tIỂU LUẬN:CHẨN ĐOÁN VIRUS DẠI ( RABIES VIRUS) potx

 1
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM
Bộ môn công nghệ sinh học
Lớp DH06SH


Bài tiểu luận
CHẨN ĐOÁN VIRUS DẠI ( RABIES VIRUS)

GVHD T.S NGUYỄN NGỌC HẢI
SV Trương Thị Huyền Trang – MSSV 06126159










 2




I. Đặt vấn đề
Bệnh dại là bệnh do virus dại (rabies virus) gây lên. Đây là một bệnh
nhiễm virus cấp tính của hệ thần kinh trung ương dẫn đến tử vong chắc
chắn. Bệnh dại là một trong những bệnh truyền nhiễm được ghi nhận từ
thời cổ xưa, mô tả từ cách đây hơn 3000 năm và là một bệnh truyền

nhiễm đáng sợ. Bệnh dại có thể gặp ở tất c
ả động vật có vú và chỉ xảy ra
ở động vật có vú. Bệnh lây truyền chủ yếu do các chất tiết bị nhiễm,
thường do vết cắn, vết liếm của động vật mắc bệnh dại vào các vết
thương hở
Khi virus vào cơ thể, nó sẽ đi theo các dây thần kinh đến não bộ trung
ương, chó, mèo, chồn bị nhiễm virus thì có những biểu hiện rất khác
nhau như là sợ sệt, hung hă
ng, chảy nước mũi nước dãi nhiều, nuốt vào
khó khăn, choáng và lên cơn những thú hoang dại mắc bệnh dại thì
thường có những biểu hiện khác thường như là chúng thường chỉ thấy
vào ban đêm còn ban ngày thì chúng sẽ đi lang thang đây đó.
Có 2 dạng bệnh dại
• Bệnh dại từ động vật nuôi như chó mèo: trên thế giới có khoảng 35.000-
50.000 ca bệnh dại ở người, chủ yếu ở các nước đang phát triển, phần lớn là
do chó dại cắn .
• Bệnh dại tự nhiên : Là bệnh do động vật hoang dại truyền .Các nước Âu Mỹ
có chương trình kiểm soát bệnh dại ở động vật nuôi hiệu quả nên rất ít gặp
bệnh dại do cho cắn .
Loài dơi rất nguy hiểm vì chúng có thể mang virus dại nhưng biểu
hiện hoàn toàn khỏe mạnh, tiết virus dại vào nước bọt rồi truyền đến động
vật khác và người .Bệnh dại ở loài dơ
i có thê gây những trận dịch động vật ở
những vùng mới trên trái đất .
 3
Theo thống kê tại thành phố HCM : tỉ lệ tử vong do chó dại cắn là
98,2% và mèo dại cắn là 1,8% .Loài gặm nhấm và thỏ không truyền bệnh
dại .Tỉ lệ mắc bệnh tăng cao vào mùa nắng.
Tóm lại đây là một bệnh vô cùng nguy hiểm nếu phát triển thành dịch
II. Rabies virus

Thuộc giống lyssavirus, họ Rhabdoviridae
Rabies virus có vật chất di truyền là RNA
Quan sát dưới kính hiển vi điện tử có hình viên đạn do đó dễ phân biệt với các
virus cùng họ
Có kích thước xấp xỉ 180 x 75nm
Gồm hai cấu phần chính là lõi virus (virus core) có cấu trúc ribonucleoprotein xoắn
(RNP) và lớp vỏ bao (virus envelop).
Các phần cấu tạo của virus
•Lõi virus(ribonucleoprotein)
•Chất nền protein
•Lớp áo ngoài(envolop)
•Các gai glycoprotein
Phản ứng với các tác nhân lý hóa
Virus dạ
i kém bền vững và nhạy cảm với các yếu tố ngoại cảnh :bị tiêu diệt nhanh
chóng bởi tia cực tím hoặc ánh sáng mặt trời, xà phòng đặc 20%, bởi sức nóng
(50
0
C /1h),bởi các dung môi lipid,bởi trypsin,chất tẩy, chất oxy hóa và pH quá cao
hoặc quá thấp . Virus dại sống được hàng tuần khi lưu trữ ở 4
0
C, bất hoạt bởi CO
2

.Trong mô não, virus dại tồn tại vài tháng ở 40
0
C hoặc hàng năm ở 70
0
C .

