Khóa Luận Bước Đầu Hoàn Thiện Phương Pháp Và Nghiên Cứu Mức Độ Đa Dạng Di Truyền Cây Đưng (Rhizophora Mucronata Lamk.pdf

1

Chƣơng 1. MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong quá trình tồn tại và phát triển, con ngƣời không ngừng khai thác, tàn phá
tài nguyên thiên nhiên và môi trƣờng. Ngày nay, sự mở rộng và phát triển các khu công
nghiệp đã tạo một lƣợng khí thải vơ cùng lớn, gây ơ nhiễm khơng khí góp phần tàn phá
sự sống trên trái đất. Những hoạt động đó đang dần làm mất cân bằng hệ sinh thái, phá
hủy một trong những nguồn tài nguyên quý giá nhất, không thể thay thế trên thế giới,
đó là đa dạng sinh học - cơ sở của sự sống còn, sự thịnh vƣợng và phát triển bền vững.
[41]
Từ thực tế trên, các khu dự trữ sinh quyển đƣợc ra đời, nhằm thực hiện nhiệm vụ
trọng yếu: Bảo vệ hệ sinh quyển - một hệ sinh thái khổng lồ, đồng thời đảm bảo sự cân
bằng, bảo tồn đa dạng sinh học, thúc đẩy kinh tế - xã hội phát triển và duy trì các giá trị
văn hóa truyền thống. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh
quyển đầu tiên của Việt Nam đƣợc UNESCO công nhận [22]. Với cảnh quan thiên
nhiên tƣơi đẹp, thành phần các loài động thực vật phong phú, đa dạng, rừng ngập mặn
Cần Giờ không những là rừng phòng hộ mà còn là điểm du lịch sinh thái hấp dẫn, mơ
hình học tập và nghiên cứu lý tƣởng [22], [43]. Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn
Cần Giờ là nguồn tài ngun vơ giá, có vai trị và vị trí đặc biệt quan trọng đối với đời
sống cộng đồng dân địa phƣơng và các vùng phụ cận. Quần thể Đƣng (R. mucronata)
cùng những quần thể thực vật khác góp phần điều hịa khí hậu [30], chắn gió, chống xói
lở, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng, cung cấp
thức ăn cho các loài động vật hoang dã và hải sản có giá trị cao, đồng thời tạo sinh kế
cho ngƣ dân [21]. Nhằm đem lại hiệu quả kinh tế và môi trƣờng cao hơn, chúng ta cần
lập kế hoạch phát triển lâu dài và bền vững, tiến hành nghiên cứu, đánh giá nguồn gene
và mức độ đa dạng di truyền các quần thể thực vật rừng ngập mặn Cần Giờ, trong đó có
quần thể Đƣng, nhằm tìm đƣợc những chỉ thị phân tử phục vụ đắc lực cho việc chọn lọc


2

nhanh giống Đƣng, góp phần đảm bảo cơng tác trồng và phát triển rừng đạt hiệu quả
cao nhất. Phƣơng pháp tốt nhất đáp ứng yêu cầu này là sử dụng các marker phân tử.
Đƣợc sự phân công của Bộ môn Công nghệ Sinh học - Trƣờng Đại học Nông
Lâm Tp. HCM, dƣới sự hƣớng dẫn của Thầy TS. Bùi Minh Trí chúng tơi đã tiến hành
thực hiện đề tài: “BƢỚC ĐẦU HOÀN THIỆN PHƢƠNG PHÁP VÀ ĐÁNH GIÁ
MỨC ĐỘ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÂY ĐƢNG (Rhizophora mucronata Lamk.)
TẠI KHU DỰ TRỮ SINH QUYỂN RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ BẰNG KỸ
THUẬT RAPD”.
1.2. Mục đích
 Hồn thiện quy trình ly trích DNA đối với cây Đƣng.
 Xây dựng quy trình RAPD và bƣớc đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền quần
thể Đƣng tại khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.
 Phục vụ công tác tuyển chọn giống Đƣng để lai tạo và xây dựng tiền đề cho những
nghiên cứu chuyên sâu về sự đa dạng di truyền, nhận diện chỉ thị phân tử.
1.3. Yêu cầu
 Thu thập mẫu lá từ những cây Đƣng có đặc điểm hình thái khác nhau: thân cây to,
cây mọc tốt, cây mọc yếu ớt, cây bị bệnh, cây mọc tự nhiên hay đƣợc trồng.
 Ly trích DNA có chất lƣợng tốt làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD.
 Thực hiện kỹ thuật RAPD và phân tích kết quả bằng phần mềm NTSYS 2.1.
1.4. Giới hạn của đề tài
 Đề tài chỉ tiến hành nghiên cứu quần thể Đƣng tại một số tiểu khu trong khu dự trữ
sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ, Tp. Hồ Chí Minh.
 Thời gian thực hiện ngắn.
 Chƣa đủ điều kiện để thực hiện nhiều thí nghiệm tối ƣu, chƣa khảo sát nhiều primer
đối với kỹ thuật RAPD nhằm đạt đƣợc kết quả chính xác hơn.


