Tái bản, sữa chữa DNA docx

Bài 7: Tái bản DNA và sửa chữa DNA
1. Ch ng minh DNA ứ tái bản theo kiểu bán
bảo tồn
2. Các đặc tính và yếu tố thiết yếu của sự tái bản
3. Cơ chế của sự tái bản
4. Sự tái bản ở tế bào chân hạch
5-Sửa chữa DNA
•
Nguyên phân (tạo 2 tế bào
con) & giảm phân (tạo 4 tế
bào con) đều cần sự nhân đôi
nhiễm sắc thể → cần nhân
đôi DNA (tái bản)
•
1. Chứng minh DNA tái bản theo kiểu bán bảo tồn
Thí nghiệm của Meselson & Stahl
* Thí nghiệm sơ khởi:
- Ống nghiệm 1: Ly tâm siêu tốc DD CsCl (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 gradien tỷ trọng (tỷ trọng
tăng dần về hướng đáy ống nghiệm).
- Ống nghiệm 2: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ
trọng nặng nằm gần đáy ống nghiệm.
- Ống nghiệm 3: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 14N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được 1 lớp cĩ tỷ
trọng nhẹ nằm giữa ống nghiệm.
- Ống nghiệm 4: Ly tâm siêu tốc DD CsCl với DNA 15N và DNA 14N (40.000 v/p trong 48 giờ) → tạo được
2 lớp tương ứng với 2 lớp trong ống nghiệm 1&2
•
Kỹ thuật ly tâm theo Gradien mật độ:
•
Mật độ hay tỷ trọng là khối lượng hay số hạt của 1 chất trong 1đơn vị thể tích (gr/cm3).
Tỷ trọng là số đo độ chặt của các chất.
•

DD CsCl ly tâm siêu tốc, các ion Cesium hướng về đáy ống ( tạo 1 Gradien mật độ hay
thang tỷ trọng - ion Cesium nhiều ở đáy ON).
•
Mỗi DNA lắng thành 1 lớp tương ứng theo tỷ trọng của nó (DNA 15N ở dưới và DNA
14N ở trên)
* Thí nghiệm của Meselson & Stahl
Nuôi VK E.coli trong MT chứa 15N là nguồn đạm duy nhất, sau 1 thời gian trích
DNA nghiên cứu. Chuyển VK E.coli sang MT chứa 14N là nguồn đạm duy nhất để đủ 1
lần phân chia tế bào, trích DNA nghiên cứu. Tương tự nuôi tiếp E.coli trong MT chứa
14N để đủ 2,3 lần phân chia tế bào, trích DNA nghiên cứu. Ghi nhận và giải thích kết
quả.
Trong MT chứa 15N, DNA của E.coli chứa 15N lắng thành 1 lớp như ống
nghiệm 1. Chuyển sang MT chứa 14N, ở lần phân bào thứ 1 có duy nhất 1 lớp DNA lai
(1 mạch 15N và 1 mạch 14N ) - ở lần phân bào thứ 2 có 2 lớp gồm: 1 lớp DNA lai (50%)
và 1 lớp DNA 14N (50%) - ở lần phân bào thứ 3 cũng có 2 lớp gồm: 1 lớp DNA lai
(25%) và 1 lớp DNA 14N (75%). Kết luận DNA tự nhân đôi theo kiểu bán bảo toàn.
•
2. Các đặc tính và yếu tố thiết yếu của sự tái bản
•
Các đặc tính
∀
• Theo cơ chế bán bảo toàn
∀
• Phát triển theo hai hướng từ OriC
∀
• Sự gắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, theo cách đối song (với sợi cha-mẹ) và bắt cặp bổ
sung
∀
• Không liên tục trên một trong hai sợi
Cơ chế bán bảo toàn

Cơ chế bán bảo toàn
DNA con cĩ mang 1 mạch đơn của cha-mẹ và 1 mạch đơn mới cĩ các nucleotide
lấy từ mơi trường (TN chứng minh của Meselson & Stahl). Như vậy DNA con cĩ mang 1
mạch cũ và 1mạch mới (bán bảo tồn).

