BÀI GIẢNG: CÔNG NGHỆ HOÁ SINH docx

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
KHOA KHOA HỌC SỰ SỐNG

BÀI GIẢNG:
CÔNG NGHỆ HOÁ SINH
Người soạn: ThS. Trịnh Đình Khá
THÁI NGUYÊN - 2010
CHƯƠNG 1
CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH VÀ KHÁNG SINH BÁN
TỔNG HỢP
1. ĐẠI CƯƠNG VỀ KHÁNG SINH
2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁN SINH PENICILLIN
3. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT β-LACTAM BÁN TỔNG HỢP
1. ĐẠI CƯƠNG VỀ CHẤT KHÁNG SINH
1.1. LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU
Thuật ngữ “chất kháng sinh” lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877) sử dụng để
mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn Bacillus anthracis trên
động vật nhiễm bệnh.
Babes (1885) đã nêu ra định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính
tổng hợp được các hợp chất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng.
Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của Bacillus
subtilis có liên quan đến quá trình hình thành loài bào tử.
Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách từ nấm mốc một chế phẩm có thể sử dụng điều
trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da do cầu khuẩn và ông là người đầu tiên
xây dựng hoàn thiện phương pháp tìm kiếm và phát hiện vi sinh vật sinh tổng hợp
chất kháng sinh trong tự nhiên.
Năm 1929 thuật ngữ “chất kháng sinh” mới được Alexander Fleming mô tả một cách
đầy đủ và chính thức trong báo cáo chi tiết về penicillin
Năm 1931, các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên
men bề mặt. Năm 1938 ở Oxford, Ernst Boris Chain và Howara Walter Florey đã tiếp tục triển khai

nghiên cứu này. các ông đã tinh chế được một lượng lớn penicillin (1939) đủ để thử nghiệm trên
các loạt động vật thí nghiệm. Ngày 25/05/1940 penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên
chuột và chính thức được dùng điều trị thành công trên người (1941) trong nỗ lực cuối cùng nhằm
cứu sống các thương binh bị nhiễm khuẩn nặng trong chiến tranh thế giới thứ hai.
Trong thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậc của ngành công nghệ sản
xuất chất kháng sinh non trẻ như:
* Khám phá ra hàng loạt chất kháng sinh như: griseofulvin (1939), gramicidin S (1942), streptomycin
(1943), bacitracin (1945), chloramphenicol và polymycin (1947), clotetracyclin và cephalosporin
(1948), neomycin (1949), oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954),
vancomycin (1956), kanamycin và rifamycin (1957),
* Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến đã tạo ra những biến chủng công
nghiệp có năng lực “siêu tổng hợp” các chất kháng sinh cao gấp hàng vạn lần các chủng ban đầu.
* Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công nghiệp để sản xuất penicillin G
(1942) và hoàn thiện công nghệ lên men này trên những sản phẩm khác trong những năm tiếp
theo.
* Năm 1959, phát hiện và tinh chế sử dụng thành công 6-aminopenicillinic acid (6APA) làm nguyên liệu
để sản xuất các chất kháng sinh penicillin bán tổng hợp
1.2. KHÁI NIỆM CHẤT KHÁNG SINH
• Theo các nhà sinh học, kháng sinh là những hợp chất hoá học do vi sinh vật
tiết ra có tác dụng ức chế sự phát triển hay tiêu diệt một cách chọn lọc một
nhóm vi sinh vật xác định hay cả tế bào ung thư ở nồng độ thấp.
• Còn các nhà hoá học thì muốn định nghĩa kháng sinh sinh phải bao hàm cả
các chất tổng hợp bằng hoá học có tác dụng diệt khuẩn như các chất thuộc
quinolon.
“Chất kháng sinh (antibiotic) là các chất hoá học xác định, không
có bản chất enzyme, có nguồn gốc sinh học với đặc tính ngay ở
nồng độ thấp có khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt được
các vi sinh vật gây bệnh mà vẫn đảm bảo được an toàn cho người
hay động vật được điều trị”.
Tên kháng sinh Vi sinh vật sản xuất kháng sinh Hoạt phổ