3

Chƣơng 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ,
Tp. Hồ Chí Minh
2.1.1. Khái niệm và chức năng của khu dự trữ sinh quyển
Sinh quyển là lớp vỏ trái đất có các sinh vật sống trên đó, kể cả đại dƣơng, ao
hồ, sơng suối, đất và phần dƣới của khí quyển. Sinh quyển cùng với khí quyển, địa
quyển và thủy quyển tác động qua lại với nhau trong “Hệ thống trái đất”. [45]
Sinh quyển là một hệ sinh thái khổng lồ, bao gồm các hệ sinh thái nhỏ hơn trên
bề mặt trái đất. Việc bảo tồn nguyên vẹn tất cả hệ sinh thái là điều khơng thể, nên ngƣời
ta chỉ có thể lựa chọn ra một số đại diện của các hệ sinh thái này để bảo tồn với ý nghĩa
là các khu dự trữ vốn gene, loài và hệ sinh thái cho toàn bộ sinh quyển. [45]
Khu dự trữ sinh quyển là những vùng có các hệ sinh thái trên cạn hoặc ven biển
đƣợc quốc tế công nhận trong phạm vi chƣơng trình Con ngƣời và Sinh quyển (Man
and Biosphere – MAB) của UNESCO, nhằm thúc đẩy và trình diễn mối quan hệ giữa
con ngƣời với thiên nhiên. Các khu dự trữ sinh quyển là mơ hình mẫu của các hệ sinh
thái trên trái đất, là phịng thí nghiệm sống cho việc nghiên cứu và giám sát các hệ sinh
thái đem lại lợi ích cho ngƣời dân địa phƣơng mà không gây hại đến môi trƣờng. [45]
Mỗi khu dự trữ sinh quyển có 3 chức năng [45]:
 Chức năng bảo tồn: đóng góp vào việc bảo tồn đa dạng di truyền, loài, hệ sinh
thái và cảnh quan.
 Chức năng phát triển: thúc đẩy phát triển kinh tế bền vững về sinh thái cũng nhƣ
các giá trị văn hóa truyền thống.
 Chức năng hỗ trợ: tạo điều kiện cho các hoạt động nghiên cứu, giám sát, giáo
dục và trao đổi thông tin giữa các địa phƣơng, quốc gia, quốc tế về bảo tồn và
phát triển bền vững.


4

2.1.2. Tổng quan về khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ

2.1.2.1. Điều kiện tự nhiên
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ đƣợc hình thành ở hạ lƣu sơng
Đồng Nai – Sài Gịn đổ ra biển Đơng ở cửa Xồi Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái,
đồng thời nằm ở cửa ngõ Đông Nam Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành
phố khoảng 300 km. [8], [29], [44]
Tọa độ địa lý [29]
 Vĩ độ Bắc: 10o 22’ 14” – 10o 37’ 39”
 Kinh độ Đơng: 106o 46’ 12” – 107o 00’ 59”
Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đơng, phía Tây giáp tỉnh Tiền
Giang và Long An, phía Đơng giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
Cần Giờ có khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo với hai mùa rõ rệt: mùa mƣa
từ tháng 5 – 11, gió hƣớng Tây Nam, mùa nắng từ tháng 12 – 4 năm sau, gió hƣớng
Đơng Nam. Nhiệt độ trung bình 25,8 0C. Lƣợng mƣa thấp, trung bình từ 1.000 – 1.200
mm / năm. [27]
Dân số khoảng 63.000 ngƣời (2003), sống chủ yếu bằng nghề đánh bắt và nuôi
trồng thủy sản. Dân cƣ phân bố không đều trên địa bàn 7 xã, phần đông tập trung ở xã
Bình Khánh, Long Hịa, Cần Thạnh và An Thới Đơng. [17]
Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ là 75.740 ha
(2000) [29], [51], gồm vùng lõi, vùng đệm, vùng chuyển tiếp. Theo định hƣớng qui
hoạch phát triển của huyện Cần Giờ đến năm 2010, cơ cấu đất đai về cơ bản vẫn giữ vai
trò nồng cốt là rừng phòng hộ, rừng sinh quyển trên diện tích khoảng 38.000 ha (1993 1999) [29], mở mang thêm diện tích ni trồng thủy sản (6.990 ha [23]) với nguyên tắc
gắn bó chặt chẽ với các hệ sinh thái rừng ngập mặn.


5

Ghi chú:

Vùng lõi
Vùng đệm

Vùng chuyển tiếp

Hình 2.1 Bản đồ khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ.


6

2.1.2.2. Chức năng từng vùng trong khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần
Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh
a. Vùng lõi (4.721 ha)
Vùng lõi bao gồm các tiểu khu rừng số 3, 4b, 6, 11, 12 và 13. Vùng này đặc
trƣng cho các hệ sinh thái rừng trồng, đặc biệt là rừng ngập mặn tái sinh tự nhiên dọc
theo các kênh rạch và bìa rừng, có mức độ đa dạng sinh học cao về thành phần các loài
động vật, thực vật, vi sinh vật cùng cảnh quan rừng ngập mặn đa dạng và hấp dẫn [28],
[45]. Các chức năng chính bao gồm:
 Bảo tồn hệ sinh thái rừng ngập mặn bao gồm rừng trồng và rừng tự nhiên.
 Bảo tồn cảnh quan rừng ngập mặn với các môi trƣờng sống của động vật hoang
dã, đặc biệt là chim nƣớc.
 Bảo tồn hệ thống thủy vực, các bãi bồi dọc bờ sông và ven biển, nơi kiếm ăn và
sinh đẻ của các loài động vật vùng triều.
 Tiến hành một số cơng trình nghiên cứu khoa học về sức bền hệ sinh thái và du
lịch sinh thái có giới hạn.
b. Vùng đệm (41.139 ha)
Là vùng tiếp giáp với vùng lõi, có thể tiến hành các hoạt động kinh tế, nghiên
cứu, giáo dục và giải trí nhƣng khơng ảnh hƣởng đến mục đích bảo tồn vùng lõi.
Vùng đệm bao gồm các tiểu khu rừng số 1, 2, 4a, 5, 7, 8, 9, 10, 14, 15, 16, 17,
18, 19, 20, 21, 22. 23 và 24. Với chức năng phục hồi các hệ sinh thái, dựa trên các quần
xã chiếm ƣu thế [28], [45], bao gồm:
 Góp phần bảo vệ chung vùng lõi của khu dự trữ sinh quyển.
 Tạo không gian lớn cho thú hoang dã ngoài vùng lõi. Khi các khu vực này trở

nên ổn định, có thể bổ sung vào vùng lõi nếu cần thiết.
 Tạo ra cảnh quan tự nhiên và văn hóa nhân văn phục vụ cho du lịch sinh thái.
 Các mơ hình lâm ngƣ kết hợp với môi trƣờng cũng đƣợc ứng dụng trong vùng
này cho cƣ dân địa phƣơng.


