Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loài sán lá gan nhỏ Opisthorchis viverrini (mẫu Việt Nam) và so sánh với các chủng của thế giới bằng các phương pháp sinh học phân tử

bộ giáo dục
v đo tạo
viện khoa học
v công nghệ việt nam
Viện công nghệ sinh học


ngô thị hơng


Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loi
sán lá gan nhỏ
Opisthorchis

viverrini
(mẫu việt nam)
v so sánh với các chủng của thế giới
bằng các phơng pháp sinh học phân tử




Chuyên ngành: Hóa sinh học
Mã số: 62 42 30 15


tóm tắt Luận án tiến sĩ sinh học

Hà Nội - 2008


luận án đợc hon thnh tại
viện công nghệ sinh học




Ngời hớng dẫn khoa học:
PGS.TS. Lê Thanh Hòa
TS. Triệu Nguyên Trung
GS.TSKH. Vũ Thị Minh Thục




Phản biện 1: PGS.TS. Nguyn Nghiờm Lut
Trng i hc Y H Ni
Phản biện 2: PGS.TS. Nguyn Vn Mựi
Trng i hc Khoa hc T nhiờn,
i hc Quc gia H Ni
Phản biện 3: GS.TS. Lờ Bỏch Quang
Hc Vin Quõn y

Lun ỏn s c bo v trc Hi ng chm lun ỏn cp Nh
nc, hp ti: Vin Cụng ngh
sinh hc, H Ni
vo hi 14 gi ngy 25 thỏng 09 nm 2008


Có thể tìm hiểu luận án tại:
- Th viện Quốc gia
- Th viện Viện Công ngh sinh học

1
MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài
Ký sinh trùng (KST) là tập hợp sinh vật rất đa dạng, nên việc phân
loại về nhóm, loài, chủng trước đây đã có phần thiếu chính xác, đặc biệt
đối với một số loài đồng hình (sibling species), đôi khi đã gộp nhầm những
cá thể hoặc quần thể ký sinh trùng mà thực chất chúng có những đặc tính
di truyền học hoàn toàn khác biệt nhau. Hiện nay các phương pháp sinh
học phân tử (SHPT) đ
ã bước đầu được ứng dụng trong chẩn đoán phân
loại và lập phả hệ sinh vật. Trong đó, các chỉ thị di truyền hệ gen ty thể
(cox1, nad1, nad3, atp6…) đã được sử dụng phổ biến trong phương pháp
phân loại sinh học phân tử. Ưu điểm của gen ty thể là ở thể đơn bội, không
tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ và có tỷ lệ bi
ến đổi nucleotide cao. Do
có kích thước nhỏ, lại chứa các gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế
bào, nên ADN hệ gen ty thể được coi là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự

biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về giám định, phân loại và lập
phả hệ quần thể.
Bệnh sán lá gan nhỏ do Opisthorchis viverrini gây nên
(opisthorchiasis), là bệnh ký sinh trùng truyền qua đường thức ăn, có ảnh
hưởng nghiêm tr
ọng đến sức khỏe cộng đồng ở các nước Đông Nam Á bao
gồm Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam. Bệnh này đã được nghiên
cứu rộng rãi ở Thái Lan, nơi được coi là trung tâm về dịch tễ của O.
viverrini, có khoảng 6 triệu người bị nhiễm sán lá gan. Sự nhiễm bệnh có
liên quan đến một số bệnh về gan mật như bệnh đường mật, vàng da tắc
mật, to gan, viêm túi mật, bệnh sỏi mậ
t và O. viverrini được coi là tác nhân
góp phần gây bệnh ung thư đường mật
Sán lá gan nhỏ O. viverrini đã được xác định là có mặt ở một số tỉnh
miền Trung, bước đầu đã khảo sát dịch tễ học và chẩn đoán, song cho đến
nay, các dữ liệu toàn diện về hệ gen ty thể của loài sán nguy hiểm này ở
Việt Nam vẫn chưa có hoặc chưa đầy đủ. Do vậy, việc phân tích một phầ
n
hệ gen ty thể và thành phần gen của O. viverrini gây bệnh ở người từ các
vùng địa lý khác nhau sẽ góp phần vào nghiên cứu ký sinh trùng phân tử ở
Việt Nam và thế giới. Trên cơ sở những kết quả đó cho phép ứng dụng lập
bản đồ phân bố dịch tễ học phân tử, tìm hiểu cơ chế sinh bệnh, xây dựng
các phương pháp và bộ sinh phẩm (kit) chẩn đoán nhanh nhằm nghiên cứu
các lo
ại thuốc, vacxin để giúp cho việc phát hiện và điều trị bệnh này một
cách hiệu quả. Xuất phát từ những vấn đề thiết thực về nghiên cứu gen học
hệ gen ty thể đã nêu ở trên, chúng tôi tiến hành đề tài:

2
“Nghiên cứu giải mã một phần hệ gen ty thể của loài sán lá gan nhỏ

Opisthorchis viverrini (mẫu Việt Nam) và so sánh với các chủng của thế
giới bằng các phương pháp sinh học phân tử”
2. Mục tiêu đề tài :
- Giải mã một vùng gen ty thể chứa một số gen quan trọng của một số
phân lập O. viverrini thu nhận tại các vùng địa lý khác nhau ở Việt Nam.
- Phân tích, so sánh các gen thu nhận được từ các phân lập của Việt
Nam và so sánh với các phân lập c
ủa thế giới.
- Phân tích mối quan hệ phả hệ của các phân lập sán lá gan nhỏ O.
viverrini dựa vào trình tự các gen thu nhận được.
- Thẩm định mối quan hệ về loài của O. viverrini trong lớp Trematoda
và trong ngành sán dẹt (Platyhelminthes) trên cơ sở phân tích vùng gen ty
thể.
3. Những đóng góp mới về khoa học và thực tiễn của đề tài
- Lần đầu tiên trình tự vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các phân lập O.
viverrini ở những vùng địa lý khác nhau của Việt Nam là Qu
ảng Nam,
Bình Định và Phú Yên được xác định.
- Lần đầu tiên đặc tính gen học vùng gen ty thể dài 4,2 kb của loài
sán lá gan nhỏ O. viverrini bao gồm trật tự, cấu trúc, tương đồng, thành
phần kiến tạo, mối quan hệ phả hệ được phân tích, góp phần quan trọng
vào phát triển nghiên cứu sinh học phân tử của ngành ký sinh trùng hiện
đại.
- Lần đầu tiên mối quan hệ về loài và vị trí phân loại của sán lá gan
nhỏ O. viverrini được làm sáng tỏ, giúp hi
ểu biết hơn về các loài trong lớp
sán lá (Trematoda) và ngành sán dẹt Platyhelminth.
Các kết quả thu được từ vùng gen 4,2 kb của các phân lập O.
viverrini sẽ giúp ích cho việc xây dựng kit chẩn đoán để phòng chống và
điều trị bệnh này có hiệu quả ở Việt Nam và thế giới.