 4

Cấu tạo virus dại



Sơ đồ cắt ngang virus

Bộ gene virus (khoảng 12kb) mang leader-sequence (trình tự để trắng hay trình tự;
trình tự mở đầu) có kích thước khoảng 50 nucleotide tiếp theo là các gene mã hóa
cho 5 loại protein N, P, M, G và L với kích thước tương ứng
 5


III. Cách gây bệnh của rabies virus
Sau khi xâm nhập trong mô, virus nhân lên tại chỗ, đặt biệt trong cơ.
Sau 1 thời gian virus bắt đầu phát tán, chúng đến tế bào cơ và những dây
chằng tận cùng thần kinh. Virus nhân lên trong những tế bào hạch thần
kinh, dây thần kinh, tùng thần kinh.
Ngoài mô thần kinh, virus con nhân lên trong biểu mô của tuyến nước
bọt, giác mô, da, dịch tiết nước bọt cơ lưỡi… Như vậy sau khi thực hiện
sự xâm lấn ly tâm từ hệ thần kinh, virus xâm nhiễm tất cả cơ quan và mô
.
Quá trình tấn công vào não bộ nhanh hay chậm tùy thuộc vào vị trí xâm
nhập của virus, càng gần não bộ thời gian tấn công đến não càng nhanh.
Sự xâm nhiễm từ thú qua thú tương tự như từ thú qua người.
Virus nhân lên ở bào tương, các virion nẩy chồi từ màng bào tương tế bào ký sinh
chủ .Virus dại tấn công vào các thụ thể acethylcholin trên bề mặt tế bào qua các gai
glycoprotein .Men polymerase RNA của virion sao chép bộ gen sợi đơn RNA
thành 5 loại RNA thông tin (mRNA) .Bộ gen RNA nằm trong ribonucleoprotein

(RNP), được protein N bao quanh chứa các gen sao chép .Các mRNA mã hóa cho
5 protein củ
a virion :nucleocapsit (N), protein của men polymerase (L,P), chất đệm
(M) và glycoprotein (G) .RNP của bộ gen làm khuôn mẫu cho RNA sợi bổ sung,
tạo ra các RNA con cháu có cực tính âm .Các protein virus đóng vai trò như
polymerase cho virus nhân lên vào sao chép . Sự dịch mã cần thiết cho virus nhân
lên, đặc biệt là cho protein N và P, RNA mới được nhân lên kết hợp với men
transcriptase và nucleprotein của virus để tạo lõi RNP trong bào tương.Các hạt
virus có được màng bao bọc trong lúc nẩy chồi qua màng bào tương .Protein đệm
của virus tạo 1 lớp ở mặt ngoài và tạo các gai virus


 6




IV. Các phương pháp chẩn đoán
IV.1. Phương pháp mô bệnh học (histopathology)
Một phương pháp nhanh chóng và đơn giản để chẩn đoán rabies là dùng loại thuốc
nhuộm thích hợp phát hiện thể Negri. Kĩ thuật mô bệnh học làm được điều này, tuy
nhiên ngày nay ở hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng phương pháp
fluorescent antibody( FA), kĩ thuật này đã được Goldwasser và Kissling lần đầu
tiên năm 1958.
Thuốc nhuộm huỳnh quang xuyên qua màng tế bào đi vào trong nhân sẽ nhuộm
màu thể Negri.
Sơ đồ cách gây bệnh của Rabies virus
 7

Thể Negri là biểu hiện bệnh lý đặc thù của virus dại



Thể Negri trong tế bào thần kinh nhiễm virus (mũi tên chỉ)
Tuy vậy, cũng chỉ phát hiện ở khoảng 70% trường hợp nhiễm virus.
IV.2. phương pháp Taqman PCR
 8
Nguyên tắc của phương pháp này là dựa trên phản ứng PCR có bổ sung tác
nhân dò Taqman. Phát hiện mục tiêu thông qua cường độ phát huỳnh quang của
Taqman.
Các bước tiến hành:
2.1 Ly trích RNA và tạo cDNA

