securedownload ppt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
PHÒNG THÍ NGHIỆM TẾ BÀO GỐC
ThS. Tô Minh Quân
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào
1. Nuôi cấy sơ cấp
2. Nuôi cấy thứ cấp – Tạo dòng
3. Nhận diện tế bào
4. Bảo quản
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy sơ cấp
Nuôi cấy sơ cấp
Nuôi cấy thứ cấp
Nuôi cấy thứ cấp
Mô
Mô
Dòng tế bào
Dòng tế bào
Cấy chuyền
Cấy chuyền
Xử lý theo mục
đích
Xử lý theo mục
đích
Nuôi cấy tế bào sơ cấp
Nuôi cấy tế bào sơ cấp
Nuôi cấy sơ cấp (primary culture) là quá trình nuôi tế bào trực
tiếp từ mô trước lần cấy chuyền đầu tiên (subculture).

Sau lần cấy chuyền đầu tiên, việc nuôi cấy được gọi là thứ cấp
(secondary culture)
Mô
Mô
Tế bào
Tế bào
Tế bào hợp dòng
Tế bào hợp dòng
Cấy chuyền
Cấy chuyền
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy bám dính
Nuôi cấy bám dính
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy tế bào
Nuôi cấy huyền phù
Nuôi cấy huyền phù
Các loại tế bào bám dính vào bề mặt đĩa nuôi
-
Tế bào trung mô
-
Tế bào nội mô
-
Tế bào biểu bì
Các loại tế bào bám dính vào bề mặt đĩa nuôi
-
Tế bào trung mô
-
Tế bào nội mô

-
Tế bào biểu bì
Các loại tế bào không bám vào bề mặt đĩa nuôi
- Tế bào gốc tạo máu
- Tế bào ung thư
Các loại tế bào không bám vào bề mặt đĩa nuôi
- Tế bào gốc tạo máu
- Tế bào ung thư
Phần 1. Nuôi cấy tế bào bám dính
Phần 1. Nuôi cấy tế bào bám dính
Mẫu mô
Mẫu mô
Xử lí mẫu
Xử lí mẫu
Tách tế bào từ mô (Cơ học; Hóa
học)
Tách tế bào từ mô (Cơ học; Hóa
học)
Nuôi mảnh mô
Nuôi mảnh mô
Nuôi tế bào đơn
Nuôi tế bào đơn
Nuôi cấy tế bào sơ cấp
Nuôi cấy tế bào sơ cấp
Cắt nhuyễn mảnh mô
Cắt nhuyễn mảnh mô
Nuôi mảnh mô, tế bào
Nuôi mảnh mô, tế bào
Người hiến
Người hiến

Thu nhận mô
Thu nhận mô
o
Các nguồn mẫu: mô lỏng; mô rắn
o
Bảo quản mẫu trong dung dịch bảo quản có bổ sung kháng sinh (PBS, )
o
Đảm bảo điều kiện bảo quản mẫu.
Vd: Nếu nơi thu mẫu xa PTN → Bảo quản trong đá (4
0
C) trong 72h
o
Bảo đảm an toàn, đặc biệt khi thao tác với mô có nguồn gốc từ người
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
o
Là việc nuôi cấy các mảnh mô in vitro. Trong quá trình nuôi cấy, các tế
bào từ mảnh mô sẽ phát triển lan ra từ vùng mô trung tâm
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
Cố định bằng lammel Tăng kết dính và lật ngược bình nuôi
Đĩa 35 mm
Miếng Lammel
Mảnh da (2-3mm
2
)
Miếng Lammel
Mảnh da (2-3mm

2
)
NUÔI CẤY
MẢNH MÔ SƠ
CẤP
(mảnh mô ung
thư vú)
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy mảnh mô
Nuôi cấy tế bào đơn
Nuôi cấy tế bào đơn
o
Là việc nuôi cấy các tế bào đơn được tách ra từ mảnh mô. Trong quá
trình nuôi, từng mỗi tế bào sẽ phát triển tăng sinh thành nhiều tế bào mới
o
Có 2 phương pháp tách tế bào:
─
Tách bằng hóa học (enzyme)
─
Tách bằng cơ học
Nuôi cấy tế bào đơn
Nuôi cấy tế bào đơn
Phân tách tế bào
Nuôi cấy
Tăng sinhHợp dòng
Thu nhận mô/cơ quan
Nuôi cấy tế bào đơn