4. Bố cục luận án
Luận án gồm 147 trang (không kể phần phụ lục), kết cấu thành 3
chương
- Mở đầu: 3 trang
-
Chương 1: Tổng quan tài liệu: 47 trang (13 hình, 1 bảng)
- Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu: 20 trang (6 hình)
- Chương 3: Kết quả và thảo luận: 63 trang (23 hình, 18 bảng)
- Kết luận và kiến nghị: 2 trang
- Tài liệu tham khảo: 178 tài liệu (26 tiếng Việt, 152 tiếng Anh)
- Phụ lục

3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 LỊCH SỬ CỦA BỆNH OPISTHORCHIASIS VÀ PHÂN BỐ ĐỊA LÝ
Bệnh sán lá gan nhỏ (opisthorchiasis) do Opisthorchis viverrini gây
nên là bệnh quan trọng đối với sức khỏe cộng đồng ở các nước Đông Nam
Á bao gồm Thái Lan, Lào, Campuchia và Việt Nam. Bệnh này đã được
nghiên cứu rộng rãi ở Thái Lan, nơi được coi là trung tâm về dịch tễ của O.
viverrini, có khoảng 6 triệu người bị nhiễm sán lá gan. Sự nhiễm bệnh có
liên quan đến một số bệnh v
ề gan mật như bệnh đường mật, vàng da tắc
mật, to gan, viêm túi mật, bệnh sỏi mật. Hơn nữa các bằng chứng về thực
nghiệm và dịch tễ học đã chứng minh sán lá gan nhỏ là tác nhân góp phần
gây nên bệnh ung thư đường mật.
Ở Việt Nam, sán lá gan nhỏ O. viverrini được tìm thấy ở một số tỉnh
phía Nam (Phú Yên, Bình Định, Quảng Nam, Huế, Đak Lak…) và đã
được giám định phân tử b
ằng chỉ thị di truyền hệ gen ty thể.

1.2 HỆ GEN TY THỂ VÀ ỨNG DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU KÝ
SINH TRÙNG
Hiện nay đã có rất nhiều loài đã có hệ gen ty thể được giải mã toàn bộ
hoặc một phần, cung cấp nguyên liệu chuỗi nucleotide và amino acid cho
so sánh giám định các loài cần nghiên cứu. Do có kích thước nhỏ, lại chứa
gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ty thể được coi là đối
tượng lý tưởng
để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen phục vụ nghiên cứu về
giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể. Các gen trong ty thể lại có hệ
số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân tế bào 10-15 lần, nên rất thuận lợi cho
nghiên cứu về tiến hoá. Các gen của ty thể trong cùng chủng, cùng loài,
thậm chí trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao,
do vậy, bất cứ s
ự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định
và phân loại.
Nghiên cứu hệ gen ty thể còn có tầm quan trọng trong chẩn đoán, điều
trị và phòng chống bệnh, vì có nhiều bệnh ở người và động vật liên quan
đến sự biến đổi ở ty thể. Đối với KST, hiểu biết đầy đủ về hệ gen ty thể,
còn có giá trị định hướng trong phòng chống, đặc biệt tìm kiế
m hóa chất,
hóa dược, hoặc thực nghiệm các loại vacxin thế hệ mới. Đã có nhiều hệ
gen ty thể của các loại KST như giun đũa (Ascaris suum), giun chỉ
(Onchocerca volvulus), sán máng (Schistosoma mansoni, S. japonicum, S.
mekongi, S. haematobium), sán dây (Taenia solium, T. saginata, T.

4
asiatica, T. crasiceps ), sán lá gan lớn (Fasciola hepatica, F. gigantica),
sán lá gan nhỏ (Clonorchis sinensis, Opisthorchis viverrini), sán lá ruột
(Fasciolopsis buski) đã được giải mã và phân tích cung cấp nguồn dữ
liệu cần thiết cho nghiên cứu giám định, phân loại, phả hệ, quần thể ký

sinh trùng.
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU SINH HỌC PHÂN TỬ SÁN LÁ GAN
NHỎ O. VIVERRINI Ở VIỆT NAM
Hiện nay đã xác định ít nhất có 8 tỉnh lưu hành Opisthorchis
viverrini đó là các tỉnh, như Phú Yên, Bình Định, Đak Lak, Đà Nẵng,
Quảng Nam, Khánh Hoà và Thừa Thiên Hu
ế
Sán lá gan nhỏ O. viverrini lần đầu tiên được giám định phân tử bằng
chỉ thị di truyền hệ gen ty thể vào năm 2003, trên các mẫu sán được thu
thập trên người tại Phú Yên, đến năm 2006, kỹ thuật PCR đa năng được
ứng dung để giám định và phân biệt 2 loài sán lá gan nhỏ O. viverrini và
C. sinensis ở Việt Nam.
Hiện nay, trong Ngân hàng gen, theo công bố, chỉ có gen nad3, một
số gen ARN vận chuyển trnN, trnP, trnI
và trnK hoàn chỉnh và một phần
gen nad1 của O. viverrini được giải trình trình tự. Chưa có toàn bộ hệ gen
ty thể giải trình một cách hoàn chỉnh nào của O. viverrini được đăng ký
vào Ngân hàng gen. Như vậy, vấn đề đặt ra là cần có dữ liệu sinh học phân
tử hệ gen ty thể cũng như của hệ gen nhân của sán lá gan nhỏ của Việt
Nam nhằm đáp ứng nhu cầu chẩn đoán giám
định và nghiên cứu bệnh học.
1.4 TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC GIẢI MÃ HỆ GEN TY THỂ
CỦA LOÀI SÁN LÁ GAN NHỎ O. VIVERRINI
Việc sử dụng phương pháp sinh học phân tử mà cụ thể là ứng dụng
phương pháp PCR trong chẩn đoán và phân loại bệnh sán lá gan nhỏ nói
riêng và bệnh ký sinh trùng nói chung có một ý nghĩa hết sức to lớn. Nhờ
phương pháp này mà người ta có thể chẩn đoán từ rất sớm, rất chính xác
tác nhân gây bệnh. Điều này giúp cho các nhà điều trị học lựa chọn
phương pháp điều trị hiệu quả ít tốn kém nhất, góp phần ngăn chặn các
hậu quả xấu do bệnh gây ra.

Việc xác định các cấu trúc một gen hay nhiều gen đặc trưng của sán
lá gan nhỏ còn giúp cho các nhà sinh học xác định được sản phẩm cụ thể
của gen đó. Đây sẽ là cơ sở cho việc sả
n xuất các kháng nguyên đặc hiệu,
sử dụng cho phương pháp chẩn đoán bằng miễn dịch học.
Nguồn thông tin thu được sẽ giúp cho việc xác định phân bố phân tử
của chúng cũng như giúp cho các nghiên cứu về phòng chống và điều trị
có hiệu quả bệnh này ở Việt Nam và thế giới.

5
CHƯƠNG 2
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu nghiên cứu là mẫu sán lá gan nhỏ trưởng thành có kích
thước 1,2 x 0,1 cm, màu vàng nhạt, được xác định là O. viverrini về mặt
hình thái học. Mẫu sán được thu thập từ bệnh nhân tại các địa điểm sau:
- Xã An Mỹ, huyện Tuy An, tỉnh Phú Yên. Ký hiệu (OvPY3)
- Xã Mỹ Thọ, huyện Phù Mỹ, tỉnh Bình Định. Ký hiệu (OvBD1)
- Xã Tam Xuân 1, huyện Núi Thành, tỉnh Quảng Nam. Ký hiệu (OvQN).
Đây là những nơi được xác định là vùng lư
u hành bệnh sán lá gan nhỏ.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thu nhận được các chuỗi ADN hệ gen ty thể của các phân lập O.
viverrini, phương pháp PCR được sử dụng kết hợp, bao gồm PCR thông
thường và PCR cực đại (long PCR). Các sản phẩm PCR được dòng hóa,
giải trình trình tự và phân tích theo quy trình tổng quát như sau:
2.2.1. Phương pháp tách chiết ADN tổng số từ mẫu vật: sử dụng bộ
sinh phẩm QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN Inc, USA).
2.2.2. Phương pháp tiến hành phản ứ
ng PCR: phản ứng PCR cực

