Báo cáo tối ưu hóa quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng (raphanus sativus l ) với sự hỗ trợ của vi sóng

LỜI MỞ ĐẦU
Flavonoid là một trong 5 nhóm chính thuộc nhóm các hợp chất polyphenol, được
biết đến là một nhóm hợp chất tự nhiên có nhiều tác dụng tốt cho sức khỏe con người,
trong đó nổi bật nhất là các chức năng chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống viêm nhiễm
và ung thư…
Trong tự nhiên, các hợp chất flavonoid tồn tại khá phổ biến, được tìm thấy trong
hầu như tất cả các lồi thực vật. Đã có khá nhiều các cơng trình nghiên cứu về
flavonoid từ các lồi thực vật khác nhau, tập trung vào khảo sát thành phần hóa học,
hoạt tính sinh học của hợp chất đơn lẻ và dịch chiết, phương pháp cải thiện hiệu suất
thu nhận (sử dụng phương pháp trích ly hiện đại có các giải pháp hỗ trợ: enzyme, vi
sóng, sóng siêu âm, áp suất cao...), ứng dụng các hợp chất thu nhận được vào việc tạo
ra các sản phẩm thương mại. Các phương pháp trích ly hiện đại đều cho hiệu quả thu
nhận cao hơn, rút ngắn được thời gian trích ly, bảo tồn được hoạt tính của dịch chiết
thu được. Tuy nhiên, điều kiện trích ly tối ưu cho từng phương pháp trên mỗi đối
tượng cụ thể là không giống nhau.
Củ cải trắng tên khoa học là Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae, là
cây trồng hàng năm, dùng như một loại rau ăn củ ở Việt Nam và nhiều nước trên thế
giới. Theo các tài liệu y học ghi nhận, củ cải trắng có vị ngọt hơi cay, khơng độc,
Những nghiên cứu khoa học được công bố gần đây từ một số nước trên thế giới cho
thấy củ cải trắng có thành phần hóa học rất phong phú, trong đó có chứa các hợp chất
phenolic và flavonoid. Ở nước ta, củ cải trắng là một loại rau phổ biến, rẻ tiền, được
trồng và sử dụng nhiều, nhưng các nghiên cứu về thành phần, hoạt tính và ứng dụng
của loại củ này cịn rất hạn chế.
Với mục đích thu nhận dịch chiết giàu flavonoid từ củ cải trắng, tôi đã thực hiện
nghiên cứu: “Tối ưu hóa q trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng Raphanus sativus
L. với sự hỗ trợ của vi sóng”.
Trong quá trình thực hiện nghiên cứu này, mặc dù đã rất cố gắng, song khơng thể
tránh được cịn nhiều hạn chế, thiếu sót. Rất mong nhận được sự góp ý của Hội đồng
để đề tài được hoàn thiện hơn.

1

❖ Mục đích nghiên cứu: Xác định được điều kiện tối ưu cho q trình xử lý vi sóng
để thu nhận hợp chất giàu hoạt tính chống oxi hóa từ củ cải trắng Raphanus sativus
L.
❖ Nội dung chính:
1. Tối ưu quá trình thu nhận flavonoid từ củ cải trắng trong điều kiện khơng xử
lý và xử lý vi sóng. Xác định các điều kiện xử lý vi sóng để phá vỡ tế bào giúp
thu nhận flavonoid tốt nhất.
2. Khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid thu được.
❖ Phương pháp nghiên cứu:
Các phương pháp phân tích thơng thường được dùng để xác định thành phần
hóa học của nguyên liệu củ cải trắng.
Đánh giá hiệu quả q trình trích ly qua hàm lượng flavonoid thu nhận được.
Hàm lượng flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp tạo màu với muối nhơm
clorua.
Hoạt tính chống oxi hóa được đánh giá qua khả năng khử gốc tự do ABTS*.
Quá trình tối ưu được thực hiện theo mơ hình Box – Wilson dạng CCC trên phần
mềm Mode 5.0.
Quan sát sự thay đổi cấu trúc bề mặt nguyên liệu trong điều kiện không xử lý và
xử lý vi sóng bằng phương pháp chụp SEM.

2


CHƯƠNG 1.TỔNG QUAN
1.1 Tổng quan về củ cải trắng
1.1.1 Thực vật học cây cải củ
Củ cải trắng (white radish) là củ của cây cải củ, có tên khoa học là Raphanus
sativus L. thuộc giới thực vật, ngành Magnoliophyta, lớp Magnoliopsida, bộ

Brassicales, họ Brassicaceae, chi Raphanus, loài sativus [1].
Củ cải trắng cịn có các tên gọi khác như white radish (Anh), Daikon (Nhật), Hua
piahs (Thái Lan), Lai fu (Trung Quốc), Lobak beurem (Indonesia), Mu (Hàn Quốc),
Muli (Ấn Độ) [1], [2]
Nhiều tài liệu cho rằng cải củ hoang dại có nguồn gốc từ khu vực Biển Đen và
Địa Trung Hải, đã được dùng như một loại thực phẩm từ thời Ai Cập cổ đại, sau đó
được trồng ở châu Âu vào thế kỉ 16-17 và châu Mỹ vào thế kỉ 20. Ở khu vực Đông
Á, nhiều loại củ cải khác nhau đã được phát hiện trồng ở Trung Quốc khoảng 2450
năm trước và ở Nhật Bản 1300 năm trước [3].
Chi Raphanus được chia thành 2 phân chi: Raphanis DC. và Hesperidopsis Boiss.
Phân chi Raphanis DC. có 5 lồi khác nhau gồm Raphanus sativus, Raphanus
raphanistrum, Raphanus microcarpus, Raphanus rostras và Raphanus landra. Phân
chi Hesperidopsis Boiss chỉ có 1 lồi là Raphanus maritimus [3].
Lồi Raphanus sativus lại được chia thành 5 thứ khác nhau, gồm: thứ radicular
DC. (thứ sativus Saz. củ cải Hatsuka, củ cải tròn nhỏ ở miền Bắc Trung Quốc), thứ
niger (Mill.) Pers. (thứ majorA.Voss, củ cải đen, củ cải nhỏ ở các nước phương tây),
thứ raphanistroides Makino (thứ hortensis Backer, củ cải miền bắc Trung Quốc, củ
cải miền nam Trung Quốc, củ cải Nhật Bản), thứ mougri Helm (thứ caudatus (L.)
Hooker et Anderson, củ cải có đi), thứ olerfer Netz. (thứ oleiformis Pers., củ cải
lấy dầu) [3].
Trong mỗi thứ lại chia ra thành nhiều giống khác nhau do nguồn gốc, sự lai hóa,
điều kiện đất đai, khí hậu, mùa vụ gieo trồng. Nhìn chung, trong gia đình họ cải củ
có sự đa dạng về kích thước, hình dáng và màu sắc. Dựa vào yếu tố màu sắc, người
ta thường chia củ cải thành các nhóm lớn: củ cải trắng (white radish), củ cải đỏ (red
radish) và củ cải đen (black radish). Dựa vào yếu tố hình dáng, chia củ cải thành 2