7

c. Vùng chuyển tiếp (29.880 ha)
Vùng chuyển tiếp bao gồm các khu vực còn lại của huyện Cần Giờ, cả các khu
lúa nƣớc và vƣờn cây ăn trái cùng thảm cỏ dọc theo bờ biển Cần Thạnh, Long Thành,
Lý Nhơn. [28], [45] Chức năng chính của vùng này:
 Đệm xã hội: các hoạt động sản xuất trong vùng chuyển tiếp cung cấp các loại
sản phẩm và dịch vụ chủ yếu cho cƣ dân địa phƣơng. Việc sử dụng đất và tài
nguyên thiên nhiên trong khu vực này không đƣợc mâu thuẫn với mục tiêu của khu
dự trữ sinh quyển do UNESCO qui định. Mối quan hệ giữa con ngƣời và thiên nhiên
phải đƣợc hài hòa.
 Đệm mở rộng: việc quản lý và phát triển của vùng chuyển tiếp nhằm mục tiêu
mở rộng khơng gian có sẵn nhƣ mơi trƣờng sống cho các loài thú hoang dã từ vùng
đệm.
2.1.2.3. Hệ sinh vật ở rừng ngập mặn Cần Giờ
Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ mang tính đa dạng sinh học cao.
Hệ thực vật, có trên 158 lồi thực vật thuộc 76 họ, các loài chủ yếu nhƣ Đƣớc, Bần
trắng, Mắm trắng, các quần hợp Đƣớc đôi - Bần trắng cùng Xu ổi, Trang, Đƣng (Đâng
hay Đƣớc xanh) và các loài nƣớc lợ nhƣ Bần chua, các quần hợp Mái dầm – Ơ rơ, Dừa
lá, Ráng. Thảm cỏ biển với các loài ƣu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia
sp., đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa, vƣờn cây ăn trái.
Thảm thực vật này là mơi trƣờng sống cho nhiều lồi động vật [29], [40], [44],
theo thống kê năm 1999 nhƣ sau:
 Khu hệ động vật thủy sinh khơng xƣơng sống có trên 700 loài thuộc 44 họ, 19

bộ, 6 lớp, 5 ngành. Điển hình: Tơm sú (Penaeus monodon), Cua biển (Scylla
serrata).
 Khu hệ cá có trên 137 lồi thuộc 39 họ, 13 bộ. Điển hình: cá Dứa (Pangasius
polyurandon), cá Thịi lịi (Periophthalmus schosseri).
 Khu hệ động vật có xƣơng sống trên cạn có 9 lồi lƣỡng thê, 31 lồi bị sát, 4
lồi hữu nhũ. Trong đó có 11 lồi bị sát có tên trong sách đỏ Việt Nam nhƣ: Tắc kè


8

(Gekko gekko), Kỳ đà nƣớc (Varanus salvator), trăn Đất (Python molurus), trăn
Gấm (Python reticulatus), rắn Cạp nong (Bungarus fasciatus), rắn Hổ mang (Naja
naja), rắn Hổ chúa (Ophiophagus hannah), Vích (Chelonia mydas), cá Sấu hoa cà
(Crocodylus porosus).
 Khu hệ chim có khoảng 130 lồi thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 lồi chim
nƣớc và 79 lồi khơng phải chim nƣớc sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau. Điển
hình nhƣ: Cò lạo Ấn Độ (Mycteria leucocephala), Choắt lớn mỏ vàng (Tringa
stagnatilis).
Ngày 21 / 01 / 2000, khu rừng ngập mặn Cần Giờ đã đƣợc MAB / UNESCO
công nhận là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên của Việt Nam nằm trong mạng lƣới 459
khu dự trữ sinh quyển thuộc 97 quốc gia trên thế giới tính đến 10 / 2004, đồng thời
cũng là khu rừng trồng đầu tiên của thế giới đƣợc công nhận là khu dự trữ sinh quyển.
[49], [52]
2.1.3. Thực trạng của rừng ngập mặn Cần Giờ hiện nay
Sau 29 năm tái tạo (1978 - 2007) và 7 năm là khu dự trữ sinh quyển (2000 2007), chất lƣợng rừng tại rừng ngập mặn Cần Giờ đã có chiều hƣớng giảm. Sâu bệnh
phát triển mạnh. Đặc biệt khi mật độ cây quá dày, tán cây bao kín nhƣ hiện nay thì sự
tấn cơng của sâu bệnh sẽ càng thuận lợi hơn. Sâu ăn lá, nấm trắng, sâu đục thân làm cho
cây sinh trƣởng chậm và chết hàng loạt. Hiện ở rừng Cần Giờ, cây khỏe và cây bệnh
đang sống chen nhau [50]. Ngồi ra, do bịt kín bờ đê, không cho nƣớc ra vào tự nhiên
nhƣ trƣớc nên gây ra hiện tƣợng cả khu vực nƣớc bị tù đọng, sẫm màu, rễ cây ngày

càng phát triển nên sự lắng tụ càng nhiều làm cho vùng đất gò cao hơn. Bên cạnh đó,
việc xây dựng tuyến đƣờng xuyên Bắc – Nam rộng lớn nhƣ hiện nay đã phân rừng
thành 2 khu rõ rệt tạo sự cách ly địa lý, nên hệ sinh thái cũng có sự khác biệt. Một số
loài động vật (chuột, ếch, nhái) cũng hạn chế qua lại. Tuyến đƣờng này khơng những
làm ơ nhiễm khơng khí, mà còn ngăn cản dòng chảy ở một số nơi, làm hạn chế nƣớc
triều ngập vào rừng hoặc gây tình trạng ứ nƣớc, làm cây chết, chủ yếu là đƣớc. Rừng
ngập mặn Cần Giờ khơng chỉ là rừng phịng hộ mà còn là khu dự trữ sinh quyển, khu


9

bảo tồn thiên nhiên. Cho nên nhất thiết phải có chủ trƣơng về quản lý và những tác
động lâm sinh, cũng nhƣ cơ chế chính sách phù hợp cho khu rừng này. [39]
2.2. Cây Đƣng (Rhizophora mucronata Lamk.)
2.2.1. Phân loại [35], [46], [47]
Tên La tinh: Rhizophora mucronata.
Ngành: Thực vật có hoa.
Ngành phụ: Thực vật hạt kín.
Lớp: Hai lá mầm.
Lớp phụ: Có nhiều cánh tràng.
Bộ: Sim Myrtales.
Nhóm: Cây ngập mặn.
Họ: Đƣớc Rhizophoraceae.
Chi: Rhizophora.
Lồi: mucronata Lamk.
Tên thơng dụng tại một số quốc gia Đông Nam Á [47]
Brunei: Lengayong.
Campuchia: Doeum prasak.
Indonesia: Bakau bakau hitam.
Malaysia: Bakau jangkar.

