Luận án Tiến sĩ Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẶNG VIỆT ANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU
CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus
carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG
TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HÓA HỌC

Hà Nội - 2022


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

ĐẶNG VIỆT ANH

NGHIÊN CỨU TỐI ƯU QUY TRÌNH TẠO CHẾ PHẨM GIÀU
CANTHAXANTHIN TỪ VI KHUẨN ƯA MẶN Paracoccus
carotinifaciens VTP20181 VÀ BƯỚC ĐẦU ỨNG DỤNG

TRONG CHĂN NUÔI CÁ HỒI VÂN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ KỸ THUẬT HĨA HỌC

Chun ngành: Kỹ thuật Hóa học
Mã số chuyên ngành: 9.52.03.01

Người hướng dẫn khoa học: 1. GS.TS. Phạm Quốc Long
2. TS. Phạm Hồng Hải

Hà Nội - 2022


LỜI CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan:
Đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của
GS. TS Phạm Quốc Long và TS Phạm Hồng Hải. Các kết quả và số liệu thu được
trong luận án là hồn tồn trung thực, chưa được cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào
khác.
Tác giả luận án

Đặng Việt Anh

1


LỜI CẢM ƠN
Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên, Viện Hàn
lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam.
Với sự kính trọng, cùng tấm lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất, tôi xin

bày tỏ sự biết ơn tới GS.TS. Phạm Quốc Long và TS. Phạm Hồng Hải là những
người thầy đã hướng dẫn tận tình và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian
thực hiện luận án.
Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Ban lãnh đạo Viện Hóa học
các hợp chất thiên nhiên, Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện để tơi
hồn thành luận án.
Tơi cũng xin cảm ơn tới tập thể cán bộ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển các
Sản phẩm thiên nhiên, phịng Cơng nghệ và thiết bị hóa học - Viện Hóa học các hợp
chất thiên nhiên, Bộ môn Công nghệ Enzyme và Protein - Viện công nghiệp thực
phẩm, Trung tâm công nghệ sinh học - Viện Nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản 1 đã giúp
đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Cuối cùng, tơi xin gửi lịng kính trọng và sự biết ơn sâu sắc đến gia đình, người
thân và bạn bè đã ln quan tâm, giúp đỡ, khích lệ và tạo điều kiện cho tơi trong q
trình làm luận án.
Tơi xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày

tháng

năm 2022

Tác giả luận án

Đặng Việt Anh

2


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ..........................................................................................................1

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................2
MỤC LỤC ......................................................................................................................3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT .............................................................................. 8
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................................9
DANH MỤC CÁC HÌNH ...........................................................................................11
MỞ ĐẦU .......................................................................................................................13
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................14
1.1. Vài nét về Carotenoid ...........................................................................................14
1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin ...............................................................................14
1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin ................................................................. 15
1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin.............................................................. 15
1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản .................. 16
1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin ........................................................................... 16
1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin......................................17
1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus .................................................................17
1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin ............................................................... 18
1.3.3.1. Nhu cầu về NaCl ............................................................................................. 19
1.3.3.2. Nguồn carbon và nitơ .....................................................................................20
1.3.3.3. Nguyên tố vi lượng.......................................................................................... 20
1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp
canthaxanthin...............................................................................................................21
1.3.4.1. Tỷ lệ giống .......................................................................................................21
1.3.4.2. Nhiệt độ ............................................................................................................21
1.3.4.3. Sự cung cấp oxy .............................................................................................. 21
1.3.4.4. Độ pH môi trường...........................................................................................22
1.3.4.5. Thời gian lên men ...........................................................................................22
1.3.4.6. Phương pháp lên men ....................................................................................22
1.4. Thu hồi sản phẩm .................................................................................................24
1.4.1. Kỹ thuật tách sinh khối vi sinh vật .................................................................. 24
1.4.1.1. Phương pháp lọc ............................................................................................. 25

3


1.4.1.2. Phương pháp ly tâm ....................................................................................... 25
1.4.1.3. Phương pháp lắng........................................................................................... 25
1.4.2. Sấy thu hồi sinh khối vi sinh vật ...................................................................... 26
1.5. Các phương pháp trích ly và tinh chế canthaxanthin .......................................27
1.5.1. Các phương pháp phá hủy thành tế bào .........................................................27
1.5.1.1. Các phương pháp cơ học gián đoạn .............................................................. 27
1.5.1.2. Các phương pháp cơ học không gián đoạn ..................................................28
1.5.2. Nguyên lý hoạt động của quá trình chiết xuất bằng siêu âm ........................ 31
1.5.3. Ảnh hưởng các thông số chiết siêu âm ............................................................ 31
1.5.3.1. Thông số vật lý ................................................................................................ 31
1.5.3.2. Thông số môi trường ...................................................................................... 33
1.6. Giới thiệu về liposome và ứng dụng của liposome ............................................ 35
1.6.1. Giới thiệu về liposome ....................................................................................... 35
1.6.1.1. Lịch sử liposome ............................................................................................. 35
1.6.1.2. Cấu tạo của liposome ..................................................................................... 35
1.6.1.3. Ứng dụng của liposome .................................................................................. 36
1.6.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến sản xuất liposome .............................................. 37
1.6.2. Nghiên cứu và ứng dụng liposome trong nuôi cá hồi vân .............................. 38
1.7. Giới thiệu về phương pháp bề mặt đáp ứng sử dụng trong tối ưu hóa ........... 38
1.8. Giới thiệu về cá hồi vân và nghề nuôi cá hồi nước lạnh ................................... 40
1.8.1. Phân loại ............................................................................................................. 40
1.8.2. Tình hình nuôi cá hồi tại trên thế giới và Việt Nam....................................... 40
1.8.2.1. Tình hình ni cá hồi vân trên thế giới ........................................................ 40
1.8.2.2. Tình hình ni cá hồi vân tại Việt Nam ....................................................... 40
1.8.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến chăn nuôi cá hồi ................................................... 41
1.8.3.1. Nhiệt độ............................................................................................................ 41
1.8.3.2. Nồng độ oxy hoà tan, muối, pH ..................................................................... 41

1.8.3.3. Nhu cầu dinh dưỡng và thức ăn của cá hồi vân .......................................... 42
1.8.3.4. Nhu cầu protein .............................................................................................. 42
1.8.3.5. Nhu cầu về lipid acid béo ............................................................................... 42
1.8.3.6. Nhu cầu vitamin và khoáng chất................................................................... 43
1.8.3.7. Nhu cầu carotenoids ....................................................................................... 44
4