3


nhóm lớn: của cải trịn và củ cải dài. Trong khi củ cải tròn, nhiều màu sắc khác nhau

phổ biến ở các nước phương Tây, củ cải dài màu trắng phổ biến ở các nước châu Á
như Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Việt Nam.
Cải củ là cây hàng năm, thân củ, được trồng chủ yếu để lấy củ. Củ có thể dùng ăn
sống, nấu chín hoặc ngâm muối. Ở một số quốc gia, thân và lá cũng được sử dụng
như một loại rau. Cây con của cải củ (mầm củ cải), cũng được sử dụng như một loại
rau.
Cải củ có rễ cọc phình to thành củ chứa nhiều dinh dưỡng, hình dáng, màu sắc,
kích thước phụ thuộc vào giống. Rễ củ là bộ phận chính được dùng trong thực phẩm
mà ta quen gọi là củ, củ có hình dạng khác nhau phụ thuộc vào giống, chế độ dinh
dưỡng, đất đai và điều kiện ngoại cảnh. Củ hình thành ở giai đoạn 4 - 6 lá thật tuỳ
từng giống. Củ cải trắng Việt Nam thường thon dài 15 - 30 cm, đường kính 3 - 4 cm,
màu trắng, vị cay nồng, cấu trúc giịn [1], [4].

Hình 1.1 Một số loại củ cải
Lá: có màu xanh hoặc xanh vàng tùy giống. Lá mọc ở phần đầu của củ gồm phiến
lá và cọng lá. Cọng dài hay ngắn, nhỏ hay to, không lơng hay có lơng tùy giống. Phiến
có thể ngun hay xẻ thùy, rìa lá nguyên hay răng cưa tùy giống.
Hoa có dạng chùm và mọc thành cụm ở đỉnh và có màu trắng hay phớt tím, hoa
có 4 cánh hoa.

4


Quả dài hình trụ và thắt lại từng đoạn, mỏ quả dài, có màu xanh, khi chín thì vỏ
quả chuyển sang màu vàng, số hạt trong quả tuỳ theo giống, thơng thường mỗi quả
có từ 3-5 hạt. Hạt hình trịn hoặc thn dài, đầu tiên hạt có màu xanh, khi chín hồn
tồn thì hạt chuyển sang màu nâu [4], [5].

Hình 1.2 Hoa, lá và quả của cây cải củ
Cải củ có thể trồng quanh năm. Thời gian trồng tốt nhất là mùa xuân và đầu mùa

thu. Thời gian sinh trưởng khác nhau từ 50 đến 90 ngày tùy giống và sản phẩm mong
muốn, nhưng thường là 50 - 60 ngày vào mùa hè và 70 - 80 ngày vào mùa đông. Nhiệt
độ lý tưởng cho sự sinh trưởng là 20 - 250C. pH đất trồng tối ưu là 6,0 – 6,5. Loại cây
trồng này không chịu được điều kiện ngập nước [4,5].

Hình 1.3 Cây và củ cải trắng

5


1.1.2 Thành phần hóa học củ cải trắng
1.2.2.1 Thành phần hóa học cơ bản
Các thành phần hóa học cơ bản của 100 g củ cải trắng được nêu ở bảng 1.1. Trong
củ cải trắng, protein chiếm khoảng 1,5% khối lượng củ với nhiều acid amin không
thay thế như glycine, alanine, serine, proline, valine, threonine, trans-4 hydroxy – L
– proline, leucine, isoleucine, methione, phenylalanine, arginine, acid aspartic, acid
glutamic, tryptophan, cystein, lysine, histidine, tyrosine và cystine [6], [7].
Bảng 1.1 Thành phần hóa học của 100 g củ cải trắng Việt Nam
STT Thành phần

Hàm lượng

STT Thành phần

Hàm lượng

1

Nước

92 g

8

Sắt

1,1 mg

2

Protein

1,5 g

9

Phospho

41 mg

3

Glucid

3,7 g

10

Vitamin PP

0,5 mg

4

Lipid

0,1 g

11

Vitamin B1

0,1 mg

5

Chất xơ

1,5 g

12

Vitamin B2

0,1 mg

6

Tro

1,2 g

13

Vitamin C

30 mg

7

Canxi

40 mg

14

Β-caroten

15 mcg

(nguồn: Viện dinh dưỡng quốc gia Việt Nam)

Glucid trong củ cải trắng bao gồm đường, tinh bột, pectin và xơ. Đường trong củ
cải trắng chủ yếu là glucose, một lượng nhỏ fructose, sucrose và pentosan. Tinh bột
thay đổi tùy theo giống, chiếm từ 0,2 – 0,5%. Xơ chiếm một lượng khoảng 1,5%
gồm chủ yếu là cellulose và hemicellulose có trong phần vỏ, mơ nâng đỡ và thành tế
bào của củ cải trắng, đóng vai trị tạo cấu trúc, chống lại các va chạm cơ học. Pectin
chiếm khoảng 0,3%, chủ yếu tham gia vào cấu tạo của thành tế bào, tồn tại chủ yếu
dưới dạng calcium pectate [8], [9]. Ngồi ra, củ cải trắng cịn nổi bật với hàm lượng
lipid thấp, hàm lượng vitamin và khoáng cao. Một số khống vi lượng cũng được tìm

thấy trong củ cải trắng như nhôm, bari, liti, mangan, silic, titan, flour và iod với hàm
lượng tổng lên đến 18 µg/100g [8].
1.2.2.2 Các hợp chất thứ cấp trong củ cải trắng
Các nghiên cứu đã cơng bố cho thấy trong củ cải trắng có chứa nhiều hợp chất
thứ cấp có lợi cho sức khỏe con người.