đại được thực hiện trên máy MJ Thermal Cycler PCT-100 (MJ Research,
USA), sử dụng bộ hóa chất Elongase kit của hãng Invitrogen theo chu
trình nhiệt như sau: 94
o
C/5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94
o
C/30 giây,
54
o
C/1 phút; 68
o
C/12 phút. Phản ứng PCR thông thường được thực hiện
theo chu trình nhiệt như sau: 94
o
C/5 phút, tiếp theo là 35 chu kỳ ở 94
o
C/30
giây, 52
o
C/30 giây; 72
o
C/2 phút và chu kỳ cuối cùng là 72
o
C/10 phút. Sản
phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, nhuộm gel bằng Ethidium
Bromide 10 phút và sau đó quan sát sản phẩm trên máy soi gel Wealtech
(Mỹ).
2.2.3. Phương pháp tách dòng và giải trình trình tự: sản phẩm
PCR tinh sạch được dòng hóa vào vector pCR2.1TOPO (TA-cloning Kit )
của hãng Invitrogen. Các đoạn ADN trong plasmid tái tổ hợp được giải

trình trình tự trên máy ABI3100 Avant Genetic Analyzer.
2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu: các chuỗi nucleotide được xử lý
bằng chương trình SeqEdv1.03, sau đó so sánh sử dụng chương trình
AsemblyLIGNv1.9c và MacVector8.2 (Accelrys Inc.) trên máy tính
Macintosh; các chương trình GENEDOC2.5, MEGA3.1 trên máy tính PC,
được sử d
ụng để phân tích, so sánh về thành phần nucleotide và amino
acid cũng như phân tích mối quan hệ phả hệ

6
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ THU NHẬN VÙNG GEN TY THỂ DÀI 4,2 KB
CỦA CÁC PHÂN LẬP SÁN LÁ GAN NHỎ O. VIVERRINI
Phản ứng PCR thông thường và PCR cực đại (long PCR) được sử
dụng kết hợp để thu nhận vùng gen ty thể có kích thước 4,2 kb của các
phân lập O. viverrini của Việt Nam (OvQN, OvBD1, OvPY3) và của Thái
Lan (OvKK). theo sơ đồ tổng quát giới thiệu ở Hình 3.1.










Hình 3.1: Sơ đồ tổng quát thu nhận vùng gen dài 4,2 kb của các phân lập
OvQN, OvBD1, OvPY3 của.Việt Nam và OvKK của Thái Lan.

Các chuỗi gen của các phân lập OvQN, OvBD1, OVPY3 và OvKK
sau khi giải trình trình tự được đưa vào phân tích sử dụng các chương trình
SeqEd1.03 AsemblyLIGNv1.9c và MacVector8.2 (Accelrys Inc.) để thu
nhận toàn bộ trình tự vùng ADN ty thể có độ dài 4,2 kb.
3.2. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH VÙNG GEN TY THỂ DÀI 4,2 KB CỦA
CÁC PHÂN LẬP O. VIVERRINI CỦA VIỆT NAM VÀ THÁI LAN
3.2.1. Phân tích sự biến đổi về thành phần nucleotide giữa các
phân lập O. viverrini của Việt Nam và Thái Lan trong vùng gen ty thể
dài 4,2 kb
Kết quả cho thấy, vùng ADN giới hạn giữa cặp mồi Ov8F-OvR có độ
dài 4.252 bp ở
cả 3 phân lập O. viverrini là OvQN, OvPY3 và OvKK.
Ov8F
cox1
rrnL
rrnS
cox2
nad6
T
C
Y
E
R
nad
5
G
L
1
L
2

S
2
SNR LNR
W
atp6 nad
2
A
V N
I
F M
nad1
P
K
Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
4,2 Kb
1,3 kb
2,9 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3

cox1
rrnL
rrnS
cox2
nad6
T
C
Y
E
R
nad
5
G
L
1
L
2
S
2
SNR LNR
W
atp6 nad
2
A
V N
I
F M
nad1
P
K

Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
Ov4R
OvN3R
Ov15R
Ov17R
Ov19R
Ov21R
Ov8F
OvR
OvF
4,2 Kb
3,7 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvR
OvKK

Ov8F
SảnphẩmPCR
Mồigiải trình trình tự
Vùng gen ty thể 4,2 kb của
các chủng O. viverrini
Ov4R
Ov8F
OvN3R
OvF
OvR
Ov8F
cox1
rrnL
rrnS
cox2
nad6
T
C
Y
E
R
nad
5
G
L
1
L
2
S
2

SNR LNR
W
atp6 nad
2
A
V N
I
F M
nad1
P
K
Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
4,2 Kb
1,3 kb
2,9 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvQN
OvBD1

OvPY3
cox1
rrnL
rrnS
cox2
nad6
T
C
Y
E
R
nad
5
G
L
1
L
2
S
2
SNR LNR
W
atp6 nad
2
A
V N
I
F M
nad1
P

K
Q
D
nad3
cox
3
cob nad
4
H
nad4L
S
1
Ov4R
OvN3R
Ov15R
Ov17R
Ov19R
Ov21R
Ov8F
OvR
OvF
4,2 Kb
3,7 kb
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvQN
OvBD1
OvPY3
OvR

OvKK
Ov8F
SảnphẩmPCR
Mồigiải trình trình tự
Vùng gen ty thể 4,2 kb của
các chủng O. viverrini
Ov4R
Ov8F
OvN3R
OvF
OvR

7
Riêng đối với phân lập OvBD1, độ dài là 4253 nucleotide, do phân lập
OvBD1 có đột biến thêm vào một nucleotde (T) tại vị trí 816 so với 3 phân
lập còn lại, tuy nhiên sự đột biến này xảy ra ở vùng giao gen nên cũng
không gây nên sự thay đổi nào về acid amin. Đăng ký Ngân hàng gen:
OvBD1 (số: EU443831), OvQN (số: EU443832), OvPY3 (số: EU443833).
Có tất cả 58 vị trí sai khác giữa các phân lập O. viverrini với nhau,
chiếm tỷ lệ 1,36% (Bảng 3.1A-B-C-D). Đây là tỷ lệ sai khác cho phép giữa
các phân lập trong cùng một loài. Trong số 58 đột bi
ến, có 9/58 là đột biến
dị hoán (tranversion), chiếm tỷ lệ 15,5%; và 48/58 nucleotide là đột biến
đồng hoán (transition), chiếm tỷ lệ 84,5%.
3.2.2. Phân tích trật tự các gen trong vùng ADN ty thể dài 4,2 kb
Kết quả cho thấy có 5 gen mã hóa protein đó là các gen nad4, atp6,
nad2, nad1 và nad3; và 10 gen mã hóa cho ARN vận chuyển các amino
acid là trnQ (glutamine), trnF (phenylalanine), trnM (methionine), trnV
(valine), trnA (alanine), trnD (aspartate), trnN (asparagine), trnP (proline),
trnI (isoleucine) và trnK (lysine).

