Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans

25
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ
LIÊN QUAN ĐẾN NỘI DUNG LUẬN ÁN

1) Nguyễn Quang Huy, Phạm Thanh Nga, Phan Tuấn Nghĩa, 2005. Tìm hiểu
tác dụng chống sâu răng của dịch chiết vỏ cây Sao Đen (Hopea odorata
Roxb). Tạp chí Dược học 45 (350): 13-19.
2) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2005.
Inhibition of acid production by Streptococcus mutans of some medicinal
plant extracts. Tạp chí Khoa học 21(2): 161-168.
3) Nguyen Quang Huy, Pham Anh Thuy Duong, Phan Tuan Nghia, 2006,
Antibacterial activity of some medicinal plants against dental caries
pathogen Streptococcus mutans. The first international conference on
science and technology for sustainable development of the greater Mekong
Sub-region, Khon Kaen, Thailand p. 10
4) Nguyen Quang Huy, Phung Thi Thu Huong, Pham Anh Thuy Duong, Phan
Tuan Nghia, 2006. Inhibitory effects of Syzygium resinogsum Gagnep
extracts on caries-inducing properties of Streptococcus mutans. Tạp chí
Khoa học 22 (4): 131-136.
5) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn
Kiệm, 2007. Các oligostilben từ vỏ cây sao đen Hopea odorata Roxb. Tạp
chí Dược học 47 (372):37-39.
6) Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa, Nguyễn Văn Quang, Phan Văn
Kiệm, 2007. Axít asiatic từ cây sắn thuyền Syzygium resinosum Gagnep và
tác dụng của nó lên vi khuẩn Streptococcus mutans. Tạp chí Dược học 47
(375):19-22.
7) Nguyễn Quang Huy, Phùng Thị Thu Hường, Phan Tuấn Nghĩa, 2007. Phân
lập và nhận dạng một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ người Việt
Nam. Tạp chí Công nghệ Sinh học 5(3): 291-297.

8) Đỗ Thị Huê, Bùi Thanh Duyên, Nguyễn Quang Huy, Phan Tuấn Nghĩa,
2008.Tác dụng của acid asiatic từ cây Sắn thuyền lên vi khuẩn Streptococcus
mutans H2 phân lập từ người Việt Nam. Hội nghị toàn quốc Hóa sinh và
Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Y học và Công nghệ thực phẩm 15-
17/10-2008 trang 56-59.


26

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN




NGUYỄN QUANG HUY




NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ CHẤT THỨ CẤP TỪ
THỰC VẬT LÊN VI KHUẨN GÂY SÂU RĂNG Streptococus mutans


Chuyên ngành: HOÁ SINH HỌC
Mã số: 62.42.30.15



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

Hà Nội, 2009


27
Công trình này được hoàn thành tại:

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội

Người hướng dẫn khoa học
1. PGS.TS. Phan Tuấn Nghĩa
2. TS. Dương Văn Hợp

Phản biện
1.
2.
3.
Luận án sẽ được bảo vệ trước hội đồng cấp nhà nước chấm luận án tiến sĩ họp tại
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Hà Nội.

Vào hồi giờ ngày tháng năm 2009

Có thể tìm luận án tại

Thư viện Quốc gia Việt Nam
Trung tâm thông tin- Thư viện Đại học Quốc gia Hà Nội


1
MỞ ĐẦU

Sâu răng là một trong số các bệnh răng miệng phổ biến nhất hiện nay và
đang có xu hướng tăng lên đặc biệt ở các nước đang phát triển. Sự gia tăng của
căn bệnh này là do những thay đổi trong lối sống, thói quen sinh hoạt, chế độ ăn
uống hàng ngày và tuổi thọ trung bình. Theo số liệu điều tra gần đây của Viện
Răng Hàm Mặt Trung ương, khoảng 90% dân số Việt Nam mắc các bệnh về
răng, miệng, trong đó phổ biến nhất là sâu răng và viêm quanh răng. Bệnh sâu
răng không chỉ gây ảnh hưởng tới tình trạng sức khoẻ của người bệnh mà còn
gây ra nhiều chi phí tốn kém trong chữa trị.Tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO) đã
xếp sâu răng là một trong số các căn bệnh nguy hiểm của loài người. Nhiều
chương trình nghiên cứu cũng như khuyến cáo nhằm mục đích ngăn ngừa và
phòng chống bệnh này đã được WHO thực hiện trong những năm qua. Mặc dù tỷ
lệ sâu răng trong cộng đồng dân cư đã giảm đi đáng kể nhưng vẫn còn duy trì ở
mức cao và đòi hỏi phải có những biện pháp dự phòng tốt hơn nữa để đạt mục
tiêu mà WHO đưa ra.
Cách tốt nhất để hạn chế bệnh sâu răng là vệ sinh răng, miệng thường xuyên
và đúng cách cùng với việc hạn chế dùng các thức ăn, đồ uống có nhiều đường.
Tuy vậy, phương pháp vệ sinh răng miệng, thói quen ăn uống không phải lúc nào
cũng thực hiện được, vì vậy việc sử dụng các chất có khả năng kháng khuẩn như
fluo, axit yếu, muối kim loại là một biện pháp để phòng chống sâu răng. Trong
số các chất kháng khuẩn được sử dụng thì fluo là chất có hiệu quả hơn cả.Tuy
nhiên, việc sử dụng fluo lâu dài hay với nồng độ cao có thể dẫn đến chứng nhiễm
fluo (fluorosis) làm men răng ố vàng và trở nên sần sùi (Hamilton, 1990; Aeba,
2002). Chính vì những lý do đó mà xu hướng hiện nay là tìm kiếm các hợp chất

mới, có thể thay thế một phần fluo mà vẫn có hiệu quả chống sâu răng cao. Hiện
nay, việc tìm kiếm các hợp chất thiên nhiên có tác dụng bảo vệ răng miệng đang
là xu hướng được quan tâm nghiên cứu và có nhiều ứng dụng trong thực tiễn.
Việt Nam có hệ thực vật vô cùng phong phú và đa dạng, trong đó rất nhiều
loài có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học cao. Từ ngàn xưa, cộng đồng các
dân tộc trên đất nước ta đã có truyền thống sử dụng cây cỏ để chữa bệnh, bảo vệ
sức khỏe chống lại bệnh tật trong đó có bệnh sâu răng (Đỗ Huy Bích và tập thể,


2

2004; Đỗ Tất Lợi, 2001; Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001). Tuy nhiên, đến nay việc
tìm kiếm các hợp chất mới chưa mang lại nhiều kết quả như mong muốn. Hơn
nữa, các nghiên cứu sâu về cơ chế tác dụng của các hợp chất thứ cấp từ thực vật
lên vi khuẩn sâu răng hiện vẫn còn thiếu.
Đề tài: “Nghiên cứu tác dụng của một số chất thứ cấp từ thực vật lên vi
khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans” của chúng tôi nằm trong xu thế
nghiên cứu chung của thế giới và Việt Nam.Việc tiến hành đề tài này là cần thiết
và có ý nghĩa thực tiễn, đáp ứng nhu cầu nâng cao hiệu quả phòng chống các
bệnh về răng, miệng đặc biệt là bệnh sâu răng.
Mục tiêu: Mục tiêu nghiên cứu của đề tài là điều tra tác dụng chống sâu răng
của dịch chiết một số loài thực vật ở Việt Nam thông qua việc nghiên cứu ảnh
hưởng của chúng lên các quá trình sinh lý, hoá sinh, một số enzyme và hệ
enzyme có liên quan của vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans, từ đó
nghiên cứu cách tách chiết, tinh sạch một vài hợp chất thứ cấp từ thực vật và đi
sâu tìm hiểu tác dụng chống sâu răng của chúng.
Nội dung nghiên cứu
• Nghiên cứu điều tra ảnh hưởng một số dịch chiết thực vật lên quá trình
sinh axit gây sâu răng của Streptococcus mutans và tác dụng giết chết vi
khuẩn này của các dịch chiết.

