Bước đầu đánh giá mức độ đa dạng di truyền của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa - Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP

1
Chƣơng 1
GIỚI THIỆU

1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, cây điều (Anacardium occidental L.) đã và đang trở
thành một cây công nghiệp mạnh, có giá trị kinh tế – xã hội cao của nước ta. Hằng
năm, doanh thu từ cây điều đem về cho nước ta hàng trăm triệu USD, trở thành nước
xuất khẩu nhân điều đứng thứ 2 thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil [4]. Bên
cạnh đó, việc canh tác cây điều còn giúp nước ta giải quyết được những vấn đề xã hội
khác như: phủ xanh đất trống đồi trọc, giải quyết việc làm, đem lại thu nhập ổn định
cho người nông dân ở những vùng đất khô cằn, bạc màu,…Nước ta nằm trong vùng
có khí hậu thuận lợi và có diện tích lớn đất phù hợp cho sự phát triển của cây điều, vì
vậy chúng ta có tiềm năng lớn để phát triển mạnh cây điều.
Tuy nhiên tình hình canh tác cây điều của nước ta nói chung và của tỉnh Bà Rịa –
Vũng Tàu nói riêng không đạt tương xứng như tiềm năng, do đó năng suất bình quân
còn thấp, không đồng đều và không ổn định cả về chất lượng và sản lượng, bắt nguồn
từ việc phát triển cây điều một cách tự phát, không được đầu tư nghiên cứu nghiêm
túc, đặc biệt là những nghiên cứu về các giống điều và kỹ thuật canh tác. Để có thể đề
ra một chiến lược toàn diện phát triển cây điều, điều qua trọng là cần phải đầu tư cho
công tác lai tạo, bảo tồn và phổ biến những giống điều có chất lượng vượt trội so với
những giống hiện có. Muốn vậy trước hết phải đánh giá được mức độ đa dạng di
truyền của quần thể cây điều hiện có. Xuất phát từ yêu cầu đó, được sự phân công của
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học–Trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM, dưới sự hướng
dẫn của thầy TS. Bùi Minh Trí, chúng tôi thực hiện đề tài: “Bƣớc đầu đánh giá mức
độ đa dạng di truyền của quần thể điều (Anacardium occidental L.) tại tỉnh Bà
Rịa – Vũng Tàu bằng kỹ thuật RAPD và AFLP”.

2
1.2. Mục tiêu và yêu cầu
1.2.1. Mục tiêu
 Thông qua kỹ thuật RAPD đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng di truyền và
nhận diện chỉ thị phân tử của quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.
 Xây dựng quy trình tiến hành kỹ thuật AFLP trên cây điều, làm cơ sở cho
việc áp dụng kỹ thuật AFLP vào những nghiên cứu sâu rộng hơn về tính đa dạng di
truyền và nhận diện chỉ thị phân tử trên cây điều cũng như trên những đối tượng
nghiên cứu khác sau này.
1.2.2. Yêu cầu
 Thu thập được mẫu lá của những cây điều có những đặc điểm nổi bật và
điển hình dựa trên kiểu hình như: khả năng chịu hạn tốt hay không tốt, năng suất và
chất lượng hạt cao hay thấp, có tính đề kháng với sâu bệnh cao hay thấp, ra hoa sớm
hay muộn,…
 Ly trích DNA có chất lượng tốt từ các mẫu lá thu được (được bảo quản
lạnh) làm nguyên liệu cho kỹ thuật RAPD và AFLP.
 Thực hiện thành công kỹ thuật RAPD từ đó đánh giá sơ bộ mức độ đa dạng
di truyền quần thể điều tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu, đồng thời nhận diện một số đoạn
DNA có thể được sử dụng như những chỉ thị phân tử liên quan đến những tính trạng
đáng quan tâm.
 Thực hiện kỹ thuật AFLP trên một số mẫu DNA có chất lượng tốt, từ đó
lựa chọn ra một vài tổ hợp primer nhân bản chọn lọc thích hợp cho việc áp dụng kỹ
thuật AFLP trên cây điều.
1.3. Hạn chế của đề tài
 Những nghiên cứu phân loại giống điều tại Việt Nam chưa được thiết lập,
đồng thời khó có khả năng nhận diện giống trong thực tế tại vườn nông hộ nên chỉ

thực hiện lấy mẫu những cây điều có đặc điểm nổi bật và điển hình, không dựa trên
đặc điểm phân loại giống.
 Không có đủ điều kiện để thu thập lượng mẫu lớn.