Trật tự các gen được sắp xếp như trình bày ở Bảng 3.2
.
3.2.3. Kết quả phân tích các gen mã hóa protein nằm trong vùng
gen ty thể 4,2 kb
a) Kết quả phân tích thành phần nucleotide và amino acid đoạn gen
nad4 của các phân lập O. viverrini
Bảng 3.3: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini với nhau (một
phần gen nad4 dài 807 nucleotide)

















999999
OvPY3
999999
OvBD1

999899
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
999999
OvPY3
999999
OvBD1
999899
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK

8
Bảng 3.1 (A,B,C,D): Bảng phân tích các vị trí có sai khác về nucleotide trong vùng gen ty thể 4,2 kb giữa
các phân lập O. viverrini của Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái Lan, lần lượt theo trật tự các gen.
Ghi chú: Dấu (*) là vùng giao gen









nad2atp6trnM
TCCTCTTGGCCCAT

OvPY3
CTCTTTTGGTTTGT
OvBD1
TCTTCCTGGCTCAC
OvQN
TCCGCTCTCCTTAT
OvKK
16781616158714391407135412581247124612421207114110691019
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
nad2atp6trnM
TCCTCTTGGCCCAT
OvPY3
CTCTTTTGGTTTGT
OvBD1
TCTTCCTGGCTCAC
OvQN
TCCGCTCTCCTTAT
OvKK
16781616158714391407135412581247124612421207114110691019
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
(B)
trnF*nad4
GC-ACTTTGCTTTT
OvPY3
GTTGTCCTATCTAC
OvBD1
GC-GCTTAGCTCAT
OvQN

CC-GCTTTGCTTAT
OvKK
9469428168087697297266965164902342093425
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
trnF*nad4
GC-ACTTTGCTTTT
OvPY3
GTTGTCCTATCTAC
OvBD1
GC-GCTTAGCTCAT
OvQN
CC-GCTTTGCTTAT
OvKK
9469428168087697297266965164902342093425
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng

9

nad1
*
trnAnad2
TCTTCAACCTATCGC
OvPY3
CGTCTGATTTGTTGT
OvBD1
TGTTCACCTTACCAT
OvQN
CGGTTAACTCACCGC
OvKK
334532983023300229522881260325332340212220552047193419021695
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
nad1
*
trnAnad2

TCTTCAACCTATCGC
OvPY3
CGTCTGATTTGTTGT
OvBD1
TGTTCACCTTACCAT
OvQN
CGGTTAACTCACCGC
OvKK
334532983023300229522881260325332340212220552047193419021695
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
nad3trnK*nad1
TGGCCCAGCATTTCT
OvPY3
CAACCTGATGCTCTT
OvBD1
CGGTTTAGCGTCCCC
OvQN
CGGCCTAGTGTTCCT
OvKK
416941454083407040164004399539273908380737233545351934543381
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
nad3trnK*nad1
TGGCCCAGCATTTCT
OvPY3
CAACCTGATGCTCTT
OvBD1
CGGTTTAGCGTCCCC
OvQN

CGGCCTAGTGTTCCT
OvKK
416941454083407040164004399539273908380737233545351934543381
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
(D)
(C)

10

Bảng 3.2: Vị trí các gen mã hoá protein và các trình tự nối các gen (vùng
giao gen) trong vùng gen ty thể dài 4,2 kb của các phân lập O. viverrini



Gen và
trình tự
Vị trí 5'→3'
Độ dài
bp/aa
Bộ mã bắt đầu/
Kết thúc
Ghi chú
nad4 1- 807 807/268 */TAG
808 - 814 Vùng giao gen (7bp)
trnQ 815 - 877 63
878 - 889 Vùng giao gen (12bp)
trnF 890 - 955 66
trnM 956 - 1022 67
atp6 1023 - 1538 516/171 ATG/TAG

1539 - 1556 Vùng giao gen (18bp)
nad2 1557 - 2426 870/289 ATG/TAG
2427 - 2440 Vùng giao gen (14bp)
trnV 2441 - 2506 66
2507 - 2536 Vùng giao gen (30bp)
trnA 2537 - 2598 62
2599 - 2603 Vùng giao gen (5bp)
trnD 2604 - 2671 68
2672 - 2675 Vùng giao gen (4bp)
nad1 2676 - 3578 903/300 GTG/TAG
3579 - 3583 Vùng giao gen (5bp)
trnN 3584 - 3652 69
3653 - 3656 Vùng giao gen (4bp)
trnP 3657 - 3720 64
3721 - 3736 Vùng giao gen (16bp)
trnI 3737 - 3801 65
trnK 3802 - 3867 66
3868 Vùng giao gen (1bp)
nad3 3869 - 4225 357/118 GTG/TAG
trnS1 4226 - 4252 27 Một phần gen trnS1

11
Bảng 3.4: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (một phần gen nad4 dài 807 nucleotide)

Kết quả phân tích thành phần nucleotide và amino acid của đoạn gen
nad4 của các phân lập O. viverrini của Việt Nam và Thái Lan, cho thấy
mức độ tương đồng (%) là rất cao, 98-99% (nucleotide) và 99% (aminino
acid) (Bảng 3.3). Có 10 vị trí có sự sai khác về nucleotide, dẫn đến thay đổi
3 amino acid ở các vị trí 9, 12 và 70 (Bảng 3.4).

b) Kết quả phân tích thành phần gen atp6 ở các phân lập O. viverrini
Bảng 3.5: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini với nhau (gen
atp6)












VCSOvPY3
VSPOvBD1

ASSOvQN
VSSOvKK
70129
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
VCSOvPY3
VSPOvBD1
ASSOvQN
VSSOvKK
70129
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
CTTTGCTTTTOvPY3
TCCTATC
TACOvBD1
CTTAGCT
CATOvQN
CTTTGCT
TATOvKK
769729726696516490234
2093425
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
CTTTGCTTTTOvPY3
TCCTATC
TACOvBD1
CTTAGCT
CATOvQN
CTTTGCT
TATOvKK

769729726696516490234
2093425
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
999999
OvPY3
999999
OvBD1
999899
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
999999
OvPY3
999999
OvBD1
999899
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK

12
Bảng 3.6: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (atp6)

Ghi chú: Khung bôi đậm: Nucleotide làm thay đổi amino acid.
Phân tích gen atp6 cho thấy thành phần nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini có mức độ tương đồng tương đối cao, 98-99%
(nucleotide) và 97-100% (amino acid) (Bảng 3.5). Tỷ lệ này phản ánh mức
độ tương đồng nội loài. Trong khi đó, tỷ lệ tương đồng về thành phần
nucleotide và amino acid của các phân lập O. viverrini so với C. sinensis là
77-78% (nucleotide) và 78-80% (amino acid), với F. buski là 64-65%
(nucleotide) và 78-80% (amino acid), với F. gigantica và F. hepatica thì tỷ
lệ này càng thấp hơn, chỉ đạt 65-66% (nucleotide) và 56-59% (amino
acid). Đây là tỷ
lệ tương đồng ngoại loài, hay nói cách khác, về mặt phân
loại (dựa vào gen atp6) các phân lập O. viverrini và C. sinensis là 2 loài
hoàn toàn khác nhau, còn đối với các loài khác xa nhau nhiều về phân loại
thì mức độ tương đồng càng thấp
So sánh thành phần nucleotide giữa các phân lập O. viverrini của Việt
Nam cho thấy phân lập OvQN và OvPY3 có tỷ lệ tương đồng cao hơn so
với phân lập OvBD1, đạt 98% (nucleotide) và 100% (amino acid); giữa
chúng chỉ sai khác ở 2 vị trí là 184, và 331 và sai khác này không dẫn đến
sự khác biệ
t về amino acid. Như vậy dựa trên kết quả phân tích gen atp6
cho thấy phân lập OvQN và OvPY3 có lẽ gần nhau hơn so với phân lập
OvBD1 (Bảng 3.6).
Trong chuỗi gen atp6, có 10 vị trí có sự sai khác về nucleotide giữa
các phân lập O. viverrini của Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái
Lan (Bảng 3.6). Đặc biệt, ở vị trí 46, 224, 235 và 416 là các vị trí có sự sai
khác giữa các phân lập O. viverrini của Việt Nam so với phân lập OvKK
của Thái Lan và dẫn
đến thay đổi amino acid; trong số đó tại 3 vị trí
nucleotide 224, 235 và 416 thành phần nucleotide của các phân lập O.