Mianma: Pyoo.
Philipine: Bakßuan.
Singapore: Belukap.
Thái Lan: Phangka.
Việt Nam: Đƣng, Đâng, Đƣớc xanh.


10

2.2.2. Hình thái học
Cây gỗ cao khoảng 20 m, đƣờng kính 60 – 70 cm. Vỏ có màu xám đen hay đỏ
sẫm, có đƣờng nứt ngang đều đặn. Hệ rễ rất phát triển, gốc có nhiều rễ chống hình nơm,
và rễ nổi. Trên rễ có nhiều lỗ bì. Rễ dài khoảng 3 m, đƣờng kính rễ dao động từ 2,5 –
8,0 cm. Mạng lƣới rễ đan vào nhau chằng chịt nhƣ những tấm đăng khổng lồ giữ phù
sa. [31], [34], [46], [47]
Lá đơn, mọc đối, dài 6 – 16 cm, rộng 3 – 8 cm, dày, cứng, dai. Lá màu xanh đậm
bóng có hình trái xoan hay thn nhọn giáo. Gân giữa lớn, màu lục, gân bên không rõ.
Cuống lá thơ, hơi dẹt, màu lục. Lá kèm hình tam giác thƣờng rụng sớm.

C

B

A

C

A

B

D

Hình 2.2 Các thành phần trong cấu tạo hình thái cây Đƣng. [18], [37], [28]
(A) lá, (B) hoa, (C) trái, (D) hệ thống rễ.
Đài hoa không rụng cho đến khi thành trái [12]. Có 4 đài hoa, nhiều lá đài, lá đài
hình ovan, nhọn, có nhiều thịt, dày, màu xanh lá, khơng có lơng tơ. Đài hoa dài khoảng
1,2 cm, rộng khoảng 0,7 cm, chiều dài các đài hoa bằng nhau.
Cánh hoa màu trắng, có 4 cánh hoặc nhiều hơn, nhọn, cánh hoa đều, mọc thẳng,
không theo quy luật, có lơng tơ, mép ngun hơi cong, dày, đầy thịt. Các cánh hoa mọc
so le với đài hoa. Mặt lƣng cánh hoa có lơng thƣa, uốn cong vào ơm lấy nhị. Nhị 8
chiếc, chỉ nhị ngắn, bao phấn 3 khía, bầu trung hoặc bầu dƣới hình nón 2 ơ, mỗi ô 2


11

nỗn, vịi chẻ đơi [12]. Hoa có cuống dài khoảng 0,5 cm, dẹt, màu xanh lá, khơng có
lơng tơ.
Trái non hình trứng phía dƣới phình rộng, màu lục hoặc màu xám, có đài rủ
xuống. Trụ mầm dài 35 – 70 cm, phía dƣới hơi phình to, một hạt. Trái Đƣng nảy mầm
ngay trên cây mẹ, trái chín rơi xuống, trụ mầm cấm vào trong bùn nhƣ một cái cọc,
tránh cho cây con khỏi bị nƣớc biển cuốn trôi, cây con tự cấm rễ xuống bùn để tiếp tục
phát triển. [2], [12]
2.2.3. Phân bố
Đƣng đƣợc tìm thấy ở nhiều nơi, dọc bờ biển Ấn Độ Dƣơng, Tây Thái Bình
Dƣơng nhƣ Ấn Độ, Campuchia, Trung Quốc (đảo Hải Nam, Đài Loan), Malaysia,
Indonesia, Philipin, Nhật Bản, Madagascar, Ustralia, Melanesia. Ở Kenya (Đông Phi),
Đƣng là loài cây đặc trƣng cho Rhizophoraceae. [2], [47]
Ở Việt Nam Đƣng đƣợc trồng trên các bãi bồi ven biển, chịu ảnh hƣởng thƣờng
xuyên của thủy triều giàu mùn hay trên các bãi đang ổn định ở vùng ngập mặn ven
biển. Cây trƣởng thành nhanh, tái sinh hạt tốt, ra hoa vào khoảng tháng 5 – 6, tạo trái

vào tháng 10 – 11.
2.2.4. Giá trị kinh tế
Gỗ Đƣng màu đỏ vàng sẫm, nặng, rắn nên đƣợc sử dụng trong xây dựng, làm đồ
nội thất, làm củi rất tốt, than đốt tỏa nhiệt lƣợng cao [26], [32]. Vỏ cây giàu tannin,
đƣợc dùng trong công nghiệp thuộc da, nhuộm lƣới đánh cá [46]. Bột vỏ cây Đƣng còn
đƣợc dùng làm thuốc trị bệnh thiếu máu, bệnh đái tháo đƣờng, bệnh viêm họng, bệnh
xuất huyết, chứng huyết niệu, urê máu, lá cây còn đƣợc dùng làm thuốc cao đắp rất tốt
[33]. Ngoài ra, Đƣng cịn giữ chức năng điều hịa khí hậu, chắn gió, chống xói lở đất
ven sơng, ven biển, mở rộng diện tích bãi bồi ra biển, giảm bớt sự xáo trộn đất đai và ô
nhiễm nguồn nƣớc ven biển, nuôi dƣỡng và cung cấp thức ăn cho các loài động vật
hoang dã và hải sản có giá trị cao [43]. Trong quá trình phân giải lƣợng protein trong
lớp thảm mục nhờ quá trình hoạt động của vi sinh vật, quần thể Đƣng đã giúp tạo ra
nhiều mùn bã hữu cơ là nền tảng của chuỗi thức ăn đặc trƣng của vùng ven biển cửa