3
 Không có đủ điều kiện để thực hiện phản ứng PCR – RAPD với nhiều
primer và tìm ra quy trình PCR – RAPD tối ưu.
 Không có điều kiện để tiến hành kỹ thuật AFLP trên nhiều mẫu và với
nhiều tổ hợp primer do chi phí thực hiện quá cao.

4
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về cây điều
2.1.1. Nguồn gốc cây điều
Cây điều có tên khoa học là Anacardium occidentale L.
Cây điều có nguồn gốc ở Brazil. Người Bồ Đào Nha là những người đầu tiên
mang cây điều từ Brazil sang trồng ở châu Á và châu Phi trong công cuộc mở rộng
thuộc địa của họ. Điều kiện tự nhiên ở châu Á phù hợp cho sự phát triển của cây điều.
Ngày nay cây điều trải rộng trong ranh giới vĩ tuyến 25
o
Bắc và 25
o
Nam. Trước
kia, cây điều được trồng chủ yếu để che phủ đất, chống xói mòn,…Mãi đến tận đầu thế
kỷ 20 nhân điều mới thực sự trở thành nông sản có giá trị trên toàn thế giới [2][3].
2.1.2. Đặc điểm thực vật học của cây điều
Cây điều là loài cây thân mộc vùng nhiệt đới, sống lâu năm (đến khoảng 30 – 40
năm hay cao hơn), chịu hạn tốt, có thể sinh trưởng và phát triển ở những vùng đất khô
cằn, bạc màu mà những cây lương thực khác khó có thể sống nổi.
2.1.2.1. Thân và cành cây
Thân thường cao khoảng 6 – 8 m, những nơi đất tốt có thể đến 10 – 12 m,
đường kính vòng thân có thể đạt 40 – 50 cm. Chiều cao thân cây có liên hệ mật thiết
với mật độ trồng. Nếu trồng với mật độ dày, thân cây tăng trưởng chiều cao mạnh

nhưng cành nhánh nhỏ và ngắn, lá thưa thớt, không thể cho nhiều hoa và trái. Thông
thường khoảng cách trồng phổ biến khoảng 8 – 10 m.
Tán cây điều rộng, trung bình khoảng 10 m, có khi đạt 20 m [2].
2.1.2.2. Hệ rễ
Cây điều có rễ cọc và rễ ngang. Ở những vùng đất khô, mạch nước ngầm thấp,
rễ cọc đâm xuống sâu để hút nước, do đó cây điều có khả năng chịu hạn cao và vững



5
chắc. Rễ cọc cây điều trên 5 tuổi có thể sâu khoảng 5 m. Hệ thống rễ ngang mọc cách
mặt đất khoảng 12 cm.
2.1.2.3. Lá
Lá cây điều thuộc loại lá đơn, nguyên. Lá thường có dạng thuôn hay hình
trứng, đuôi lá thường hơi tròn. Lá non có màu xanh hay đỏ tía tùy giống, khi già có
màu xanh thẫm. Theo Rao và Hassan (1957), thời gian trung bình từ khi ra lá non đến
lá trưởng thành khoảng 20 ngày [3].
2.1.2.4. Hoa và quả điều
Hoa điều nhỏ, đài hợp, có năm cánh rời. Khi mới nở cánh hoa có màu trắng
hay vàng có sọc đỏ, sau đó chuyển thành màu hồng sẫm. Hoa điều có hai loại: hoa đực
và hoa lưỡng tính. Hoa đực gồm toàn nhị đực, hoa lưỡng tính có khoảng 8 – 12 nhị
đực và có một nhụy cái ở chính giữa. Nhụy cái gồm một bầu noãn nằm dưới một vòi
dài (dài và mập hơn nhị đực). Theo Copeland (1961), trong bầu noãn chứa một noãn
duy nhất, nếu được thụ tinh sẽ phát triển thành hạt điều [2].
Hoa điều mọc thành từng chùm có từ vài chục đến 1 – 2 trăm hoa, gồm cả hoa
đực và hoa lưỡng tính, trong đó hoa đực chiếm tỉ lệ cao, còn hoa lưỡng tính dao động
từ 0 – 30 % tổng số hoa trong chùm. Số hoa lưỡng tính đậu quả tới chín cho thu hoạch
khoảng 10 %. Những chùm hoa của đầu và cuối vụ thường nhiều hoa đực, những
chùm hoa chính vụ có tỉ lệ hoa lưỡng tính cao. Tỉ lệ hoa lưỡng tính còn tùy thuộc vào
từng cây khác nhau trong vườn. Bình quân tỉ lệ hoa lưỡng tính trong chùm khoảng