Phát triển theo hai hướng từ OriC
Gắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, đối song
•
Phát triển theo hai hướng từ OriC
Điểm khởi đầu của sự tái bản là OriC
* Ở SV Procaryote: DNA 2 sợi vịng cĩ 1 điểm khởi đầu cố định là OriC (đánh dấu trên pt DNA
của vi khuẩn E.coli bằng 1 đoạn DNA của virus µ). Đơn vị sao chép gọi là Replicon, VK cĩ 1
Replicon
* Ở SV Eucaryote: DNA 2 sợi thẳng cĩ nhiều điểm khởi đầu. SV Eucaryote cĩ nhiều Replicon. TD
ở Người cĩ 20- 30.000 điểm khởi đầu và mỗi Replicon khoảng 100-200kb
Bắt cặp bổ sung
Các base của 2 mạch đối diện
bắt cặp theo nguyên tắc bổ
sung A với T(2 cầu nối
Hydrogen) và C với G T(3 cầu
nối Hydrogen)
•
*Sự gắn nucleotide theo hướng 5’→ 3’, theo cách đối song (với sợi cha-mẹ):
•
Ở mạch mới sự kéo dài chuỗi theo hướng 5’→ 3’ (dọc theo hướng 3’→ 5’ của sợi
khuôn)
•
Sợi khuôn 3’ 5’
•

Mạch mới 5’ 3’
•
Sợi khuôn 3’ATTGCACT………… 5’
•
Mạch mới 5’ TAACGT… 3’
•
Không liên tục trên một trong hai sợi
•
Không liên tục trên một trong hai sợi
•
* Ở một trong 2 mạch sự tái bản từng đoạn nhỏ (Khoảng 1968-1972, Okazaki & csv
phát hiện - gọi là đoạn Okazaki (cĩ kích thước 1000 - 2000 pb)
* DNA Ligase nối các đoạn Okazaki
•
Các yếu tố thiết yếu
•
(1) Các nucleoside triphosphate: dATP, dTTP, dCTP và dGTP (nguyên liệu cho sự tái
bản & nhiên liệu cung cấp năng lượng).
•
(2) Sợi khuôn (sợi đơn cha-mẹ): sợi sẽ được giữ trong phân tử DNA mới (bán bảo toàn).
•
(3) Mồi RNA (do DNA Primase tạo): là 1 đoạn RNA gồm 4-12 nucleotide, giúp DNA pol
III kéo dài chuỗi polynucleotide
•
(4) Các enzyme và protein, bao gồm:
• Helicase: enzyme mở xoắn
• DNA Gyrase: cản sự xoắn trở lại
• DNA Primase: tạo đoạn mồi RNA
•

DNA pol III kéo dài sợi DNA đang tăng trưởng
•
DNA pol I loại đoạn mồi RNA và tổng hợp đoạn DNA thay đoạn mồi .
•
DNA ligase tạo cầu nối phosphodiester giữa hai đoạn Okazaki cạnh nhau
• SSB Protein giữ sợi DNA thẳng (các sợi khơng tái bắt cặp)
•
Các đặc tính của các DNA polymerase
∀
• Gắn nucleotide vào 3’OH của mồi và 3’OH của sợi đang tăng trưởng
∀
• Kéo dài chuỗi theo hướng 5’→ 3’ (dọc theo hướng 3’→ 5’ của sợi khuôn)
∀
• DNA polymerase III kéo dài chuỗi DNA theo hướng 5’→ 3’
∀
• DNA pol I cĩ 2 vai trị:
•
*loại mồi (đĩng vai trị của 1 Exonuclease 5’→ 3’)
•
* thay thế mồi bởi DNA ( đĩng vai trị của 1 DNA polymerase theo hướng 5’→ 3’)
* Tổng hợp DNA in vitro:
1956 Kornberg tổng hợp DNA in vitro nhờ ly trích được 1 enzyme DNA polymerase
trong E.coli . Enzyme này tổng hợp DNA in vitro khi có: DNA khuôn, 4 loại Nucleotide,
đoạn mồi RNA, Mg2+ ( sau này còn gọi tên là DNA Kornberg hay DNA polymerase I).
Sau nay người ta biết E.coli có 3 DNA polymerase I, II, III (nay là 5)
Tóm tắt quá trình tự tái bản DNA:
DNA 2 sợi mở xoắn (Helicase)→ tạo đoạn mồi (DNA primase) → tổng hợp sợi

mới từ đầu 3’ OH của mồi (DNA polymeraseIII) dựa vào sợi khuôn 3’ → 5’ → loại
đoạn mồi (DNA polymerase I- Exonuclease 5’→ 3’ ) → tổng hợp đoạn DNA thay đoạn
mồi (DNA polymerase theo chiều 5’→ 3’ ). Ở các sợi bất liên tục DNA Ligase nối các
đoạn Okazaki lại với nhau.