Nghiên cứu tình hình phát hiện kiểu hình và kiểu gen của vi khuẩn staphylococcus aureus kháng methicilline được phân lập từ những bệnh phẩm tại bệnh viện trường đại học y dược cần thơ v
Bạn đang xem bản rút gọn của tài liệu. Xem và tải ngay bản đầy đủ của tài liệu tại đây (2.46 MB, 100 trang )
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ
NGUYỄN THỊ BÉ HAI
NGHIÊN CỨU TÌNH HÌNH PHÁT HIỆN KIỂU HÌNH VÀ
KIỂU GEN CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS AUREUS
KHÁNG METHICILLINE ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ NHỮNG
BỆNH PHẨM TẠI BỆNH VIỆN TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC
CẦN THƠ VÀ BỆNH VIỆN ĐA KHOA THÀNH PHỐ CẦN THƠ
NĂM 2020-2021
Chuyên ngành: Khoa học Y sinh
Mã số: 8720101
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Y SINH
Người hướng dẫn khoa học: Ts.Bs. Nguyễn Thị Hải Yến
Cần Thơ – 2021
LỜI CẢM ƠN
Để hồn thành luận văn này, tơi đã nhận được rất nhiều sự giúp đỡ của các thầy
cô giáo, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Tơi xin bày tỏ lịng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới Ts.Bs. Nguyễn Thị Hải Yến
là người đã trực tiếp hướng dẫn và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong q trình thực
hiện luận văn.
Tơi xin trân trọng cám ơn Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau đại học, khoa Y,
các thầy cô Bộ môn Vi sinh, Trường Đại học Y Dược Cần Thơ đã trang bị kiến thức,
tạo điều kiện, giúp đỡ cho tôi trong thời gian học tập và làm việc tại Trường. Tơi xin
bày tỏ lịng biết ơn tới Ban Giám đốc Bệnh viện Trường Đại hoc Y Dược Cần Thơ và
Bệnh viện Đa Khoa Thành phố Cần Thơ, Ban Lãnh đạo và tập thể Khoa Xét nghiệm
Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Bệnh viện Đa khoa Thành Phố Cần
Thơ đã tạo điều kiện và động viên tơi hồn thành luận văn này.
Tơi vơ cùng biết ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã động viên,
hỗ trợ tôi cả về tinh thần và vật chất trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.
Cần Thơ, tháng 8 năm 2021
Nguyễn Thị Bé Hai
CAM ĐOAN
Tơi xin cam đoan, đây là cơng trình nghiên cứu do tơi chủ trì thực
hiện dưới sự hướng dẫn của Ts.Bs. Nguyễn Thị Hải Yến. Các số liệu trong
luận văn là trung thực và kết quả nghiên cứu chưa từng được ai cơng bố
trong bất kỳ cơng trình nào khác.
Tác giả
Nguyễn Thị Bé Hai
MỤC LỤC
Lời cam đoan
Danh mục các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình
Danh mục các biểu đồ
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................... 3
1.1. Đặc điểm của Staphylococcus aureus .......................................................... 3
1.2. Đặc điểm S. aureus kháng methicilline (MRSA) ........................................ 4
1.3. Các kỹ thuật xác định S. aureus và MRSA trong phòng xét nghiệm .......... 6
1.4. Các nghiên cứu về S. aureus kháng methicilline (MRSA) ........................13
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........19
2.1. Đối tượng ...................................................................................................19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...........................................................................19
2.3. Đạo đức trong nghiên cứu ..........................................................................31
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ...................................................32
3.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu .........................................................................32
3.2. Tỉ lệ nhiễm MRSA và một số yếu tố liên quan .........................................35
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN ...........................................................................49
4.1. Đặc điểm mẫu nghiên cứu .........................................................................49
4.2. Đặc điểm về MRSA và một số yếu tố liên quan........................................52
4.3. Đánh giá độ tương thích giữa phương pháp phát hiện MRSA bằng kiểu
hình và kiểu gen ................................................................................................62
KẾT LUẬN ..................................................................................................66
KIẾN NGHỊ .................................................................................................68
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CLSI:
Clinical and Laboratory Standards Institute
MRSA:
Methicillin resistant Staphylococcus aureus
(Tụ cầu vàng kháng Methicillin)
MSSA:
Methicillin susceptible Staphylococcus aureus
(Tụ cầu vàng nhạy cảm Methicillin)
PCR:
Polymerase Chain Reaction
(Phản ứng trùng hợp chuỗi)
PVL:
Panton-Valentine leukocidin
S. aureus:
Staphylococcus aureus