1.8.3.8. Phát triển thức ăn cho cá hồi ở Việt Nam .................................................... 44
1.8.4. Nghiên cứu bổ sung canthaxanthin vào thức ăn thủy sản ở Việt Nam ........ 45
CHƯƠNG II: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
.......................................................................................................................................46
2.1. Nguyên vật liệu .....................................................................................................46
2.1.1. Nguyên vật liệu nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ... 46
2.1.2. Nguyên vật liệu nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ............. 46
2.1.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu tổng hợp liposome .............................................. 46
2.2. Thiết bị máy móc ..................................................................................................46
2.2.1. Thiết bị nghiên cứu lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ................. 46
2.2.2. Thiết bị nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ........................... 47
2.2.3. Thiết bị nghiên cứu tổng hợp liposome ........................................................... 47
2.3. Phương pháp nghiên cứu .....................................................................................47
2.3.1. Phương pháp lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn ........................... 47
2.3.1.1. Phương pháp định lượng sinh khối vi sinh vật ............................................ 47
2.3.1.2. Phương pháp xác định hàm lượng canthaxanthin ...................................... 47
2.3.1.3. Phương pháp xác định sản lượng canthanxanthin...................................... 49
2.3.2. Phương pháp nghiên cứu chiết xuất canthaxanthin sau lên men ................. 49
2.3.2.1. Xác định hàm lượng tổng carotenoid ........................................................... 49
2.3.2.2. Xác định hàm lượng canthaxanthin bằng sắc ký lỏng cao áp (HPLC) ..... 50
2.3.2.3. Phương pháp sắc kí lớp mỏng ....................................................................... 50
2.3.2.4. Phương pháp sắc kí cột .................................................................................. 50

2.4. Phương pháp nghiên cứu tạo sản phẩm thức ăn cho cá hồi chứa
canthaxanthin .............................................................................................................. 51
2.4.1. Nghiên cứu lựa chọn phương pháp bổ sung chế phẩm canthaxanthin ........ 51
2.4.2. Phương pháp xác định liều lượng bổ sung canthaxanthin vào thức ăn cá hồi
....................................................................................................................................... 51
2.5. Phương pháp quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa q trình cơng nghệ .....52
2.6. Phân tích thống kê ................................................................................................ 54
CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM ...............................................................................55
3.1. Lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn .....................................................55
3.1.1. Lựa chọn thành phần môi trường ....................................................................55
5


3.1.2. Khảo sát tìm tâm thí nghiệm tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp
canthaxanthin .............................................................................................................. 57
3.1.3. Sàng lọc điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ............................. 57
3.1.4. Tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ......................... 58
3.1.5. Lựa chọn mơ hình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ............................. 59
3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men .............................. 60
3.2. Xây dựng quy trình chiết xuất canthaxanthin ...................................................61
3.2.1. Định lượng canthaxanthin bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp .............. 61
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất quá trình chiết
xuất canthaxanthin ......................................................................................................62
3.2.2.1. Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết ........................... 62
3.2.2.2. Khảo sát sự ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu đến q trình chiết
....................................................................................................................................... 63
3.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết .............................. 63
3.2.2.4. Khảo sát ảnh hưởng của công suất siêu âm đến q trình chiết ............... 63
3.2.3. Xây dựng mơ hình nghiên cứu và ma trận kế hoạch thực nghiệm ............... 64
3.3. Đặc điểm và quá trình tổng hợp liposome .........................................................66

3.3.1. Q trình tổng hợp liposome ............................................................................ 66
3.3.2. Kích thước hạt ................................................................................................... 66
3.3.3. Quá trình đưa canthaxanthin lên liposome .................................................... 67
3.3.4. Thử nghiệm giải phóng thuốc ........................................................................... 67
3.3.5. Thí nghiệm phối trộn liposome vào thức ăn cho cá hồi vân .......................... 67
3.3.5.1. Cá và chế độ ăn ............................................................................................... 67
3.3.5.2. Tiến hành đo khối lượng ................................................................................ 69
3.3.5.3. Xác định thành phần canthaxanthin trong cơ của cá hồi ........................... 69
CHƯƠNG IV: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................70
4.1. Tối ưu quá trình lên men canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn.........................70
4.1.1. Khảo sát thành phần môi trường sinh tổng hợp canthaxanthin................... 70
4.1.2.

Nghiên cứu tối ưu điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin ..................... 78
4.1.2.1. Sàng lọc mức ảnh hưởng của điều kiện lên men sinh tổng hợp

canthaxanthin .............................................................................................................. 78

6


4.1.2.2. Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin bằng mơ hình RSMCCD. ............................................................................................................................. 81
4.1.3. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men .............................. 90
4.1.4. Quy trình cơng nghệ lên men sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ vi
khuẩn ưa mặn quy mơ 80-100 lít/mẻ ......................................................................... 91
4.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố công nghệ đến hiệu suất chiết
xuất ................................................................................................................................ 95
4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình chiết .................................................. 95
4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tới quá trình chiết .................... 96
4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới q trình chiết .................................................. 97

4.2.4. Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới quá trình chiết ................................... 98
4.2.5. Kết quả quy hoạch thực nghiệm và tối ưu hóa các thơng số cơng nghệ q
trình chiết xuất .............................................................................................................99
4.2.6. Kiểm tra sự tương hợp của mơ hình .............................................................. 100
4.2.7. Tối ưu hóa quá trình chiết xuất ..................................................................... 105
4.2.8. Kết quả chiết xuất, phân lập canthaxanthin ................................................. 107
4.3.2. Quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol ...... 112
4.3.3. Sự tăng trưởng của cá với chế độ ăn có bổ sung chế phẩm canthaxanthin
.....................................................................................................................................113
4.3.3. Màu sắc cơ của cá hồi ...................................................................................... 115
KẾT LUẬN ................................................................................................................119
KIẾN NGHỊ ...............................................................................................................121
NHỮNG ĐIỂM MỚI CỦA LUẬN ÁN ....................................................................121
CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN ..122
BÀI BÁO QUỐC TẾ .................................................................................................122
BÀI BÁO TRONG NƯỚC ........................................................................................122
SÁNG CHẾ ................................................................................................................122
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 123