• Tách chiết, tinh sạch, xác định cấu trúc và nghiên cứu tác dụng của một số
chất thứ cấp từ thực vật từ các loài được điều tra lên các quá trình sinh lý,
hoá sinh của vi khuẩn S. mutans cũng như một số enzyme và phức hệ
enzyme đích, liên quan đến tính chất gây sâu răng của vi khuẩn này.
• Phân lập một số chủng vi khuẩn Streptococcus mutans từ bệnh phẩm của
người Việt Nam bị sâu răng và bước đầu nghiên cứu tác dụng của một số
chất thứ cấp từ thực vật thu được lên một số quá trình sinh lý, hoá sinh
cũng như một số enzyme và phức hệ enzyme liên quan của chủng vi
khuẩn Streptococcus mutans phân lập được.
Ứng dụng thực tiễn của đề tài
Các kết quả nghiên cứu của đề tài góp phần cung cấp các dẫn liệu về khả
năng kháng khuẩn sâu răng của một số dịch chiết thực vật, hợp chất tinh sạch từ
lá Sắn thuyền và vỏ Sao đen có ở Việt Nam góp phần ứng dụng hiệu quả hơn
trong việc bảo vệ răng, miệng.


3
Đóng góp mới của đề tài
• Đây là công trình nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có tác dụng chống
sâu răng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, phát triển của vi khuẩn gây sâu
răng Streptococcus mutans GS-5.
• Đây là công trình nghiên cứu có tính hệ thống về tác dụng của dịch chiết
vỏ cây Sao đen và lá cây Sắn thuyền lên vi khuẩn gây sâu răng S. mutans
GS-5.
• Đây là công trình đầu tiên công bố về việc tách chiết, tinh sạch, xác định
công thức hoá học và tác dụng chống sâu răng của hợp chất hopea phenol,
malibatol A từ vỏ Sao đen và axit asiatic từ lá Sắn thuyền thông qua việc
đánh giá tác dụng của chúng lên sự sinh axit, khả năng giết vi khuẩn và tác
dụng của chúng lên hoạt độ một số enzyme đích trong việc sinh và chịu
axit của vi khuẩn S. mutans GS-5.

• Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu phân lập và nhận dạng đến loài một
số chủng vi khuẩn S. mutans từ người Việt Nam.
Bố cục của luận án:
Luận án gồm 136 trang, 10 bảng số liệu, 47 hình, 209 tài liệu tham khảo
tiếng Việt và tiếng Anh. Bố cục luận án gồm: mở đầu (3 trang), tổng quan tài
liệu (36 trang), nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu (14 trang), kết quả
nghiên cứu và bàn luận (59 trang), kết luận và kiến nghị (2 trang), tài liệu tham
khảo (21 trang) và phần phụ lục.

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh sâu răng và các yếu tố liên quan
Sâu răng là bệnh gây ra bởi vi khuẩn trên mảng bám răng, điển hình là
Streptococcus mutans. Những vi khuẩn này sử dụng các carbohydrate, chủ yếu là
đường glucose để lên men tạo ra axit lactic. S. mutans có thể tồn tại và sinh
trưởng trong môi trường pH thấp, có thể duy trì hoạt động trao đổi chất mạnh và
tạo ra axit. Axit hình thành sẽ gây ra sự hòa tan các khoáng chất có trong men
răng vốn được cấu tạo bởi hydroxylapatide liên kết với ion canxi tích điện dương


4

và ion phosphate tích điện âm, dẫn đến làm mòn men răng, tạo thành các hố trên
răng và gây ra sâu răng (Gibbons và Van, 1975; Nguyễn Dương Hồng, 1997).
Mặt khác, trên răng các vi khuẩn trong khoang miệng và sản phẩm của
chúng cùng với những mảnh vụn thức ăn tạo thành mảng bám răng. Mảng bám
răng không chỉ là nguyên nhân gây ra sâu răng mà còn là một yếu tố chủ yếu gây
bệnh nha chu (Kolenbrander, 2000).
Bệnh sâu răng là một trong 3 bệnh được tổ chức Sức khỏe thế giới (WHO)
khuyến cáo về mức độ nguy hiểm chỉ đứng sau bệnh tim mạch và ung thư. Trong
các thập niên trước, tỷ lệ người mắc bệnh sâu răng khá cao đặc biệt ở trẻ em.

Trung bình mỗi trẻ em dưới 12 tuổi có từ 8 đến 10 răng sâu hoặc răng đã bị mất
do sâu. Tới năm 1997, số người mắc bệnh sâu răng ở lứa tuổi trung niên từ 35
đến 44 tuổi tại các nước công nghiệp phát triển vẫn còn ở mức rất cao, chỉ số
DMFT (phản ánh số răng sâu, số răng mất hay trám răng do sâu) ở Canada, Nhật
Bản, Úc và các nước Bắc Âu là 13,9, ở Mỹ là hơn 9 (Trịnh Đình Hải, 2004).
Hiện nay số bệnh nhân mắc bệnh sâu răng còn cao là do mức sống ngày càng cải
thiện, nhiều loại bánh kẹo và sản phẩm có đường được sử dụng.
Tại Việt Nam, theo số liệu thống kê của Nguyễn Dương Hồng năm 1977 ở
Hà Nội cho thấy có tới 77% trẻ em 6 tuổi có sâu răng, tỷ lệ này ở thanh niên là
48%. Đến năm 1990 theo Võ Thế Quang và tập thể, tỷ lệ sâu răng ở lứa tuổi 12
là 57%, tỷ lệ viêm lợi và viêm quanh răng là 95% và ở lứa tuổi từ 35 đến 44 thì
tỷ lệ này cao tới 99,26%. Theo kết quả điều tra sức khoẻ răng miệng toàn quốc
lần thứ 2 năm 2001 thì chỉ số DMFT (phản ánh số răng sâu, số răng mất hay
trám răng do sâu) của nhóm tuổi 18-34 là 3,64 và chỉ số này tăng theo độ tuổi, cụ
thể độ tuổi từ 34-44 và trên 45 tương ứng là 5,06 và 8,26. Đối với trẻ em tỷ lệ
sâu răng vĩnh viễn là 54,89% và người lớn tỷ lệ này là 75,2%. Tỷ lệ người có
răng khoẻ mạnh ở Việt Nam chỉ đạt mức dưới 10%.
WHO đã đưa ra mục tiêu cho toàn cầu phấn đấu đến năm 2010 chỉ số DMFT
dưới 1. Tại Việt Nam, mục tiêu phấn đấu đến năm 2010 ở độ tuổi 5-6 có 50% trẻ
em không bị sâu răng, ở độ tuổi 18 có 85% người giữ được toàn bộ răng, ở tuổi
từ 35-44 tuổi giảm 50% số người không còn răng và trên 65 tuổi giảm 25% số
người không còn răng.


5
1.2. Vi khuẩn S. mutans và khả năng gây sâu răng
Những vi khuẩn có khả năng lên men đường thành axit lactic tồn tại trong
khoang miệng được xem là nguyên nhân gây sâu răng. Chúng chủ yếu thuộc 3
nhóm vi sinh vật: Streptococcus, Lactobacillus và Actinomyces. Trong số những
vi khuẩn này, S. mutans được coi là nguyên nhân chính gây bệnh sâu răng do vi