6


Enzyme: trong củ cải trắng đã tìm thấy sự hiện diện của các enzyme invertase,
cellulase, ß-galactosidase, protease, peroxidase, catalase, sucrase, amylase, alcohol
dehydrogenase, pyruvic carboxylase [8], [10], [11], glutathione reductase [12] và
raphanin [13]. Trong số này, catalase và glutathione reductase là 2 enzyme có tác
dụng như những chất chống oxi hóa bậc 2, góp phần ngăn chặn sự tạo thành các gốc
tự do [14]. Ngồi ra, raphanin, một protease trung tính có khả năng kháng khuẩn và
kháng nấm mạnh cũng được tìm thấy trong củ cải trắng.
Acid hữu cơ: chủ yếu gồm acid oxalic, acid malic, acid malonic, acid erythorbic,
acid erucic, acid gentisic, acid hydrocinnamic, acid salicylic và acid vanillic [15],
[16].
Các hợp chất phenolic: các flavonoid được tìm thấy trong củ cải trắng gồm
quercetin, kaempferol, myricetin, apigenin, luteolin, catechin và rutin [17], [18]. Các
acid phenolic có mặt trong củ cải trắng gồm caffeic, p-coumaric, ferulic,
hydroxycinnamic, p-hydroxybenzoic, vanillic, salicylic, acid gentisic [16], acid
syringic và phenyl pyruvic [19]. Anthocyanidin cũng được tìm thấy trong củ cải trắng
nhưng với hàm lượng nhỏ, ngoại trừ pelargonidine, delphinidin và cyanidine, là
những chất tạo màu cho củ cải đỏ, hồng hoặc tía [16].
Các hợp chất isothiocyanate: gồm 4-methylthio-3-butenyl isothiocyanate
(raphasatin), 4-(methylthio) butyl isothiocyanate (erucin) [20], allyl isothiocyanate.
benzyl isothiocyanate và phenethyl isothiocyanate [12] đã được ghi nhận là có mặt
trong thành phần của củ cải trắng.

Ngoài các thành phần trên, trong củ cải trắng cịn có các hợp chất tannin, alkaloid,
coumarin, gibberellin và các hợp chất có chứa lưu huỳnh.
1.2 Hợp chất flavonoid
1.2.1 Khái niệm
Flavonoid là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo màu cho rất nhiều loại rau,
hoa và quả. Flavonoid có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là gồm 2 vòng
benzen (vòng A và B) nối với nhau qua 1 dây 3 carbon (vòng pyron - vòng C).

7


Hình 1.4 Khung sườn cơ bản của flavonoid [21]
1.2.2 Phân loại
Flavonoid được chia thành ba phân nhóm chính: euflavonoid (2phenylbenzopyrans),

isoflavonoid

(3-benzopyrans)

và

neoflavonoid

(4-

benzopyrans). Trong mỗi nhóm này các flavonoid lại được chia thành các nhóm phụ
khác nhau dựa vào sự khác biệt trong cấu tạo của vịng C [22], [23].

Hình 1.5 Các phân nhóm chính của flavonoid
(A: euflavonoid, B: iso-flavonoid, C: neo-flavonoid)

• Phân nhóm của euflavonoid gồm các nhóm phụ: flavan, flavan 3-ol (catechin),
flavan 4-ol, flavan 3,4-diol, anthocyanidin, flavanone, flavone, flavonol, 3-hydroxy
flavanon, chalcon, dihidrochalcon, aurone.
• Phân nhóm isoflavonoid gồm các nhóm phụ: iso flavan, iso flavan-4-ol,
isoflavon, isoflavanon, rotenoid…Thường gặp nhất là isoflavon trong cây họ đậu.
• Neoflavon chỉ giới hạn trong một số cây gồm các nhóm phụ 4-aryl-chroman,
4-aryl-coumarin, dalbergion.
Ngồi ra. người ta còn phân loại flavonoid thành flavonoid, biflavonoid,
triflavonoid và flavonlignan [22].
1.2.3 Tính chất lý hóa
Trong thực vật, flavonoid tồn tại ở 2 dạng: dạng tự do (gọi là aglycon) và dạng
liên kết với đường (glycoside). Các glycoside khi bị thủy phân bằng acid hoặc enzyme

8


sẽ giải phóng ra đường và aglycon. Các đường thường gặp nhất là D-glucose, Dgalactose, L-rhamnose, L-arabinose, D-xylose, D-apiose [22].
Tính tan: aglycon kém tan trong dung môi kém phân cực (hexan, benzen, ether
dầu hỏa), tan trong dung môi phân cực vừa và mạnh (ethyl acetate, dimethyl ether,
methanol, ethanol), tan trong kiềm loãng, kém tan trong dung dịch acid. Glycoside:
tan trong ethanol, methanol. Các glycoside càng có nhiều nhóm đường và mạch
đường càng dài thì tan tốt trong nước nóng. Các flavonoid glycoside có nhóm -OH
tại vị trí C7 cịn tan được trong dung dịch NaOH, Na2CO3, NaHCO3 do có tính acid.
Các flavonoid dạng aglycon thường dễ kết tinh, trong khi các glycoside thường khó
kết tinh hơn [22].
Các flavonoid thường có màu. Flavon có màu vàng nhạt hoặc màu cam; flavonol
có màu vàng đến vàng nhạt; chalcon có màu vàng đến cam đỏ. Các isoflavon,
flavanon, flavanonol, leucoanthocyanidin, catechin kết tinh không màu.
Anthocyanidin thường hiện diện ở dạng glycosid: pelargonidin, cyanidin,
delphinidin…tạo màu xanh dương, đỏ, tím cho hoa và trái [21], [22].