Penicillin Penicillium chrysogenum Kháng khuẩn
Steptomycin Str. griseus Kháng khuẩn
Tetracyclin Str. aureofaciens Kháng khuẩn
Chloramphenicol Str. venezuela Kháng khuẩn
Oxytetracyclin Str. rimosus Kháng khuẩn
Cephalosporin Cephalosporium acremonium Kháng khuẩn
Actinomycin D Str. antibioticus Kháng ung thư
Bleomycin Str. verticillum Kháng ung thư
Daunorubicin Str. peuceticus Kháng ung thư
Mitomycin C Streptomyces sp. Kháng ung thư
Kanamycin Str. kanamyceticus Kháng khuẩn
Nystatin Str. noursei Kháng nấm
Fumagillin A. fumigatus Kháng protozoa
Griseofulvin P. griseofulvum Kháng nấm
Nistin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm
Natamycin Streptococcus sp. Bảo quản thực phẩm
Rifamycin Nocardia sp. Kháng lao
Polymycin B Bacillus polymyxa Kháng khuẩn
Gentamycin Micromonospora sp. Kháng khuẩn
1.3. CƠ CHẾ TÁC DỤNG CỦA CHẤT KHÁNG SINH
• Làm rối loạn cấu trúc thành tế bào
• Rối loạn chức năng điều tiết quá trình vận chuyển vật chất qua màng tế bào
chất
• Làm rối loạn hay kiềm toả quá trình sinh tổng hợp protein
• Rối loạn quá trình tổng hợp DNA
• Hoặc tương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển
hoá trao đổi chất.
Đánh giá hiệu quả ứng dụng của chất kháng sinh:
• hoạt tính kháng sinh đặc hiệu, phổ kháng sinh
• đáp ứng phản hồi của mầm bệnh đối với kháng sinh đó

• phản ứng phụ của thuốc, đường cấp thuốc
• sự chuyển hoá thuốc trong cơ thể bệnh nhân, đường hướng đào thải thuốc
• tương tác qua lại giữa các loại thuốc khi sử dụng phối hợp.
1.4. CHỨC NĂNG SINH HỌC CỦA CHẤT KHÁNG SINH
• Việc tổng hợp các chất kháng sinh nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh
tranh có lợi cho chủng sinh kháng sinh, nhờ đó chúng có thể tiêu diệt hay
kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển
trong hệ sinh thái cục bộ đó.
• Việc tổng hợp chất kháng sinh là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho
khả năng sống sót cao cho chủng vi sinh ra chất kháng sinh trong tự nhiên,
nhất là đối với các loài có bào tử.
1.5. ĐIỀU CHỈNH SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG SINH
• Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng hợp chất kháng sinh
• Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành
quá trình lên men.
1.5.1. Tuyển chọn và tạo ra các chủng công nghiệp siêu tổng
hợp chất kháng sinh
Trải qua 6 giai đoạn cơ bản:
• Phân lập từ tự nhiên
• Nghiên cứu xử lý tạo các biến chủng siêu tổng hợp có hoạt lực cao
• Tuyển chọn sơ bộ
• Tuyển chọn lại thu các chủng có hoạt tính cao quy mô phòng thí nghiệm
• Thử nghiệm và tuyển chọn lại trên quy mô sản xuất thử nghiệm pilot
• Thử nghiệm và chọn lọc lại các chủng phù hợp với điều kiện lên men
sản xuất lớn công nghiệp.
1.5.2. Tối ưu hoá thành phần môi trường, thiết bị lên men và điều kiện vận hành quá
trình lên men
• nguồn cacbon thường được lựa chọn là: các loại bột và hạt ngũ cốc, cám
mỳ, cám gạo, vỏ khoai tây, rỉ đường, các loại đường, dextrin, glyxerin, axit
axetic, dịch thuỷ phân gỗ,