khuẩn này luôn được phát hiện trong nước bọt, mảng bám răng của người và có
số lượng rất cao ở những vùng răng bị sâu. Đặc trưng gây sâu răng của S. mutans
chính là khả năng sinh axit mạnh và chịu axit tốt của vi khuẩn này, cho nên trong
môi trường có đường, S. mutans tạo ra axit làm tan men răng dẫn đến sâu răng.
Khả năng thích nghi hay chịu axit của S. mutans liên quan đến nhiều cơ chế
khác nhau, quan trọng nhất là hoạt động của các bơm proton, đặc biệt là F-
ATPase, nhằm bơm proton ra ngoài, duy trì pH nội sinh (pHi) luôn cao hơn so
với pH môi trường. F-ATPase của S. mutans được phát hiện là có sự thay đổi
trong cấu trúc để thích nghi hoạt động tốt ở pH thấp (Sturr và Marquis, 1992).
Ngoài ra, S. mutans còn có một số cơ chế thích nghi axit khác như: tăng cường
tổng hợp các chaperonin hỗ trợ sự hình thành cấu trúc không gian đúng của các
protein (Jayaraman và tập thể, 1997), tăng cường sinh tổng hợp các enzyme sửa
chữa ADN bị tổn thương do axit (Haln và tập thể, 1999) hay
thay đổi thành phần
lipid của màng tế bào để làm giảm khả năng thấm proton (Quivey và tập thể,
2000) Nhờ vậy, S. mutans vẫn có thể tồn tại và sinh axit khi pH môi trường
giảm xuống dưới 4.
Hơn nữa S. mutans cũng có các đặc điểm để chống chịu các stress về oxy
hóa, để tồn tại và phát triển. Các vi khuẩn đường miệng sinh axit lactic thiếu các
cytochrome, các protein chứa nhân hem và enzyme catalase nhưng vẫn có thể
sinh trưởng trong môi trường có chứa các gốc oxy tự do vì chúng có hệ thống
các enzyme bảo vệ như NADH oxidase, Superoxide dismutase (Higuchi 1992,
1999).
Việc phân lập, phát hiện sự có mặt S. mutans đóng vai trò quan trọng trong
việc chẩn đoán và điều trị bệnh sâu răng. Nhiều kỹ thuật khác nhau đã được
nghiên cứu, áp dụng trong phân lập và nhận dạng các chủng S. mutans ở người.
Gần đây kỹ thuật đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn (RFLP) kết hợp kỹ


6

thuật PCR đã được áp dụng cho phép nhận dạng chính xác và nhanh chóng loài
S. mutans (Sato và tập thể, 2003).
1.3. Các biện pháp chống sâu răng
Việc loại bỏ mảng bám răng bằng cơ học (như đánh răng) có tác dụng
ngăn chặn sự hình thành mảng bám răng và là biện pháp phòng chống sâu răng
đơn giản nhất. Tuy vậy việc thay đổi thói quen ăn uống và duy trì vệ sinh răng
miệng thường xuyên rất khó thực hiện. Do vậy, hàng loạt các biện pháp khác
nhau nhằm ngăn chặn sâu răng đã được nghiên cứu và ứng dụng. Các biện pháp
này chủ yếu dựa trên việc làm giảm số lượng S. mutans trên mảng bám răng,
giảm khả năng sinh axit của S. mutans, hạn chế việc hình thành mảng bám răng,
trám bít các hố rãnh Các biện pháp được sử dụng trong việc chống sâu răng
gồm: sử dụng chất kháng khuẩn tổng hợp; sử dụng vaccine phòng chống sâu
răng; sử dụng các hợp chất tự nhiên, các chất thay thế đường Mỗi phương pháp
đều có ưu và nhược điểm, không có phương pháp nào là hoàn thiện và vì vậy cần
có sự kết hợp của các phương pháp.
Trong số các phương pháp nêu trên thì việc sử dụng các hợp chất tự nhiên
đang được nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Nhiều loài thực vật và hợp
chất tự nhiên có đặc điểm kháng khuẩn sâu răng đã và đang được phát hiện và
nghiên cứu (Chen và tập thể 1989, Matsumoto và tập thể 1999, Xiao và tập thể
2007 ).
1.4. Các chất thứ cấp từ thực vật
Các hợp chất thứ cấp từ thực vật là các sản phẩm của quá trình trao đổi chất
được sinh ra bởi thực vật. Chúng là các chất hoá học được tổng hợp và chuyển
hoá từ các chất trao đổi bậc nhất như axit amin, protein, axit nucleic,
carbohydrate, lipid hoặc từ các sản phẩm trung gian của quá trình đường phân,
chu trình Kreb (Lã Đình Mỡi và tập thể, 2001).
Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học và các thuộc tính lý học của chúng mà các
chất thực vật thứ sinh được phân loại thành 3 nhóm chất chính là nhóm terpene,
nhóm các hợp chất phenolic và nhóm alkaloid

. Tác dụng sinh học của các hợp
chất thực vật thứ sinh rất đa dạng và phong phú. Một số hợp chất thực vật thứ
sinh được khai thác về tác dụng chống oxy hoá, tác dụng kháng khuẩn, chống


7
viêm và thậm chí ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư, HIV (Park và tập
thể, 2006, Dai và tập thể, 1998). Chen và tập thể (1989) đã nghiên cứu tác dụng
của 79 dịch chiết thực vật lên vi khuẩn S. mutans và phát hiện 3 loài M.
australia, L. octovalvis và T. orientalis chứa các hợp chất có tính kháng S.
mutans cao nhất. Nhiều hợp chất nhóm flavonoid trong cây Erythirina variegata,
Ormosia monosperma được phát hiện có tác dụng giết nhiều loài vi khuẩn đường
miệng. Song và tập thể (2007) phát hiện thấy dịch chiết của cây Polygonum
cuspidatum có chứa các hợp chất thuộc nhóm terpenoid, phenolic, glycoside
không những có khả năng ức chế sự phát triển S. mutans mà còn ức chế sự hình
thành mảng bám răng. Vasconcelos và tập thể (2006) phát hiện thấy các hợp chất
từ dịch chiết cây xoài và cây neem có tác dụng ức chế sự phát triển các loài
nhóm Streptococcus như S. salivarius. S. mitis và S. sanguis. Gần đây ở Việt
Nam, Nguyễn Thị Mai Phương và tập thể (2005) đã phát hiện các chất
polyphenol trong vỏ cây măng cụt có tác dụng ức chế các enzyme của quá trình
đường phân của S. mutans. Nhìn chung, các nghiên cứu về hoạt tính kháng
khuẩn sâu răng của các hợp chất thực vật chưa đi sâu về cơ chế tác động của
chúng lên vi khuẩn gây sâu răng.

CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Chủng vi khuẩn S. mutans GS-5, S. sanguis NCTC-10904, S. gordonii
ATCC 10558, S. rattus FA-1 là quà tặng của giáo sư Robert E. Marquis, Đại học
Rochester, New York, Mỹ.
Các mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân bị sâu răng người Việt Nam (để phân lập

vi khuẩn gây sâu răng S. mutans) được lấy từ Khoa Răng Hàm Mặt, Bệnh viện
Bạch Mai, Hà Nội.
Các mẫu thực vật Chàm tía (CTI), Hương nhu trắng (HNT), Kim ngân
(KNG), Quỷ trâm thảo (QCT), Sài đất (SDA) được thu thập từ Vườn Dược liệu
của Đại học Dược Hà Nội. Mẫu lá Sắn thuyền (STA) được thu thập từ vườn
Thuốc Đông y ở Trung Văn, Từ Liêm, Hà Nội. Mẫu vỏ Sao đen (SDE) được thu


8

thập từ tỉnh Đồng Nai. Các mẫu thực vật được định tên bởi TS.Trần Đình Nghĩa,
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Các hóa chất dùng cho nghiên cứu chủ yếu được mua từ hãng Sigma (Mỹ)
có độ tinh sạch dùng cho phân tích.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Nuôi cấy và bảo quản tế bào vi khuẩn trên môi trường chứa tryptone 3%,
cao nấm men 0,5% glucose 1% và môi trường chứa tryptic soy agar.
2.2.2. Phân lập vi khuẩn gây sâu răng S. mutans từ các bệnh nhân sâu răng người
Việt Nam trên môi trường Mitis salivarius kết hợp nuôi cấy ở pH axit.
2.2.3. Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus mutans phân lập từ mẫu bệnh nhân sâu
răng người Việt Nam bằng phân tích hình thái kết hợp các phương pháp PCR-
RFLP.
2.2.4. Nuôi cấy biofilm trên môi trường chứa tryptone, cao nấm men và sucrose.
2.2.5. Xác định mức độ sinh axit của vi khuẩn bằng cách đo độ giảm pH môi
trường trong điều kiện dư thừa glucose.
2.2.6. Xác định độ gây chết vi khuẩn bởi các chất tác dụng thông qua việc đánh
giá số đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) của vi khuẩn còn lại (N) sau các
khoảng thời gian khác nhau so với số CFU ban dầu (No). Khi đó giá trị D là
khoảng thời gian để có giá trị Log N/No = -1 (tương ứng với mức 90% số vi
khuẩn bị giết chết so với ban đầu).