Các flavonoid dễ tạo muối tan trong nước với các hydroxyd kiềm, nhạy cảm với
pH, nhiệt độ và ánh sáng. Có khả năng tạo phức với các ion kim loại cho sản phẩm
có màu đặc trưng.
Hệ thống nối đơi liên hợp tạo ra bởi 2 vòng benzen và vòng pyron làm cho
flavonoid có khả năng hấp thụ tia tử ngoại. Thường thu được 2 dải hấp thu cực đại,
dải 1 có λmax = 320 - 380 nm, dải 2 có λmax = 240 - 280 nm [22].
1.2.4 Giá trị sinh học của flavonoid
1.2.4.1 Hoạt tính chống oxi hóa
Gần đây, các hợp chất flavonoid đã được coi là chất chống oxi hóa mạnh mẽ
trong ống nghiệm và được chứng minh là chất chống oxi hóa mạnh hơn vitamin C,
vitamin E và carotenoids [24].
Chất chống oxi hóa là các hợp chất có thể trì hỗn, ức chế hoặc ngăn chặn q
trình oxi hóa gây ra bởi các gốc tự do và giảm bớt tình trạng stress oxi hóa [25], [26].
Stress oxi hóa là một trạng thái mất cân bằng do số lượng gốc tự do sản sinh quá
nhiều vượt qua khả năng chống oxi hóa nội sinh, dẫn đến q trình oxi hóa của một
loại đại phân tử sinh học, như các enzym. protein. DNA và lipid [24], [26]. Stress

9


oxihóa là nguyên nhân quan trọng trong sự phát triển của các bệnh thối hóa mãn tính
bao gồm bệnh mạch vành tim, ung thư và lão hóa [24], [25].
Khả năng chống oxi hóa của flavonoid có thể được giải thích dựa vào các đặc
điểm cấu trúc phân tử của chúng:
• Trong phân tử flavonoid có chứa các nhóm hydroxyl liên kết trực tiếp với vịng
thơm có khả năng nhường hydro giúp chúng có thể tham gia vào các phản ứng oxi
hóa khử, bắt giữ các gốc tự do;
• Chứa các vòng thơm và các liên kết bội (liên kết C=C, C=O) tạo nên hệ liên
hợp giúp chúng có thể bắt giữ, làm bền hóa các phần tử oxi hoạt động và các gốc tự
do.

• Chứa nhóm có thể tạo phức chuyển tiếp với các ion kim loại như
catechol…giúp làm giảm quá trình sản sinh ra các phần tử oxi hoạt động [24], [25].
Q trìnhchống oxi hóa của flavonoid chủ yếu theo 3 cơ chế sau:
• Khử và vơ hoạt các gốc tự donhờ thế oxi hóa khử thấp: các hợp chất flavonoid
nhờ thế oxi hóa khử thấp nên có thể khử các gốc tự do bằng cách nhường ngyên tử
hidro hoặc một electron cho gốc tự do [26].

Hình 1.6 Cơ chế ức chế của catechol với gốc tự do peroxyl [25]
• Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách liên kết với các ion kim loại vi
lượng tham gia vào quá trình sản xuất các gốc tự do [26].

10


Hình 1.7 Các vị trí của flavonoid có thể liên kết với các ion kim loại [25]
• Ức chế sự hình thành các gốc tự do bằng cách ức chế một số enzyme tham gia
vào quá trình sản xuất các gốc tự do [26].
1.2.4.2 Tác dụng ức chế vi sinh vật. chống viêm nhiễm
Dịch chiết flavonoid từ quả mơ cho thấy khả năng ức chế đối với sự phát triển
của S.aureus, Shigella sonnei, Shigella flexneri, Candida albicans với đường kính
vịng ức chế tương ứng là 23, 21, 26 và 29 mm [29]. Kết quả tương tự đối với dịch
chiết flavonoid của cây diếp cá trên sự phát triển của E.coli, P.aeruginosa, B.subtilis
và S.aureus với giá trị MIC lần lượt là 100, 200, 200 và 50 µg/ml [40]. Quercetin làm
giảm đáng kể tình trạng viêm nhiễm và sự peroxyd lipid gây ra bởi Helicobacter
pylori trong niêm mạc dạ dày của chuột bạch [32].
1.2.4.3 Tác dụng đối với enzyme
Dẫn xuất 6-hydroxy luteolin của luteolin có thể ức chế sự hoạt động của enzyme
α-glucosidase đến 92% ở nồng độ 500 μM [33]. Một số flavonoid cũng đã cho thấy
hoạt tính ức chế đối với enzyme xanthine oxidase, enzyme xúc tác cho sự oxi hóa
xanthine và hypoxanthine thành acid uric [27].

1.2.4.4 Tác dụng đối với các bệnh tim mạch, tiểu đường
Tác động bảo vệ của các flavonoid đối với tim mạch có thể do khả năng của
chúng trong việc ngăn ngừa sự oxi hóa các lipoprotein tỷ trọng thấp, phòng ngừa xơ
vữa động mạch, chặn sự kết tụ huyết khối, điều hòa nhịp tim, ngăn ngừa bệnh mạch
vành và nhồi máu cơ tim, điều hòa huyết áp... Các kết quả nghiên cứu đã chỉ ra rằng
các flavonoid tự nó có vai trị như chất kích thích insulin hay bắt chước chức năng
của insulin; ngồi ra chúng cịn có sự ảnh hưởng đến hoạt động của các enzyme trong
q trình chuyển hóa đường…[27].

11


1.2.4.5 Tác dụng đối với ung thư
Với nỗ lực nhằm nghiên cứu khả năng chống ung thư của các hợp chất flavonoid.
gần đây nhiều tác giả trên thế giới đã tiếp tục thử nghiệm tác dụng in vitro và in vivo
của flavonoid lên các dòng tế bào ung thư khác nhau. Quercetin có tác dụng ức chế
sự phát triển của các tế bào ung thu tuyến tụy, chế độ ăn bổ sung quercetin cũng có
tác dụng làm giảm khả năng phát triển của các khối u [34]. Naringenin và kaempferol3-O- (2”, 6”-di-O-p-trans-coumaroyl) glucoside thu nhận từ hoa của cây Melastoma
malabathricum L. cũng đã được tìm thấy là có khả năng ức chế sự tăng sinh của dòng
tế bào ung thư vú MCF7 với giá trị IC50 lần lượt là 0,28 µM và 1,3 µM [35].
1.3 Q trình trích ly thu nhận hợp chất flavonoid
1.3.1 Quy trình chung của quá trình thu nhận flavonoid từ mẫu thực vật
Nguyên liệu
Chuẩn bị mẫu, xử lý mẫu