12

sông. Những thảm mục giàu dinh dƣỡng này là thức ăn quan trọng của ấu trùng, nhiều
lồi tơm, cá và các lồi động vật khác có giá trị kinh tế cao. [40], [41], [42]
2.3. DNA (Deoxyribonucleic acid)
Tế bào là đơn vị của sự sống, đƣợc phân ra làm 2 loại: tế bào tiền nhân
(Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote). Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên
đƣợc hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA
(Ribonucleic acid). Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là
phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có
trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau. Các nucleotide trong cùng một mạch
đơn đƣợc nối với nhau bằng liên kết phosphodieste và 2 mạch đơn sắp xếp đối song với
nhau theo nguyên tắc bổ sung A liên kết với T bằng 2 liên kết hydro, G liên kết với C
bằng 3 liên kết hydro. [4], [6]

/>
Hình 2.3 Cấu trúc mạch đơi xoắn kép của phân tử Deoxyribonucleic acid.[25]


13

2.3.1. Quy trình ly trích DNA thực vật
Gồm ba bƣớc [5]
 Bƣớc 1: Phá màng tế bào và màng nhân giải phóng DNA ra mơi trƣờng bằng
phƣơng pháp cơ học (nghiền), đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA.
Thông thƣờng ngƣời ta nghiền tế bào trong một hỗn hợp chất tẩy (nhƣ SDS,
Sarcosyl, CTAB) và proteinase (Proteinase K).
Để đảm bảo sự toàn vẹn cấu trúc của các bào quan, hạn chế sự hoạt động của các
enzyme thủy phân nội bào, ngƣời ta có thể phá vỡ cơ học mô và tế bào bằng cách
nghiền mịn trong điều kiện lạnh sâu của Nitơ lỏng (- 196 0C). Sau đó sử dụng chất
tẩy mạnh để phá màng tế bào và màng nhân (phá vỡ hóa học).
 Bƣớc 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein theo nguyên tắc các loại phân tử khác nhau (nucleic acid / protein) sẽ tạo
thành các pha không hòa tan (phenol, chloroform / nƣớc) riêng biệt. Mẫu đƣợc lắc
nhẹ trong dung dịch phenol / chloroform / iso amylalcohol (tỷ lệ 25 / 24 / 1). Dung
dịch này có tác dụng làm biến tính protein đồng thời khơng hịa tan nucleic acid.
Protein đã bị biến tính sẽ khơng cịn hịa tan trong pha nƣớc có chứa nucleic
acid nhờ vậy mà khi ly tâm sẽ tạo đƣợc một lớp tủa nằm giữa pha nƣớc và pha
phenol chloroform. Pha nƣớc có chứa nucleic acid đƣợc thu nhận lại.
 Bƣớc 3: Tủa nucleic acid. Có thể tủa bằng ethanol hoặc isopropanol, nhƣng

thơng thƣờng ngƣời ta dùng isopropanol. Nucleic acid sẽ đƣợc thu nhận lại bằng ly
tâm. Sau đó, cặn tủa đƣợc rửa trong ethanol 70 % để loại bỏ các muối hoặc các dấu
vết của isopropanol cịn dính lại trên mẫu. Việc tủa giúp thu nhận nucleic acid dƣới
dạng cô đặc, nhằm bảo vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, đồng thời có thể

hịa

tan

mong muốn.

chúng

lại

trong

dung

dịch

theo

nồng

độ


14

2.3.2. Các phƣơng pháp định lƣợng, định tính DNA
2.3.2.1. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp quang phổ
Mỗi loại phân tử có một đỉnh hấp thụ ở một độ dài sóng nhất định tùy thuộc vào
cấu trúc của chúng. Ví dụ đỉnh hấp thụ của các phân tử acid nucleotide là 260 nm. Sự
hấp thụ này là do sự tƣơng tác giữa các photon với các electron của vòng purine và

pyrimidine. Dựa vào sự hấp thụ này ngƣời ta có thể định lƣợng đƣợc hàm lƣợng DNA
có trong mẫu ly trích. [11], [14]
Sự hấp thụ ở đây đƣợc tính bằng đơn vị OD (Optical Density). Đối với DNA
tinh khiết một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với:
 50 g / ml DNA sợi đôi.
 40 g / ml DNA sợi đơn hay RNA.
 20 g / ml oligonucleotide sợi đơn.
Từ giá trị OD đo đƣợc, ngƣời ta có thể suy ra đƣợc nồng độ acid nucleotide
trong mẫu ly trích.
DNA (ng / l) = [(62,9 * OD260nm) – (36 * OD280nm)] * n
Với
 OD260nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 260 nm.
 OD280nm: Giá trị mật độ quang của mẫu ở bƣớc sóng 280 nm.
 n: Độ pha lỗng (thƣờng n = 100).
Cách tính trên chỉ đúng với mẫu DNA tinh khiết. Nếu mẫu ly trích có lẫn tạp
protein thì kết quả tính tốn sẽ khơng chính xác. Ngồi đỉnh hấp thụ là 280 nm protein
cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleoic acid và làm sai lệch giá trị
thật của nồng độ nucleoic acid. Để ƣớc lƣợng độ tinh sạch của mẫu ly trích ngƣời ta
tính tỷ lệ OD260nm / OD280nm.
 Nếu tỷ lệ này nằm trong khoảng 1,7 - 2,2 thì mẫu ly trích đƣợc xem là sạch.
 Nếu mẫu bị nhiễm protein thì tỷ lệ này sẽ thấp hơn nhiều.


