TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ KIỂM NGHIỆM TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM MỐC

TIÊU CHUẨN HIỆN HÀNH ĐỂ KIỂM NGHIỆM TỔNG
VI KHUẨN HIẾU KHÍ VÀ TỔNG SỐ NẤM MEN NẤM
MỐC
MỤC LỤC
I.
KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC
1. Vi khuẩn hiếu khí
2. Nấm men, nấm mốc
II.
PHƯƠNG PHÁP VÀ QUI TRÌNH
1. Phương pháp truyền thống
a. Vi khuẩn hiếu khí
b. Nấm men, nấm mốc
2. Phương pháp nhanh
a. Kỉ thuật màng petri (petrifilm)
b. Qui trình
III.
CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM

1. Tổng số vi khuẩn hiếu khí
•
Vi khuẩn hiếu khí là những vi khuẩn
tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc
trong điều kiện có sự hiện diện của
oxy phân tử.
Định nghĩa :
I. KHÁI NIỆM VÀ NGUYÊN TẮC
1.Tổng số vi khuẩn hiếu khí
Sử dụng kĩ thuật đổ đĩa, đếm số khuẩn lạc đã mọc trên môi trường thạch dinh dưỡng
sau khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 30
o

C trong thời gian từ 72 giờ.
Số lượng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu thực phẩm kiểm nghiệm được tính từ số
khuẩn lạc đếm được trong các hộp nuôi cấy theo các nồng độ pha loãng .
Nguyên tắc:
2.Tổng số nấm men nấm mốc
•
Là nhóm vi sinh vật rất đa dạng
•
Chúng thuộc nhóm Eucaryote, có vách tế bào là lớp vỏ chitin
•
Là các vi sinh vật dị dưỡng
•
Nhóm mesophiles, 1 số ít thuộc nhóm psychrophiles hoặc thermophiles
Định nghĩa :
2.Tổng số nấm men nấm mốc
•
Là nhóm vi sinh vật ưa mát (nhiệt độ thích hợp 20-28
0
C)
•
Phát triển tốt trong cơ chất có nước hoạt tính, khoảng 85%
•
PH thích hợp là 2-9 ( tối ưu 4-6.5)
•
Là vi sinh vật thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc có thể phát triển trong điều kiện
vi hiếu khí.
Đặc điểm :
2.Tổng số nấm men nấm mốc
•
Nấm mốc : là vi nấm dạng sợi sinh sàn bằng

bào tử hoặc khuẩn ty
•
Nấm men: đơn tính, phát triển theo kiểu nảy
chồi, thỉnh thoảng có thể tồn tại ở dạng khuẩn
ty giả trong đó có các tế bào kết nhau thành
chuỗi
Phân loại nấm men nấm mốc
2.Tổng số nấm men nấm mốc
•
kỹ thuật pha loãng, trãi đĩa và đếm khuẩn lạc trên môi trường DG18, DRBC.
•
Môi trường DG18 được sử dung cho các loại thực phẩm có hàm lượng nước thấp
•
Môi trường DRBC được sử dụng cho các mãu có hàm lượng nước cao
•
Đối với mẫu các môi trường thường được sử dụng là MEA, PDA chứa 40ppm
chloramphenicol hay chlotetraciline.
Nguyên tắc:
II. PHƯƠNG PHÁP VÀ QUY TRÌNH
1. Phương pháp truyền thống
a. Vi khuẩn hiếu khí:
Phương pháp đổ đĩa:

Quy trình xác định tổng vi khuẩn hiếu khí:
Chuẩn bị dịch đồng nhất và pha loãng mẫu để có độ pha loãng 10
-1
-10
-6
Chọn 3 nồng độ pha loãng thích hợp. Chuyển 1ml mẫu vào đĩa petri vô trùng (cấy 3 đĩa)
Rót vào mỗi đĩa 10-15ml môi trường PCA đã làm nguội đến 45

0
C, lắc đều và đem ủ ở 30
0
C trong 72h
Chọn các đĩa có số khuẩn lạc 25-250/đĩa để đếm
Tính kết quả: tổng VSV hiếu khí trong mẫu (CFU/g hay CFU/ml)
b. Nấm men, nấm mốc
Quy trình phân tích định tính:
Đồng nhất mẫu trong môi trường SDB thành độ pha loãng 10
-1
, ủ ở 30
0
C, 1-7
ngày
Cấy canh trường có mốc mọc lên đĩa SDB, MEA hay PDA, ủ ở 30
0
C trong 7 ngày
Kết luận: có/ không có nấm mốc
Quy trình phân tích định lượng:
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa DRBC hoặc DG18, ủ ngửa đĩa ở 25
0
C trong
5-7 ngày
Trải 0,1ml mẫu lên đĩa MEA hoặc PDA, ủ ngửa đĩa ở 30
0
C, trong 7
ngày
Đếm khuẩn lạc nấm mốc, nấm men, tính mật độ (CFU/g)
Cấy lên ống thạch nghiêng SDA, ủ ở 30
0

C, 7 ngày
Định danh
Đồng nhất và pha loãng mẫu thành các độ pha loãng 10
-1
, 10
-2
, 10
-3
…

Cách tính kết quả:
Đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa sau khi ủ (25-250). Mật độ tổng VSV hiếu khí trong 1g hay
1ml mẫu được tính như sau:
N
A(CFU/g hay CFU/ml) =
n
1
Vf
1
+…+n
i
Vf
i

Trong đó:A- số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc) vi khuẩn trong 1g hay 1ml
mẫu.
N- tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa.
n
i
- số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i.

V- thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa.
f
i
– độ pha loãng tương ứng.
2. Phương pháp nhanh
Kỹ thuật màng petri (petrifilm)

Kỹ thuật
The Oxoid Dip Slide được phủ hai lớp môi trường nuôi cấy khác nhau trên hai
mặt. Cả hai mặt phải được tiếp xúc với bề mặt cần kiểm tra hoặc tiếp xúc trực
tiếp với dung dịch lỏng.
Đối với kiểm tra dung dịch lỏng, Dip Slide phải được nhúng sâu vào lòng chất
lỏng hoặc đổ chất lỏng lên kín hai mặt Slide, cho chất lỏng tiếp xúc bề mặt Slide vài
giây trước khi bỏ Slide vào lại trong lọ.
Chú ý : không được giữ ấm cả Slide với cả dung dịch cần kiểm tra trong lọ - việc
kiểm tra sẽ không thực hiện được
Đối với việc kiểm tra bề mặt môi trường, mỗi bề mặt Slide nên tiếp xúc trực tiếp
với bề mặt cần kiểm, phải dùng lực nhấn mạnh để hai bề mặt tiếp xúc nhau vài giây,
sau đó bỏ Slide vào lại trong lọ.
Đem lọ chứa slide đi giữ ấm ở nhiệt độ phù hợp theo bảng dưới đây:
Bảng 1: một số loại Oxoid Dip Slides
Kiểm tra Dip Slide
Cho kiểm tra tổng số vi khuẩn hiếu
khí
Slides chứa môi trường TTC Red Spot Medium màu vàng trong suốt . Khuẩn lạc phát triển là những đốm có màu đỏ. Giữ ấm ở 35–37°C trong vòng 18-48 giờ.
Cho việc đếm tổng số vi khuẩn hiếu
khí, nấm men, nấm mốc
Slide chứa môi trường TTC (Red Spot) trên một cạnh và môi trường Malt Extract Agar trên cạnh kia cho việc cô lập nấm men và nấm mốc. Giữ ấm 25–30°C
trong 2-5 ngày.
Trên một cạnh mang môi trường Plate Count Agar, cho việc đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí, cạnh kia mang môi trường OGYE Agar cho việc đếm tổng số nấm

men và nấm mốc.
Giữ ấm 25–30°C trong 2-5 ngày.
Cho việc đếm tổng số vi khuẩn
coliform bacterial.
Plate Count Agar (PCA) trên một cạnh và MacConkey Agar No.3 trên cạnh còn lại. PCA sẽ phát hiện tổng số vi khuẩn hiếu khí và MacConkey Agar No. 3 phát
hiện faecal coliforms, inhibiUng gram posiUve cocci.
Môi trường có chứa chất ức chế diệt khuẩn.
Giữ ấm ở 30–37°C trong 18-48 giờ.
Cho việc đếm tổng số vi khuẩn
Enterobact-
eriaceae.
Môi trường PCA trên một cạnh và Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA) trên cạnh khác. PCA sẽ phát hiện tổng số vi khuẩn hiếu khí và VRBGA sẽ giúp nhìn
thấy các khuẩn đỏ Zm Enterobacteriaceae .
có chứa chất ức chế diệt khuẩn.
Giữ ấm ở 30–37°C trong vòng 18-48 giờ.
III. CÁC CHỈ TIÊU VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM
Bảng 2: QUY CHUẨN KĨ THUẬT QUỐC GIA VỀ GIỚI HẠN AN TOÀN CHO PHÉP ĐỐI VƠI Ô NHIỄM VSV
TRONG THỰC PHẨM
(QCVN:2010/BYT)
Nhóm sản phẩm
Kế hoạch lấy mẫu Mức giới hạn cho phép
Phân loại chỉ êu
n c m M
Tổng số vi khuẩn hiếu khí (CFU/g hoặc
ml)
Thịt xay và sản phẩm chế biến từ thịt
sử dụng trực Uếp không xử lí nhiệt
5 2 5.10
5
5.10

6
B
Thịt xay và sản phẩm chế biến từ thịt
phải qua xử lí nhiệt trước khi sử dụng
5 2 5.10
5
5.10
6

B
Gia vị 5 0 10
4
10
5
B
Nước chấm có nguồn gốc động vật 5 0 10
4
10
5
B
Nước chấm có nguồn gốc thực vật 5 0 10
4
10
5
B
Đồ uống có cồn
Tối đa 1000 A
Nấm men nấm mốc (CFU/ml) Tối đa 100 A
Chú thích
•

Chỉ tiêu loại A: Sản phẩm lưu thông trên thị trường bắt buộc phải thử nghiệm.
•
Chỉ tiêu loại B: Sản phẩm tại công đoạn cuối của quá trình sản xuất (áp dụng
đối với sản phẩm sản xuất tại Việt Nam) hoặc tại cửa khẩu (áp dụng đối với sản
phẩm nhập khẩu) không bắt buộc phải thử nghiệm nhưng tổ chức, cá nhân sản
xuất, nhập khẩu các sản phẩm này phải đáp ứng các quy định đối với chỉ tiêu loại
B.
•
c: số mẫu có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa
m và M vượt quá c là không đạt,
•
m: giới hạn dưới, các kết quả không quá mức này là đạt,
•
M: giới hạn trên, chỉ một mẫu vượt quá mức này là không đạt,
•
cfu/g hoặc ml : số đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 gam mẫu hoặc 1 ml.
TÀI LIỆU THAM KHẢO :
1. Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm (Trần Linh
Thước – NXBGD Việt Nam)
2. QCVN 2010/BYT