Trích ly
Lọc
Dịch trích

Dung mơi

Bã
Cơ giảm áp loại dung mơi

Cao thơ chứa
flavonoid

Tinh chế

Flavonoid

Hình 1.8 Quy trình thu nhận flavonoid từ thực vật

12


Mẫu thực vật dùng nghiên cứu sau khi thu gom sẽ trải qua q trình sơ chế chuẩn
bị để có dạng mẫu phù hợp cho nghiên cứu. Quá trình sơ chế chủ yếu là rửa sạch, loại
các phần hư hỏng và tạp chất, cắt nhỏ mẫu.
Sau đó mẫu sẽ qua quá trình chuẩn bị mẫu và xử lý mẫu (nếu có). Q trình chuẩn
bị mẫu chủ yếu là tạo mẫu ở dạng tươi hay khô. Bảo quản lạnh mẫu nếu mẫu nghiên
cứu là mẫu tươi (bảo quản lạnh thường và bảo quản lạnh đông) hoặc sấy khô mẫu nếu
mẫu nghiên cứu là mẫu khô (sấy đối lưu, sấy lạnh, sấy thăng hoa). Ngồi ra, một số
quy trình cịn có q trình tiền xử lý mẫu như: chần hoặc hấp để ức chế một số enzyme
có trong mẫu, xử lý enzyme, nghiền nhỏ hoặc đồng hóa rồi đưa vào trích ly để thu
nhận flavonoid. Đây là những phương pháp xử lý mẫu khá phổ biến, đã được sử dụng
trong nhiều nghiên cứu.
Dịch sau trích ly được đem cơ quay chân khơng loại dung môi thu cao chiết thô
chứa flavonoid. Cao này sau cùng sẽ trải qua các quá trình tinh chế để tách riêng phần
flavonoid.

1.3.2 Phương pháp trích ly thu nhận flavonoid từ mẫu nghiên cứu
Trích ly là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có hoạt
tính sinh học từ thực vật, đóng vai trị vai trọng và quyết định đến kết quả và sự thành
cơng cuối cùng của nghiên cứu.
Q trình trích ly có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau, gồm:
• Các phương pháp truyền thống: chiết Soxhlet, ngâm dầm và ngấm kiệt.
• Các phương pháp hiện đại: trích ly có sự hỗ trợ của sóng siêu âm, trích ly có
sự hỗ trợ của xung điện, trích ly có sự hỗ trợ của enzyme, trích ly có sự hỗ trợ của vi
sóng (MAE), trích ly ở áp suất cao, trích ly bằng chất lỏng siêu tới hạn.
Mặc dù có nhiều phương pháp trích ly khác nhau, nhưng mục tiêu chung của các
phương pháp này đều là:
• Tách chất cần thu nhận ra khỏi mẫu thực vật vốn có thành phần phức tạp
• Tăng tính chọn lọc của các phương pháp phân tích
• Tăng độ nhạy của sự thử nghiệm các tác dụng sinh học của hợp chất khi nghiên
cứu trên cơ thể sống do tăng được nồng độ của chất
• Chuyển đổi các hợp chất mong muốn sang dạng phù hợp để phát hiện và tách
riêng [18].

13


1.3.3 Ngun lý của q trình trích ly [19]
Trích ly là q trình hịa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử có trong mẫu nguyên
liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc với dung mơi. Đây là q trình truyền khối
do có sự chênh lệch nồng độ của hợp chất cần thu nhận bên trong nguyên liệu và dòng
chảy bên ngồi (dung mơi). Động lực của q trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ
của cấu tử ở trong ngun liệu và trong dung mơi.
1.3.4 Trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng (MAE: microwave - assisted extraction)
1.3.4.1 Khái niệm [18], [20]
Vi sóng là sóng bức xạ điện từ có tần số từ 0,3 đến 300 GHz. Vi sóng dùng trong

gia đình và quy mơ cơng nghiệp thường có tần số 2,45 GHz.

Hình 1.9 Thiết bị trích ly MAE [24]
Vi sóng được truyền đi dưới dạng sóng, do đó có thể xâm nhập vào bên trong các
vật liệu sinh học, tương tác với những phần tử phân cực bên trong vật liệu như nước
và sinh ra nhiệt. Do vậy, nó có thể làm nóng tồn bộ vật liệu cùng lúc.
1.3.4.2 Cơ chế tác dụng [18], [20]
Cơ chế tác dụng của vi sóng trong q trình trích ly được cho là theo 3 bước như
sau:
• Do sự tương tác của vi sóng và các phân tử phân cực trong mẫu làm tăng nhiệt
độ và áp suất ở một số điểm hoạt động mạnh trong mẫu, gây ra sự phá vỡ cấu trúc tại
đó, giúp giải phóng các chất hòa tan bên trong.

14


• Từ những điểm đã bị phá vỡ dung môi sẽ xâm nhập sâu hơn vào bên trong
mẫu, kết hợp với sự tác động của vi sóng gây ra nhiều hơn sự phá vỡ các cấu trúc từ
bên trong.
• Các chất hịa tan trong mẫu sẽ được giải phóng dưới tác động của dung môi
và nhiệt độ.
1.3.4.3 Ưu nhược điểm của phương pháp [18], [20]
MAE có một số ưu điểm như sau: giảm thời gian trích ly, giảm lượng dung mơi
sử dụng và nâng cao hiệu suất trích ly. MAE cũng có thể được so sánh với các phương
pháp trích ly hiện đại khác, ví dụ như trích ly bằng dung mơi siêu tới hạn (SFE) vì ưu
điểm thiết bị đơn giản và giá thành thấp.
Tuy nhiên, nhược điểm của MAE là hiệu quả sẽ thấp nếu hợp chất cần thu nhận
hoặc dung mơi sử dụng kém phân cực. Ngồi ra, khi so với SFE, nó cịn có một nhược
điểm khác là cần phải có một q trình loại dung mơi để thu chất mong muốn. Đồng
thời, trong q trình trích ly bằng MAE, sự tăng nhiệt độ cũng gây bất lợi nếu hợp

chất cần thu nhận có tính nhạy cảm với nhiệt độ cao.
1.3.4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến MAE
- Dung môi sử dụng: loại dung môi và nồng độ dung mơi có ảnh hưởng quan
trọng đến hiệu quả thu nhận các hợp chất bằng MAE. Trong phương pháp MAE, các
dung mơi có tính phân cực sẽ cho hiệu quả tốt hơn khi sử dụng các dung môi không
phân cực [26], [27].
- Các thông số kỹ thuật của q trình xử lý vi sóng: cơng suất vi sóng và thời
gian xử lý vi sóng.
- Các thơng số kỹ thuật của q trình trích ly: nhiệt độ, thời gian, tỉ lệ ngun
liệu: dung mơi dùng trích ly.
- Đặc điểm của mẫu nguyên liệu: bao gồm độ ẩm và kích thước hạt. Độ ẩm liên
quan đến lượng nước có trong mẫu và do đó liên quan đến khả năng tương tác với vi
sóng để sinh nhiệt. Kích thước hạt cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của MAE, kích
thước phù hợp nằm trong khoảng 100 µm – 2 mm.
Zhang Yan et al. (2011) đã sử dụng MAE để thu nhận flavonoid từ râu bắp. Tác
giả đã xác định được các thơng số cho q trình trích ly MAE tối ưu như sau: dung
mơi ethanol 60%, cơng suất vi sóng 600 W, thời gian 16 phút, tỉ lệ nguyên liệu: dung