15

Tuy nhiên, việc định lƣợng bằng phƣơng pháp hấp thu mật độ quang lại không
cho biết chất lƣợng của DNA ly trích. Để biết chính xác chất lƣợng DNA ly trích, ngƣời
ta sử dụng phƣơng pháp điện di trên gel.
2.3.2.2. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di
Trong một điện trƣờng, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện

tích và kích thƣớc của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lƣợng thì phân tử nào có
điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngƣợc dấu nhanh hơn. [11], [14]
Đối với phân tử DNA, việc điện di đƣợc thực hiện trên giá thể bán rắn là gel. Gel
là môi trƣờng xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi qua. Kích
thƣớc phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel đƣợc sử
dụng tùy theo kích thƣớc và mức độ phân tách của phân tử acid nucleic: gel agarose và
gel polyacrylamide.
 Gel agrose: Lỗ có đƣờng kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA
sợi đơi, kích thƣớc 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng
hiệu quả phân tách các nhóm phân tử có kích thƣớc khác nhau.
 Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn
DNA có kích thƣớc dƣới 500 bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide.
Sau khi phân tách bằng điện di, để phát hiện các phân tử DNA trên gel, ngƣời ta
sử dụng một số phƣơng pháp phát hiện nhƣ sau:
 Đối với gel agarose: Nhuộm bằng ethidium bromide. Chất này sẽ gắn xen vào
giữa các base của phân tử DNA, phát huỳnh quang dƣới tia tử ngoại. Điều này cho
phép phát hiện vị trí các đoạn DNA trên gel.
 Đối với gel polyacrylamide: Các phân tử DNA thƣờng đƣợc đánh dấu bằng đồng
vị phóng xạ và vị trí của nó sẽ đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Ngồi
ra, các phân tử DNA cịn có thể đƣợc đánh dấu bằng các chất nhuộm chuyên biệt.
Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết đƣợc chất lƣợng của DNA ly
trích nhƣ gãy, lẫn tạp, hay cho band sáng rõ.


16

2.4. Enzyme giới hạn (RE – restriction enzyme)
2.4.1. Các loại enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn là những endonuclease, có khả năng thủy giải DNA mạch đôi
một cách lặp lại ở những vị trí xác định. Chính vì đặc tính đó mà chúng đƣợc chia làm 3

loại (type). [5]
 Type I: khi một enzyme nhận biết đƣợc một trình tự, nó sẽ di chuyển trên phân
tử DNA đến một vị trí cách đó khoảng 1000 – 5000 nucleotide và giải phóng độ vài
chục nucleotide.
 Type II: enzyme nhận biết trình tự và cắt ngay tại vị trí nhận biết đó.
 Type III: enzyme nhận biết một trình tự và cắt DNA ở vị trí cách đó khoảng 20
nucleotide.
Type I và Type III có vai trị rất hạn chế, tuy nhiên type II là những enzyme cắt
có vai trị rất quan trọng trong kỹ thuật biến đổi di truyền.
2.4.2. Trình tự nhận biết của enzyme cắt giới hạn
Mỗi RE nhận biết một trình tự nucleotide đặc trƣng, các trình tự này thƣờng bao
gồm 4 – 8 nucleotide. Từ đó, DNA hệ gene sẽ đƣợc cắt ra thành những đoạn ngắn, hoặc
dài có kích thƣớc khác nhau. Tuy nhiên đối với một số enzyme, trình tự nhận biết
khơng có tính chun biệt tuyệt đối, một số nucleotide của trình tự có thể đƣợc thay thế
bởi nucleotide khác. [5]
Một đặc trƣng quan trọng của trình tự nhận biết là chúng có cấu trúc
palindromic, có nghĩa là hai mạch của trình tự hồn tồn giống nhau nếu chúng đƣợc
đọc theo chiều 5’ – 3’. Nhƣ vậy vị trí cắt giống nhau trên 2 mạch DNA.
2.4.3. Sử dụng các enzyme cắt giới hạn trong phân tích DNA
Việc sử dụng các enzyme cũng khá đơn giản, chỉ cần thêm một lƣợng enzyme
thích hợp vào DNA mục tiêu trong dung dịch đệm thích hợp và sau đó để cho phản ứng
xảy ra ở 37 C. Hoạt tính của các enzyme đƣợc biểu hiện bằng đơn vị (unit). Đó là
lƣợng enzyme cần thiết để phân cắt 1 g DNA trong 1 giờ ở 37 C. Phần lớn các thí


17

nghiệm địi hỏi phải phân cắt hồn tồn DNA mục tiêu, tuy nhiên trong một số trƣờng
hợp sử dụng kết hợp nhiều enzyme chỉ cần tính tốn nồng độ và thời gian ủ để đạt đƣợc
sự phân cắt khơng hồn toàn. [5]

Các kiểu đoạn DNA tạo thành do sự phân cắt của các enzyme phụ thuộc vào
trình tự nhận biết và vị trí điểm cắt trong trình tự này. Chiều dài của đoạn DNA tùy
thuộc vào tần số xuất hiện của trình tự nhận biết. Vị trí cắt của enzyme sẽ xác định kiểu
đầu của đoạn DNA tạo thành (đầu bằng – blunt end hay đầu dính – sticky end). Nếu RE
cắt hai mạch DNA tại cùng một điểm sẽ tạo thành các đoạn DNA có đầu bằng, sau khi
cắt, hai đầu bằng không thể tự kết hợp trở lại, để nối chúng lại cần phải dùng enzyme
T4 ligase. Nếu vị trí cắt của RE lệch nhau trên hai mạch thì sẽ tạo thành các đầu dính,
các đầu dính bổ sung có thể bắt cặp trở lại. Việc tạo thành đầu bằng hay đầu dính có ý
nghĩa rất quan trọng đối với những thao tác ở mức độ DNA, đặc tính đƣợc quan tâm
nhất là khả năng cắt tạo đầu dính, đƣợc ứng dụng rất nhiều trong tái tổ hợp di truyền in
vitro. Hai phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau đƣợc cắt bởi cùng một RE sẽ có khả
năng kết hợp thành một phân tử tái tổ hợp.

http://www/math.mit.edu/~lippert/18.417/lectures/02_PartialDigest/

Hình 2.4 Một số enzyme cắt giới hạn. [48]