7


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Diễn giải

Tiếng Anh

ANOVA

Phân tích phương sai

Analysis of Variance

CMS

Chất hoạt động bề mặt

Glycerol monostearate

CS

Cộng sự

DL

Tải lượng thuốc

Drug loading

DMAPP

Dimethylallyl pyrophosphate

Dimethylallyl pyrophosphate

EE

Hiệu suất đóng gói

Encapsulation Efficiency

GGPP

Geranylgeranyl pyrophosphate

Geranylgeranyl pyrophosphate

HMG-CoA

3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA

3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA

HPCL

Sắc ký lỏng cao áp

High-performance chromatography
liquid

IC

Nồng độ ban đầu

Initial concentration

MeOH

CH3OH

Methanol

PBS

Dụng dịch đệm phosphate

Phosphate-buffered saline

PDI

Chỉ số phân tán

Polydispersity Index

ppm

Phần triệu

Parts per million

RSM

Phương pháp bề mặt đáp ứng

Response surface methodology

SD

Độ lệch chuẩn

Standard deviation

SKK

Sinh khối khô

STT

Số thứ tự

TCA

Hợp chất trung gian

Tricarboxylic acid

THF

Tetra hydro furan

Tetrahydrofuran

TLC

Sắc ký lớp mỏng

Thin Layer Chromatography

TLTK

Tài liệu tham khảo

Reference

TPC

Hàm lượng phenolic tổng

Total phenolic content

UI

Cường độ siêu âm

Ultrasound intensity

UV

Tia cực tím

Ultraviolet

8


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.8. 1. Nhu cầu một số vitamin của cá hồi vân ....................................................43
Bảng 1.8. 2. Nhu cầu một số khoáng chất của cá hồi vân .............................................44

Bảng 1.8.3. Công thức thức ăn cho cá hồi giai đoạn nuôi thương phẩm ......................44
Bảng 2.5.1. Các thông số kế hoạch ...............................................................................53
Bảng 3.1.1. Thành phần môi trường và nồng độ sử dụng thí nghiệm ...........................56
Bảng 3.1.2. Các yếu tố được khảo sát và mức khảo sát ................................................57
Bảng 3.1.3. Ma trận Factorial minium Run Resolution IV screening ...........................57
Bảng 3.1.4. Bố trí ma trận kế hoạch thực nghiệm .........................................................58
Bảng 3.1.5. Lựa chọn điều kiện tối ưu sinh tổng hợp canthaxanthin ............................ 59
Bảng 3.1.6. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men ...........................60
Bảng 3.2.1. Bảng ma trận kế hoạch thực nghiệm ..........................................................64
Bảng 3.2.2. Các mức thí nghiệm của các biến biến cơng nghệ .....................................65
Bảng 3.3.1. Thành phần thức ăn cho cá được sử dụng trong thử nghiệm .....................68
Bảng 4.1.1. Đánh giá nồng độ NaCl đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin của
chủng vi khuẩn P.carotinifaciens VTP20181 ................................................................ 73
Bảng 4.1.2. Thành phần môi trường ..............................................................................77
Bảng 4.1.3. Ma trận Min Run Screening và mức ảnh hưởng đến hàm đáp ứng Cx và
Biomass .........................................................................................................................80
Bảng 4.1.4. Giá trị biến thực và biến mã hóa trong kế hoạch thực nghiệm Box –
Hunter (CCD) ................................................................................................................81
Bảng 4.1.5. Ma trận kế hoạch thực nghiệm điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin ....82
Bảng 4.1.6. Kết quả phân tích thống kê ANOVA đối với 2 hàm mục tiêu Y1 và Y2 ..82
Bảng 4.1.7. Điều kiện sinh tổng hợp canthaxanthin......................................................88
Bảng 4.1.8. Lựa chọn phương pháp thu nhận sinh khối sau lên men ...........................90
Bảng 4.2.1. Biến mã hóa và các mức thí nghiệm ..........................................................99
Bảng 4.2.2. Bảng kết quả ma trận kế hoạch thực nghiệm .............................................99
Bảng 4.2.3. Bảng phân tích hồi quy các hàm mục tiêu Y1 và Y2 ................................100
Bảng 4.2.4. Kết quả tối ưu hóa các biến công nghệ ....................................................105
Bảng 4.3.1. Giá trị EE và DL của liposome đối chứng, liposome chứa canthaxanthin,
liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng thời canthaxanthin và α-tocopherol
liposome với các tỉ lệ IC = 0.1%; IC = 0.5% và IC = 1%. Các số là kết quả của các
phép đo ba lần và được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn. ........110

9


Bảng 4.3.2. Thành phần của cơ cá hồi vân sau 3 tháng thí nghiệm (n=3, đơn vị: % khối
lượng ướt) ....................................................................................................................115
Bảng 4.3.3. Giá trị đo màu của philê lấy từ cá hồi vân được thí nghiệm bằng các chế
độ ăn khác nhau tại thời điểm ban đầu và sau một, hai và ba tháng cho ăn thử nghiệm
(n=3) ............................................................................................................................116

10


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.2.1. Cơng thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione) .14
Hình 1.3.1. Sơ đồ sinh tổng hợp canthanxanthin .........................................................19
Hình 1.3.2. Sơ đồ lên men liên tục và lên men liên tục có lắng tế bào và lấy bổ sung .24
Hình 1.5.1. Sơ đồ hệ thống chiết siêu âm quy mơ cơng nghiệp ....................................30
Hình 1.6.1. Sơ đồ liposome được hình thành bởi phospholipid trong dung dịch nước 36
Hình 1.8.1. Cá hồi vân ...................................................................................................40
Hình 2.3.1. Quy trình xử lý mẫu xác định hàm lượng canthaxanthin ...........................48
Hình 3.2.1. Đồ thị đường chuẩn của canthaxanthin ......................................................61
Hình 3.3.1. Cấu trúc của liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol......................66
Hình 3.3.2. Máy đo màu DSM SalmoFan .....................................................................69
Hình 4.1.1. Ảnh hưởng của cơ chất các bon và ni tơ đến sự sinh tổng hợp
canthanaxanthin của P.carotinifaciens VTP 20181 .......................................................70
Hình 4.1.2. Ảnh hưởng của hợp chất trung gian, vitamin và acid amin đến sự sinh tổng
hợp canthaxanthin của P.carotinifaciens VTP20181.....................................................71
Hình 4.1.3. Ảnh hưởng của hợp chất vơ cơ đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin của
P.carotinifaciens VTP20181 ..........................................................................................72
Hình 4.1.4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sự sinh tổng hợp canthaxanthin

của P.carotinifaciens VTP20181 ...................................................................................77
Hình 4.1.5. Thực nghiệm lên men sinh tổng hợp canthaxanthin ..................................78
Hình 4.1.6. Ảnh hưởng điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp canthaxanthin 80
Hình 4.1.7. Biểu đồ thực nghiệm và dự đốn, phân bố ngẫu nhiên của Y1 và Y2 .......84
Hình 4.1.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hiệu suất tạo
canthaxanthin (b) ...........................................................................................................88
Hình 4.1.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của hàm mục tiêu Y1 và Y2 ......................89
Hình 4.1.10. Điều kiện tối ưu quá trình lên men sinh tổng hợp canthaxanthin theo mơ
hình xây dựng được .......................................................................................................89
Hình 4.1.11. Quy trình cơng nghệ sản xuất sinh khối giàu canthaxanthin từ Paracoccus
carotinifaciens VTP 20181 quy mơ 80-100 lít/mẻ ........................................................92
Hình 4.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết tới quá trình chiết .......................................95
Hình 4.2.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ dung mơi/ngun liệu tới quá trình chiết ..................96
Hình 4.2.3. Ảnh hưởng của thời gian tới quá trình chiết ...............................................97
11