2.2.7. Xác định khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn thông qua việc đếm
số CFU sau các khoảng thời gian khác nhau ở pH thấp.
2.2.8. Xác định mức độ tiêu thụ oxy của tế bào trong điều kiện dư thừa glucose
bằng điện cực oxy.
2.2.9. Xác định hoạt độ một số enzyme chính liên quan đến đặc trưng sinh axit
và chịu axit thông qua sự chuyển hóa của các chất đặc hiệu.
2.2.10. Xác định thành phần một số hợp chất tự nhiên có trong dịch chiết thực
vật bằng các phản ứng đặc trưng.
2.2.11. Xác định cấu trúc hoá học các hợp chất bằng phân tích phổ cộng hưởng
từ hạt nhân (NMR) với sự giúp đỡ của Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên,
Viện Khoa học Việt Nam.



9
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN
3.1. Nghiên cứu sàng lọc một số thực vật có khả năng kháng khuẩn sâu răng
3.1.1. Khả năng ức chế của dịch chiết một số thực vật lên sự sinh axit của S.
mutans
Trong nghiên cứu này chúng tôi đã sử dụng 7 loài thực vật là: Chàm tía
Strobilanthes cusia B. (CTI), Hương nhu trắng Ocimum gratissimum L. (HNT),
Kim ngân Lonicera japonica T. (KNG), Quỷ trâm thảo Bidens pilosa L. (QCT),
Sài đất Verbesina calendulaceae L. (SDA), Sắn thuyền Syzygium resinosum G.
(STA) và Sao đen Hopea odorata R. (SDE). Cả 7 loài này đều là những cây
thuốc có khả năng chống viêm và được ứng dụng trong các bài thuốc dân gian để
chữa các bệnh có liên quan đến răng miệng (Đỗ Tất Lợi, 2001; Đỗ Huy Bích và
tập thể, 2001). Bộ phận được sử dụng để thu dịch chiết là lá, riêng với Sao đen
bộ phận sử dụng là vỏ.
Cơ chế gây bệnh sâu răng của S. mutans là do tác dụng làm mòn men răng
bởi axit được vi khuẩn sinh ra trong quá trình phân giải đường. Do vậy, để xác

định tác dụng chống sâu răng của các dịch chiết thực vật, bước đầu chúng tôi tìm
hiểu ảnh hưởng của chúng tới quá trình sinh axit của S. mutans. Kết quả thu
được (bảng 3.2) cho thấy dịch chiết bằng H
2
O và ethanol của cả 7 loài thực vật
đều có tác dụng ức chế sinh axit của S. mutans GS-5, thể hiện ở giá trị pH cuối
cùng cao hơn mẫu kiểm tra không có dịch chiết. Dịch chiết bằng ethanol có tác
dụng ức chế mạnh hơn, chứng tỏ hoạt chất chính gây ức chế sự sinh axit của S.
mutans hoà tan tốt hơn trong ethanol. Đặc biệt, dịch chiết ethanol của Sao đen
(SDE) và Sắn thuyền (STH) thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit tốt nhất.
Huyền dịch tế bào S. mutans sau khi loại bỏ các dịch chiết SDE và STH, vẫn còn
tác dụng ức chế sự sản xuất axit, chứng tỏ tác dụng ức chế là không thuận
nghịch. Trong điều kiện trên mảng bám răng, các chất tác dụng thường xuyên bị
pha loãng bởi nước bọt, tác dụng ức chế không thuận nghịch sự sinh axit của S.
mutans của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền có giá trị ứng dụng cao.
Bảng 3.2. Tác dụng của một số dịch chiết thực vật lên sự sinh axit của S.
mutans GS-5
Giá trị pH cuối cùng
STT
Loại dịch chiết
ở nồng độ 10% (w/v)
Chiết bằng ethanol

Chiết bằng nước
1 Mẫu đối chứng
4,01 ± 0,06 3,98 ± 0,04


10
2 Chàm tía

5,24 ± 0,16 4,36 ± 0.20
3 Hương nhu trắng
4,92 ± 0,26 4,25 ± 0,08
4 Kim ngân
5,37 ± 0,20 4,98 ± 0,13
5 Quỷ châm thảo
5,20 ± 0,07 4,36 ± 0,08
6 Sài đất
4,76 ± 0,39 4,56 ± 0,14
7 Sao đen
6,83 ± 0.06 5,12 ± 0,09
8 Sắn thuyền
6,51 ± 0,19 5,02 ± 0,05
Các giá trị sau ± là giá trị SD với n =5
3.1.2. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 bởi các dịch chiết thực vật
Kết quả thí nghiệm diệt khuẩn S. mutans GS-5 ở pH 4 (hình 3.5) và pH 7
(hình 3.6) cho thấy ở nồng độ 10%, dịch chiết cả 7 loài thực vật trong nghiên
cứu đều có tác dụng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 ở các mức khác nhau. Trong
đó dịch chiết KNG, SDE và STH có tác dụng cao hơn so với các dịch chiết còn
lại, và tác dụng này ở pH 4 cao hơn ở pH 7, thể hiện ở chỗ thời gian để 90%
quần thể tế bào bị tiêu diệt bởi dịch chiết ứng với giá trị D từ 5 đến 7 phút trong
khi ở các mẫu dịch chiết khác giá trị D là trên 10 phút. Khả năng diệt S. mutans
GS-5 của các dịch chiết ở pH 4 cao hơn pH 7 là một điều khá thú vị vì đây là
một tác dụng mong muốn của các hợp chất chống sâu răng, bởi pH thấp (dưới 4)
mới có tác dụng bào mòn men răng dẫn đến sâu răng (Gibbons và Van, 1975).
-8
-6
-4
-2
0

0 20 40 60
Thời gian ( phút)
logN/No
DC CTI HNT KNG
QCT SDA STH SDE

Hình 3.5. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 của các dịch chiết tại pH 4. Ký
hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3.


11
-2,5
-2
-1,5
-1
-0,5
0
0 20 40 60
Thêi gian (phót)
lo g N /N o
DC CTI HNT KNG
QCT SDA STH SDE

Hình 3.6. Khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 của các dịch chiết tại pH 7. Ký
hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3.
3.1.3. Khả năng ức chế sự hình thành biofilm S. mutans GS-5 của các dịch chiết
thực vật
Sự hình thành biofilm ở mẫu thí nghiệm kém hơn rõ rệt so với đối chứng. Ở
mẫu đối chứng vi khuẩn S. mutans mọc dày đặc tạo thành lớp màng bám trên
tấm kính, còn mẫu thí nghiệm vi khuẩn mọc thưa và ít hơn. So sánh sinh khối tế

bào trên biofilm nhận thấy sinh khối biofilm của mẫu thí nghiệm tăng lên ít hơn
so với mẫu đối chứng (bảng 3.3). Đặc biệt với mẫu xử lý bằng dịch chiết Sao đen
hay Sắn thuyền, lượng sinh khối tế bào tăng lên tương ứng 12,1% và 20,5% của
mẫu đối chứng (tức là sự hình thành biofilm đã bị ức chế tương ứng 87,9% và
79,5%). Đây là phát hiện có ý nghĩa thực tiễn, do có nhiều chất có tính kháng
khuẩn ở dạng huyền dịch nhưng không có tác dụng với các tế bào ở dạng biofilm
vì bị hạn chế về khả năng khuyếch tán và rất khó kiểm soát khi sử dụng các chất
kháng khuẩn thông thường như hiện nay.
Bảng 3.3. Tác dụng của dịch chiết thực vật lên sự hình thành biofilm ở S.
mutans GS-5
Mẫu Đối
chứng
CTI HNT KNG QCT SDA SDE STH
% sinh
khối tăng
100 65,8 78,9 54,1 60,8 48,2 12,1 20,5
% ức chế 0 34,2 21,1 45,9 39,2 51,8 87,9 79,5