12 – 15 % [3].
Mùa hoa điều nở là mùa khô. Hoa điều thường nở từ tháng 11 kéo dài đến tận
tháng 3 năm sau, tuy nhiên hoa nở rộ ở tháng 1 – tháng 2. Sự nở hoa có liên hệ mật
thiết với nhiệt độ môi trường. Có sự chênh lệch về thời điểm nở hoa, ngay cả với
những hoa cùng chùm. Hoa điều nở từ sáng sớm tới trưa, sau đó bắt đầu héo. Sau khi
thụ phấn xong, quá trình thụ tinh bắt đầu: hạt phấn nảy nầm trên đầu núm nhụy cái đưa
các tinh tử xuyên qua vòi nhụy vào bầu noãn để thụ tinh cho tế bào trứng. Thụ tinh
xong bắt đầu quá trình hình thành và phát triển của hạt điều. Quả điều thật là phần mà
ta hay gọi là hạt, phần gọi là quả thực ra do phần cuống phình to ra, gọi là quả giả. Hạt
điều bao giờ cũng phát triển trước và nhanh hơn quả giả ở gần cuống. Khi hạt điều



6
tăng trưởng đến kích thước tối đa, có sự hình thành đầy đủ các bộ phận, bước vào giai
đoạn chín lúc bấy giờ quả giả mới tăng trưởng mạnh [2].
Hạt điều có hình dạng giống quả thận, khi non có màu xanh, khi chín khô
chuyển qua màu nâu xám hoặc xám hồng. Hạt điều ở nước ta thường dài 2,6 – 3,1 cm,
dày 1,2 – 1,7 cm, nặng khoảng 3 – 7 g. Cấu tạo hạt điều gồm 3 phần rõ rệt:
 Phần vỏ cứng: chiếm khoảng 60 % – 70 % trọng lượng hạt điều, trong đó
phần dầu vỏ hạt chiếm 20 % – 22 % trọng lượng hạt.
 Phần giữa: là lớp vỏ lụa, lúc còn non đóng vai trò cung cấp chất dinh
dưỡng nuôi hạt, khi chín teo lại, chiếm khoảng 5 % trọng lượng hạt.
 Phần trong cùng: là nhân hạt điều, chính là phôi hạt có đầy đủ chồi mầm,
thân mầm và rễ mầm. Bộ phận có kích thước lớn của phôi là hai lá mầm có chứa nhiều
chất dinh dưỡng để nuôi cây mầm khi mới mọc [3].
 Sau khi thụ tinh xong không phải bất cứ hoa điều lưỡng tính nào cũng đều
phát triển thành quả giả và hạt cho đến khi chín. Có nhiều khi hạt và quả giả chưa kịp
chín đã rụng, gọi là hiện tượng rụng trái non. Tỉ lệ rụng trái non phụ thuộc vào từng
cây, từng vụ, do nhiều nguyên nhân khác nhau như: di truyền, thời tiết bất thường, sâu

bệnh, đất quá khô hoặc úng lầy, thiếu hụt chất dinh dưỡng nghiêm trọng.
Sau khi trồng khoảng 2 – 3 năm, cây điều bắt đầu ra hoa kết trái. Năng suất
giữa các cây trong cùng một vườn, giữa các năm, giữa các vườn điều với nhau thường
khác nhau, phụ thuộc chủ yếu vào giống, kỹ thuật trồng và thời tiết. Năng suất hạt điều
trung bình của nước ta khoảng 1,1 tấn/ha [4].
2.1.3. Đặc điểm sinh thái của cây điều
2.1.3.1. Khí hậu
Các yếu tố thuận lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của cây điều :
 Chế đô mưa: Theo Ohler (1979), lượng mưa thích hợp giới hạn từ 1.000 –
2.000 mm/năm, có một mùa mưa tập trung, không đến sớm, sau đó là một mùa khô
kéo dài 4 – 6 tháng [2].