Hình 4.2.4. Ảnh hưởng của cơng suất siêu âm tới quá trình chiết ................................ 98
Hình 4.2.5. Biểu đồ thực nghiệm và dự đoán, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y1 ........102
Hình 4.2.6. Biểu đồ thực nghiệm và dự đốn, phân bố ngẫu nhiên của hàm Y2 ........102
Hình 4.2.8. Bề mặt đáp ứng của hàm lượng canthaxanthin (a) và hàm lượng
carotenoid tổng (b).......................................................................................................104
Hình 4.2.9. Mức độ đáp ứng nguyện vọng của quá trình chiết xuất ...........................106
Hình 4.2.10. Điều kiện tối ưu các biến cơng nghệ và kết quả tối ưu hóa hàm mục tiêu
Y1 và Y2 .......................................................................................................................106
Hình 4.2.11. Thực nghiệm chiết canthaxanthin ứng dụng điều kiện tối ưu hóa trong
phịng thí nghiệm .........................................................................................................107
Hình 4.2.12. Cơng thức hóa học của hợp chất canthaxanthin .....................................107
Hình 4.2.13. Sắc ký đồ hợp chất canthaxanthin sạch ..................................................108
Hình 4.2.14. Canthaxanthin sạch .................................................................................108

Hình 4.2. 15. Sắc ký lớp mỏng canthaxanthin ............................................................108
Hình 4.3.1. Kích thước trung bình và giá trị PDI của liposome đối chứng, liposome
chứa canthaxanthin, liposome chứa α-tocopherol, liposome chứa đồng canthaxanthin
và α-tocopherol ở các tỉ lệ IC = 0,1%; IC = 0,5% và IC = 1%. ..................................109
Hình 4.3.2. Thí nghiệm invitro giải phóng canthaxanthin từ liposome chứa
canthaxanthin, liposome chứa canthaxanthin và α-tocopherol tại IC = 0.1%; IC = 0.5%
và IC = 1% trong PBS ở pH 7.4 ..................................................................................111
Hình 4.3.3. Sơ đồ quy trình tổng hợp liposome có chứa canthaxanthin và α-tocopherol
.....................................................................................................................................112
Hình 4.3.4. Sự thay đổi trọng lượng của các nhóm cá hồi vân được ni bằng các chế
độ ăn khác nhau. ..........................................................................................................114
Hình 4.3.5. Màu sắc cơ của cá khi kết thúc thí nghiệm ..............................................117
Hình 4.3.6. Hàm lượng canthaxanthin trong các mẫu cơ ............................................118

12


MỞ ĐẦU
Canthaxanthin được sử dụng như một loại phụ gia, chất tạo màu cho thực phẩm
và thuốc nhuộm trong mỹ phẩm. Ngồi ra nó cũng được phép cho thêm vào thức ăn
cho gia cầm và thuỷ sản. Canthaxanthin được tìm thấy trong tự nhiên ở một số loài
động vật, thực vật và vi sinh vật, chúng đóng vai trị quan trọng trong quá trình tạo
màu cho cơ thịt động vật trưởng thành, chống lại các gốc tự do oxy hóa [1], chống
khối u [2], ngăn ngừa bệnh tim mạch [3], [4], bảo vệ gan [5], chống tiểu đường [6],
chống bức xạ tia cực tím [7], chống viêm [8], thối hóa điểm vàng [9]. Trong hệ sinh
thái biển, canthaxanthin được tìm thấy trong tảo, vi khuẩn và giáp xác.
Cá khơng có khả năng tự sinh tổng hợp carotenoid nhưng có khả năng tích lũy
các chất này trong cá khi chúng ăn các loại trên. Trong ni thủy sản, hồn tồn có thể
gia tăng màu sắc thịt của chúng bằng cách bổ sung canthaxanthin vào thức ăn. Ngày
nay, canthaxanthin được sử dụng khá phổ biến trong việc nuôi cá hồi thương phẩm khi

chúng là nguồn bổ sung cần thiết trong thức ăn cho cá giúp nâng cao chất lượng giá trị
cá hồi thương phẩm.
Cho đến nay, có nhiều con đường khác nhau để thu nhận canthaxanthin từ
nguyên liệu tự nhiên hoặc tổng hợp hóa học. Trong số đó, con đường thu nhận
canthaxanthin từ quá trình sinh tổng hợp của một số chủng vi khuẩn ưa mặn như
Dietzia natronolimnaea, Halobacterium, Paracoccus sp, Micrococcus roseus đã và
đang được áp dụng có hiệu quả nhất, việc sử dụng, các sản phẩm từ vi sinh vật ngày
càng nhiều do chúng có tính an tồn cao, hiệu quả và thân thiện với mơi trường. Do đó
việc nghiên cứu xây dựng quy trình sinh tổng hợp, làm sạch và tinh chế canthaxanthin
từ vi khuẩn có ý nghĩa lớn về khoa học và thực tiễn. Từ những vấn đề nêu trên, chúng
tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tối ưu quy trình tạo chế phẩm giàu
canthaxanthin từ vi khuẩn ưa mặn Paracoccus carotinifaciens VTP20181 và bước
đầu ứng dụng trong chăn nuôi cá hồi vân”
Nội dung nghiên cứu của luận án gồm:
- Nghiên cứu, tối ưu hóa q trình lên men thu sinh khối giàu canthaxanthin từ
vi khuẩn ưa mặn
- Nghiên cứu tối ưu hóa q trình chiết xuất canthaxanthin từ sinh khối vi
khuẩn ưa mặn.
- Tổng hợp liposome có chứa canthxanthin và ứng dụng bổ sung vào thức ăn
nhằm nâng cao chất lượng và mầu sắc thịt cá hồi vân (Oncorhynchus mykiss).