viverrini của Việt nam hoàn toàn giống nhau. Ngoại trừ vị trí 46 phân lập
OvBD1 có sai khác với các phân lập còn lại của Việt Nam và Thái Lan dẫn
đến làm thay đổi amino acid ở vị trí 16.
TCTTGGCCCAOvPY3
TTTTGGTTTGOvBD1
TCCTGGCTCAOvQN
GCTCTCCTTAOvKK
41638433123522422321918411846
C¸c vÞ trÝ cã thay ®æi nucleotide
Chñng
TCTTGGCCCAOvPY3
TTTTGGTTTGOvBD1
TCCTGGCTCAOvQN
GCTCTCCTTAOvKK
41638433123522422321918411846
C¸c vÞ trÝ cã thay ®æi nucleotide
Chñng
VFGMOvPY3
VFGVOvBD1
VFGMOvQN
GLLMOvKK
139797516
VÞ trÝ cã sai kh¸c amino acid
Chñng
VFGMOvPY3
VFGVOvBD1
VFGMOvQN
GLLMOvKK
139797516
VÞ trÝ cã sai kh¸c amino acid

Chñng

13
c) Kết quả phân tích thành phần gen nad2 ở các phân lập O. viverrini
Bảng 3.7: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini (gen nad2)






Bảng 3.8: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (nad2)






Ghi chú: Khung bôi đậm: Nucleotide làm thay đổi amino acid
Phân tích gen nad2 cho thấy thành phần nucleotide và amino acid
giữa các phân lập O. viverrini có mức độ tương đồng rất cao, 99%
(nucleotide) và 98-100% (amino acid) (Bảng 3.7).
Có 10 vị trí sai khác về nucleotide giữa các phân lập O. viverrini Việt
Nam so với phân lập OvKK (Thái Lan) (Bảng 3.8). Phân lập OvQN có 4
vị trí sai khác về nucleotide so với phân lập OvKK của Thái Lan tuy nhiên
những sai khác này chưa dẫn đến làm thay đổi về trình tự amino acid. Phân
lập OvPY3 có 3 vị trí sai khác về nucleotide so với phân lập OvKK của
Thái Lan, kết quả dẫn đế

n làm thay đổi 1 amino acid ở vị trí 164. Riêng
phân lập OvBD1 có đến 7 vị trí sai khác về nucleotide so với phân lập
OvKK của Thái Lan và dẫn đến làm thay đổi 3 amino acid ở các vị trí 20,
126 và 164. Nếu chỉ xét riêng về gen nad2, kết quả phân tích cho thấy
phân lập OvBD1 có sự thay đổi nhiều nhất về nucleotide cũng như amino
acid so với phân lập OvKK của Thái Lan và các phân lập khác của Việt
Nam.
999999
OvPY3
999898
OvBD1
9999100
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
999999
OvPY3
999898
OvBD1
9999100
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
CTATCGCTCCOvPY3
TTG
TTGTCTCOvBD1
TTA
CCATTCTOvQN

TCA
CCGCTCCOvKK
783565498
4903773451381215930
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
CTATCGCTCCOvPY3
TTG
TTGTCTCOvBD1
TTA
CCATTCTOvQN
TCA
CCGCTCCOvKK
783565498
4903773451381215930
Các vị trí có thay đổi nucleotide
Chủng
YSSOvPY3
YFFOvBD1
HSSOvQN
HSSOvKK
16412620
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
YSSOvPY3
YFFOvBD1
HSSOvQN
HSSOvKK
16412620
Vị trí có sai khác amino acid

Chủng

14
d) Kết quả phân tích thành phần gen nad1 ở các phân lập O. viverrini
Bảng 3.9: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo) và
amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini (gen nad1)






Bảng 3.10: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (nad1)






Ghi chú: Khung bôi đậm: Nucleotide làm thay đổi amino acid.
Phân tích gen nad1 cho thấy thành phần nucleotide và amino acid
giữa các phân lập O. viverrini cũng có mức độ tương đồng cao, 99%
(nucleotide) và 98-99% (amino acid) (Bảng 3.9).
Có 10 vị trí sai khác về nucleotide giữa các phân lập O. viverrini của
Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái Lan (Bảng 3.10). Kết quả phân
tích cho thấy phân lập OvQN có 5 vị trí sai khác về nucleotide so với phân
lập OvKK của Thái Lan; kết quả dẫn đến làm thay đổi 2 amino acid ở các
vị trí 116 và 290. Phân lập OvPY3 cũng có 5 vị trí sai khác về nucleotide
so vớ

i phân lập OvKK của Thái Lan, kết quả cũng dẫn đến làm thay đổi 2
amino acid. Riêng phân lập OvBD1 chỉ có 4 vị trí sai khác về nucleotide
so với phân lập OvKK của Thái Lan nhưng đều dẫn đến làm thay đổi
amino acid ở các vị trí 69, 109, 116 và 260. Như vậy, tương tự như gen
nad2, sự thay đổi về nucleotide của gen nad1 phân lập OvBD1 cũng dẫn
đến sự thay đổi nhiều nhất về amino acid so với phân lập OvKK của Thái
Lan và các phân lập khác của Việt Nam.
989999
OvPY3
999898
OvBD1
999999
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
989999
OvPY3
999898
OvBD1
999999
OvQN
999999
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
TTCTTCTTCAOvPY3
TCTTCGTCTGOvBD1
CCCCTGTTCAOvQN
TCCTCGGTTAOvKK
869843778705669622347326276205

Các vị t
r
ícótha
y
đ
ổ
inucleotide
Chủng
TTCTTCTTCAOvPY3
TCTTCGTCTGOvBD1
CCCCTGTTCAOvQN
TCCTCGGTTAOvKK
869843778705669622347326276205
Các vị t
r
ícótha
y
đ
ổ
inucleotide
Chủng
MLQVMIOvPY3
MFEVTVOvBD1
TLEVMIOvQN
MLEGMIOvKK
29026020811610969
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
MLQVMIOvPY3
MFEVTVOvBD1

TLEVMIOvQN
MLEGMIOvKK
29026020811610969
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng

15
e) Kết quả phân tích thành phần gen nad3 ở các phân lập O. viverrini
Bảng 3.11: So sánh tỷ lệ (%) tương đồng về nucleotide (trên đường chéo)
và amino acid (dưới đường chéo) của các phân lập O. viverrini (gen nad3)









Bảng 3.12: So sánh các vị trí có thay đổi về nucleotide và amino acid giữa
các phân lập O. viverrini (nad3)

Phân tích gen nad3 cho thấy thành phần nucleotide và amino acid
giữa các phân lập O. viverrini có mức độ
tương đồng rất cao, 98-99%
(nucleotide) và 98-100% (amino acid) (Bảng 3.11).
Có 9 vị trí có sự sai khác cơ bản về nucleotide giữa các phân lập O.
viverrini của Việt Nam so với phân lập OvKK của Thái Lan. (Bảng 3.12).
Kết quả phân tích cho thấy phân lập OvQN có 3 vị trí sai khác về
nucleotide so với phân lập OvKK của Thái Lan. Phân lập OvPY3 cũng có
3 vị trí sai khác về nucleotide so với phân lập OvKK của Thái Lan, Tuy
nhiên sự thay đổi này ở cả 2 phân lập không dẫn đến làm thay đổi amino
acid. Phân lập OvBD1 có 4 vị
trí sai khác về nucleotide so với phân lập
OvKK của Thái Lan, và làm thay đổi amino acid ở 2 vị trí là 20 và 72.
Như vậy, kết quả phân tích các gen nad2, nad1, nad3 đều cho thấy phân
lập OvBD1 tương đổi có nhiều thay đổi về thành phần nucleotide cũng như
amino acid so với phân lập OvKK của Thái Lan hơn là các phân lập khác
của Việt Nam so với phân lập O. viverrini của Thái Lan.
98100100
OvPY3
989898
OvBD1
9898100
OvQN
999899
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
98100100
OvPY3
989898