7
 Chế độ nhiệt: Thích hợp từ 20
o
C – 37
o
C, cực thuận ở 27
o
C [9]. Một điều
ảnh hưởng rõ rệt đến năng suất hạt điều là do sương muối. Khi có nhiều sương muối
trùng với thời kỳ kết hạt non của cây, nhiều hạt non sẽ bị thối đen, năng suất giảm. Cây
điều nước ta thường bị ảnh hưởng nhiều bởi sương muối.
 Chế độ ánh sáng: Cây điều là cây ưa sáng hoàn toàn, thích hợp ở những
vùng mà độ dài ngày và đêm bằng nhau và bầu trời quang đãng. Số giờ nắng khoảng
2000 h/năm [3].
 Độ ẩm tương đối: Độ ẩm không khí thích hợp từ 65 % – 80 %.
2.1.3.2. Đất đai

Cây điều có thể mọc trên nhiều loại đất khác nhau (đất đỏ, đất cát, đất xám
phù sa cổ, đất sỏi đá,…), tuy nhiên muốn đạt năng suất cao đòi hỏi phải có tầng đất
mặt sâu, thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước tốt, pH đất từ 4,5 – 6,5. Vườn trồng phải
được nhổ cỏ thường xuyên để cây phát triển tốt.
2.1.3.3. Mật độ trồng
Thông thường mật độ trồng thích hợp là 10 m x 10 m, ở mật độ này cây điều
phát triển tốt chiều cao và tán [3].
2.1.4. Giống điều và các phƣơng pháp nhân giống
Giống như các loại cây trồng từ hạt khác, cây điều có khả năng xảy ra thụ phấn
chéo cao và phát tán rộng, vì vậy quần thể cây điều có tính đa dạng di truyền cao.
Trong thực tế, ở Việt Nam có những giống điều chủ yếu như: PN1, MH4/5,
MH5/4, BO1 (là giống điều ghép cao sản). Bên cạnh đó còn những giống điều khác
chưa phân loại được [3]. Theo như kinh nghiệm của các nông dân, có 2 giống điều chủ
yếu là: điều Ấn Độ có tán rộng, đọt non màu đỏ và cho năng suất rất cao song hay bị
sâu hại trong khi điều Việt Nam có tán hẹp và đọt non màu xanh, năng suất không cao
bằng điều Ấn Độ song khả năng chống chịu sâu hại cao.
2.1.4.1 . Đặc điểm thực vật học của các giống điều
 Về hình dạng cây: Có cây thân cao và cây thân lùn. Giữa 2 dạng chính này
còn có nhiều dạng trung gian phong phú.



8
 Về màu sắc lá: Có giống có lá non màu nõn chuối và lá già màu xanh nhạt,
có giống có lá non từ màu hồng đến đỏ tía và lá già màu xanh đậm.
 Về hoa: Có giống hoa nở muộn, nở sớm chênh nhau 10 – 15 ngày, số lượng
hoa trong mỗi chùm cũng khác nhau (có giống mỗi chùm chỉ có vài chục hoa, có giống
lại có vài trăm hoa trên một chùm), tỉ lệ hoa đực/hoa lưỡng tính bình quân trong một
chùm cũng thay đổi tùy giống (có giống có tỉ lệ hoa lưỡng tính thấp chỉ khoảng 5 %
hay cũng có giống cao đến khoảng 30 %). Tỉ lệ hoa lưỡng tính sau khi nở và đậu thành