DANH CÁC MỤC BẢNG
Bảng 2.1:
Khả năng mẫn cảm với kháng sinh của MRSA ........................ 22
Bảng 2.2:
Tóm tắt thành phần cho một phản ứng PCR............................. 28
Bảng 3.1:
Phân bố S. aureus theo giới ...................................................... 32
Bảng 3.2:
Phân bố S. aureus theo nhóm tuổi ............................................ 32
Bảng 3.3:
Phân bố S. aureus theo nơi cư trú ............................................. 33
Bảng 3.4:
Phân bố S. aureus theo khoa phòng .......................................... 33
Bảng 3.5:
Phân bố S. aureus theo mẫu bệnh phẩm ................................... 34
Bảng 3.6:
Phân bố S. aureus theo bệnh lý nền được chẩn đoán ............... 34
Bảng 3.7:
Phân bố S. aureus theo số ngày nằm viện trước khi thực hiện
xét nghiệm .................................................................................. 34
Bảng 3.8:
Phân bố S. aureus theo gen PVL .............................................. 35
Bảng 3.9:
Phân bố MRSA theo nhóm tuổi ................................................ 36
Bảng 3.10:
Phân bố MRSA và MSSA theo giới tính .................................. 36
Bảng 3.11:
Phân bố MRSA theo nơi cư trú................................................. 37
Bảng 3.12:
Phân bố MRSA và MSSA theo khoa phòng............................. 37
Bảng 3.13:
Phân bố MRSA theo bệnh nền được chẩn đoán ....................... 38
Bảng 3.14:
Phân bố MRSA theo loại bệnh phẩm ....................................... 38
Bảng 3.15:
Phân bố MRSA theo số ngày nằm viện trước khi thực hiện
xét nghiệm................................................................................. 39
Bảng 3.16:
Phân bố MRSA với đa kháng kháng sinh ................................. 39
Bảng 3.17:
Đề kháng kháng sinh của MRSA và MSSA bằng máy Vitek .. 40
Bảng 3.18:
Đề kháng kháng sinh của MRSA và MSSA bằng phương pháp
Kirby-Bauer .............................................................................. 41
Bảng 3.19:
Tỉ lệ MRSA và MSSA theo gen PVL....................................... 42
Bảng 3.20:
Phân bố MRSA có mang gen PVL trên bệnh hiện mắc .......... 42
Bảng 3.21:
Phân bố đề kháng kháng sinh của chủng MRSA có mang gen
PVL ........................................................................................... 43
Bảng 3.22:
Phân bố MRSA có mang gen PVL theo thời gian nằm viện .... 44
Bảng 3.23:
Phân bố MRSA có mang gen PVL theo đa kháng kháng sinh ........ 44
Bảng 3.24:
So sánh khả năng chẩn đoán MRSA theo máy Vitek bằng các
chuẩn xác định khi đối chiếu với phương pháp Realtime-PCR 46
Bảng 3.25:
So sánh khả năng chẩn đoán MRSA theo phương pháp
Kirby-Bauer bằng các chuẩn xác định khi đối chiếu với
Realtime-PCR ........................................................................... 46
Bảng 3.26:
Đánh giá tương đồng giữa Kirby-Bauer và Realtime-PCR ...... 47
Bảng 3.27:
Đánh giá sự tương đồng giữa phương pháp Kirby-Bauer và
Vitek
. ………………………………………………………………..48
Bảng 3.28: Đánh giá sự tương đồng giữa phương pháp Realtime-PCR và
phương pháp bằng máy Vitek .................................................... 48
Bảng 4.1:
So sánh tỉ lệ MRSA phân lập được từ các mẫu bệnh phẩm trong
nghiên cứu với các tác giả khác ................................................ 55
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1:
Cơ chế đề kháng của MRSA..................................................... 6
Hình 1.2:
Máy Vitek 2 Compact ............................................................... 9
Hình 1.3:
Máy Real-time PCR Gen-up ................................................... 12
Hình 1.4:
Tỉ lệ chủng MRSA phân lập được các quốc gia ..................... 15
DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ 3.1:
Phân bố MRSA ..................................................................... 35
Biểu đồ 3.2:
Phân bố gen PVL của S. aureus và MRSA .......................... 42
Biểu đồ 3.3:
Phân bố MRSA và MSSA phân lập được bằng phương pháp
kiểu hình và kiểu gen ............................................................ 45
1
MỞ ĐẦU
Staphylococcus aureus là một trong những loại vi khuẩn gây bệnh quan
trọng trên người vì độc lực cao, gây ra các bệnh nhiễm trùng nặng đe dọa đến
tính mạng. Ngày nay, S. aureus là nguyên nhân hàng đầu gây ra các bệnh
nhiễm trùng liên quan đến chăm sóc sức khỏe trên tồn cầu [28]. S. aureus có
thể gây nhiễm trùng ngoài da, ngộ độc thực phẩm, viêm tủy xương, nhiễm
khuẩn huyết hay nhiễm trùng hậu phẫu,... [19], [14]. Có nhiều loại kháng sinh
đươc sử dụng điều trị S. aureus, bao gồm Methicillin, Tetracycline,
Fluoroquinolones, Linezolid và Daptomycin. Tuy nhiên các kháng sinh này
nhanh chóng bị đề kháng do vi khuẩn có cơ chế đề kháng hiệu quả với kháng
sinh [71], đặc biệt là S. aureus kháng Methicillin (MRSA).