OvBD1
9898100
OvQN
999899
OvKK
OvPY3OvBD1OvQNOvKK
TGGCCCAGCOvPY3
CA
ACCTGATOvBD1
CG
GTTTAGCOvQN
CG
GCCTAGTOvKK
300276
2142011471351265839
Các vị trí có thay đổinucleotide
Chủng
TGGCCCAGCOvPY3
CA
ACCTGATOvBD1
CG
GTTTAGCOvQN
CG
GCCTAGTOvKK
300276
2142011471351265839
Các vị trí có thay đổinucleotide
Chủng
DVOvPY3
NIOvBD1

DVOvQN
DVOvKK
7220
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng
DVOvPY3
NIOvBD1
DVOvQN
DVOvKK
7220
Vị trí có sai khác amino acid
Chủng

16
3.2.4. Kết quả phân tích các gen ARN vận chuyển nằm trong vùng
gen ty thể 4,2 kb
Xác định được 10 ARN vận chuyển amino acid là trnQ, trnF, trnM,
trnV, trnA, trnD, trnN, trnP, trnI và trnK. Các gen ARN vận chuyển này
có kích thước gần giống nhau, dao động trong khoảng 62-69 nucleotide,
tương tự với các loài sán dẹt khác đã được nghiên cứu như F. hepatica,
Paragonimus westermani, Taenia solium, T. crassiceps
So sánh từng gen ARN vận chuyển của các phân lập O. viverrini,
chúng tôi nhận thấy các trình tự này đều giống nhau ở hầu hết các chuỗi
ARN vận chuyển. Tuy nhiên, cũng có một vài đột biến xảy ra ở trình tự
ARN vận chuyển, nhưng các đột biến này đều nằm ngoài vị trí của bộ ba
nucleotide của đối mã (anticodon), dùng để nhận biết bô ba mã hóa cho
amino acid mà chúng vận chuyển, nên cũng không làm ảnh hưởng đến
chức năng vận chuyển amino acid của chúng.
Trật tự của 10 gen ARN vận chuyển của các phân lập
O. viverrini

trong vùng gen ty thể 4,2 kb đang phân tích là không có sự thay đổi so với
các loài sán lá khác đã được nghiên cứu.
Tất cả các ARN vận chuyển của sán lá gan nhỏ đều có cấu trúc chuẩn
có hình dạng “cỏ 3 lá” “clover-leaf” tương tự như cấu trúc của ARN vận
chuyển của hệ gen ở trong nhân.

3.3 KẾT QUẢ PHÂN TÍCH MỐI QUAN HỆ PHẢ HỆ CỦA CÁC
PHÂN LẬP O. VIVERRINI CỦA VIỆT NAM VÀ THÁI LAN DỰA
VÀO MỘT SỐ GEN TRONG VÙNG GEN 4,2 KB
Trong vùng gen ty thể 4,2 kb, có 4 gen hoàn chỉnh
đã được xác định là
atp6, nad2, nad1 và nad3, chúng tôi sử dụng toàn bộ chuỗi nucleotide của
các gen atp6, nad3 và nad1, là những gen thông dụng trong phân tích đặc
tính sinh học phân tử. Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ trên cơ sở các
gen riêng biệt là atp6, nad3, nad1, được trình bày ở Hình 3.2, Hình 3.3, và
Hình 3.4.

17
Phân tích phả hệ với chuỗi gen atp6

Hình 3.2: Phân tích mối quan hệ phả hệ trên cơ sở gen atp6 của các
phân lập O. viverrini và các loài C. sinensis (CsND), Paragonimus
westermani (PwKR), Fasciolopsis buski (FbL2), Fasciola gigantica
(FgIND), F. hepatica (FhUS), Echinococcus granulosus, G1 (EgG1),
Echinococcus granulosus, G4 (EgG4), Echinococcus mutilocularis (Em),
Taenia crasciceps (TcUS), T. solium (TsCN) và T. asiatica (TasTW).
Kết quả cho thấy, các phân lập O. viverrini của Việt Nam và Thái Lan
tập trung với nhau tạo thành nhóm phụ trong nhóm các loài thuộc lớp
Trematoda. Các loài sán dây thuộc lớp Cestoda nhóm họp cùng nhau tạo
thành một nhóm riêng tạo thành một trong 2 nhánh phân loại riêng biệt c
ủa
sán dẹt (Hình 3.2). Trong lớp Trematoda, các phân lập O. viverrini tập hợp
thành một nhóm; trong đó phân lập OvQN và OvPY3 xếp gần nhau và gần
với phân lập OvKK (Thái Lan) hơn so với phân lập OvBD1, phù hợp với
kết quả phân tích về mức độ tương đồng về thành phần nucleotide ở trên.
OvPY3atp6
OvQNatp6
OvKKatp6
OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6

FhUSatp6
EgG1atp6
EgG4atp6
Ematp6
TcUSatp6
TsCNatp6
TasTWatp6
0.05
Trematoda
Cestoda
O. viverrini
OvPY3atp6
OvQNatp6
OvKKatp6
OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6
FhUSatp6
EgG1atp6
EgG4atp6
Ematp6
TcUSatp6
TsCNatp6
TasTWatp6
0.05
OvPY3atp6
OvQNatp6
OvKKatp6

OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6
FhUSatp6
EgG1atp6
EgG4atp6
Ematp6
TcUSatp6
TsCNatp6
TasTWatp6
0.05
OvPY3atp6
OvQNatp6
OvKKatp6
OvBD1atp6
CsNDatp6
PwKRatp6
FbL2atp6
FgINDatp6
FhUSatp6
EgG1atp6
EgG4atp6
Ematp6
TcUSatp6
TsCNatp6
TasTWatp6
0.05
Trematoda

Cestoda
O. viverrini

18
Phân tích phả hệ với chuỗi gen nad3










Hình 3.3: Phân tích mối quan hệ phả hệ trên cơ sở gen nad3 của các
phân lập O. viverrini trong nghiên cứu này (OvBD1, Bình Định; OvPY3,
Phú Yên; OvQN, Quảng Nam) và các phân lập khác của Việt Nam
(OvDL3, Dak Lak, DQ882174
) với các phân lập Thái Lan (OvKK) và
OvMH (Thái Lan), OvL (Lào) và Cs (C. sinensis); Pwe (P. westermani)
và Fh(AUS) (F. hepatica, Australia).
Kết quả cho thấy các phân lập O. viverrini cũng tập hợp thành một
nhóm rất gần nhau; trong đó phân lập OvBD1 (Bình Định) gần với phân
lập OVKK (Thái Lan), tương tự như kết quả phân tích phả hệ dựa vào gen
nad1; phân lập OvDL3 (Đak Lak) lại gần với phân lập OvQN (Quảng
Nam); C. sinensis; P. westermani và F. hepatica tách riêng tạo thành các
nhánh riêng biệt (Hình 3.3).
Phân tích phả hệ với chuỗi gen nad1
Kết quả cho thấy, rõ ràng, tất cả các phân lập O. viverrini tập hợp

thành một nhóm (Hình 3.4) bao gồm tất cả các phân lập phân lập tại các
vùng địa lý khác nhau của cùng một loài.






