Việt Nam”.
2.

MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
 Đánh giá sự đa dạng thành phần loài, đặc điểm phân bố của các lồi thuộc
giống Bungarus ở Việt Nam
 Kết hợp hình thái và di truyền phân tử trong việc định loại và xác định

mối quan hệ di truyền của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.

3.

NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Nội dung 1: Nghiên cứu đa dạng thành loài rắn thuộc giống cạp nia

Bungarus ở Việt Nam.
 Danh sách loài
 Ghi nhận các địa điểm phân bố mới của các loài giống Bungarusi ở Việt
Nam.
 Mơ tả, phân tích, so sánh đặc điểm hình thái.
 Xây dựng khố định loại


3
 Nội dung 2: Đánh giá tính đa dạng và mối quan hệ di truyền giữa các
quần thể và giữa các loài trong giống.
 So sánh sự đa dạng di truyền giữa các loài và giữa các quần thể của một
số loài phân bố rộng
 Xây dựng cây phát sinh chủng loại.
4.

Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI
 Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học mới
về đa dạng thành phần loài và phân bố của các loài thuộc giống Bungarus
ở Việt Nam.
 Đánh giá mối quan hệ di truyền giữa các quần thể và giữa các loài thuộc
giống Bungarus ở Việt Nam.
 Xây dựng dữ liệu về hình thái và di truyền phân tử giống Bungarus ở

Việt Nam, từ đó làm cơ sở khoa học cho việc giám định, bảo tồn và phát
triển lồi này ở ngồi tự nhiên.

5.

NHỮNG ĐĨNG GĨP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
 Cập nhật về phân bố của các loài thuộc giống Bungarus ở Việt Nam.
 Đánh giá mối quan hệ di truyền của các loài trong giống Bungarus ở
Việt Nam.