Các chủng S. aureus kháng Methicillin là tác nhân gây nhiễm trùng
bệnh viện quan trọng trên thế giới với tỉ lệ nhiễm MRSA thay đổi từ 7% đến
60% [66], [47], [50] gây ảnh hưởng đến hiệu quả điều trị các tuyến y tế cơ sở
làm gia tăng chi phí chăm sóc sức khỏe [28]. Cơ chế đề kháng kháng sinh
Beta-lactam của MRSA là do sự hiện diện của gen mecA, tạo ra
transpeptidase PB2a làm giảm ái lực của vi khuẩn với kháng sinh Beta-lactam
[69].
Các phương pháp được sử dụng để xác định MRSA, bao gồm phương
pháp khuếch tán trên thạch đĩa Oxacillin, Oxacillin và / hoặc Cefoxitin và
phương pháp tìm nồng độ ức chế tối thiểu Oxacillin. Tuy nhiên, có nhiều báo
cáo cho thấy các xét nghiệm này có độ nhạy và độ đặc hiệu chưa cao. Do đó,
cần phải sử dụng phương pháp PCR là một xét nghiệm dựa trên DNA của vi
khuẩn S.aureus để xác định gen mecA [40].
Trên thế giới, xét nghiệm PCR tìm gen mecA là tiêu chuẩn vàng để xác
định MRSA. Tuy nhiên tại Việt Nam, phương pháp này chưa được sử dụng
2
rộng rãi. Chính vì vậy chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu
tình hình phát hiện kiểu hình và kiểu gen của vi khuẩn Staphylococcus
aureus kháng Methicilline được phân lập từ những bệnh phẩm tại Bệnh
viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và Bệnh viện Đa khoa Thành phố
Cần Thơ năm 2020-2021” với hai mục tiêu sau:
1. Xác định tỷ lệ nhiễm Staphylococcus aureus kháng Methicilline
(MRSA) trên quần thể Staphylococcus aureus phân lập được từ mẫu bệnh
phẩm và một số yếu tố liên quan tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược
Cần Thơ và Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ.
2. Xác định giá trị phát hiện Staphylococcus aureus kháng
Methicilline bằng kỹ thuật kiểu hình so với kỹ thuật kiểu gen từ mẫu bệnh
phẩm được phân lập tại Bệnh viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ và
Bệnh viện Đa khoa Thành phố Cần Thơ
3
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của Staphylococcus aureus
1.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Staphylococci là một trong những vi khuẩn gây bệnh ở người được biết đến
từ rất sớm. Năm 1878, Robert Koch phát hiện được Staphylococci trong mủ của
một bệnh nhân. Hai năm sau - 1880, Louis Pasteur đã nuôi cấy được vi khuẩn này
trên môi trường lỏng nhân tạo. Sau đó, năm 1881, Ogston chứng minh vai trò gây
bệnh thực nghiệm cho chuột và đặt tên cho những cầu khuẩn này là
Staphylococcus [5]. Chi Staphylococcus bao gồm ít nhất 20 lồi, trong đó S.
aureus là lồi gây bệnh hay gặp nhất ở người [5].
1.1.2. Tính chất sinh học của S. aureus
S. aureus là những cầu khuẩn Gram dương, có đường kính 0,8-1m,
xếp thành hình chùm nho, khơng có lơng, khơng sinh nha bào và thường
khơng có vỏ. S. aureus thuộc loại dễ ni cấy, phát triển được ở nhiệt độ
100C-450C và nồng độ muối cao tới 10%, thích hợp ở cả điều kiện hiếu và kỵ
khí.
Trên mơi trường thạch thường, S. aureus tạo thành khuẩn lạc S; đường
kính 1-2mm sau 24 giờ ở 370C, thường có màu vàng chanh. Trên mơi trường
thạch máu, S. aureus phát triển nhanh; tạo tan máu hoàn toàn. S. aureus tiết ra
5 loại hemolysin: α, β, δ, ε, γ. Trên môi trường canh thang, S. aureus làm đục
môi trường; nếu để lâu có thể lắng cặn.