13


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Vài nét về Carotenoid
Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ tự nhiên trong các loài sinh vật quang hợp
như là tảo, một vài loài nấm, một vài loài vi khuẩn và thực vật. Đến nay đã tìm được
hơn 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophyl và carotene [10].
Carotenoid thuộc nhóm tetraterpenoid (phân tử chứa 40 nguyên tử carbon) được

tạo nên bởi 8 đơn vị isoprene. Khác với thực vật, con người không thể tự tổng hợp ra
carotenoid mà sử dụng thực phẩm có chứa carotenoid trong bữa ăn để tăng sức đề
kháng và bảo vệ bản thân mình. Carotenoid cịn có tác dụng chống lại các tác nhân oxy
hóa từ bên ngồi.
Carotenoid được chia thành 2 loại là: carotene và xanthophyll.
+ Các carotene: có màu da cam, đỏ, là những hydrocác bon (C40H58) có 1 mạch
chính 18 carbon mang 4 nhóm CH3 và 9 liên kết đôi mạch nhánh, chúng khác nhau ở
các đầu chuỗi. Ví dụ: α-carotene, β-carotene và lycopene.
+ Xanthophyl: là các phân tử chứa oxi, thường có màu vàng. Ví dụ: lutein và
zeaxanthin.
Một số carotenoid tìm thấy trong thuỷ sản như: canthaxanthin, astaxanthin,
zeaxanthin, tuna xanthin, lutein, beta carotene, doradexanthin, erichinenone.
1.2. Giới thiệu về Canthaxanthin
Hình 1.2.1. Cơng thức cấu tạo hóa học của canthaxanthin (β,β-Carotene-4,4'-dione)

Canthaxanthin có tên khoa học là β-β carotene-4,4’- dione, là một trong những
dẫn xuất của β-carotene có tác dụng chống oxy hóa mạnh, thậm chí trội hơn βcarotene. Hoạt chất này thuộc nhóm diketo-carotenoid (4,4’-oxo-carotenoid) với nhóm
keto đối xứng ở vị trí 4 và 4’ của vịng β-ionone, 9 nhóm liên kết đơi C=C ở trung tâm
phân tử hoạt động như cấu tử hấp phụ ánh sáng, tạo ra màu đỏ-cam của hoạt chất [11],
[12].
Công thức phân tử của canthaxanthin: C40H52O2
14


Khối lượng phân tử M=564.82g/mol
Nhiệt độ nóng chảy: 211  2120C (kèm phân hủy)
Hấp phụ cực đại tại bước sóng λmax: 482 nm (CHCl3); 474 nm (C2H5OH); 466
nm (ete dầu hỏa).
Cúng giống như các carotenoid khác, canthaxanthin là chất chống oxi hóa mạnh,
dễ bị phân hủy khi để trong khơng khí, hồ tan tốt trong các dung mơi kém phân cực.

Cơng thức phân tử của canthaxanthin thì tương tự như β-caroten nhưng phức tạp hơn.
canthaxanthin có 13 nối đơi trong khi β-caroten chỉ có 7 nối đơi vì vậy khả năng chống
oxi hóa của nó cũng cao hơn β-caroten.
Canthaxanthin tồn tại tương đối phổ biến trong tự nhiên, được phân lập đầu tiên
từ, loài nấm ăn được Cinnabarinus cantharellus vào năm 1950 bởi Haxo [11].
Canthaxanthin cũng được tạo ra ở một số loài tảo xanh ở giai đoạn cuối của chu kỳ
sinh trưởng cùng với một số các caroten khác [12]. Ngồi ra, nó cịn được phát hiện ở
các lồi vi khuẩn [10], động vật giáp xác [13] và ở nhiều loài cá như cá chép [14], cá
đối vàng, cá tráp biển [15]. Canthaxanthin khơng được tìm thấy ở lồi cá hồi hoang dã
Đại Tây Dương nhưng được tìm thấy ở lồi cá hồi hoang dã Thái Bình Dương và một
số lồi cá hồi khác [13].
1.2.1. Tính chất vật lý của canthaxanthin
Tính tan: canthaxanthin rất ít tan trong nước vì nó là hợp chất khơng phân cực,
nó tan trong các dung môi hữu cơ như ete, cồn, pyridine, dầu mỏ, dầu thực vật.
Khả năng hấp thụ ánh sáng và màu sắc: canthaxanthin hấp thụ rất mạnh bức xạ
trong vùng 470÷510 nm nên tạo màu đỏ cam.
Khả năng hấp thụ ánh sáng của canthaxanthin có thể bị thay đổi khi
canthaxanthin liên kết với các chất khác. Trong các động vật giáp xác như cua, tôm
canthaxanthin thường liên kết với phân tử protein (crutacyanin) có

max

= 628nm tạo

nên màu xanh đặc trưng của các lồi giáp xác sống. Khi có tác dụng của nhiệt, liên kết
bị phá hủy các canthaxanthin được giải phóng dưới dạng tự do có màu đỏ cam.
1.2.2. Tính chất hóa học của canthaxanthin
Trong phân tử canthaxanthin có chuỗi polyen, liên kết với các nhóm keto,
hydroxyl gắn với các vịng ở đầu mạch nên canthaxanthin rất nhạy với nhiệt độ cao,
ánh sáng và các tác nhân oxy hóa, axít, bazơ… Tốc độ oxy hóa canthaxanthin diễn ra

nhanh khi có sự xuất hiện của ion kim loại, sunfit, độ ẩm, hoặc để trong khơng khí.
15


Tính chất oxy hóa: canthaxanthin ở dạng tự do dễ bị oxy hóa bởi tác nhân
electrophil như oxy phân tử. Nhưng khi canthaxanthin tạo phức với protein hay ở dạng
este hóa thì chúng trở nên bền hơn. Tính chất chống oxy hóa của canthaxanthin trong
cơ thể được giải thích bởi khả năng giữ lại các gốc tự do tạo thành gốc cacbon trung
tâm bền vững nhờ hiệu ứng cộng hưởng.
Phản ứng với axít: canthaxanthin phản ứng với, axít yếu làm dịch chuyển cực đại
hấp thụ của phân tử về phía bước sóng dài, nhưng trung hịa bằng bazơ yếu, cấu trúc
phân tử canthaxanthin lại được phục hồi, tuy nhiên khi phản ứng với axít mạnh như:
HCl, H2SO4… thì có thể xảy ra sự phân hủy chuỗi polyen của canthaxanthin làm giảm
màu đỏ cam.
1.2.3. Tính chất dược lý của canthaxanthin đối với động vật thủy sản
- Canthaxanthin có vai trị rất quan trọng trong việc bảo vệ tế bào, tạo mầu sắc
cho cơ thịt, tăng cường khả năng đề kháng, tăng khả năng tăng trưởng, tăng cường
năng suất sinh sản, chống lại sự oxy hóa và chống lại các tia tử ngoại của một số loài
thủy sản.
1.2.4. Ứng dụng của canthaxanthin
Trong thực phẩm thì màu sắc bên ngồi là yếu tố quan trọng thu hút người tiêu
dùng.
- Canthaxanthin là chất màu chính trong vỏ và các cơ quan bên trong của các lồi
động vật giáp xác, nó chiếm từ 86 ÷ 98% của tổng lượng carotenoid. Màu đỏ tạo ra do
quá trình gia nhiệt, protein bị biến tính làm đứt các liên kết giữa phức hợp
carotenprotein làm giải phóng canthaxanthin tự do. Màu sắc cuối cùng phụ thuộc vào
hàm lượng của canthaxanthin còn lại trong thịt cơ và vỏ của các lồi giáp xác.
- Với một số thực phẩm có nguồn gốc từ các loài giáp xác sau chế biến bị giảm
mầu hoặc mất mầu, có thể bổ sung canthaxanthin như một phụ gia sẽ làm tăng giá trị
cảm quan của thực phẩm.