12
3.1.4. Tác dụng của các dịch chiết thực vật phối hợp với fluo lên S. mutans GS-5
Trong các chất kháng khuẩn bảo vệ răng miệng, fluo được Tổ chức Y tế thế
giới khuyến cáo sử dụng do vừa có khả năng kháng khuẩn vừa có khả năng tái
tạo làm bền men răng. Florua natri (NaF) là thành phần chính được sử dụng
trong thuốc đánh răng hay nước súc miệng. Dựa trên các kết quả nghiên cứu
trước đây của Phan và tập thể (2001) về tác dụng của fluo, chúng tôi đã lựa chọn
và sử dụng các dịch chiết với nồng độ 10% phối hợp với NaF ở nồng độ 0,25
mM (thấp hơn nhiều lần nồng độ fluo được sử dụng trong các sản phẩm bảo vệ
răng miệng thông thường).
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp các dịch chiết với NaF

hiệu quả ức chế quá trình sinh axit của tế bào cao hơn khi sử dụng dịch chiết hay
NaF ở dạng riêng lẻ thể hiện ở giá trị pH trong các mẫu kết hợp dịch chiết với
NaF đều cao hơn mẫu chỉ chứa dịch chiết hay NaF. Kết quả ở bảng 3.4 còn cho
thấy tác dụng của dịch chiết khi kết hợp với NaF là tương tự như tác dụng khi
phối hợp fluo indomethacin trong nghiên cứu của Belli và tập thể (1995) hay với
một số axit yếu khác trong nghiên cứu của Phan và tập thể (2000).
3.1.5. Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với H
2
O
2
lên sự sinh axit của S.
mutans GS-5
Kết quả trình bày ở bảng 3.4 cho thấy khi phối hợp dịch chiết với H
2
O
2
(0,3
mM) tác dụng ức chế sự sinh axit của S. mutans GS-5 cao hơn so với khi sử
dụng dịch chiết hay H
2
O
2
ở

dạng riêng lẻ. Tác dụng này là tương tự như khi phối
hợp dịch chiết với NaF.
Bảng 3.4 và 3.5. Tác dụng của dịch chiết thực vật phối hợp với NaF hay
H
2
O

2
lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
Giá trị pH cuối cùng Giá trị pH cuối cùng Mẫu
nghiên
cứu
Không bổ
sung NaF
Bổ sung NaF
0,25mM
Không bổ
sung H
2
O
2

Bổ sung H
2
O
2
0,3mM
Nước
4,08 ± 0,21 4,21 ± 0,02 4,08 ± 0,09 4,45 ± 0,16
Ethanol
4,11 ± 0,08 4,23 ± 0,09 4,30 ± 0,16 4,48 ± 0,12
CTI
5,41 ± 0,06 6,27 ± 0,09 5,29 ± 0,12 5,64 ± 0,12


13
HNT

5,28 ± 0,09 6,21 ± 0,08 5,32 ± 0,13 6,23 ± 0,17
KNG
5,05 ± 0,13 6,14 ± 0,10 5,45 ± 0,05 6,84 ± 0,14
QCT
5,15 ± 0,12 6,04 ± 0,15 5,15 ± 0,05 6,21 ± 0,13
SDA
5,10 ± 0,08 5,97 ± 0,21 5,45 ± 0,04 6,01 ± 0,21
SDE
6,78 ± 0,06 7,11 ± 0,09 6,82 ± 0,12 7,14 ± 0,12
STH
6,10 ± 0,08 6,97 ± 0,21 6,45 ± 0,04 6,90 ± 0,21
Các giá trị sau ± là giá trị SD với n =5.
3.1.6. Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền lên một số vi khuẩn đường
miệng khác
Trên cở sở phát hiện thấy dịch chiết SDE và STH có khả năng ức chế mạnh
sự sinh axit của S. mutans GS-5 cũng như có tác dụng giết chết vi khuẩn này một
cách rõ rệt, chúng tôi đã tìm hiểu khả năng giết một số loài vi khuẩn đường
miệng khác, bao gồm: S. gordonii, S. rattus và S. sanguis của hai loại dịch chiết
này. Kết quả thu được ở hình 3.11 cho thấy dịch chiết SDE và STH ở nồng độ
10% có khả năng diệt 90% quần thể S. gordonii ATCC 10558 dưới 16 phút hay
quần thể vi khuẩn S. sanguis NTCC 10904 và S. rattus FA-1 trong 8 phút.
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 15 30 45 60
thêi gian (phót)

log N /N o

-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 15 30 45 60
thêi gian ( phót)
L ogN/N o

-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 15 30 45 60
thêi gian ( phót)
L og N /No

Hình 3.11. Tác dụng diệt vi khuẩn của dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen
với S. gordonii ATCC-10558 (A), S. sanguis NCTC-10904 (B), S. rattus FA-1
(C). Đối chứng (), SDE (), STH (♦).
Ngoài ra, chúng tôi cũng còn phát hiện thấy dịch chiết SDE và STH có tác
dụng ức chế mạnh với sự tiêu thụ oxy của S. mutans GS-5 (dẫn liệu không trình
bày ở đây).

A

B

C



14
Với các kết quả điều tra bước đầu về hoạt tính chống sâu răng của 7 loại
dịch chiết thực vật, chúng tôi đã lựa chọn dịch chiết của Sao đen và Sắn thuyền
cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một số chất thứ cấp có hoạt
tính kháng khuẩn sâu răng từ cây Sao đen
3.2.2. Tách chiết tinh sạch một số chất thứ cấp từ vỏ cây Sao đen
Để tách, tinh sạch một chất thực vật thứ cấp từ vỏ Sao đen chúng tôi đã chiết
các chất ra khỏi mẫu bằng cách ngâm mẫu trong ethanol (tỷ lệ 1 g mẫu: 10 ml
ethanol) trong thời gian 5 ngày. Dịch chiết sau đó được cô lại và được chiết tiếp
bằng n-hexan, chloroform, ethyl acetate và n-butanol (với độ phân cực tăng dần).
Chloroform thể hiện có hiệu suất chiết cao nhất. Khi thử nghiệm ảnh hưởng của
các phân đoạn này lên khả năng sinh axit của S. mutans GS-5, chúng tôi thấy
rằng phân đoạn chiết bằng chloroform cũng thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit
của S. mutans GS-5 tốt hơn các phân đoạn còn lại, chính vì vậy phân đoạn này
được lựa chọn cho các bước tinh sạch tiếp theo.
Phân đoạn dịch chiết bằng chloroform của vỏ Sao đen được cho qua cột
silicagel, rửa chiết bằng hệ dung môi methanol: nước với tỷ lệ methanol tăng
dần, chúng tôi đã thu được 6 phân đoạn hợp chất khác nhau ký hiệu lần lượt là
S1, S2, S3, S4, S5 và S6. Phân đoạn S6 được tiếp tục sắc ký qua cột sắc ký pha
đảo RP-18, rửa chiết bằng hệ dung môi methanol: acetone: nước theo tỷ lệ 2:1:2
về thể tích. Kết quả chúng tôi đã thu được 2 hợp chất ký hiệu là SDE1 và SDE2.