S. aureus có hệ thống enzyme phong phú. Những enzyme được dùng
trong chẩn đoán như coagulase có khả năng làm đơng huyết tương người và
động vật khi đã được chống đông. Vi khuẩn sinh catalase nên có khả năng
4
chuyển hóa H2O2 thành nước và oxy [5].
S. aureus có khả năng đề kháng với nhiệt độ và hóa chất cao hơn các vi
khuẩn khơng có nha bào khác, bị tiêu diệt ở 800C trong một giờ (các vi khuẩn
khác thường bị diệt ở 600C trong 30 phút). Khả năng đề kháng với nhiệt độ tối
đa đến 450C.
1.1.3. Đặc điểm di truyền của S. aureus
Trong những năm gần đây, bộ gen của một số chủng S. aureus đã được
giải trình tự hoàn toàn. Các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu về cấu trúc
cũng như chức năng của vật liệu di truyền của S. aureus.
Trình tự bộ gen đầu tiên của S. aureus được công bố năm 2001 là của
chủng Mu50 và N315 (Kuroda và cộng sự). Cho tới nay đã có hơn 10 chủng
được giải trình tự gen. Khi so sánh các trình tự gen nói trên, các nhà khoa học
nhận thấy, có những gen có mặt ở tất cả các chủng S. aureus nhưng cũng có
những gen chỉ có ở chủng này mà khơng có ở những chủng khác. Kết quả
nghiên cứu cũng cho thấy 22% bộ gen của S. aureus chứa những vùng hay thay
đổi. Bộ gen của 5 chủng S. aureus được giải trình tự hồn tồn có kích cỡ từ
2820 đến 2903 bp với G+C chứa khoảng 33% và có từ 2592 đến 2748 trình tự
mã hố cho các protein. Trong đó, 75% các trình tự là rất ít thay đổi giữa các
chủng S. aureus. Tập hợp tồn bộ các trình tự này gọi là vùng gen gốc [18].
1.2. Đặc điểm S. aureus kháng Methicilline (MRSA)
1.2.1. Lịch sử phát hiện và phân loại
Methicillin là một Penicillin bán tổng hợp chống lại men Beta-lactamase
được giới thiệu vào năm 1959; ngay sau đó, chủng S. aureus và Staphylococci
coagulase âm tính đề kháng Methicillin đã được báo cáo. Sự bùng phát của
MRSA xảy ra ở châu Âu vào đầu những năm 1960 [63]. Ba dòng MRSA gây đại
dịch năm 1959 phân lập ở Đan Mạch và Anh. Ngoài ra, loại phân tử của chủng
MRSA thu thập từ nhiều khu vực địa lý phát hiện 5 dòng MRSA chính trên tồn
5
thế giới vào năm 2002 [53]. Các dịch do chủng MRSA liên quan cộng đồng đầu
những năm 2000 xuất hiện từ chủng của đại dịch trước đó.
1.2.2. Cơ chế và ý nghĩa đề kháng Methicillin
Các Beta-lactam gắn với các protein gắn Penicilin (PBP) cần thiết cho
sinh tổng hợp màng tế bào và ngăn hình thành liên kết chéo peptidoglycan,
dẫn đến ly giải tế bào vi khuẩn. Đề kháng với beta-lactam của MRSA được
tạo ra do mắc phải một yếu tố di truyền di động, các nhiễm sắc thể băng S.
aureus (SCCmec) mang gen mecA mã hóa PBP biến đổi PBP2a / PBP 20 mà
giảm ái lực với kháng sinh Beta-lactam. Kết quả là sinh tổng hợp màng tế bào
của MRSA tiếp tục ngay cả khi có sự hiện diện của kháng sinh Beta-lactam.
Mặc dù hiếm, kháng Methicillin của S. aureus có thể xảy ra bởi các cơ chế
khác mecA. Các cơ chế này gồm tăng sản xuất beta-lactamase và biểu hiện
chất đồng đẳng mecA, gọi là mecC [63]. Mặc dù Methicillin khơng cịn được
sản xuất, MRSA vẫn tồn tại. Chủng kháng Oxacillin hay Methicillin thì cũng
có thể kháng lại tất cả các thuốc beta lactam, bao gồm Cephalosporin (ngoại
lệ Ceftaroline, là một Cephalosporin thế hệ thứ năm). Hiện nay, thử nghiệm
tính nhạy cảm thường dùng là Oxacillin và / hoặc Cefoxitin.
Định nghĩa kháng Methicillin trong phòng xét nghiệm vi sinh lâm sàng
là nồng độ ức chế tối thiểu Oxacillin (MIC) ≥4 mcg/mL [42]. Những phương
pháp khác phát hiện, như sử dụng xét nghiệm khuếch tán đĩa Cefoxitin,
Oxacillin hoặc một số phản ứng chuỗi polymerase để phát hiện các gen mec
đặc biệt là mecA.