Hình 3.4: Phân tích mối quan hệ phả hệ giữa các phân lập O. viverrini
và Fh (F. hepatica) trên cơ sở gen nad1. Các phân lập O. viverrini cũng
tập hợ
p thành một nhóm và Fh (F. hepatica) tách thành một nhóm khác.
OvBD1nad3
OvKKnad3FF
OvLnad3
OvDL3nad3
OvQNnad3
OvPY3nad3
OvMHnad3
Csnad3FF
Pwenad3(Jn)
Fhnad3(AUS)
0.05
OvKKnad1
OvBD1nad1
OvQNnad1
OvPY3nad1
Fhnad1
0.05

19
Một số nhận xét về phân tích phả hệ: Rõ ràng, các phân lập thuộc cùng
một loài, tuy có nguồn gốc địa lý khác nhau, ở Việt Nam, ở Thái Lan hay
Lào, đều tập trung vào một nhóm có quan hệ gần gũi với nhau về di truyền
học. Các loài khác được đưa vào phân tích, tùy theo mức độ khác nhau về
mặt phân loại mà có những sự sắp xếp khác nhau trong cây phả hệ (Hình
3.2-3.4).
3.4. KẾT QUẢ PHÂN TÍCH TỔNG THỂ VÙNG GEN TY THỂ 4,2
KB CỦA CÁC PHÂN LẬP
OPISTHORCHIS VIVERRINI VÀ MỘT
SỐ LOÀI SÁN DẸT THƯỜNG GẶP
3.4.1. Sử dụng thành phần các nucleotide kiến tạo vùng gen ty
thể 4,2 kb của các phân lập O viverrini của Việt Nam và Thái Lan
Kết quả phân tích sử dụng thành phần các nucleotide kiến tạo vùng
gen ty thể 4,2 kb (Bảng 3.13) cho thấy, tất cả các phân lập sử dụng 44,1-
44,3% thymine (T); 12,2-12,3% cytosine (C); 15,9% adenine (A); và
27,6% guanine (G) để kiến tạo vùng gen ty thể dài 4.252-4.253 bp. Tỷ lệ
A+T là 60% và G+C là 40%. Đây là một tỷ lệ sử dụng A+T và G+C thông
d
ụng ở các loài sán lá gan lớn (Fasciola spp) và sán lá phổi (Paragonimus
spp). Như vậy, ở sán lá gan nhỏ O. viverrini, tỷ lệ này cũng tương đồng
với các loài sán lá nói chung được khảo sát cho đến nay, trừ các loài sán
máng Schistosoma spp. Sán máng Schistosoma spp có tỷ lệ sử dụng A+T
vượt trội (đến 70%) và sử dụng ít hơn các nucleotide G+C (khoảng 30%).

Bảng 3.13: Thành phần nucleotide sử dụng trong vùng gen ty thể 4,2 kb
(4.252 nucleotide) của các phân lập Việt Nam và Thái Lan (No: số
nucleotide; %: tỷ lệ so với toàn b
ộ số nucleotide của chuỗi gen 4,2 kb)

OvBD1 OvQN OvPY3 OvKK

No % No % No % No %
T
1884 44,3 1876 44,1 1879 44,2 1877 44,2
C
517 12,2 525 12,3 524 12,3 525 12,3
A
676 15,9 677 15,9 677 15,9 676 15,9
G
1175 27,6 1174 27,6 1172 27,6 1174 27,6
A+T
2560 60,2 2553 60,0 2556 60,1 2553 60,1
G+C
1692 39,8 1699 40,0 1696 39,9 1699 39,9


20
3.4.2. Tương đồng thành phần nucleotide vùng gen ty thể 4,2 kb
giữa các loài sán dẹt thường gặp
Phân tích tương đồng thành phần nucleotide của vùng gen ty thể 4,2
kb giữa 10 loài sán dẹt bao gồm 6 loài thuộc lớp Trematoda (sán lá) và 4
loài thuộc lớp Cestoda (sán dây). Sáu loài sán lá đó là Opisthorchis
viverrini (4 phân lập đang nghiên cứu: OvBD1, OvQN, OvPY3, OvKK),
Clonorchis sinensis (phân lập Nam Định); FgIND: sán lá gan lớn Fasciola
gigantica (nguồn gốc Indonesia); FhAUS: Fasciola hepatica (nguồn gốc
Australia); FbL2: sán lá ruột lớn Fasciolopsis buski (từ lợn); PweKR: sán
lá phổi Paragonimus westermani (nguồn gốc Hàn Qu
ốc). Bốn loài sán dây

bao gồm: Emu: sán dây chó/cừu Ecchinococcus multilocularis; Tas: sán
dây người Taenia asiatica; Tso: sán dây lợn T. solium; Hdi: sán dây
Hymenolepis diminuta; EgG1: sán dây chó Ecchinococcus granulosus
(genotype G1). Kết quả cho thấy, giữa sán lá gan nhỏ Clonorchis sinensis
(phân lập CsND) và 4 phân lập O. viverrini tỷ lệ tương đồng là 76%, cao
hơn so với tỷ lệ tương đồng của sán lá gan lớn (FgIND, FhAUS), sán ruột
lớn (FbL2) và sán phổi (PweKR). Tỷ lệ tương đồng giữa O. viverrini và
các loài sán lá này là 60-64%. Như vậy, mức độ sai khác 36% đến 40%
giữa
O. viverrini với các loài sán lá này, cũng như 26% với sán lá gan nhỏ
cùng họ Opisthorchidae là C. sinensis, phản ánh đúng quan hệ biến đổi
ngoại loài (inter-specific variation).
3.4.3 Quan hệ phân loại giữa các loài sán dẹt thường gặp trên cơ
sở phân tích toàn bộ vùng gen ty thể 4,2 kb
Phân tích mối quan hệ phân loại trên cơ sở phân tích toàn bộ chuỗi
gen dài 4,2 kb của các phân lập thuộc loài O. viverrini và các loài sán lá,
sán dây thường gặp cho thấy các phân lập O. viverrini hợp thành một
nhóm gần gũi nhau cùng với C.sinensis. M
ối quan hệ càng xa dần giữa các
phân lập/loài sán lá khi so sánh với sán lá gan lớn và sán lá phổi. Các loài
sán dây (ký hiệu: Emu, EgG1, Tas, Tso, Hdi) nằm ở vòng ngoài cùng,
chứng tỏ mối quan hệ phân loại của chúng với O. viverrini xa hơn rất
nhiều so với các loài sán lá gan và sán lá phổi (Hình 3.5). Như vậy, phân
tích mối quan hệ về loài trên cơ sở thành phần gen riêng rẽ mã hoá protein
(atp6, nad1, nad3), hay toàn bộ chuỗi gen dài 4.2 kb đều cho kết quả
tương ứng về mối quan hệ phân lo
ại của O. viverrini với các loài trong
ngành sán dẹt (Platyhelminthes).

21

Hình 3.5: Quan hệ phân loại giữa O. viverrini và các loài sán dẹt trên cơ sở
phân tích toàn bộ chuỗi gen 4,2 kb. Các dấu móc chỉ mối quan hệ ngày
càng xa dần giữa các phân lập/loài sán lá. Sán dây có quan hệ xa hơn với
O. viverrini và sán lá (lớp Trematoda).

3.5. THẢO LUẬN CHUNG
Vùng gen dài 4,2 kb được chọn để giải trình trình tự vì vùng gen này
chứa các gen quan trọng của ty thể, bao gồm 5 gen mã hóa protein là gen
nad4, atp6, nad2, nad1, nad3 và 10 gen mã hóa cho ARN vận chuyển
amino acid. Vùng gen này bao gồm cụm gen nad4, atp6, nad2, nad1,
nad3, là các gen mã hoá và chịu trách nhiệm tổng hợp các enzym có vai
trò quan trọng trong hoạt động dẫn truyền điện tử và tạo năng lượng của ty

thể. Những gen này thông thường được bảo tồn cao giữa các phân lập
trong loài, và giữa các loài trong một giống và lớp phân loại. Như vậy với
việc giải trình trình tự vùng gen 4,2 kb của cả 3 phân lập O. viverrini củ
a
Việt Nam là OvQN, OvBD1 và OvPY3 để so sánh với phân lập OvKK
(Thái Lan), cũng như với các loài sán lá sán dây gây bệnh thường gặp
khác, sẽ cung cấp một số lượng thông tin tương đối đầy đủ để nghiên cứu
phân tích các phân lập O. viverrini khác nhau về địa lý.
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb)
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb)
FhAUS(4.2kb)
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb)
OvBD1(4.2kb)
OvQN(4.2kb)
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb)
Tas(4.2kb)
Tso(4.2kb)
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb
FhAUS(4.2kb
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb

OvKK(4.2kb)
100
93
100
100
100
100
100
100
75
100
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb)
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb)
FhAUS(4.2kb)
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb)
OvBD1(4.2kb)
OvQN(4.2kb)
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb)
Tas(4.2kb)
Tso(4.2kb)
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb
FhAUS(4.2kb

PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb
OvKK(4.2kb)
100
93
100
100
100
100
100
100
75
100
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb)
Hdi(4.2kb)
FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb)
FhAUS(4.2kb)
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb)
OvBD1(4.2kb)
OvQN(4.2kb)
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb)
Tas(4.2kb)
Tso(4.2kb)
Emu(4.2kb)
EgG1(4.2kb
Hdi(4.2kb)

FbL2(4.2kb)
FgIND(4.2kb
FhAUS(4.2kb
PweKR(4.2kb)
CsND(4.2kb
OvPY3(4.2kbOvPY3(4.2kb
OvKK(4.2kb)
100
93
100
100
100
100
100
100
75
100

22
Vùng gen ty thể dài 4,2 kb chứa khối gen atp6-nad2-nad1-nad3, đây
là khối gen được gọi là “điểm nóng” (“HOT SPOT”) trong hệ gen ty thể
của sán dẹt, điểm này đánh dấu có sự đảo vị trí hay/hoặc sắp xếp lại trật tự
của các gen. Các nghiên cứu trước đây của một số tác giả trên một số loài
sán dẹt cho thấy trật tự các gen mã hóa protein của sán lá gan nhỏ rất giống
với các loài sán dẹt khác như sán lá gan lớn (Fasciola spp), sán lá phổi
(Paragonimus westermani) hay sán máng châu Á (
Schistosoma japonicum,
S. mekongi ). Tuy nhiên, trật tự gen lại khác biệt đáng kể so với sán máng
châu Phi như Schistosoma mansoni, S. haematobium, S. intercalatum,
trước đây đã được phát hiện, đó là có sự sắp xếp lại trật tự của 2 khối gen

atp6-nad2 và nad1-nad3 ở ADN ty thể của các loài sán máng Ấn Độ và
châu Phi. Do đó, việc phân tích vùng gen này còn giúp cho việc xác định
trật tự sắp xếp của các gen này ở sán lá gan nhỏ O. viverrini.
Ứng dụng các kỹ thuật PCR cực đại và PCR thông thường chúng tôi
đã thành công trong việc giải trình trình tự đoạn gen dài 4,2 kb của 3 phân
lập O. viverrini thu nhận tại một số tỉnh miền Trung Việt Nam là OvQN
(Quảng Nam), OvBD1 (Bình Định) và OvPY3 (Phú Yên). Vùng gen này
bao gồm 15 gen, trong đó có 5 gen mã hóa protein, đó là các gen nad4
(một phần gen), toàn bộ các gen atp6, nad2, nad1,
nad3 và 10 gen mã hóa
cho các ARN vận chuyển các amino acid là trnQ, trnF, trnM, trnV, trnA,
trnD, trnN, trnP, trnI và trnK.
Trật tự các gen mã hóa protein và các ARN vận chuyển cũng giống
với các loài sán dẹt đã được nghiên cứu trước đây. Đây là công bố đầu tiên
về trật tự và thành phần gen của loài sán lá gan nhỏ O. viverrini, ít nhất là
ở vùng gen ty thể dài 4,2 kb này.
Các gen mã hóa protein của sán lá gan nhỏ O. viverrini đều có mã mở
đầu là ATG hoặc GTG, đ
ây là các mã mở đầu phổ biến được sử dụng ở
các loài giun sán ký sinh; mã kết thúc của gen thường là TAG, đó là một
trong các bộ mã kết thúc chung cho đa số các loài. Việc xác định các bộ
mã khởi đầu và mã kết thúc ở một số gen mã hóa protein của sán lá gan
nhỏ O. viverrini là thêm một bằng chứng nữa minh họa cho sự đa dạng về
các bộ mã này ở hệ gen ty thể của các loài giun sán ký sinh.
Trong số 5 gen mã hóa protein, chúng tôi chỉ thu được phần cu
ối gen
nad4 (hướng 5’-3’), có chiều dài là 807 nucleotide, mã hóa cho 268 amino
acid, có bộ mã kết thúc là TAG. Bốn gen còn lại là các gen hoàn chỉnh.
Gen atp6 của tất cả các phân lập O. viverrini có kích thước là 516 bp, mã
hoá cho 171 amino acid. Bộ mã khởi đầu là ATG và bộ mã kết thúc là

TAG. Gen nad2 của tất cả các phân lập O. viverrini có kích thước là 870
bp, mã hoá cho 289 amino acid. Bộ mã khởi đầu là ATG và bộ mã kết thúc
là TAG. Gen nad1của tất cả các phân lập O. viverrini là 903 bp, mã hoá

23
cho 300 amino acid. Bộ mã khởi đầu là GTG. Bộ mã kết thúc là TAG. Độ
dài của gen nad3 là 357 bp, mã hoá cho 116 amino acid, Bộ mã khởi đầu
cho gen nad3 là GTG. Bộ mã kết thúc cho gen nad3 là TAG.
Các gen ARN vận chuyển có kích thước gần giống nhau, dao động
trong khoảng 62-69 nucleotide. Trật tự của 10 gen ARN vận chuyển của
các phân lập O. viverrini trong đoạn gen phân tích là không có sự thay đổi
so với các loài sán lá khác đã được nghiên cứu. Các gen mã hóa cho các
ARN vận chuyển cũng có kích thước tương tự như
ở một số loài sán lá gan
khác như C. sinenensis, F. hepatica, F. gigantica, các gen này thường có
kích thước dao động trong khoảng 60-70 nucleotide. Các ARN vận chuyển
có cấu trúc dạng “cỏ 3 lá” “clover-leaf” chuẩn, đó là cấu trúc đặc trưng
của ARN vận chuyển có trong hệ gen ty thể và hệ gen nhân của tất cả mọi
loài.
Kết quả phân tích mối quan hệ phả hệ cho thấy các phân lập O.
viverrini được xếp vào cùng một nhóm, chứng tỏ chúng thuộc cùng một
loài và những s
ự sai khác giữa chúng là những đột biến cho phép giữa các
phân lập trong cùng loài. Phân tích mối quan hệ về loài trên cơ sở sử dụng
thành phần gen riêng rẽ mã hoá protein (atp6, nad1, nad3), hay toàn bộ
chuỗi gen dài 4.2 kb bao gồm tất cả các loại gen (mã hoá protein, gen
ARN vận chuyển) kể cả thành phần nucleotide không mã hoá của các vùng
giao gen, đều cho kết quả tương ứng về mối quan hệ phân loại của O.
viverrini với các loài trong ngành sán dẹt (Platyhelminthes).
Các kết quả thu được từ đo

ạn gen 4,2 kb của các phân lập O. viverrini
của Việt Nam sẽ là nguồn thông tin có giá trị trong nghiên cứu về gen và
hệ gen, về xây dựng kit chẩn đoán, về dữ liệu đối chiếu so sánh trong giám
định phân loại. Nguồn thông tin thu được cũng cung cấp những đặc điểm
sinh học và dịch tễ học phân tử của loài sán lá gan nhỏ O. viverrini, giúp
cho việc xác định phân bố phân tử của chúng cũng như giúp cho các
nghiên cứu về
phòng chống và điều trị có hiệu quả bệnh này ở Việt Nam
và thế giới.