PHƯƠNG PHÁP WESTERN BLOT & ELISA

WESTERN BLOT & ELISA
I.Giới thiệu
1. Western blot

Dùng để phát hiện 1 protein
chuyên biệt trong một hỗn
hợp phức tạp nhiều
protein(mô,dịch chiết mô)

Western blot được phát triển
bởi George Stark. Công nghệ
này dùng kháng thể để xác
định vị trí của Protein .
NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP
Chuẩn bị mẫu
(Sample preparation)
Điện di
(Electrophoresis)
Gel SDS–Polyacryamide
(SDS-PAGE)
Qúa trình phân tách protein
Chuyển protein
lên màng
(Transfer of protein )
Mục đích
PVDF, nitrocellulose.
Các phương pháp
Khoá màng
(Blocking membrane)
Nhuộm màng kiểm tra protein
Mục đích

Phương pháp
Phát hiện
(detected)
Phương pháp
Phân tích
Sample preparation ( Chuẩn bị mẫu)
grind the
tissue with
liquid
nitrogen
Centrifuge tube
VOATEX
RIPA Lysis
Buffer
Protease &
phosphatase
4
0
C
ultra speed
centraifuge
tube
collect the
supernatant
LY TÂM
Mẫu chứa
protein
4
0
C

RIPA Lysis Buffer: Lysates tế bào

Tris-HCl pH 7.4 50mM

NaCl 150mM

EDTA 1mM

Triton X-100 1%

SDS(sodium dodecyl sunfate) 0.1%

Sodium deoxycholate 1%

PMSF(phenylmethanesulfonylfluoride hoặc
phenylmethylsulfonyl fluoride) : chất ức chế serine
protease 1mM

SDS có điện tích âm rất lớn ,liên kết với mạch
polypeptide, SDS bao lấy protein có thể làm bất cứ
phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện
trường từ cực âm(-) sang cực dương(+).

protease và phosphatase :chất ức chế, ngăn chặn
sự tiêu hóa của mẫu bởi các enzyme của chính
mẫu.

Chuẩn bị mô thường được thực hiện ở nhiệt độ
lạnh để tránh biến tính protein và suy thoái,bảo vệ
mẫu.


Kết hợp voatex,ly tâm Nhanh chóng giúp ly giải
tế bào và hòa tan protein.
Video về bước chuẩn bị mẫu và SDS-Tác nhân làm biến tính protein
Electrophoresis ( Điện di )

Điện di để phân tách protein trong mẫu. Sự phân
tách này dựa trên điểm đẳng điện (isoelectric
point - pI), khối lượng phân tử, điện tích, hoặc
phối hợp các yếu tố trên. Đặc điểm của quá trình
phân tách phụ thuộc vào cách xử lý mẫu và đặc
điểm của bản gel.

Cho tới nay, phương pháp điện di sử dụng phổ
biến nhất là gel polyacrylamide và đệm tải là
sodium dodecyl sulfate (SDS )
Electrophoresis ( Điện di )

SDS –PAGE (SDS polyacrylamide gel
electrophoresis) giữ polypeptide ở trạng thái biến
tính sau khi chúng đã bị xử lý với chất khử mạnh
và mất đi cấu trúc bậc 2 bậc 3 (thí dụ, cầu
disulfide) và phân tách protein dựa trên khối
lượng phân tử.

Protein trong mẫu mang điện tích âm SDS và dịch
chuyển tới cực dương qua mạng acrylamide bản
gel

Electrophoresis(điện di)

Cực âm (-)
Cực
dương (+)
Protein
- Protein nhỏ di chuyển
nhanh hơn và do đó chúng
được phân tách theo khối
lượng (thường sử dụng
đơn vị kilo, kDa).
- Nồng độ acrylamide xác
định khả năng phân tách
(độ phân giải) của bản gel
nồng độ càng cao thì
phân tách càng tốt protein
có khối lượng phân tử nhỏ.
Protein chỉ di chuyển theo
một hướng dọc theo bản
gel.
Các giếng
Gel SDS–Polyacryamide (SDS-PAGE)
* Resolving gel:

ddH
2
O 35.85mL

1.5M tris-HCl pH8.8 18.9mL

40% Acrylamide Mix 18.75mL


10% SDS 0.75 mL

TEMED 0.03mL

10% APS 0.75mL

75mL
Stacking gel:

ddH
2
O 18.22mL

1.0M tris-HCl 3.15mL

40% Acrylamide 3.13mL

10% SDS 0.25mL

TEMED 0.025mL

10% APS 0.25mL

25mL
nhỏ gel chứa mẫu
vào các rãnh(giếng)
một hay 2 giếng
cho thang (marker
hay ladder), là sản
phẩm thương mại

chứa các protein
với khối lượng
phân tử xác định,
được nhuộm để
tạo ra băng màu
và nhìn thấy được
Tiến hành
điện di
Video sds-page và điện di
*Điện di một chiều:

Mẫu được tải lên giếng.