6
Hình 1.1: Cơ chế đề kháng của MRSA
(Nguồn: Lee Andie S., 2018 [53])
1.2.3. Đặc điểm mang gen PVL của MRSA
Panton-Valentine leukocidin (PVL) là một cytotoxin gây phá hủy bạch
cầu và hoại tử mơ, được sản xuất bởi ít hơn 5% chủng S. aureus [57]. Gen có
liên quan đến áp xe da và nhiễm trùng da hoại tử nghiêm trọng. Nhiều báo
cáo cho thấy sự liên kết mạnh mẽ của độc tố PVL trong nhiễm trùng S.
aureus và MRSA liên quan đến cộng đồng [57].
1.3. Các kỹ thuật xác định S. aureus và MRSA trong phòng xét nghiệm
1.3.1. Các kỹ thuật xác định S. aureus
Ngày nay đã có nhiều kỹ thuật xác định S. aureus như: nhuộm soi,
ngưng kết hạt, Staphylatex, lysostaphin, định type phage, ELISA, điện di
miễn dịch và thử nghiệm miễn dịch dùng chất phóng xạ…. Sau đây là một số
kỹ thuật được áp dụng trong phòng xét nghiệm để xác định và nghiên cứu S.
aureus.
7
1.3.1.1. Nhuộm soi
Nguyên lý
Nhuộm Gram để sơ bộ nhận định hình thể của vi khuẩn: tiêu bản được
làm từ bệnh phẩm/mẫu hoặc từ khuẩn lạc.
Phân tích kết quả
- Trên tiêu bản nhuộm Gram từ bệnh phẩm: cầu khuẩn Gram dương,
đường kính trung bình 0,8µm, đứng lẫn với tế bào mủ, hoặc tập hợp lại thành
hình chùm nho, cũng có khi cầu khuẩn đứng riêng rẽ.
- Trên tiêu bản nhuộm Gram từ khuẩn lạc: S. aureus có hình ảnh cầu
khuẩn bắt màu Gram dương xếp thành từng đám [5].
1.3.1.2. Nuôi cấy, phân lập S. aureus
Nguyên lý
Tùy loại bệnh phẩm lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp. Thơng
thường sử dụng thạch máu 5% ủ ở nhiệt độ 35-370C từ 18-24 giờ. S. aureus
mọc tốt trên hầu hết các môi trường nuôi cấy thường dùng, nhiệt độ thích hợp
370C, pH: 7.2-7.4, trong khí trường có oxy hoặc kỵ khí tùy nghi.
Phân tích kết quả
Trên canh thang: sau 6 giờ S. aureus đã làm đục đều mơi trường, sau 24
giờ có thể có lắng cặn và có váng. Trên thạch thường: khuẩn lạc trịn, lồi,
nhẵn, bóng, đục, bờ rõ rệt. Sau 24-36 giờ xuất hiện sắc tố màu vàng. Trên
thạch máu: khuẩn lạc trịn, ướt, bóng, có thể có vịng tan huyết hoặc khơng.
Nếu có vịng tan huyết là vịng tan huyết hồn tồn, tạo thành một vịng trong
xung quanh khuẩn lạc (tan máu β). Trên mơi trường Chapman (có đường
manitol): S. aureus có khả năng sử dụng manitol làm cho mơi trường bị axit
hóa, do đó màu mơi trường chuyển sang vàng. Khuẩn lạc S. aureus có ánh
vàng [6].
8
Xác định sự có mặt của men coagulase: (men làm đơng huyết tương) tự
do và liên kết.
Ngồi các tính chất trên, S. aureus cịn có khả năng sinh các enzyme
dezoxyribonuclease, catalase, phosphatase, kháng novobiocin, gây hoại tử da
thỏ. Khi các thử nghiệm khác khơng rõ có thể sử dụng kit API-STAPH để xác
định S. aureus [70].
Kỹ thuật nuôi cấy và định danh vi khuẩn là tiêu chuẩn vàng trong chẩn
đoán xác định S. aureus. Nhưng kỹ thuật này cho kết quả khá lâu (từ 3-4
ngày), cần một lượng vi khuẩn lớn và không xác định được các yếu tố ở mức
phân tử.