Ly trích RNA bằng TRIzol, TRIzol LS với 1μl Glycoblue
Reverse transcription toàn bộ RNA thành cDNA
0.5 μl random primer cho 1μl RNA
2.2. Thiết kế mồi và Taqman

Đọan mồi được thiết kế đặc hiệu cho vật chất di truyền của virus.
Taqman được thiết kế có mạch đơn ngắn (vài nucleotide) có trình tự bắt cặp với
cDNA virus
Taqman được gắn huỳnh quang ở đầu 5’có hoạt tính, đầu 3’ gắn huỳnh quang
không hoạt tính. Huỳnh quang ở đầu 3’ sẽ ức chế sự phát huỳnh quang ở đầu 5’ khi
còn trong mạch. Một khi mạch Taqman bị enzyme polymerase phá hủy (khi phản
ứng PCR xảy ra) sẽ giải phóng huỳnh quang ở đầu 5’ khi đó cường độ huỳnh
quang trong dung dịch phản ứng sẽ tăng lên và có thể đo được bằng máy đo cường
độ huỳnh quang. Do đó nếu cường độ huỳnh quang trong dung dịch tăng lên sẽ
đồng nghĩa với phản ứng PCR đã xảy ra nghĩa là có virus rabies.
2.3. Tiến hành phản ứng

 9


Sản phẩm PCR sẽ được đem đi đo cường độ huỳnh quang, thông qua đó xác định
được sự hiện diện của virus
Phương pháp này phát hiện đựợc khoảng 95% trường hợp nhiễm virus
IV.3. Phương pháp chẩn đoán huyết thanh học:
Kháng thể virus dại xuất hiện chậm sau khi cơ thể bị nhiễm nhưng thường có thể
phát hiện khi bắt đầu có biểu hiện lâm sàng.
Bản chất của phương pháp này là phản ứng ELISA (phản ứng kháng nguyên kháng
thể).
Virus dại có 1 type kháng nguyên duy nhất .Tuy nhiên, các dòng virus phân lập từ
các loài khác nhau ở các vùng địa lý khác nhau có các epitop trên nucleoprotein và
glycoprotein khác nhau . Dùng kháng thể đơn dòng hoặc trình tự nucleotide đặc
hiệu để xác định những epitop khác nhau . Ở Mỹ, đã tìm thấy 5 biến thể
kháng
nguyên trong động vật sống trên cạn và 8 biến thể khác trong loài dơi.Vị trí amino
acid 333 của glycoprotein mang tính độc đóng vai trò quan trọng trong sinh bệnh
học bệnh dại và gây hòa màng tế bào nhiễm virus. Các gai virus chứa glycoprotein,
tạo kháng thể trung hòa ở động vật .Kháng huyết thanh kháng nucleocapsit giúp
chẩn đoán bệnh dại bằng phản ứng ELISA. Kháng thể trong kháng huyết thanh
 10
được nhuôm huỳnh quang rồi được cố định trên giá thể. Sau đó cho huyết thanh
mẫu cần chẩn đoán vào để phản ứng ELISA xảy ra, rửa dung dịch phản ứng loại bỏ
các phần không bắt cặp. soi dưới kính hiển vi huỳnh quang phát hiện mục tiêu
thông qua sự phát huỳnh quang.

Chẩn đoán huyết thanh học được cho là có hiệu quả nhất trong chẩn đoán bệnh dạ
i.
Phương pháp này phát hiện gần 100% trường hợp nhiễm virus.
V. So sánh giữa các phương pháp
Trong 3 phương pháp đã trình bày ở trên thì phương pháp chẩn đoán
huyết thanh học là phương pháp có hiệu quả nhất vì nó có thể phát hiện
được gần 100% trường hợp nhiễm virus. Tuy nhiên mỗi phương pháp
đều có ưu và nhược điểm riêng nên tùy trường hợp ta áp dụng cho phù
hợp các phương pháp

VI. Kết luận
 11
Bệnh dại là một bệnh nguy hiểm vì nó là một bệnh truyền nhiễm có tốc
độ lây lan cao và gây tử vong chắc chắn nếu không phát hiện kịp thời. do
đó cần có những biện pháp phòng bệnh, chẩn đoán bệnh và điều trị một
cách kịp thời và có hiệu quả.
VII. Tài liệu tham khảo
www.techmicrobio.net

www.beforethebite.typepad.com