• Nguồn nitơ có thể là: bột đậu tương, nước chiết ngô, cao nấm men, nước
chiết nấm men, pepton, các loại muối vô cơ chứa nitơ,
• Các nguyên tố khoáng đa lượng như: P, S, Mg, Fe, Ca, K, Na. Các nguyên tố
vi lượng như: Cu, Zn, Co, Mo, và các chất kích thích sinh trưởng.
• Khai thác hiệu quả tác động của các yếu tố khác trong môi trường
như: nhiệt độ lên men tối ưu, pH, nồng độ oxy, thế oxy hoá - khử,
cường độ sục khí, cường độ khuấy trộn dịch lên men,
1.6. CÁC BƯỚC CƠ BẢN TẠO CHẤT KHÁNG SINH DÙNG TRONG Y HỌC
Bước 1: Phân lập vi sinh vật sinh kháng sinh dưới dạng thuần khiết. Chọn lọc chủng có
hoạt phổ kháng sinh mong muốn. Định tên chủng vi sinh vật tuyển chọn được.
Bước 2: Nuôi cấy vi sinh vật sinh kháng sinh trong thiết bị lên men dung tích từ 5 – 100 lít.
Chiết xuất, tinh chế để thu kháng sinh tinh khiết, xác định cấu trúc hoá học, thử sơ bộ về
độc tính và một vài hằng số lý hoá của kháng sinh tìm được.
Bước 3: Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi sinh vật sinh kháng sinh, tìm môi
trường tối ưu để nuôi cấy. Đột biến cải tạo giống bằng kỹ thuật di truyền cổ điển và kỹ
thuật gen để thu được chủng giống có năng suất cao, ổn định.
Bước 4: Nghiên cứu dược lý của kháng sinh tìm được, tác dụng điều trị của kháng sinh
bằng cách gây bệnh thực nghiệm trên động vật thí nghiệm.
Bước 5: Nghiên cứu sản xuất kháng sinh trên qui mô công nghiệp bao gồm: môi trường lên
men, các thông số kỹ thuật của quá trình lên men, phương pháp chiết xuất và tinh chế để
đạt tiêu chuẩn dùng làm thuốc,
Bước 6: Nghiên cứu kinh tế và thị trường
1.7. PHƯƠNG HƯỚNG PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG
SINH
• Nghiên cứu sản xuất thêm các chế phẩm bán tổng hợp, mở rộng phổ điều trị và mang lại các
đặc tính ưu việt hơn. Nghiên cứu các hoạt tính mới của kháng sinh như: kháng nấm, kháng
virus, kháng sinh có khả năng kìm hãm sự phát triển của các khối u,
• Hoàn thiện các phương pháp phân lập, tuyển chọn, tạo các biến chủng siêu tổng hợp, điều
chỉnh đường hướng các quá trình trao đổi chất và đường hướng quá trình lên men, áp dụng
các công nghệ tách chiết và tinh chế mới, hoàn thiện và áp dụng các kỹ thuật phân tích hiện

đại (đặc biệt là kỹ thuật “in vivo assay systems”), để triển khai sản xuất công nghiệp các
chất kháng sinh.
• Tiếp tục tìm kiếm phát hiện các chất kháng sinh mới, bao gồm cả mở rộng tìm kiếm phát hiện
khả năng sinh tổng hợp các chất kháng sinh sang các nhóm sinh vật khác
• Sản xuất các chế phẩm điều trị với sự phối hợp nhiều loại thuốc, mở rộng khả năng ứng dụng
và điều trị của các chất kháng sinh đã biết; đồng thời góp phần làm giảm nguy cơ kháng
thuốc và hạn chế bớt các hiệu ứng không mong muốn của mỗi chất kháng sinh.
• Mở rộng thêm khả năng ứng dụng các chất kháng sinh vào các lĩnh vực kinh tế và khoa học
khác như: ứng dụng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm, nông nghiệp, bảo vệ môi trường,
nghiên cứu khoa học,
2. CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG SINH PENICILLIN
2.1. GIỚI THIỆU KHÁNG SINH PENICILLIN
Hình 1.1. Cấu trúc vòng β-lactam và khung penam
Hình 1.2. Cấu trúc của penicillin
β-lactam
Penam
Bảng 1.3. Cấu trúc phân tử của một số penicillin tự nhiên
Gốc R Tên gọi gốc Tên penicillin
C
6
H
5
-CH
2
- Benzylpenicillin Penicillin G
C
6
H
5
-O-CH