1.3.2. Các kỹ thuật xác định MRSA
1.3.2.1. Kỹ thuật kháng sinh đồ xác định MRSA
Nguyên lý kỹ thuật kháng sinh đồ khoanh giấy khuếch tán
Mức độ nhạy cảm với kháng sinh của các chủng vi khuẩn thử nghiệm
được đánh giá dựa vào vùng ức chế tạo ra xung quanh khoanh giấy thấm
kháng sinh. Khi đặt khoanh giấy kháng sinh trên bề mặt thạch, kháng sinh sẽ
khuếch tán vào trong thạch; càng xa khoanh giấy, nồng độ kháng sinh càng
giảm. Sự phát triển của vi khuẩn sẽ bị ức chế khi kháng sinh đạt đến một nồng
độ nhất định. Dựa vào đường kính vùng ức chế và điểm gãy trong tài liệu
hướng dẫn phiên giải kết quả kháng sinh đồ, mức độ nhạy cảm có thể phân
chia thành phân loại S (susceptible - nhạy cảm), I (intermediate-trung gian), R
(resistant-đề kháng) hoặc NS (non-susceptible-không nhạy cảm) [3].
Nguyên lý kỹ thuật kháng sinh đồ định lượng
Kháng sinh được hồ đều trong mơi trường lỏng hoặc môi trường đặc
nên tại bất kỳ điểm nào trong môi trường, nồng độ kháng sinh đều như nhau.
Kháng sinh được pha loãng thành nhiều nồng độ khác nhau (thường là pha
loãng theo cấp số nhân). Một lượng vi khuẩn nhất định như nhau được cấy
9
vào mơi trường có nồng độ kháng sinh khác nhau. Nồng độ kháng sinh pha
lỗng nhất có khả năng ức chế được sự phát triển của vi khuẩn được gọi là
nồng độ ức chế tối thiểu. Giá trị MIC cho biết nồng độ kháng sinh cần đạt
được tại ổ nhiễm trùng để có thể ức chế được căn nguyên gây bệnh. Tuy
nhiên, giá trị MIC không phải là một giá trị tuyệt đối. Giá trị MIC thực có khi
nằm giữa nồng độ ức chế tối thiểu có được khi đọc kết quả thử nghiệm và
nồng độ kháng sinh thấp hơn ngay sát giá trị của MIC đọc kết quả. Ví dụ, khi
pha loãng kháng sinh theo cấp số nhân bậc hai, thử nghiệm xác định MIC cho
giá trị là 16 g/mL nhưng giá trị MIC thực có thể nằm trong khoảng giữa của
16 g/mL và 8 g/mL. Dựa vào giá trị MIC và điểm gãy trong bảng chuẩn,
mức độ nhạy cảm có thể phân loại S (Susceptible-nhạy cảm), I (Intermediatetrung gian), R (Resistant-đề kháng) hoặc NS (non-susceptible-không nhạy
cảm) [3].
Nguyên lý kháng sinh đồ bằng hệ thống máy tự động
Hình 1.2: Máy Vitek 2 compact
(Nguồn: Catologue của hãng Biomerieux)
10
Nguyên lý của kháng sinh đồ trên hệ thống tự động cũng giống như
nguyên lý của kỹ thuật kháng sinh đồ pha lỗng trong canh thang. Trong đó,
hệ thống tự động sẽ đo độ đục của canh khuẩn hoặc đo tín hiệu huỳnh quang
biến đổi có trong mơi trường ni cấy để xác định giá trị MIC. Hệ thống tự
động cịn có thể có thêm phần mềm hỗ trợ phiên giải kết quả và có thể rút
ngắn thời gian thực hiện kháng sinh đồ xuống còn 5-15 giờ theo từng lồi vi
khuẩn. Hơn nữa, hệ thống tự động có thể kết nối với phần mềm quản lý của
phòng xét nghiệm để chuyển trực tiếp kết quả từ hệ thống tự động sang hệ
thống phần mềm quản lý. Hiện nay, có 4 hệ thống tự động có thể làm kháng
sinh đồ là hệ thống BD Phoenix (BD Diagnostic Systems, Sparks, Md.),
MicroScan WalkAway SI (Siemans Healthcare Diagnostics, Sacramento),
TTEK Sensititre (ARIS 2X, TREK Diagnostic Systems) và Vitek 2 Compact
(Biomerieux, Vitek, Hazelwood, …) [3].