18

2.5. PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.5.1. Khái niệm
Phƣơng pháp PCR đƣợc nhà khoa học Mỹ Karl Mullis và cộng sự phát minh vào
năm 1985 (giải Nobel Hóa học năm 1993).
Đây là phƣơng pháp nhằm khuếch đại một đoạn phân tử DNA nào đó một cách
đặc hiệu in vitro nhờ sự xúc tác của enzyme Taq polymerase từ một lƣợng DNA mẫu
rất nhỏ. PCR là một kỹ thuật trong sinh học phân tử để tạo dòng DNA rất đơn giản,
hiệu quả, hàng triệu đoạn DNA đặc hiệu và đồng nhất sẽ đƣợc thu nhận. [5], [10]
2.5.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là một phƣơng pháp tổng hợp DNA dựa trên mạch khn là một trình tự

đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lƣợng bản sao của khuôn này thành hàng triệu
bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp enzyme đặc hiệu cho đoạn
DNA này. Hiện nay, phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu, tạo ra
các đột biến gene, chẩn đoán phát hiện bệnh trên ngƣời, động vật, thực vật và kiểm
nghiệm thực phẩm. [5]
Tất cả các DNA polymerase đều cần những primer chuyên biệt để tổng hợp một
mạch DNA mới từ mạch khuôn. Mạch khn thƣờng là một trình tự DNA của gene
(gọi là trình tự DNA mục tiêu) đặc trƣng cho lồi sinh vật mục tiêu hoặc là gene quy
định việc tổng hợp một loại độc tố chuyên biệt của vi sinh vật.
Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch
của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này đƣợc
kéo dài để hình thành mạch mới. Phƣơng pháp PCR đƣợc hình thành dựa trên đặc tính
này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đƣợc khuếch đại thành số
lƣợng lớn bản sao đến mức có thể thấy đƣợc sau khi thực hiện điện di trên gel, nhuộm
ethidium bromide và quan sát dƣới tia UV. Nhƣ vậy, để khuếch đại một trình tự DNA
xác định, cần phải có những thơng tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt là trình tự
base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.


19

2.5.3. Quy trình phản ứng PCR
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau [5]. Mỗi chu kỳ gồm 3 bƣớc
 Bƣớc 1 (biến tính, denaturation): trong một dung dịch phản ứng bao gồm các
thành phần cần thiết cho sự sao chép, phân tử DNA đƣợc biến tính ở điều kiện nhiệt
độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử, thƣờng là ở nhiệt độ 94 - 95 C phân tử
DNA từ dạng sợi đôi sẽ tách thành dạng sợi đơn trong vòng 30 – 60 giây.
 Bƣớc 2 (lai, annealation): trong bƣớc này ở nhiệt độ đƣợc hạ thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong
thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40 - 70 C. Tùy thuộc vào Tm của

các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.
 Bƣớc 3 (kéo dài, elongation - extension): dƣới tác động của DNA polymerase,
các nucleotide lần lƣợt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn.
Mạch mới đƣợc tạo thành từ mạch đƣợc kéo dài. Nhiệt độ của phản ứng là 72 C và
thƣờng kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần
khuếch đại.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ gồm 3 bƣớc nhƣ trên đƣợc lặp đi lặp lại nhiều
lần, làm số lƣợng DNA đƣợc gia tăng theo cấp số nhân. Theo tính tốn, sau 30 – 40
chu kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, DNA sản phẩm
đƣợc nhuộm bằng ethdium bromide sau khi thực hiện điện di trên gel agarose hoặc
gel polyacrylamide và quan sát dƣới tia UV (bƣớc sóng 312 nm).


20

Andy Vierstraete, 1999.
/>
Hình 2.5 Phản ứng PCR. [20]
2.6. Khái niệm đa dạng sinh học (Biodiversity) và tầm quan trọng
Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới – World Wildlife Fund (WWF)
(1989) đề xuất nhƣ sau: “Đa dạng sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên Trái đất, là
hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài
và là những hệ sinh thái vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trƣờng”. Đa dạng sinh
học đƣợc xem xét trên ba mức độ: đa dạng hệ sinh thái, đa dạng lồi và đa dạng di
truyền. [13]
Tính đa dạng trong thiên nhiên là nguồn tài nguyên vô tận của nhân loại, là
nguồn gốc của sự thịnh vƣợng, cung cấp cho chúng ta toàn bộ thức ăn, phần lớn các
loại nguyên vật liệu, hàng hoá và dịch vụ, cung cấp nguyên liệu di truyền cần thiết cho

21

nông nghiệp, dƣợc học, công nghệ. Đa dạng sinh học giúp duy trì các dịch vụ sinh thái
quan trọng, cung cấp cơ sở cho sức khoẻ con ngƣời, là nguồn tạo ra năng suất và tính
bền vững trong nơng nghiệp tạo cơ sở ổn định kinh tế và các hệ thống chính trị, xã hội
đồng thời làm giàu chất lƣợng cuộc sống của chúng ta. Vì vậy, việc duy trì đƣợc tính đa
dạng sinh học sẽ giúp lồi ngƣời bảo vệ môi trƣờng sống, hạn chế đến mức thấp nhất
những thiệt hại do thiên nhiên hay do con ngƣời gián tiếp tạo nên nhƣ hiệu ứng nhà
kính, băng các vùng cực tan, môi trƣờng đất, môi trƣờng nƣớc bị nhiễm độc phóng xạ.
Chính việc lạm dụng tài ngun thiên nhiên trong q trình cơng nghiệp hóa, đơ thị hóa
con ngƣời đã, đang và sẽ gây ra những tác động lớn đến môi trƣờng làm rối loạn các hệ
sinh thái tự nhiên và suy giảm tính đa dạng về sự sống trên trái đất. Trƣớc thực tế nhƣ
hiện nay, việc nghiên cứu và bảo tồn tính đa dạng sinh học là một vấn đề cấp bách
nhằm bảo đảm cho sự phát triển bền vững.
2.7. Sự đa dạng di truyền (Genetic diversity)
Trong một lồi, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ
gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một
loại đột biến nào đó. Đơi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột
biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho gene
đó khơng biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá thể
khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền nhƣ vậy đƣợc gọi là sự đa dạng di truyền.
2.8. Ý nghĩa của việc nghiên cứu sự đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên
đồng thời cũng quan trọng đối với con ngƣời.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nịi giống, kháng
với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trƣờng. Sự đa dạng di
truyền của cây trồng và vật ni có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật
nuôi mới phục vụ lợi ích của con ngƣời.