- Mục đích của việc bổ sung chất màu vào thực phẩm nhằm:
+ Khôi phục lại màu sắc đã bị mất trong quá trình bảo quản, chế biến (khi tiếp
xúc với nhiệt độ, độ ẩm, khơng khí …).
+ Làm tăng màu của thực phẩm trong giới hạn cho phép.
+ Điều chỉnh màu sắc tự nhiên của thực phẩm, khi màu tự nhiên không đủ để thể
hiện màu sắc cho sản phẩm.
16


+ Làm đồng nhất màu sắc thực phẩm
+ Làm thực phẩm có màu hấp dẫn đối với người tiêu dùng
Đến nay, có rất nhiều tài liệu đã chứng minh rằng canthaxanthin là một chất an
toàn về mặt thực phẩm.
1.3. Tổng quan về quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin
1.3.1. Giới thiệu chung về chi Paracoccus
Năm 1992, các tác giả đã mô tả Paracoccus là một Prokaryote gồm có 2 lồi là
P.denitrificans

và

P.halodenitrificans

[16].

Sau

đó,

chủng

Paracoccus

halodenitrificans bị loại trừ bởi vì nó được chứng minh là một thành viên của chi
Halomonas thuộc ngành Proteobacteria [17]. Tính đến năm 2006, tổng cộng đã phát
hiện 14 loài mới của Paracoccus dựa trên mơ tả và phân tích trình tự gen bao gồm các
lồi: vi khuẩn hóa tự dưỡng lưu huỳnh P.pantotrophus và P.Versutus
Các chủng thuộc chi Paracoccus thuộc cu khun cú ng kớnh t 0,4 ữ 0,9àm,
hoc trc cầu khuẩn (coccobacilli) có chiều dài lên đến 2 µm ở dạng tế bào đơn, tế bào
đôi, chuỗi tế bào. Paracoccus là vi khuẩn gram âm và hầu hết các lồi đều khơng di
động. Các lồi thuộc Paracoccus là vi khuẩn hiếu khí, phát triển nhanh trên mơi
trường các chất hữu cơ, một số lồi có khả năng phát triển trọng mơi trường yếm khí
với nitrate hoặc oxide ni tơ là tác nhân oxy hóa và tạo ra sản phẩm cuối cùng là dinito.
Khả năng lên men của Paracoccus chưa được biết đến nhiều trong các công bố.
Paracoccus sinh trưởng tốt ở nhiệt độ 25-37°C, pH= 6,5-8,5, ngoại trừ P.alcaliphilus
phát triển ở pH=8-9.5 và phát triển yếu ở pH= 7.0 [18]. Tất cả các chủng Paracoccus
được kiểm tra cho đến nay đều chứa ubiquinone-10 là một quinone hô hấp, như mong
đợi đối với các thành viên thuộc phân lớp α-3 của Proteobacteria, ngồi ra cịn một
lượng nhỏ ubiquinone-9 và ubiquinone-11 cũng được báo cáo ở một số chủng. Một số
chủng có thể tích lũy poly-β-hydroxybutyrate trong điều kiện đủ các bon và có hoạt
tính catalase và oxydase. Để mơ tả các đặc điểm chung của chi là xuất phát từ các đặc
tính của P.denitrificans, P.pantotrophus và P.versutus, khơng áp dụng cho một số
chủng được phân lập gần đây.
Các quy trình nuôi cấy làm giàu (tăng mật độ giống) một số chủng Paracoccus
phụ thuộc vào việc lựa chọn một trong hai con đường là tự dưỡng hoặc chuyển hóa
methan (methylotrophic) trong mơi trường oxy hóa với hydro hoặc methylamine (với
sự có mặt của các bon dioxide) hoặc của các chủng khử nitơ trong điều kiện anoxic
17


(nitrat hóa và khử nitrat) với nitrat là chất oxy hóa và các hợp chất hữu cơ như là

nguồn các bon và năng lượng [19].
Sự tăng, trưởng của hầu hết các vi khuẩn oxy hóa hydro tự dưỡng ưa ấm trung
bình (mesophilic) là chậm hoặc khơng thể phát triển trong điều kiện ni cấy khử nitơ
và kỵ khí [20]. Một số, chủng cũng có khả năng tăng trưởng tự dưỡng tốt trên formate
và trong số đó có ba chủng là P.denitrificans, P.versutus và P. kocurii. Do đó, làm giàu
lượng giống bằng lên men kỵ khí với formate, các bon dioxide và nitrate (hoặc nitrous
oxide) có thể phù hợp với 2 chủng P.denitrificans và P.versutus. P.denitrificans tăng
trưởng tự dưỡng yếu trên methanol trong điều kiện khử nitrat. Một số chủng
Paracoccus có thể phát triển tự dưỡng bằng cách sử dụng quá trình oxy hóa thiosulfate
để cung cấp năng lượng, trong khi P.pantotrophus có thể sử dụng, các hợp chất cacbon
disulfide (CS2) và methyl hóa hợp chất sulfur [21] và P.thiocyanatus có thể phát triển
tự dưỡng hiếu khí trên thiocyanate [22]. Những cơ chất này đã giúp làm giàu mẫu và
phân lập, được các chủng Paracoccus mới.
Hiện nay, các chủng Paracoccus là nguồn sản phẩm sinh học tiềm năng chưa
được khai thác một cách hiệu quả, khai thác thương mại mới sử dụng một số chủng.
Hỗn hợp tế bào cố định 2 chủng P.denitrificans và Corynebacterium đã dùng để sản
xuất liên tục L-phenylalanine từ acid acetamidocinnamic và 2 chủng P.carotinifaciens
và P.marcusii sản xuất quy mô công nghiệp canthaxanthin [16], [23].
Trong khuôn khổ của luận án này, chúng tôi sử dụng chủng: Paracoccus
carotinifaciens VTP20181 được sàng lọc, tuyển chọn bởi Bộ môn Công nghệ Enzyme
- Viện Công nghiệp Thực phẩm để tiến hành thực hiện các nghiên cứu.
1.3.2. Cơ chế sinh tổng hợp canthaxanthin
Quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin bắt đầu bởi sự chuyển hóa, acetyl CoA
thành 3-hydroxy-3-methyl glutaryl CoA, (HMG-CoA) xúc tác bởi HMG-CoA
synthase. HMG-CoA tiếp tục được chuyển hóa thành mevalonic acid (MVA), tiền chất
đầu tiên của chu trình sinh tổng, hợp terpenoid. Các bước chuyển hóa tiếp theo gồm 2
xúc tác kế tiếp phosphoryl hóa bởi mevalonate kinase và phosphomevalonate
decarboxylase để tạo thành IPP. 3 phân tử IPP được isome hóa thành dimethylallyl
pyrophosphate (DMAPP) xúc tác bởi prenyltranssferase, tạo thành geranylgeranyl
pyrophosphate (GGPP). Phản ứng trùng hợp 2 phân tử GGPP tạo thành phytoene