2
- Phenooxymethylpenicillin Penicillin V
CH
3
-CH
2
-CH=CH-CH
2
- 2-pentenylpenicillin Penicillin F
CH
3
-(CH
2
)
4
- n-amylpenicillin Dihydropenicillin F
CH
3
-(CH
2
)
6
- Hepthylpenicillin Penicillin K
HOOC-(NH
2
)CH(CH
2
)
3
-

1-amino-1-carboxyl-
buthylpenicillin
Penicillin N
HO-C
6
H
5
-CH
2
- p-hydroxybenzylpenicillin Penicillin X
Cơ chế tác dụng của họ kháng sinh β-
lactam
Cấu tạo thành tế bào vi khuẩn?
Gram dương Gram âm
Cơ chế tác dụng
2.2. CƠ CHẾ SINH TỔNG HỢP PENICILLIN Ở NẤM MỐC P.
CHRYSOGENUM
Hình 1.3. Sơ đồ cơ chế tổng hợp penicilin ở nấm mốc P. chrysogenum
H
2
N CH C
(CH
2
)
3
OH
O
C
OH

O
H
2
N CH C
CH
2
OH
O
SH
NH
2
CH
C
CH
OH
O CH
3
CH
3
CH
H
2
N
HOOC
(CH
2
)
3
CONH
N

SH
O
CH
H
2
N
HOOC
(CH
2
)
3
CONH
N
S
COOH
O
RCONH
N
S
COOH
O
H
2
N
N
S
COOH
O
Isopenicillin N
Penicillin N

Phenylacetic acid
Benzylpenicillin
(Penicillin G)
axit aminoadipic
Cystein
Valin
aminoadipyl- cystein - valin
6-APA
(6 amino penicillinic acid)
axit aminoadipic
(
H

í
n
g

1
)
(Híng 2)
H

í
n
g

3
2.3. QUY TRÌNH LÊN MEN SẢN XUẤT PENICILLIN TRONG CÔNG
NGHIỆP
2.3.1. Đặc điểm chung

Theo công nghệ lên men của hãng Gist-Brocades (Hà Lan) thì toàn bộ
dây chuyền sản xuất penicillin có thể phân chia làm 4 công đoạn chính
như sau:
• Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặc G).
• Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.
• Sản xuất các penicillin bán tổng hợp
• Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại
2.3.2. Chuẩn bị lên men
a. Giống, bảo quản và nhân giống cho sản xuất
• Giống công nghiệp P. chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông
khô, bảo quản siêu lạnh ở -70oC hoặc bảo quản trong nitơ lỏng.
• Giống từ môi trường bảo quản được cấy chuyền ra môi trường thạch hộp
để hoạt hoá và thu bào tử. Dịch huyền phù bào tử được cấy chuyền tiếp
sang môi trường bình tam giác, rồi thiết bị nhân giống nhỏ, thiết bị nhân
giống trung gian, và cuối cùng trên thiết bị nhân giống sản xuất.
b. Chuẩn bị môi trường và thiết bị lên men
 Các thành phần môi trường thường được cân đong rồi pha chế riêng rẽ
trong các thùng chứa phù hợp, sau đó thanh trùng gián đoạn ở 121oC (hay
thanh trùng liên tục ở khoảng 140-146oC) hoặc bằng phương pháp siêu
lọc rồi mới bơm vào trong thùng lên men.
 Thiết bị lên men trước khi đưa vào sử dụng phải được vô khuẩn, thường
được thanh trùng bằng hơi nước ở áp suất 2,5-3 at trong thời gian 1-3h.
Sau khi khử trùng xong thiết bị được đưa vào sử dụng ngay. Không khí
thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó được lọc khử
khuẩn bằng cách lọc qua màng vô khuẩn hoặc siêu lọc.
Bảng 1.4. Thành phần môi trường lên men cơ bản để lên men sản xuất
penicilin
 Lactose 20-50 kg/m
3
 Glucose 0-10 kg/m