1.3.2.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử xác định MRSA
Các kỹ thuật sinh học phân tử ngày càng được ứng dụng nhiều trong
chẩn đoán và nghiên cứu S. aureus. Kết quả xác định sẽ nhanh hơn, nhiều
trường hợp đỡ tốn kém hơn. Đặc biệt, các kỹ thuật này cho các kết quả có
độ nhạy, độ đặc hiệu rất cao. Ngồi việc xác định nhanh căn nguyên vi
khuẩn với độ chính xác cao, các kỹ thuật sinh học phân tử còn có thể cho
biết một số độc tố gây bệnh của S. aureus. Ví dụ, trong trường hợp xác
định độc tố ruột của S. aureus. Việc xác định S. aureus và sự có mặt của
một hoặc một số độc tố ruột có thể được phát hiện cùng một lúc bằng kỹ
thuật PCR. PCR cũng cho phép xác định sự có mặt của gen liên quan đến
sự kháng thuốc của S. aureus ví dụ như gen mecA, vanA [55]. Áp dụng kỹ
thuật PCR để xác định và nghiên cứu các gen độc lực của S. aureus như
agr, tsst-1 gây hội chứng shock nhiễm độc. Ngoài ra, sử dụng một số cặp
mồi đặc hiệu có khả năng khuếch đại một vùng gen đặc trưng của vi khuẩn
11
có thể xác định vi khuẩn này trong một loại bệnh phẩm nào đó. Ngày nay,
kỹ thuật PFGE và MLST được ứng dụng để xác định nguồn gốc của S.
aureus trong các vụ dịch và phân type chúng. Trong một số trường hợp,
bằng việc giải trình tự một đoạn nucleotide, sau đó so sánh trình tự này với
các trình tự sẵn có trên ngân hàng gen, người ta có thể biết rằng đoạn
nucleotide đó là của S. aureus [70].
+ Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Năm 1985, nhà khoa học người Mỹ, Kary B. Mullis đã phát triển “phản
ứng chuỗi trùng hợp’’ gọi là Polymerase Chain Reaction.
- Nguyên lý: dựa theo sự sao chép theo cơ chế bán bảo tồn của DNA
trong tế bào. Một đoạn của phân tử DNA chuỗi kép được tách ra làm hai
chuỗi đơn, mỗi chuỗi đơn này sẽ làm khuôn mẫu cho việc tổng hợp sợi DNA
mới. Kỹ thuật PCR được thực hiện với một cặp mồi đặc hiệu, mồi này có khả
năng bắt cặp, bổ sung vào hai đầu của hai sợi DNA khuôn theo chiều 5’ đến
3’ dưới tác dụng của enzym Taq DNA polymerase. Mạch DNA mới được
hình thành với các nucleotide bổ sung với các nuclotide trên sợi DNA khuôn.
Qua mỗi chu kỳ nhiệt, số lượng đoạn DNA cần tổng hợp sẽ tăng gấp đôi [13].
Kỹ thuật PCR ứng dụng trong xác định S. aureus: David P. Kateele và
cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nhân gen Nuc của S. aureus được sử dụng
như kỹ thuật cơ bản, là tiêu chuẩn vàng để xác định S. aureus [45]. Gonzalez
V. và cộng sự ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử với mồi tác động đích
16S rRNA của S. aureus. Độ nhạy đạt đến 100%, độ đặc hiệu 99,4% [38].
Paola Cremonesi ứng dụng PCR đa mồi để xác định các gen cog, nuc, sea,
seb, sec, sed, see, seg, she, sei, sej, sel. Kỹ thuật PCR đa mồi này có độ nhạy
và đặc hiệu cao hơn nhiều so với kỹ thuật ELISA [62]. Yu-cheng Chiang và
cộng sự ứng dụng kỹ thuật PCR nghiên cứu gen độc tố tsst-1 ở Đài Loan [27].
Kỹ thuật PCR cũng được ứng dụng để xác định gen kháng kháng sinh như
12
mecA, vanA [64].
+ Kỹ thuật Realtime PCR
- Nguyên lý: dựa trên phản ứng PCR có khả năng vừa phát hiện vừa
định lượng sản phẩm PCR theo từng chu kỳ của phản ứng (realtime nghĩa là
đúng thời điểm). Đây là kỹ thuật phát hiện không đồng nhất, một hỗn hợp của
sản phẩm PCR được phát hiện mà không phải từng thành phần được phát hiện
như trong kỹ thuật điện di thông thường.
Hình 1.3. Máy Real-time PCR Gene-up
(Nguồn: Catologue của hãng Biomerieux)
- Ưu điểm:
+ Kiểm sốt được lượng huỳnh quang giải phóng ra do đó xác định
được lượng sản phẩm PCR tại từng thời điểm (chu kỳ) của khuếch đại. Ở kỹ
thuật PCR thơng thường, gel agarose có nhiều hạn chế như độ phân giải thấp
13
do vậy định lượng thường khơng chính xác.
+ Độ đặc hiệu cao hơn do sử dụng các mẫu dò đặc hiệu để phát hiện
sản phẩm khuếch đại.
+ Tiết kiệm thời gian chỉ khoảng 1-2h trong khi PCR truyền thống phải
mất từ 3-5h.
+ Có hệ thống kín do đó ít có nguy cơ bị tạp nhiễm.