H
O
HO
H
H
HO
OH
OH
OH
HO
O
H
O
OH
H
H
OH
HO
H
1a
2a
3a
4a
5a
6a
7a
8a
9a
10a

11a
12a
13a
14a
1b
2b
3b
4b
5b
6b
7b
8b
9b
10b
11b
12b
13b
14b
1b'
2b'
3b'
4b'
5b'
6b'
7b'
8b'
9b'
10b'
11b'
12b'

13b'
14b'
1a'
2a'
3a'
4a'
5a'
6a'
7a'
8a'
9a'
10a'
11a'
12a'
13a'
14a'

H
OH
O
HO
H
O
HO
HO
OH
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1'
2'
3'
4'
5'
6'
7'
8'
9'
10'
11'
12'
13'
14'


Hình 3.13. Cấu trúc hoá học của SDE1 (trái) và SDE2 (phải)
Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) cho thấy hợp chất
SDE1 có cấu trúc đặc trưng phù hợp với cấu trúc của hợp chất hopea phenol với

15
công thức phân tử C
56
H
42
O
12
, đây là một hợp chất đã được tách ra từ Hopea
paviflora (Tanaka và tập thể, 2000). Hợp chất SDE2 cũng có dạng phổ NMR
tương ứng với phổ của hợp chất malibatol A với công thức phân tử C
28
H
20
O
7
đã
được biết đến từ loài Hopea malibato. Hợp chất này có tác dụng ức chế sự phát
triển của dòng tế bào ung thư CEM-SS (Dai và tập thể, 1998). Đây là lần đầu
tiên hai hợpchất hopea phenol và malibatol A từ vỏ Sao đen được tinh sạch, tách
chiết tại Việt Nam.
3.2.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của hopea phenol và
malibatiol A từ vỏ Sao đen
3.2.3.1. Tác dụng của hopea phenol và malibatiol A lên sự sinh axit của S.
mutans GS-5
Khi bổ sung hopea phenol hoặc malibatiol A ở nồng độ 4 mM vào huyền
dịch S. mutans GS-5 trong điều kiện dư thừa glucose thì pH cuối cùng mẫu
tương ứng là 4,9 và 5,21, trong khi mẫu kiểm tra có pH là 4,1 (hình 3.15). Kết
quả này chứng tỏ cả hai chất đều ức chế sự sinh axit của S. mutans GS-5, tương
tự như của dịch chiết vỏ Sao đen ban đầu.

3.5
4.5
5.5
6.5
7.5
0 50 100
Thêi gian (phót)
Gi¸ trÞ pH

3.2.3.2. Tác dụng diệt tế bào S. mutans GS-5 của hopea phenol và malibatol A
Kết quả nghiên cứu khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 của hai hợp
chất hopea phenol và malibatol A cho thấy tại giá trị pH 4 cả hai hợp chất này
đều có khả năng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5. Với nồng độ 4 mM malibatol A
có giá trị D là 16 phút; Hopea phenol với nồng độ 3 mM có giá trị D là 45 phút
(hình 3.16).
Hình 3.15.
Tác dụng của hopea phenol,
malibatol A lên sự sinh axit của S. mutans
GS-5. Đối chứng (), Hopea phenol (),
Malibatol A (). Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ
giá trị SD với n = 3.



16
-3
-2
-1
0
0 20 40 60

Thêi gian (phót)
log N/No

3.2.3.3.Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ ATPase của S.
mutans GS-5
Hoạt độ ATPase của S. mutans chủ yếu thuộc về F-ATPase. Enzyme này
định vị trên màng tế bào, có vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển proton
qua màng, quyết định khả năng chịu axit của vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu
(hình 3.17) cho thấy hopea phenol và malibatol A đều ức chế hoạt độ ATPase
của S. mutans GS-5. Nồng độ hopea phenol và malibatol A gây ra ức chế 50%
hoạt độ ATPase tương ứng là 1,3 mM và 0,75 mM, chứng tỏ cả hai đều là những
chất ức chế mạnh của ATPase. Tác dụng ức chế ATPase của hopea phenol và
malibatol A giải thích được một phần tác dụng diệt vi khuẩn S. mutans GS-5 tại
pH axit của dịch chiết Sao đen.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4
nång ®é (mM)
Ho¹t ®é cßn l¹i (%)

3.2.3.4. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ enzyme
phosphoryl hoá đường (PTS) của Streptococcus mutans GS-5
Hình 3.16. Khả năng diệt S. mutans GS-5 tại
pH 4 của Hopea phenol và Malibatol A.
Đối chứng (), Hopea phenol 0,75 mM
(

), 3 mM () và Malibatol A 1 mM (), 4
mM (). Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị
SD với n = 3.
Hìn
h
3.17
. Ảnh hưởng của hopea phenol
và malibatol A lên hoạt độ ATPase của
S. mutans. Malibatol A (); Hopea
phenol (). Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ
giá tr
ị SD với n = 3
.



17
Hệ thống enzyme chuyển gốc phosphate có vai trò chính trong việc
phosphoryl hoá glucose ở S. mutans. Kết quả thí nghiệm (hình 3.18) cho thấy
hopea phenol và malibatol A đều là những chất ức chế mạnh của PTS, ở nồng độ
0,75 mM cả hai chất đều ức chế 50% hoạt độ enzyme.

0
20
40
60
80
100
0 0,5 1 1,5 2
nång ®é (mM)

Ho¹t ®é cßn l¹i (%)

3.2.3.5. Tác dụng của hopea phenol và malibatol A lên hoạt độ một số enzyme
khác của Streptococcus mutans GS-5.
Chúng tôi cũng đã tìm hiểu tác dụng của hopea phenol và malibatol A
lên hoạt độ của pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, NADH oxidase của S.
mutans GS-5 và phát hiện thấy rằng, cả hai hợp chất này đều ức chế hoạt độ của
các enzyme này. Nồng độ hopea phenol và malibatol A ức chế 50% hoạt độ
pyruvate kinase tương ứng là 2,2 mM và 2,5 mM. Nồng độ hopea phenol và
malibatol A ức chế 50% hoạt độ lactate dehydrogenase tương ứng là 2,3 mM và
2,5 mM. Nồng độ hopea phenol và malibatol A ức chế 50% hoạt độ NADH
oxidase tương ứng là 1,5 mM và 1 mM. Tác dụng ức chế PTS, pyruvate kinase,
lactate dehydrogenase bởi hopea phenol và malibatol A có thể là nguyên nhân
làm cho sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans GS-5 bị ức chế bởi các hợp chất này
cũng như bởi dịch chiết từ vỏ Sao đen. Còn tác dụng ức chế NADH oxidase của
hai hợp chất này góp phần làm rõ nguyên nhân ức chế tiêu thụ oxy bởi Sao đen.

3.3. Tách, tinh sạch, nghiên cứu tính chất của một chất thứ cấp có hoạt tính
kháng khuẩn sâu răng từ cây Sắn thuyền
3.3.2. Tách, tinh sạch một chất thứ cấp từ lá cây Sắn thuyền
Để tách, tinh sạch một hợp chất thực vật thứ cấp từ lá Sắn thuyền chúng
tôi đã thực hiện theo quy trình tách chiết, tinh sạch hopea phenol và malibatol A
Hình 3.18. Ảnh hưởng của hopea phenol
và malibatol A lên hoạt độ PTS của S.
mutans GS-5. Hopea phenol (),
Malibatol A (). Ký hiệu (I) trong đồ thị
ch
ỉ giá trị SD với n = 3
.

18
từ vỏ Sao đen. Chúng tôi cũng phát hiện thấy rằng phân đoạn chiết bằng
chloroform thể hiện khả năng ức chế sự sinh axit của S. mutans GS-5 tốt hơn các
phân đoạn còn lại. Phân đoạn này được cho qua cột sắc ký sephadex LH 20 và
cho rửa chiết bằng hệ dung môi chloroform: methanol với tỷ lệ methanol tăng
dần, chúng tôi thu được 3 phân đoạn hợp chất khác nhau ký hiệu lần lượt là ST1,
ST2 và ST3. Phân đoạn ST3 được tiếp tục sắc ký qua cột sắc ký pha đảo RP-18
rửa chiết bằng hệ dung môi methanol: acetone: nước theo tỷ lệ 2:1:2 về thể tích.
Kết quả chúng tôi đã thu được một phân đoạn với một băng duy nhất khi kiểm
tra bằng sắc ký bản mỏng silicagel, ký hiệu là ST3A.