15


mơi là 1: 20. Khi đó, lượng flavonoid tổng thu được là 4,55%. Các nghiên cứu cũng
cho thấy MAE không ảnh hưởng lên hoạt tính của flavonoid và các polyphenol thu
được [28].
Ping Shao et al. (2012) và Farid Dahmoune et al. (2015) đã sử dụng MAE để thu
nhận các flavonoid tan trong nước từ lá tía tơ Perilla frutescens và ly polyphenol từ
lá Myrtus communis L. Kết quả nghiên cứu đã khẳng định hiệu quả của phương pháp
MAE với 1 số phương pháp khác [25], [29].
.
Phương pháp

Bảng 1.2 Hiệu suất thu nhận flavonoid từ lá tía tơ [29]
Thời gian trích ly

Dung môi

Flavonoid thu được (mg/g)

Soxhlet

4 giờ

Methanol

6,73

Soxhlet

4 giờ

Nước

2,69

Gia nhiệt

2 giờ x 2 lần

Ethanol 85%

3,15

MAE

23 phút

Nước

6,07

Bảng 1.3 Hiệu quả thu nhận polyphenol từ lá Myrtus communis L. [25]
Thời

Tỉ lệ

Phuon

gian

ethano

g pháp

(phút

l

)

(%)

MAE

1,04

UAE
CSE

P.m

R

w

(ml/g

(W)

)

42

500

32

162,49±16,9

15

50

-

50

120

50

-

50

TPC

TFC
(mg

IC50 (µg GAE/ml)
ABTS.

DPPH.

5,02±0.0

38,20±1,0

16,80±0,2

5

5

8

9

144,77±30,2

3,88±0.4

71,81±2,1

20,61±1,6

3

5

9

6

128,00±18,0

4,15±0.7

39,85±1,1

21,56±0,1

7

5

3

0

(mg GAE/g)

QE/g)

1.4 Tổng quan tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về củ cải trắng
1.4.1 Các nghiên cứu nước ngoài
Năm 2010, Syed Sultan Beevi và cộng sự khảo sát thành phần các hợp chất
polyphenol, khả năng chống oxi hóa và khử gốc tự do của lá và thân cây Raphanus
sativus. Kết quả cho thấy trong lá và thân củ cải có các chất chống oxy hóa mạnh và
có khả năng khử gốc tự do. Dịch chiết methanol và acetone của lá R.sativus có tổng
hàm lượng polyphenol lần lượt là 86,16 và 78,77mg/g chất khơ, có thể so sánh với
trà xanh và trà đen. Phân tích HPLC cho thấy sự hiện diện của catechin, acid

16


protocatechuic, acid syringic, acid vanillic, axit ferulic, acid sinapic, o-coumaric acid,
myricetin, và quercetin trong dịch chiết này. Dịch chiết methanol từ lá và thân cây đã
cho thấy khả năng ức chế đáng kể acid linoleic peroxy và biểu thị hoạt động khử ion
kim loại. Cụ thể, IC50 khi khử gốc tự do DPPH lần lượt là 31 và 42 mg/ml, khi khử

superoxide là 23 và 52 mg/ml, khi khử hydrogen peroxide là 67 và 197 mg/ml, khi
khử gốc NO là 56 và 62 µg/ml tương ứng [19].
Năm 2012, Ali Ghasemzadeh và cộng sự đã nghiên cứu thành phần flavonoid
và hoạt tính chống oxi hóa của một số lồi cây nhiệt đới gồm bắp cải, ớt xanh, ớt đỏ,
rau dền, củ cải trắng, xả và nghệ. Flavonoid tổng được xác định bằng phương pháp
của Chen et al (1998), các flavonoid thành phần được xác định bằng HPLC. Kết quả
cho thấy trong củ cải trắng có hàm lượng flavonoid tổng là 0,098 ± 0,012 mg/g chất
khơ với ít nhất 5 loại flavonoid gồm quercetin, catechin, kaemferol, apigenin và rutin
với hàm lượng lần lượt là: 0,016; 0,057; 0,039; 0,014 và 0,012 mg/g chất khô [17].
Năm 2013, Safia Janiua và cộng sự cũng cho thấy trong củ cải trắng tồn tại các
hợp chất có tác dụng chữa bệnh như tanin, saponin, flavonoid, phlobatannin,
anthraquinon, carbohydrat, đường khử, steroid, phytosterol, alkaloid, amino acid,
terpenoid, cardiac glycoside và chalcone. Để khảo sát khả năng kháng khuẩn của củ
cải, tác giả đã tiến hành trích ly củ cải trong các dung môi khác nhau (nước, methanol,
ethanol, ethyl acetate, ete dầu hỏa). Dịch sau trích được bổ sung vào các đĩa thạch
agar đã cấy vi khuẩn khảo sát (S.aureus, B.subtilis, M.lutes, E.aerogenes, S.typhi,
E.coli, K.pneumoniae, P.auregnosa, B.bronchiseptica). Kết quả cho thấy dịch trích
trên tất cả các dung mơi đều có khả năng ức chế đối với tất cả các vi khuẩn khảo sát,
có mẫu khả năng ức chế cịn cao hơn mẫu đối chứng sử dụng kháng sinh gentamycin
cùng liều lượng. Tuy nhiên, khả năng ức chế có sự khác biệt giữa các mẫu [8].
Năm 2014, K. Agarwal, R. Varma đã nghiên cứu về thành phần sinh hóa và khả
năng khử gốc tự do của củ cải trắng. Kết quả công bố cho thấy dịch chiết trong nước
của phần củ có khả năng kháng oxi hóa ở mức 58,38% với nồng độ 200µg/ml, giá trị
IC50 là 166,79 µg/ml. Kết quả phân tích cho thấy trong dịch chiết có sự tồn tại của
alkaloid, flavonoid, glycoside, tannin, triterpenoid và steroid [30].
1.4.2 Các nghiên cứu trong nước:

17

Năm 2008, Trần Thị Hồng đã tiến hành nghiên cứu phương pháp sử dụng
enzyme peroxidase (POD) tách chiết từ củ cải trắng để xác định hàm lượng thủy ngân
trong nước ô nhiễm. Kết quả nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein trong củ cải là
0,1269 mg/g; Enzyme POD hoạt động mạnh nhất tại giá trị pH = 6,5; Ion Hg2+ ảnh
hưởng đến hoạt tính của POD, enzyme hồn tồn mất hoạt tính tại giá trị nồng độ 5
mg/l Hg2+. Đây là hướng nghiên cứu thân thiện với mơi trường, có giá trị thực tiễn
cao với phạm vi áp dụng rộng rãi [31].
Năm 2011, đề tài “Tinh chế peroxydase từ củ cải trắng và ứng dụng trong xét
nghiệm ethanol” của Nguyễn Anh Thủy cũng được đưa ra. Dịch củ cải với hoạt tính
peroxidase ban đầu 29 U/ml được tinh chế 190 lần sử dụng các phương pháp kết tủa
bằng (NH4)2SO4, sắc ký trao đổi ion và lọc gel. Enzyme thu nhận được có hoạt tính
810 U/ml, hoạt tính riêng 3237 U/mg protein, kích thước phân tử 43 KDa theo SDSPAGE. Peroxidase từ củ cải trắng được thử nghiệm ứng dụng trong xét nghiệm
ethanol dựa trên hệ alcohol oxidase – peroxidase kết hợp với phản ứng tạo màu sử
dụng cơ chất 3,3’, 5’5’–tetramethylbenzidine. Phương pháp enzyme cho phép phát
hiện ethanol ở mức 25ppm. Tương quan tuyến tính được xác định trong dải nồng độ
ethanol từ 50 ppm tới 500 ppm [32].
➢ Theo tổng quan tình hình các nghiên cứu của tác giả cho thấy thế giới đã
có nhiều nghiên cứu về thành phần và hoạt tính của củ cải trắng. Qua đó cho thấy,
dịch chiết từ củ cải trắng có các giá trị sinh học quan trọng, có hoạt tính chống oxi
hóa cao, khả năng ức chế sự phát triển của rất nhiều loài vi khuẩn và nấm bệnh,
tiềm năng ứng dụng rất lớn. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về củ cải trắng cịn rất
hạn chế. Đó là lý do tơi chọn thực hiện đề tài này.

18


CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Thời gian, địa điểm thực hiện
Thời gian: từ tháng 4/2016 đến tháng 2/2017.
Địa điểm: Viện Kỹ thuật và Kinh tế biển, trường ĐH Bà Rịa Vũng Tàu. Một

phần nghiên cứu được thực hiện tại Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm.
trường ĐH Công nghiệp TP.HCM.
2.2 Nguyên vật liệu - dụng cụ
2.2.1 Nguyên liệu
Củ cải trắng: củ cải trắng được thu hái vào tháng 2 năm 2016 tại trang trại thuộc
huyện Đức Trọng, tỉnh Lâm Đồng, Việt Nam.
Nguyên liệu sau khi thu hái được rửa sạch, cắt lát dày 0,5 cm, rồi cắt thành sợi,
chần qua nước nóng 800C trong 3 phút, để ráo, sấy ở 600C trong 24 giờ đến độ ẩm
khoảng 8%, sau đó xay nhỏ (0,5 – 1 mm) và bảo quản trong bao PE , tránh ánh sáng ở 200C.
2.2.2 Hóa chất
Aluminium chloride (AlCl3)
Sodium carbonate (Na2CO3)
Kali acetat (CH3COOK)
ABTS, K2S2O8, Trolox – Sigma.
2.2.3 Trang thiết bị
Máy quang phổ UV-vis
Máy lọc chân khơng
Máy đo pH
Tủ sấy
Lị vi sóng
Các dụng cụ thơng thường trong phịng thí nghiệm.
2.3 Nội dung nghiên cứu

19


Bột củ cải trắng

Phân tích thành phần hóa học

Trích ly bằng phương pháp

Trích ly với sự hỗ trợ của vi
sóng đồng thời

truyền thống
- Loại dung môi
- Tỉ lệ dung môi và nguyên liệu
- Nhiệt độ
- Thời gian

- Tỉ lệ dung mơi và ngun liệu
- Cơng suất sóng
- Thời gian xử lý vi sóng

Tối ưu q trình trích ly

So sánh hiệu quả của 2 phương pháp
- Lượng flavonoid thu được
- Hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết flavonoid
- Cấu trúc bề mặt của mẫu thơng qua kết quả chụp SEM
Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu
2.7 Bố trí thí nghiệm
2.4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát q trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng bằng
phương pháp truyền thống
2.4.1.1 Khảo sát loại dung mơi
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 7 loại dung môi ethanol 70, ethanol 90, ethanol 90 +
1% HCl, metanol, ethylacetate, cloroform và nước.
➢ Yếu tố cố định:
Tỉ lệ rắn/ lỏng: 1/20 (g/ml)

Nhiệt độ: 50oC
Thời gian: 4 giờ

20


Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh)
➢ Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.
2.4.1.2 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung mơi (tỉ lệ rắn/lỏng)
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml)
➢ Yếu tố cố định:
Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1
Nhiệt độ: 50oC
Thời gian: 4 giờ
Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh)
➢ Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.
2.4.1.3 Khảo sát nhiệt độ trích ly
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 5 mức 40, 45, 50, 55 và 60oC
➢ Yếu tố cố định:
Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1
Tỉ lệ rắn/ lỏng: từ kết quả mục 2.4.1.2
Thời gian: 4 giờ
Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh)
➢ Chỉ tiêu theo dõi:

Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.
2.4.1.4 Khảo sát thời gian trích ly
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 2, 3, 4 và 5 giờ
➢ Yếu tố cố định:
Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1

21


Tỉ lệ rắn/ lỏng: từ kết quả mục 2.4.1.2
Nhiệt độ: từ kết quả mục 2.4.1.3
Phương pháp: trích ly có gia nhiệt (chưng ninh)
➢ Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.
2.4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát q trình trích ly flavonoid từ củ cải trắng với sự
hỗ trợ của vi sóng
2.4.2.1 Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu và dung môi (tỉ lệ rắn/lỏng)
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 1/10, 1/20, 1/30 và 1/40 (g/ml)
➢ Yếu tố cố định:
Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1
Thời gian: 5 phút
Cơng suất sóng: 450 W
➢ Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.