Kỹ thuật realtime PCR được ứng dụng trong xác định gen kháng kháng
sinh như mecA, vanA của S. aureus [70]. Kỹ thuật này đã được Lance R.
Peterson sử dụng để xác định MRSA ở mũi, kết quả trong vòng 2 giờ với độ
nhạy từ 95-100%, độ đặc hiệu 96-99% [64].
+ Giải trình tự gen
Hai phương pháp chính xác định trình tự là phương pháp hóa học của
Maxam và Gilbert (1977) và phương pháp enzyme học của Sanger và cộng
sự (1977). Phương pháp của Sanger được ứng dụng phổ biến trong nghiên
cứu y sinh học [13].
Nguyên lý của Sanger: Phương pháp này dựa vào sự tổng hợp DNA
nhờ enzyme DNA polymerase mạch bổ sung cho trình tự DNA mạch đơn
cần xác định. Đặc trưng của phương pháp là ngồi bốn loại Nucleotide
thơng thường cịn sử dụng thêm bốn loại dideoxynucleotide là những
deoxynucleotide trong đó nhóm 3’OH được thay bằng H. Điều này khiến
các dideoxynucleotide khơng cịn khả năng hình thành các cầu nối
phosphodiester, do đó sẽ làm ngừng quá trình tổng hợp. Kết quả phản ứng
tạo ra các đoạn DNA có kích thước khác nhau. Sản phẩm được đem phân
tách trên gel polyacrylamide và kết quả được đọc trên máy tự ghi [13].
1.4. Các nghiên cứu về S. aureus kháng Methicilline (MRSA)
1.4.1. Các nghiên cứu trên thế giới
Năm 1960, nhiễm khuẩn do MRSA xuất hiện đầu tiên và ngày càng
14
tăng đáng kể trên khắp Hoa Kỳ. Gần đây, một số nghiên cứu về MRSA tại
Hoa Kỳ cho thấy về việc giảm tỉ lệ mắc HA-MRSA nhưng có sự gia tăng của
CA-MRSA. Tỉ lệ nhiễm MRSA được báo cáo nằm trong khoảng từ 7% đến
60% [66], [47], [50]. The Agency for Healthcare Research & Quality
(AHRQ) nghiên cứu cho thấy S. aureus kháng Methicillin có liên quan đến
375.000 ca nhiễm trùng và 23.000 ca tử vong ở Hoa Kỳ. Đây là nguyên nhân
chính gây nhiễm trùng hậu phẫu với tỷ lệ tử vong cao hơn và thời gian chăm
sóc dài hơn so với S. aureus nhạy cảm với Methicillin [46]. Phần lớn dữ liệu
nghiên cứu chỉ ra rằng MRSA làm tăng tỉ lệ tử vong và bệnh tật ở người cao
tuổi và những người bị suy giảm miễn dịch. Đối với những đối tượng bệnh
nhân suy gan, suy thận và những bệnh nhân nằm tại ICU có tỷ lệ tử vong cao
khi có nhiễm trùng tác nhân là MRSA. Tỉ lệ tử vong thay đổi từ 5-60%, tùy
thuộc vào số lượng bệnh nhân và vị trí nhiễm trùng [46]. Đối với bệnh nhân
bỏng tại các đơn vị chăm sóc đặc biệt như ICU có nguy cơ cao bị nhiễm trùng
bệnh viện do MRSA khá cao [47]. MRSA đã tạo ra một gánh nặng lớn về
chăm sóc sức khỏe, một số nghiên cứu cho thấy tỉ lệ tử vong lên tới 60% và
tăng gấp hai lần so với MSSA trong nhiễm khuẩn huyết [54]. Đối với bệnh
nhân nhiễm HIV, tỉ lệ nhiễm MRSA trên toàn thế giới ở mức khoảng 7% [66].
Hầu hết các bệnh viện ở châu Á đều có sự hiện diện của tác nhân gây
bệnh MRSA, với tỉ lệ ước tính từ 28% tại Hồng Kơng và Indonesia cho đến
trên 70% tại Hàn Quốc trong số tất cả các chủng S. aureus lâm sàng
được phân lập vào đầu những năm 2010. Các chủng phân lập có độ mẫn cảm
giảm hoặc mức độ kháng cao với glycopeptide cũng ngày càng được xác định
trong vài năm qua. Và tỉ lệ MRSA trong số các trường hợp nhiễm S.
aureus liên quan đến nhiễm khuẩn cộng đồng ở các nước châu Á đã thay đổi
rõ rệt, từ dưới 5% lên đến trên 35% [26].
Trong một nghiên cứu đa quốc gia của Molly K. Miller-Petrie từ năm