(carotene C40 đầu tiên của chu trình chuyển hóa canthaxanthin) sau đó bị khử tạo thành
18


lycopene. Lycopene được chuyển hóa tiếp thành beta carotene và các dẫn xuất khác
như torulene, torularhodin, astaxanthin, zeaxanthin và canthaxanthin [15].

Hình 1.3.1. Sơ đồ sinh tổng hợp canthanxanthin [24]
1.3.3. Ảnh hưởng của các nhân tố môi trường đến sự sinh trưởng của vi khuẩn ưa
mặn đến quá trình sinh tổng hợp canthaxanthin
1.3.3.1. Nhu cầu về NaCl
Tất cả vi khuẩn ưa mặn đều đáp ứng yêu cầu phát triển trong môi trường muối và
khả năng chịu đựng, muối của chúng ở nồng độ muối cao. Yêu cầu muối đối với
chủng là khác nhau và một số yếu tố khác như: dinh dưỡng và nhiệt độ trong môi
trường nuôi cấy. Do vậy, phụ thuộc vào nồng độ muối của môi trường mà có thể phân
19


ra vi khuẩn đó là ưa mặn hay chịu mặn [23; 25]. Mơi trường có độ mặn trung bình
thích hợp cho nuôi cấy sinh khối và carotenoid của vi khuẩn, tùy thuộc vào từng chủng
mà có độ mặn thích hợp khác nhau [26]. Một số các vi sinh vật cực kỳ ưa mặn sinh
canthaxanthin như là vi khuẩn cổ Hfx. alexandrinus, để tế bào phát triển bình thường
thì hàm lượng NaCl tối thiểu là 10% (w/v), để tăng hàm lượng canthaxanthin cần tăng
nồng độ NaCl đến 25% [27]. Tỷ lệ canthaxanthin/ astaxanthin cũng tăng trong các tế
bào khi phát triển trong điều kiện ánh sáng yếu (50 μmol/m2s) và nồng độ muối gây ức
chế. Tuy nhiên, sinh khối và canthaxanthin sản xuất bởi chủng vi khuẩn D.
Natronolimnaea HS-1 không bị ảnh hưởng khi mơi trường khơng có NaCl [28].
1.3.3.2. Nguồn carbon và nitơ
Một số, loại vi khuẩn ưa muối có thể tăng trưởng trong môi trường dinh dưỡng
tối thiểu. H.halophila phát triển tốt trên mơi trường có chứa muối vơ cơ, kể cả nitrat

như nguồn nitơ, glucose là nguồn carbon duy nhất. H.halodenitrifican có thể phát triển
hiếu khí trên một số nguồn carbon hữu cơ và thiamine. Hầu hết, vi khuẩn ưa mặn trung
bình địi hỏi về dinh dưỡng khắt khe hơn khi nuôi cấy ở nồng độ muối cao.
Sucrose và glucose là nguồn cung cấp carbon, cao nấm men, cao malt, và
peptone là nguồn cung cấp nitơ trong quá trình sản xuất carotenoid. Trong những năm
gần đây, một số nhà nghiên cứu đã chứng minh rằng nguyên liệu thô từ nơng nghiệp
cũng có thể được sử dụng hiệu quả cho nguồn carbon và nitơ. Tùy thuộc vào từng
chủng mà sử dụng nguồn carbon và nitơ thích hợp khác nhau [28].
1.3.3.3. Nguyên tố vi lượng
Nguyên tố vi lượng đóng một vai trị quan trọng trong q trình sinh tổng hợp sắc
tố từ vi sinh vật. Chúng là tác nhân kích thích một số enzyme tham gia vào q trình
sinh tổng hợp carotenoid, tăng giá trị chất chuyển hóa ở nồng độ nhất định. Nasri
Nasrabadi và Razavi đã công bố, nếu bổ sung ở mức tối ưu: Fe3+ (30 ppm), Cu2+
(28,75 ppm) và Zn2+ (27 ppm) có thể đạt được sản lượng canthaxanthin cao nhất
(8,923 ± 0,018 mg/l) đối với chủng D. natronolimnaea HS-1. Chủng H. pluvialis có
thể làm tăng đáng kể về hàm lượng AX khi bổ sung muối sắt (Fe3+) vào mơi trường lên
men. Sự tích lũy ion Fe3+ có thể đồng thời hình thành gốc hydroxyl thơng qua "phản
ứng Fenton" (H2O2 + Fe2