Đặt hiệu điện thế lên gel.

Các protein dịch chuyển
với tốc độ khác nhau.

Tạo thành các vạch khác
nhau trên gel.
*Cũng có thể sử dụng gel 2
chiều (two-dimensional (2-D)
gel)
*Để kháng thể có thể phát hiện được
protein thì:
Protein cần được chuyển từ bên trong gel
lên màng nitrocellulose hoặc
polyvinylidene difluoride (PVDF).
*Có 2 phương pháp để thực hiện:
+Phương pháp thấm (Blotting): dùng

phương pháp mao dẫn để dẫn protein lên
màn.
+Phương pháp electroblot: dùng dòng điện
để kéo các protein lên màng PVDF hoặc
nitrocellulose.
Transfer of proteins ( chuyển protein)

Phương pháp thấm:Đặt màng lên mặt bản gel rồi
đặt một tấm giấy lọc tiếp lên trên. Đặt cả bộ trong
dịch đệm, dịch đệm có thể thấm lên giấy lọc bằng
lực mao dẫn, và mang theo cả protein.

phương pháp electroblot : sử dụng dòng điện để
kéo protein từ gel lên màng PVDF hay
nitrocellulose. Protein di chuyển từ gel lên màng
và vẫn duy trì sự sắp xếp như trên bản gel. Kết
quả của quá trình lai thấm này là protein được
phơi ra trên lớp mỏng để thực hiện xác định và
phát hiện.

Màng nitrocellulose rẻ hơn màng PVDF, nhưng dễ
vỡ và không bền.
Video transfer proten
Blocking membrane (khóa màng)
Nhuộm màng với Coomassie hay Ponceau S. Thường
sử dụng Ponceau S hơn bởi nó có độ nhạy cao và tính
tan trong nước làm cho dễ rửa chất nhuộm
Blocking membrane (khóa màng)


Bởi màng có khả năng liên kết kháng thể và
protein đích ,cần thực hiện các bước để ngăn chặn
liên kết giữa màng và kháng thể sử dụng để xác
định protein đích.

Khóa các liên kết không đặc hiệu bằng cách đặt
màng vào dung dịch protein loãng – điển hình là
albumin huyết tương bò (Bovine serum
albumin (BSA)) hay sữa bột không béo (đều có giá
thành thấp) với phần nhỏ chất tẩy như Tween 20.

Protein trong dung dịch loãng sẽ gắn với màng ở
tất cả các vị trí mà protein đích chưa bám vào. Do
đó, khi bổ sung kháng thể, sẽ không còn chỗ trên
màng để nó bám vào ngoại trừ các vị trí liên kết
đặc hiệu với protein đích.

Điều này giảm “nhiễu” trong sản phẩm cuối của
Western blot, cho kết quả rõ ràng và loại trừ
dương tính giả.
Video bước khoá màng
Detected (phát hiện)

Kháng thể sơ cấp:ủ dịch loãng kháng thể sơ cấp
(thường sử dụng nồng độ 0.5 and 5
micrograms/ml) với màng và có lắc nhẹ. Tiêu biểu
là dung dịch này gồm dịch muối đệm với lượng
nhỏ chất tẩy và đôi khi có sữa bột hay BSA. Có thể
giữ dịch kháng thể và màng và ủ cùng một nơi
trong thời gian 30phút tới qua đêm. Cũng có thể ủ

ở nhiệt độ khác, nhiệt độ càng cao càng kích thích
liên kết, cả liên kết đặc hiệu (protein đích) và
không đặc hiệu.
Detected (phát hiện)

Sau khi rửa màng để loại bỏ kháng thể sơ cấp
chưa liên kết, tiếp tục gắn kháng thể thứ hai, bám
trực tiếp vào phần đặc hiệu theo loài của kháng
thể sơ cấp.

Kháng thể thứ cấp có khả năng liên kết với
enzyme thông báo. Enzyme này tác dụng với cơ
chất tương ứng tạo phản ứng màu.Do đó phát hiện
được protein quan tâm.

Cũng thường liên kết kháng thể thứ cấp với biotin
hay một enzyme như alkaline
phosphatase hay horseradish peroxidase.
CƠ CHẾ

Phổ biến nhất là sử dụng kháng thể
gắn horseradish peroxidase trong liên kết với chất
huỳnh quang hóa học, và sản phẩm phản ứng phát
ra huỳnh quang tỉ lệ với lượng protein. Có thể thu
được hình ảnh này trên film ảnh.
Như với quy trình ELISA, cơ chất phản ứng với
enzyme tạo màu nhìn trên màng(sẽ giới thiệu ở
phần sau).

Phương pháp phát hiện bằng 1 bước:sử dụng

kháng thể thăm dò có khả năng nhận ra các
protein quan tâm và chứa một nhãn phát hiện.