HO
COO
R
CH
2
OH
HO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
3
0


Phổ NMR của ST3A từ lá Sắn thuyền giống với phổ của một hợp chất
triterpene có 5 vòng 6 cạnh với những tín hiệu của 30 cacbon trên phổ
13
C-NMR.
So sánh các kết quả phổ của ST3A với phổ tương ứng của asiaticoside cho thấy
có sự phù hợp hoàn toàn ở cả 29 vị trí cacbon và hợp chất ST3A được xác định
là axit asiatic với công thức phân tử là C

30
H
48
O
5
(hình 3.24). Djoukeng và tập
thể (2005) cũng đã đề cập hợp chất nhóm terpene có tính kháng khuẩn từ loài
Syzygium guineense. Tuy nhiên đây là nghiên cứu đầu tiên tinh sạch được hợp
chất axit asiatic từ cây Syzygium resinosum tại Việt Nam
3.3.3. Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn sâu răng của axit asiatic
3.3.3.1. Tác dụng của axit asiatic lên sự sinh axit của S. mutans GS-5
Khi bổ sung axit asiatic ở nồng độ 15 mM vào huyền dịch Streptococcus
mutans GS-5 (hình 3.26), chúng tôi thấy rằng axit asiatic ức chế sự sản xuất axit
của S. mutans GS-5, thể hiện ở giá trị pH cuối cùng (5,37) cao hơn rõ rệt so với
mẫu đối chứng (4,08).
Hình 3.24. Cấu trúc hoá học axit
asiatic từ lá Sắn thuyền



19
4
4.5
5
5.5
6
6.5
7
7.5
0 20 40 60 80 10

0
Thêi gian (phót)
Gi¸ trÞ pH

3.3.3.2. Tác dụng của axit asiatic lên sự diệt vi khuẩn S. mutans GS-5
Kết quả cho thấy axit asiatic từ lá Sắn thuyền có tác dụng diệt vi khuẩn S.
mutans GS-5 rất rõ rệt. Ở nồng độ 15 mM chỉ sau 15 phút tại pH 4 có tới 90% số
tế bào vi khuẩn S. mutans GS-5 bị tiêu diệt (hình 3.27).
-5
-4
-3
-2
-1
0
0 20 40 60
thêi gian (phót
)
logN/No

3.3.3.3. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5
Kết quả (hình 3.28) cho thấy axit asiatic ức chế hoạt độ ATPase của S.
mutans GS-5. Ở nồng độ 1,5 mM axit asiatic ức chế 50% hoạt độ ATPase.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
nång ®é ( mM)

Ho¹t ®é cßn l¹i (%)

Hình 3.26. Tác dụng ức chế sinh axit từ
S. mutans GS-5 của axit asiatic. Đối
chứng (
), axit asiatic (). Ký hiệu (I)
trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3
Hình 3.27. Tác dụng diệt S. mutans
GS-5 của axit asiatic. Đối chứng (),
Axit asiatic (). Ký hiệu (I) trong đồ
thị chỉ giá trị SD với n = 3.
Hình 3.28. Tác dụng của axit asiatic lên
hoạt độ ATPase của S. mutans GS-5. Ký
hiệu (I) trong đồ thị chỉ giá trị SD với n = 3


20
3.3.3.4. Ảnh hưởng của axit asiatic lên hoạt độ enzyme phosphotransferase
(PTS) của S. mutans GS-5
Kết quả thu được (hình 3.29) cho thấy axit asiatic với nồng độ 2,2 mM đã
ức chế 50% hoạt độ của photphotranspherase.
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
nång ®é (mM)
Ho¹t ®é cßn l¹i (%)

3.3.3.5. Tác dụng của axit asiatic lên hoạt độ một số enzyme ở S. mutans GS-5.
Chúng tôi cũng đã tìm hiểu tác dụng của axit asiatic lên họat độ của
pyruvate kinase, lactate dehydrogenase, NADH oxidase của S. mutans GS-5 và
phát hiện thấy rằng axit asiatic ức chế hoạt độ của các enzyme này. Nồng độ axit
asiatic ức chế 50% hoạt độ pyruate kinase, lactate dehydrogenase và NADH
oxidase tương ứng là 1,5 mM, 0,75 mM và 1 mM. Tác dụng ức chế PTS,
pyruvate kinase, lactate dehydrogenase bởi axit asiatic có thể là nguyên nhân làm
cho sự sinh axit của vi khuẩn S. mutans GS-5 bị ức chế bởi hợp chất này cũng
như bởi dịch chiết Sắn thuyền. Tác dụng ức chế NADH oxidase của axit asiatic
góp phần làm rõ nguyên nhân ức chế tiêu thụ oxy bởi dịch chiết từ lá Sắn thuyền.
3.4. Phân lập một số chủng vi khuẩn S. mutanns từ người Việt Nam
Sử dụng môi trường Mitis Salivaius kết hợp với môi trường TSA pH axit,
dựa trên hình thái khuẩn lạc và hoạt tính catalase chúng tôi đã phân lập 6 chủng
vi khuẩn thuộc chi Streptococcus, được kí hiệu lần lượt là S. sp H1, S. sp H2, S.
sp H3, S. sp H4, S. sp H5 và S. sp H6. Sử dụng kit API20 Strep dựa trên các
phản ứng hoá sinh, chúng tôi sơ bộ kết luận chủng S. sp H1 thuộc loài S. mutans.
Hai chủng S. sp H4 và S. sp H5 thuộc loài S. sanguis và S. sp H6 thuộc loài S.
constellatus. Riêng đối với 2 chủng S. sp H2 và S. sp H3, chỉ số ID thu được
tương đối thấp, vì vậy cần được nhận dạng thêm bằng các phương pháp khác
chính xác hơn.
Hình 3.29. Tác dụng của axit asiatic lên
hoạt độ photphotranspherase của S.
mutans GS-5. Ký hiệu (I) trong đồ thị chỉ
giá trị SD với n = 3



21
3.4.3. Nhận dạng vi khuẩn Streptococcus bằng kỹ thuật RFLP và PCR

Để nhận dạng một cách chính xác các chủng Streptococcus sp H1,
Streptococcus sp H2 và Streptococcus sp H3, chúng tôi đã sử dụng đến kỹ thuật
RFLP và PCR. Sử dụng cặp mồi 8UA và 1492R được thiết kế đặc hiệu cho đoạn
gen ARNr 16S, chúng tôi đã nhân bản thành công đoạn gen mã hoá cho ARNr
16S từ hệ gen của các chủng vi khuẩn phân lập được. Sản phẩm PCR của đoạn
gen ARNr 16S được tinh sạch và cắt bằng HpaII và HaeIII, sau đó điện di kiểm
tra trên gel agarose. Kết quả (hình 3.38 và 3.39) cho thấy cả 3 chủng vi khuẩn S.
sp H1, S. sp H2 và S. sp H3 đều cho phổ băng tương tự chủng chuẩn S. mutans
GS-5¸ nhưng khác với phổ băng của chủng chuẩn Streptococcus sanguis NCTC
10904 (cũng thuộc chi Streptococcus).
Tiếp tục sử dụng kỹ thuật PCR với cặp mồi SD1 và SD2 được thiết kết
dựa trên trình tự hai đầu của gen mã hoá dextranase đặc hiệu cho S. mutans
chúng tôi thấy cả 3 chủng phân lập ở Việt Nam đều cho một băng nhân bản duy
nhất với kích thước khoảng 1,3 kb, tương tự băng ADN nhân bản thu được từ
chủng chuẩn S. mutans GS-5. Trong khi đó chủng Streptococcus sangius 10904
đối chứng không cho băng nhân bản 1,3 kb này (hình 3.40).
Các kết quả phân tích bằng PCR và RFLP cho phép chúng tôi khẳng định
rằng cả 3 chủng S. sp H1, S. sp H2 và S. sp H3 đều thuộc loài S. mutans (Sato và
tập thể, 2003).