3
, bổ sung gián đoạn hoặc liên tục trong quá trình lên
men
 Dịch chiết ngô cô đặc 15-50 kg/m
3
 Các khoáng chất
NaNO
3
0-5 kg/m
3
; Na
2
SO
4
0-1 kg/m
3
; CaCO
3
0-10 kg/m
3
; KH
2
PO
4
0-4 kg/m
3
;
MgSO
4
.7H

2
O 0-0,25 kg/m
3
; MgSO
4
0-0,02 kg/m
3
; ZnSO
4
0-0,04 kg/m
3
 Tiền chất tạo nhánh bổ sung liên tục theo nhu cầu. Theo lý thuyết nhu cầu
về phenylacetat là 0,47g/g penicilin G hoặc 0,5g phenooxyacetat/g
penicillin V
 Chất chống tạo bọt bổ sung liên tục theo nhu cầu
2.3.3. Kỹ thuật tiến hành lên men
• kỹ thuật lên men chìm được áp dụng trong hầu hết các cơ sở sản xuất penicillin và
thường được vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục gồm phương án
lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hoặc bán liên tục) một hay một vài
cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại một phần hệ sợi của mẻ lên men
trước.
• Quá trình lên men được vận hành theo hai pha. Pha đầu nuôi thu sinh khối
trong khoảng 2-3 ngày, pha sau lên men thu sản phẩm. Nhiệt độ lên men
pha đầu thường khống chế ở 30oC, pha sau từ 22-25oC. Tốc độ sục khí và
khuấy trộn được điều chỉnh để duy trì nồng độ oxy hoà tan khoảng 30%.
Dịch lên men ban đầu thường có pH khoảng 6,5-6,8; trong quá trình lên
men thường khống chế pH ổn định trong khoảng 6,2-6,8. Nồng độ NH4+
thường khống chế trong khoảng 0,3-0,4 kg/m3. Chất phá bọt thường sử
dụng là các loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, Thời
gian lên men mỗi mẻ thường kéo dài trong khoảng 144-180h.

2.4. XỬ LÝ DỊCH LÊN MEN, TINH CHẾ THU PENICILLIN 2.4.1. Lọc
dịch lên men
• Thông thường, chỉ cần tiến hành lọc một lần trên thiết bị lọc hút kiểu băng tải
hoặc kiểu thùng quay rồi làm lạnh dịch ngay chuyển sang công đoạn tiếp theo.
• Phần sinh khối nấm được rửa sạch, sấy khô và sử dụng để chế biến thức ăn gia
súc.
2.4.2. Trích ly
• Penicillin thường được trích ly ở dạng acid ra khỏi dịch lọc bằng dung môi
amylacetat hoặc butylacetat ở pH=2-2,5; nhiệt độ từ 0-3oC. Quá trình trích
ly được thực hiện trong thời gian rất ngắn. Dịch lọc được bơm trộn đồng
thời với dung dịch H2SO4 hoặc H3PO4 loãng có bổ sung thêm chất chống
tạo nhũ và bơm song song cùng với dung môi vào thiết bị trích ly.
• Tỷ lệ dịch lọc: dung môi thường chọn trong khoảng 4-10V dịch lọc/1V dung
môi.