+

→ Fe3+ + OH− +

•

OH), tăng cường sinh tổng hợp

carotenoid tế bào [29]. Mặt khác, Liu và Lee đã cho rằng ion sắt là chất kích thích để
tăng sản xuất carotenoid và có thể giảm chi phí chiếu sáng bằng các muối vơ cơ. Một
20

lượng nhỏ lượng Fe3+, Mg2+ và Cu2+ làm tăng khả năng sinh tổng hợp carotenoid của
Blakeslea trispora [30].
1.3.4. Ảnh hưởng của điều kiện lên men đến khả năng sinh tổng hợp
canthaxanthin
1.3.4.1. Tỷ lệ giống
Nếu tỷ lệ giống quá ít, thời gian lên men sẽ kéo dài, trong giai đoạn đầu của q
trình lên men. Ngồi ra lượng giống q ít cũng dễ gây nhiễm các vi sinh vật làm ảnh
hưởng xấu đến năng suất, chất lượng của sản phẩm.
Ngược lại nếu lượng giống nuôi cấy quá nhiều làm thay đổi tỷ lệ sản phẩm phụ
tạo ra trong quá trình lên men, làm cho giá trị của sản phẩm sẽ thay đổi theo chiều
hướng tiêu cực. Ngoài ra lượng giống nhiều cũng sẽ làm tăng chi phí cho q trình sản
xuất.
Chính vì vậy trong sản xuất cần xác định tỷ lệ giống phù hợp bằng thực nghiệm
và bằng các phần mềm tối ưu hoá.
1.3.4.2. Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng, sự trao đổi chất của vi sinh vật
và chất lượng của sản phẩm lên men.
Thường quá trình lên men ở nhiệt độ thấp thì thời gian lên men sẽ kéo dài.
Ngược lại, lên men ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm tốc độ quá trình trao đổi chất 2
chiều của vi sinh vật. Nếu chúng ta lên men thực phẩm ở nhiệt độ cao sẽ làm giảm
hoặc làm mất hương vị của sản phẩm.
Chính vì vậy trong sản xuất cần làm thực nghiệm và các phầm mềm tối ưu để
chọn nhiệt độ lên men thích hợp, nhằm để tăng năng suất, chất lượng sản phẩm, đồng
thời tiết kiệm được chi phí sản xuất.
1.3.4.3. Sự cung cấp oxy
Trong mơi trường lên men hiếu khí, nhu cầu oxy tối thiểu là 1mg/l, nếu lượng
oxy thấp hơn thì xảy ra lên men yếm khí, làm cho tốc độ tăng trưởng của vi sinh vật
giảm.

Với quá trình lên men hiếu khí, sự phát triển của vi sinh vật thường tỷ lệ thuận
với lượng oxy được cung cấp. Với môi trường canh tác là môi trường lỏng, thường sử
dụng phương pháp sục khí vơ trùng trực tiếp vào canh trường kết hợp với khuấy trộn.
Với môi trường nuôi cấy là rắn, thường thổi khí vơ trùng qua lớp canh trường trong
21


thiết bị ni cấy. Vì vậy cần xác định nồng độ cấp khơng khí trong q trình ni cấy
bằng phương pháp thực nghiệm.
Với q trình lên men kỵ khí, sự có mặt của oxy có thể gây độc và ức chế sự
phát triển của vi sinh vật, vì vậy khơng được cấp oxy cho q trình này. Với mơi
trường canh tác là môi trường lỏng, thường sử dụng phương pháp sục khí trơ (ví dụ:
nitơ, argon) vơ trùng trực tiếp vào canh trường kết hợp với khuấy trộn. Với môi trường
ni cấy là rắn, thường thổi khí trơ vơ trùng qua lớp canh trường trong thiết bị nuôi
cấy.
1.3.4.4. Độ pH mơi trường
Trong q trình lên men, pH ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh trưởng của vi
sinh vật.
Nhưng pH cũng thay đổi liên tục trong quá trình lên men do sự trao đổi chất
giữa các vi sinh vật, từ đó làm thay đổi ion H+ trong canh trường, hoặc một số vi sinh
vật sinh tổng hợp acid hữu cơ rồi tiết vào canh trường. Trong trường hợp này, một số
phân tử protein hồ tan trong canh trường có thể bị đông tụ.
Nếu giá trị pH cao quá hoặc thấp quá đều dễ làm giảm sự phát triển của vi sinh
vật trong quá trình lên men.
Do trong quá trình lên men, canh trường ln thay đổi pH, vì vậy phải điều
chỉnh pH trong suốt quá trình lên men để thu được sản phẩm có chất lượng và sản
lượng cao nhất.
1.3.4.5. Thời gian lên men
Thời gian lên men phụ thuộc vào giống vi sinh vật, yêu cầu sản phẩm thu nhận
và nhiều yếu tố khác. Khi sản phẩm là các chất như acid amin, acid hữu cơ, dung môi

hữu cơ, enzyme… thời gian lên men thường kéo dài từ 1 đến 3 ngày. Ngược lại, đối
với nhóm thực phẩm lên men, thời gian lên men có thể kéo dài hàng tuần, hàng tháng,
hàng năm (ví dụ sản xuất nước mắm: thời gian lên men đến 2 năm).
Vì các lý do nêu trên, trong sản xuất cần xác định thời gian lên men bằng thực
nghiệm và các phần mềm tối ưu.
1.3.4.6. Phương pháp lên men
Phương pháp lên men phụ thuộc vào bản chất của q trình lên men, có rất
nhiều q trình lên men được thể hiện sau:
Lên men chìm trong mơi trường lỏng:
22


Lên men chìm là phương pháp được phổ biến rộng nhất trong quy trình lên men
cơng nghiệp, nó có rất nhiều ưu điểm so với phương pháp lên men bề mặt:
- Có thể kiểm sốt được tồn bộ các khâu trong q trình.
- Giảm thể tích lên men
- Dễ tự động hố
Tuy nhiên nó cũng có các nhược điểm:
- Kinh phí đầu tư cho thiết bị cao.
- Trong q trình lên men mà bị nhiễm khuẩn phải huỷ bỏ cả mẻ, gây tốn kém
cho nhà đầu tư.
Phương pháp này dùng cho cả vi sinh vật kị khí và hiếu khí. Với lên men kỵ
khí: cần khuấy trộn định kỳ hoặc liên tục. Với lên men hiếu khí: cần sục khí vơ trùng
và khuấy trộn trong suất qúa trình lên men.
Đây là phương pháp hiện đại đã được dùng trong khoảng nửa cuối thế kỉ XX
cho đến nay và cho hiệu suất cao trong công nghiệp cũng như trong nghiên cứu.
Lên men gián đoạn:
Lên men gián đoạn phương pháp lên men theo mẻ. Cung cấp dinh dưỡng trước
nuôi cấy và thu sản phẩm ở cuối quy trình. Hầu hết các thơng số quy trình khơng thay
đổi trong suốt thời gian lên men.

Phương pháp nuôi gián đoạn được sử dụng rộng rãi vì kỹ thuật đơn giản, chi
phí ban đầu thấp, dễ dàng nâng quy mơ bằng các mơ hình tốn học.
Lên men liên tục:
Lên men liên tục là quá trình cân bằng động giữa việc cấp dinh dưỡng vào và
thu sản phẩm ra một cách liên tục. Do đó, mơi trường ni cấy có thể tích khơng thay
đổi. Nhờ việc cung cấp dinh dưỡng và thu sản phẩm liên tục, vi sinh vật sẽ có khả
năng kéo dài được pha cân bằng, sản phẩm được thu liên tục và năng suất cao.

23