1
1

2
2










3
3

4
4










5
5










6
6

1
1










2
2










3
3

4
4












5
5

6
6




Hình 3.39. Sản phẩm PCR 16S ARNr
sau khi cắt bằng HaeIII
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: S. mutans GS-5
Giếng 3: S. sangius NCTC-10904
Giếng 4: S. sp H1
Giếng 5: S. sp H2
Giếng 6: S. sp H3


Hình 3.38. Sản phẩm PCR 16S ARNr
sau khi cắt bằng HpaII
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: S. mutans GS-5
Giếng 3: S. sangius NCTC-10904
Giếng 4: S. sp H1
Giếng 5: S. sp H2
Giếng 6: S. sp H3

5
5
0

0
0
0


b
b
p
p




1
1
0
0
0
0


b
b
p
p



5
5

0
0
0
0


b
b
p
p

1
1
0
0
0
0


b
b
p
p




22

1
1

2
2










3
3

4
4










5
5








6
6

3.4.4. Một số đặc điểm sinh lý, hoá sinh của 3 chủng vi khuẩn S. mutans H1, S.

mutans H2 và S. mutans H3
3.4.4.1. Khả năng sinh axit của S. mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans H3
Kết quả thí nghiệm sinh axit của các chủng S. mutans được thể hiện ở
hình 3.41 và cho thấy cả 3 chủng S. mutans phân lập được đều có khả năng sinh
axit tốt, thậm chí tốt hơn chủng chuẩn S. mutans GS-5, thể hiện ở chỗ giá trị pH
cuối cùng của các mẫu này đều thấp hơn của S. mutans GS-5 .









3.4.4.2. Khả năng chịu axit của các chủng vi khuẩn phân lập từ người Việt Nam
Cùng với khả năng sinh axit mạnh thì khả năng chịu axit cũng là một đặc
trưng quan trọng của vi khuẩn S. mutans. Kết quả kiểm tra khả năng chịu axit (ở
pH 3) của các chủng S. mutans phân lập từ người Việt Nam (hình 3.42) cho thấy
các chủng S. mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans H3 đều có khả năng chịu
axit tốt, thậm chí tốt hơn chủng chuẩn S. mutans GS-5, thể hiện ở giá trị D của cả
3 chủng đều lớn hơn giá trị D của S. mutans GS-5.
3
4
5
6
7
8
0 30 60 90
pH

thời gian ( phút)

Hình 3.41. Khả năng sinh axit của các
chủng Streptococcus mutans. S. mutans GS-
5 (), S. mutans H1 (), S. mutans H2 (),
S. mutans H3 ()
Hình 3.40.
Điện di trên gel agarose sản
phẩm PCR gen dextranase của các chủng
S. mutans phân lập
Giếng 1: Thang chuẩn ADN 1kb
Giếng 2: S. sangius NCTC-10904
Giếng 3: S. mutans GS-5
Giếng 4: S. mutans H1
Giếng 5: S. mutans H2
Giếng 6: S. mutans H3
1
1
,
,
5
5


k
k
b
b

23
-2.5
-2
-1.5
-1
-0.5
0
0 10 20 30
Thời gian (phút)
Log N/No

3.4.5. Nghiên cứu tác dụng của dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen lên
Streptococcus mutans H2 phân lập từ người Việt Nam
Trong phần nghiên cứu này chúng tôi chỉ lựa chọn chủng Streptococcus
mutans H2 phân lập từ người Việt Nam để nghiên cứu do trong số 3 chủng
Streptococcus mutans phân lập được chủng S. mutans H2 có khả năng sinh axit
mạnh cũng như chịu axit tốt hơn so với 2 chủng còn lại, mặt khác S. mutans H2
còn khác S. mutans GS-5 chuẩn một số đặc điểm sinh hóa như khả năng chuyển
hóa một số loại đường L- arabinose, D- mannitol, Inulin
Các kết quả nghiên cứu của chúng tôi thu được cho thấy dịch chiết vỏ Sao
đen và lá Sắn thuyền với nồng độ 10% (v/v) có tác dụng ức chế sự sinh axit của
S. mutans H2 và tiêu diệt chủng vi khuẩn này ở pH 4 với giá trị D (tương đương
90% số vi khuẩn bị giết) tương ứng là 22 phút và 25 phút. Axit asiatic, hopea
phenol, malibatol A tách từ lá Sắn thuyền và vỏ Sao đen với nồng độ từ 1 đến
1,6 mM ức chế 50% hoạt độ các enzyme ATPase và PTS của S. mutans H2. Các
kết quả này thu được này tương tự tác dụng của các hợp chất tinh sạch này đối
với chủng chuẩn Streptococcus mutans GS-5.

KẾT LUẬN

Từ các kết quả nghiên cứu thu được chúng tôi rút ra các kết luận sau:
1. Dịch chiết ethanol của Chàm tía, Hương nhu trắng, Kim ngân, Quỷ trâm
thảo, Sài đất, Sao đen và Sắn thuyền có tác dụng ức chế sự sinh axit của vi
khuẩn gây sâu răng S. mutans GS-5, tác dụng này tăng lên khi dịch chiết
được phối hợp với NaF và H
2
O
2
. Các dịch chiết thực vật này đều có tác
Hình 3.42. Khả năng chịu axit của các
chủng Streptococcus mutans phân lập từ
người Việt Nam.
S. mutans GS-5 (),
S.mutans H1 (), S. mutans H2 (), S.
mutans H3 ()


24
dụng ức chế sự hình thành biofilm và giết vi khuẩn S. mutans GS-5. Đặc biệt
dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền có tác dụng giết vi khuẩn S. mutans GS-5
ở pH 4 mạnh hơn gấp 6 lần ở pH 7. Dịch chiết Sắn thuyền và Sao đen cũng
có tác dụng giết một số loài vi khuẩn đường miệng khác như S. sanguis, S.
gordonii và S .rattus.
2. Đã tách chiết, tinh sạch và xác định cấu trúc hoá học được hai hợp chất thực
vật thứ cấp thuộc thuộc nhóm oligostilben là hopea phenol (C
56
H
42
O
12

) và
malibatol A (C
28
H
20
O
7
) từ dịch chiết vỏ Sao đen và một hợp chất thứ cấp
nhóm terpene là axit asiatic (C
30
H
48
O
5
) từ dịch chiết lá Sắn thuyền.
3. Hopea phenol, malibatol A tách từ vỏ Sao đen và axit asiatic tách từ lá Sắn
thuyền ức chế hoạt độ các enzyme phosphoryl hoá đường-PTS (IC
50
tương
ứng 0,75 mM, 0,75 mM và 2 mM), lactate dehydrogenase (IC
50
tương ứng
2,5 mM, 2,3 mM và 0,75 mM), pyruvate kinase (IC
50
tương ứng 2,5 mM,
2,2 mM và 1,5 mM) liên quan đến các quá trình sinh axit, ATPase (IC
50

tương ứng 1,2 mM, 0,75 mM và 1,5 mM) liên quan đến quá trình chịu axit,
NADH oxidase (IC

50
tương ứng 1,5 mM, 1 mM và 1 mM) liên quan đến quá
trình tiêu thụ oxy của S. mutans GS-5.
4. Đã phân lập được 3 chủng vi khuẩn S.mutans H1, S. mutans H2 và S. mutans
H3 từ người Việt Nam nhờ việc nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường Mitis
salivarius chọn lọc có pH thấp, kết hợp các phân tích hình thái tế bào với
phân tích đa hình độ dài các đoạn phân cắt giới hạn gen mã hóa cho ARNr
16S được nhân bản bằng PCR. Chủng vi khuẩn S. mutans H2 có trình tự
đoạn gen mã hóa cho ARNr 16S ở mức độ tương đồng 100% so với trình tự
đoạn gen này của S. mutans đã công bố trong Genbank.
5. Tác dụng của dịch chiết Sao đen và Sắn thuyền cũng như của axit asiatic,
hopea phenol và malibatol A lên chủng vi khuẩn S. mutans H2 phân lập từ
người Việt Nam là tương tự như lên chủng chuẩn S. mutans GS-5 về khả
năng ức chế sinh axit, giết vi khuẩn cũng như ức chế hoạt độ ATPase, PTS.
ĐỀ NGHỊ
Tiếp tục nghiên cứu cơ chế tác dụng của axit asiatic từ Sắn thuyền
(Syzygium resinosum G) và hopea phenol, malibatol A từ vỏ Sao đen (Hopea
odorata R) lên vi khuẩn gây sâu răng Streptococcus mutans để có thể ứng dụng
chúng vào việc bảo vệ răng, miệng.