2.4.2.2 Khảo sát công suất của vi sóng sử dụng
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 5 mức 80, 150, 300, 450, 700 và 900 W
➢ Yếu tố cố định:
Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1
Tỉ lệ rắn/lỏng: từ kết quả mục 2.4.2.1
Thời gian: 5 phút
➢ Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hồn tồn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.
2.4.2.3 Khảo sát thời gian sử dụng vi sóng để trích ly
➢ Yếu tố thí nghiệm: gồm 4 mức 3, 5, 7 và 9 phút

22


➢ Yếu tố cố định:
Loại dung môi: từ kết quả mục 2.4.1.1
Tỉ lệ rắn/lỏng: từ kết quả mục 2.4.2.1
Công suất sóng: từ kết quả mục 2.4.2.2
➢ Chỉ tiêu theo dõi:
Hàm lượng flavonoid
Hoạt tính chống oxi hóa thơng qua khả năng khử gốc tự do ABTS*
Thí nghiệm bố trí theo kiểu 1 yếu tố hoàn toàn ngẫu nhiên, lặp lại 3 lần.
2.4.3 Thí nghiệm 3: Tối ưu hóa trích ly flavonoid từ củ cải trắng
Các thí nghiệm đơn yếu tố cho từng phương pháp được tiến hành nhằm sơ bộ xác
định các điểm tại tâm. Q trình tối ưu các thơng số của q trình trích ly được thực
hiện bằng phương pháp quy hoạch thực ngiệm theo mơ hình Box-Wilson dạng CCC.
2.5 Phương pháp phân tích
2.5.1 Xác định thành phần hóa học của nguyên liệu

Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến khối lượng không đổi.
Các chỉ tiêu đường tổng, protein tổng, béo, tro tổng và xơ thô được gởi mẫu
phân tích tại Trung tâm sắc kí Hải Đăng, 79 Trương Định, quận 1, TP.HCM.
2.5.2 Xác định hàm lượng flavonoid tổng (TFC) [39]
Tổng flavonoid được xác định theo phương pháp so màu như miêu tả của Chang
và cộng sự (2002) dựa trên nguyên tắc: flavonoid tạo phức màu vàng với dung
dịch AlCl3. Cường độ màu tỷ lệ thuận với hàm lượng flavonoid được xác định ở
bước sóng 415 nm. Quercetin được dùng làm chất chuẩn tham chiếu.
➢ Xây dựng đường chuẩn quercetin:
Pha dung dịch quercetin 100 ppm trong dung dịch ethanol 80%.
Từ dung dịch quercetin 100 ppm, tiếp tục pha ra thành các dung dịch có nồng
độ 75; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 ppm.
Ứng với mỗi nồng độ dung dịch đã được pha loãng hút 0,5 ml cho vào ống
nghiệm sau đó thêm vào: 1,5 ml ethanol 95%; 0,1 ml AlCl3 10%; 0,1 ml CH3COOK
1M; 2,8 ml nước cất.
Lắc đều, để yên ở nhiệt độ phòng trong 30 phút, đo màu ở 415nm, mẫu trắng
thực hiện tương tự nhưng thay AlCl3 bằng nước cất.

23


0.12
0.1

y = 0,009x
R = 0,994

OD 415

0.08

0.06
0.04
0.02
0
0

2

4

6

8

10

12

Quercetin (ppm)

Hình 2.2 Đường chuẩn queretin dùng xác định TFC
➢ Xác định TFC trong mẫu:
Lấy 0,5 ml dịch chiết củ cải, làm tương tự các bước xây dựng đường chuẩn.
TFC trong mẫu được tính như sau:

TFC 

a.V .n
.103 (mg quercetin/g)
m

Trong đó: a: hàm lượng quercetin xác định từ đường chuẩn (ppm)
V: tổng thể tích dịch chiết (ml)
n: hệ số pha loãng
m: khối lượng mẫu (g)
2.5.3 Xác định khả năng khử gốc tự do ABTS* [40]
Xác định hoạt tính chống oxi hóa là phương pháp dựa trên khả năng làm giảm
độ hấp thu của gốc tự do cation ABTS* bởi các hoạt chất có hoạt tính chống oxi
hóa ở bước sóng 734 nm. Cường độ màu của ABTS* tỉ lệ nghịch với nồng độ các
chất chống oxi hóa và thời gian phản ứng. Dựa vào đường chuẩn trolox với thuốc
thử sẽ tính được hoạt tính chống oxi hóa của mẫu phân tích.
ABTS được pha trong nước cất đến nồng độ 7 mM (dung dịch A).
K2S2O8 pha trong nước cất đến 2,45 mM (dung dịch B).
Gốc tự do cation ABTS* được tạo ra bằng phản ứng giữa dung dịch A và B theo
tỉ lệ 1:1 về thể tích, phản ứng diễn ra trong bóng tối từ 12 - 16 giờ ở nhiệt độ
phòng (dung dịch stock).

24


Pha loãng dung dịch stock bằng nước cất để đạt độ hấp thu 0,7 ± 0,02 A ở 734
nm (dung dịch C). Dung dịch C được chuẩn bị mới cho từng phép thử.
➢ Xây dựng đường chuẩn trolox:
Pha dung dịch trolox 1000 µM sau đó pha lỗng ra thành các nồng độ 100, 200,
300, 400, 500 và 600 µM.
Bảng 2.1 Quá trình xây dựng đường chuẩn với dung dịch trolox chuẩn
Ống nghiệm
Nồng độ trolox (µM)
Tổng thể tích (ml)

0

1

2

3

4

5

6

0

100

200

300

400

500

600

3,04

3,04

3,04

3,04

Dung dịch C (ml)

3,04

3,04

3,04

0,04

0,04

0,04

3

Thể tích trolox (ml)

0,04

0,04

0,04

0,04

Lắc đều và ủ nhiệt độ phịng trong 6 phút, trong bóng tối
Đo độ hấp thu ở bước sóng 734 nm

50

Độ giảm độ hấp thu (%)

45

y = 18,78x
R = 0,994

40
35
30
25
20
15
10
5
0
0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

Nồng độ trolox (micro mol)

Hình 2.3 Đường chuẩn trolox dùng xác định khả năng khử ABTS*
Đối với mẫu thí nghiệm: hút 3 ml dung dịch C cho vào ống nghiệm sau đó hút
0,04 ml mẫu cho vào ống nghiệm. Lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng 6 phút trong bóng
tối, lắc đều và đo độ hấp thu ở 734 nm. Mẫu trắng được chuẩn bị bằng cách thay 3

25