22

2.9. Một số kỹ thuật đánh giá sự đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị
phân tử
Từ khi con ngƣời biết đến sự hiện diện của gene cùng với việc Watson và Crick
phát minh ra cấu trúc chuỗi DNA năm 1953, các kỹ thuật sinh học phân tử đƣợc phát
minh ngày càng nhiều và trở thành công cụ đắc lực cho công tác nghiên cứu khoa học
với độ tin cậy cao hơn. Hiện nay, con ngƣời đã tìm ra đƣợc nhiều kỹ thuật đánh giá đa
dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử khác nhau, có thể chia ra làm 2 nhóm sau
[7]:
 Dựa trên PCR: RAPD, STS, SSR, SSCP, AFLP,…
 Dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là RFLP.
2.9.1. Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Lenghth Polymorphism)
2.9.1.1. Khái niệm
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa
các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lƣợng và
kích thƣớc của những đoạn DNA đƣợc tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn
(restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống đƣợc nghiên cứu,
sau đó những đoạn DNA đƣợc cắt ra này lai với những probe đánh dấu huỳnh quang đã
biết, kết quả đƣợc quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng đoạn probe chuyên
biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này dựa vào hiện tƣợng
đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ thuật RFLP có thể phát
hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy khơng cao. [7], [9]
RFLP marker có khả năng sử dụng rất phong phú, nhƣng quy trình thực hiện
phức tạp, nguy hiểm đến sức khỏe ngƣời thực hiện, đắt tiền, yêu cầu DNA có số lƣợng
và chất lƣợng rất cao. Do đó, ngƣời ta có xu hƣớng áp dụng những marker đơn giản
hơn, an toàn hơn, trên cơ sở phản ứng chuỗi polymerase.


23

Hình 2.6 RFLP trong trƣờng hợp có đột biến điểm.
2.9.1.2. Một số nghiên cứu, ứng dụng dựa trên kỹ thuật RFLP
a. Nghiên cứu lập bản đồ gene
Mc. Couch và ctv (1988) thiết lập bản đồ di truyền nhờ marker phân tử (RFLP) trên
cây lúa gồm 135 loci [9], [10]. Bản đồ gồm 12 nhiễm sắc thể (NST) với tổng cộng 1.389
cM trên genome cây lúa từ cặp lai IR34583 (indica) và Bulu Dalam (Javanica).
Ba năm sau, bản đồ thứ hai từ quần thể IRAT117 (Japonica) và Apura (indica)
đƣợc công bố (Mc. Couch 1991, Tanksley và ctv 1991).
Saito và ctv (1991) thiết lập một bản đồ khác dựa trên cặp lai Kasalath (indica)
và Fl134 (Japonica) với 347 RFLP marker, phủ trên 12 NST với tổng cộng 1.836 cM
với 347 loci.
Để phân tích sự đa dạng di truyền của 112 giống lúa ở Châu Á, Takashige và
cộng sự (1995) đã sử dụng 12 probe DNA để nghiên cứu và đã xác định đƣợc mối
tƣơng quan di truyền giữa các giống lúa nói trên.
Qifa Zhang và cộng sự (1992) đã xác định đƣợc sự đa dạng di truyền giữa các
giống lúa indica (12 dòng) và Japonia (14 dòng) qua sử dụng 49 probe RFLP.
Yu và cộng sự (1995) cho thấy một số marker hình thái (17 marker, thí dụ nhƣ
vỏ trấu màu tím, lá khơng có lơng, hạt gạo nâu, dạng cây lùn) có mối liên kết với
marker RFLP.


24

b. Một số ứng dụng khác
 Lập bản đồ gene cho bệnh đạo ôn và các gene kháng bệnh bạc lá, rầy nâu, sâu
đục thân.
 Marker phân tử trong di truyền và chọn giống.
 Phân tích tƣơng quan di truyền giữa các cá thể.
 Đánh giá sự đa dạng di truyền của quần thể.

2.9.2. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Lenghth Polymorphism)
2.9.2.1. Khái niệm
Kỹ thuật AFLP là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau và Vos (1993)
phát minh ra. Sau đó đƣợc Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997) tiếp tục phát
triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR bằng cách sử dụng những cặp
primer đặc biệt đƣợc thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR đƣợc thiết lập nghiêm ngặt
giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA đƣợc cắt bằng RE từ bộ gene
của đối tƣợng nghiên cứu. Những đoạn DNA đƣợc nhân bản có độ dài khoảng từ 60 –
500 bp. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể và phát
hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao. [1], [3], [15], [16]
Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bƣớc cơ bản [24]
 Bƣớc 1: Tách chiết DNA. AFLP đòi hỏi DNA phải có độ tinh sạch cao.
 Bƣớc 2: Cắt giới hạn và gắn adapter. Bƣớc này gồm có hai giai đoạn:
Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn nhờ 2 enzyme cắt.
Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đơi DNA đầu dính gồm
một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ sung với những
đoạn DNA vừa đƣợc cắt, để trong 2 phản ứng PCR sau ngƣời ta sử dụng những
primer có trình tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn.
Để các đoạn DNA vừa cắt không bắt cặp với nhau, giai đoạn cắt giới hạn và
gắn adapter đƣợc xem nhƣ một.


25

/>
Hình 2.7 Nguyên lý kỹ thuật AFLP. [36]
 Bƣớc 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification).
Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn adapter từ
bƣớc 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi DNA mạch đơn
có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bƣớc 2 và cộng thêm 1 nucleotide ở

đầu 3’.
Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
MseI + 1 nucleotide (thƣờng là C).
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự của adapter
EcoRI + 1 nucleotide (thƣờng là A).