Nuôi cấy tế bào đơn
NUÔI CẤY SƠ CẤP TẾ BÀO ĐƠN
(thu từ máu cuống rốn)
Sự liên kết tế bào
Sự liên kết tế bào
Những nhóm protein chính tham gia liên kết tế bào
Những nhóm protein chính tham gia liên kết tế bào
-
CAM, cadherin
-
Integrin (arginine–glycine–asparticacid)
-
Proteoglycan
Phân tách tế bào đơn
Phân tách tế bào đơn
Tách tế bào đơn
Tách tế bào đơn
Tách cơ học
Tách cơ học
Tách hóa học
Tách hóa học
- Phương pháp cắt nhuyễn
- Phương pháp cắt nhuyễn
- Phương pháp ép nhuyễn
- Phương pháp ép nhuyễn
- Phương pháp lọc bằng màng lọc
- Phương pháp lọc bằng màng lọc
- Trypsin ấm, lạnh
- Trypsin ấm, lạnh
- Collagenase

- Collagenase
Phân tách tế bào bằng enzyme
Phân tách tế bào bằng enzyme
Enzyme Nồng độ Protein mục tiêu chính
Trypsin/EDTA
0.1 - 0.5% (0.25%)
0.5 - 1mM EDTA
Collagenase 50 - 200 U/ml Collagen
Dispase 0.6 - 2.4 U/ml Fibronectin , collagen IV, collagen I
Elastase Elastin
Hyaluronidase Hyaluronic acid
Pronase
Trypsin +
Collagenase
0.1 - 0.5% (0.25%)
50 - 200 U/ml

Phân tách tế bào bằng trypsin ấm
Phân tách tế bào bằng trypsin ấm
Thu nhận mô
Cắt mô thành những mảnh
nhỏ
Rửa các mảnh mô
Bổ sung trypsin,
khuấy liên tục ở
37oC, 30ph
Thu dịch huyền phù, ly tâm thu cặn tế
bào
Huyền phù cặn trong môi trường, ủ trong
đá

Đếm tế bào
Nuôi cấy tế bào
Tách tiếp mô
còn sót
Phân tách tế bào bằng trypsin lạnh
Phân tách tế bào bằng trypsin lạnh
Thu nhận mô
Cắt mô thành những mảnh
nhỏ
Rửa các mảnh mô
Bổ sung trypsin, ủ ở 4oC, qua
đêm
Loại bỏ trypsin
Huyền phù mô trong môi trường
Đếm tế bào
Nuôi cấy tế bào
Trypsin lạnh vs Trypsin ấm
Trypsin lạnh vs Trypsin ấm
Trypsin ấm
- Thời gian ngắn (0.5 – 4h)
- Hoạt tính cao
- Tỉ lệ tế bào sống không cao, cần thu nhận tế bào mỗi 0.5h;
- Hoạt động tốt đối với mô non (thai chuột hoặc gà); không tốt trên mô trưởng thành
Trypsin lạnh
- Thời gian dài (6 – 18h)
- Hoạt tính thấp
- Thu được lượng lớn tế bào; tế bào có tỉ lệ sống cao
- Được sử dụng với nhiều loại tế bào
- Tiện lợi khi sử dụng
Phân tách tế bào bằng collagenase

Phân tách tế bào bằng collagenase
Thu nhận mô
Cắt nhỏ Rửa các mảnh mô
Ủ với collagenase
Dùng pipette huyền phù
đều
Để lắng
Thu dịch huyền phù, ly tâm, thu cặn tế
bào, nuôi cấy
Thu các mảnh mô còn sót, rửa, nuôi
cấy mảnh mô