trái cũng khác nhau, có khi nhiều khoảng 6 – 10 trái, ít chỉ 1 – 3 trái.
 Về quả giả: Khác biệt ở màu sắc, hình dạng, kích cỡ, mùi vị quả giữa các
giống. Có giống quả màu đỏ, màu hồng, màu vàng, đỏ sọc xanh. Có giống quả tròn,
quả dài, quả to hay nhỏ. Có giống quả ngọt khi chín, có giống quả nhạt, khi ăn khé cổ
do có nhiều tananh trong nước quả.
 Về hạt và năng suất hạt: Khác biệt về hạt ở các đặc điểm như hình dạng,
kích thước, trọng lượng, tỉ lệ nhân. Có giống hạt tròn mẩy, có giống hạt lép. Có giống
hạt to và nặng, khi chín trọng lượng khô đạt đến 8 g/hạt (khoảng 127 – 132 hạt/kg), có
giống hạt nhỏ, chỉ đạt 3,5 g/hạt (gần 300 hạt/kg). Có giống tỉ lệ nhân đạt 20 % trọng
lượng hạt, cũng có giống đạt 30 % trọng lượng hạt.
2.1.4.2. Phƣơng pháp nhân giống cây điều
Các phương pháp nhân giống điều chủ yếu là chiết, ghép, gieo hạt, tuy nhiên
trong thực tế nông dân thường dùng phương pháp chọn cây điều mẹ tốt để lấy hạt làm
giống. Ngoài ra, hiện nay nông dân thường mua cây giống cao sản từ những công ty
giống.
2.1.5. Sản xuất điều trên thế giới
Từ một cây mọc hoang dại ở vùng Đông Bắc Brazil, ngày nay cây điều được
trồng ở nhiều nơi trên thế giới, chủ yếu ở những nước có nền nông nghiệp khá phát
triển hay những nước đang phát triển. Hiện nay có khoảng 50 nước trồng điều trên
toàn thế giới. Những nước sản xuất điều chủ yếu: Ấn Độ, Brazil, Việt Nam, Guinea-
Bissau, Ivory Coast, Benin, Nigeria, Mozambique, Tanzania,…




9
Bảng2.1. Sản xuất nhân hạt điều của thế giới niên vụ 1997 và 2000 – 2001.
ĐVT: tấn
Nƣớc/khu vực 1997 2000 – 2001
Ấn Độ

Brazil
Việt Nam
Tanzania
Nigieria
Mozambique
Indonesia
Guinea-Bissau
Benin
Các nuớc châu Phi nói tiếng Pháp
Các nước khác
350.000
180.000
110.000
80.000
40.000
30.000
30.000
-
-
-
80.000
425.000
200.000
140.000
150.000
30.000
20.000
30.000
45.000
20.000

70.000
70.000
Cộng 900.000 1.200.000
Nguồn:[4].
Ngoài nhân điều là sản phẩm chính có giá trị kinh tế cao còn có dầu hạt điều
(CNSL – Cashew nut shell liquid) – một sản phẩm tạo ra trong quá trình chế biến hạt
điều lấy nhân xuất khẩu, chiếm khoảng 18 – 23 % trọng lượng hạt điều, có thành phần
chính là acid anacardic và cardol. CNSL là một sản phẩm nguyên liệu đa năng, dùng
cho công nghiệp hóa chất, chế tạo bố thắng, lớp phủ cho các bộ ly hợp, chế tạo các loại
sơn,vecni, các loại nhựa,…Những nước sản xuất CNSL chủ yếu là Brazil, Ấn Độ,
Mozambique, Tanzania,… Ngoài ra trái điều còn dùng làm nguyên liệu trong công
nghiệp chế biến nước giải khát khá phát triển ở một số nước (Brazil, Ấn Độ,…). Gỗ
điều dùng trong các ngành đồ gỗ mỹ nghệ và nội thất gia đình. Bên cạnh đó, cây điều
còn có một số tác dụng chữa bệnh được một số nước sử dụng như: giảm đau, lợi tiểu,
điều trị hen suyễn (Brazil), thuốc sát trùng (Peru),…[3].



10
2.1.6. Sản xuất điều ở Việt Nam
Việt Nam nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, có khí hậu thuận lợi cho cây điều
phát triển. Cây điều có thể đã được đưa vào nước ta từ thế kỷ 18 hay sớm hơn
(Johnson, 1973) [2], nhưng mãi đến đầu những năm 1975, cây điều mới được trồng
phổ biến để phủ xanh đất trống đồi trọc do bom đạn chiến tranh. Cho đến cuối thập kỷ
80 của thế kỷ 20 chúng ta mới bắt đầu xuất khẩu nhân điều [3]. Kể từ mốc thời gian đó
đến nay, phát triển cây điều không phải lúc nào cũng thuận lợi, có những lúc người
nông dân trồng điều đã phải chặt bỏ hết cả vườn điều để trồng tiêu, cà phê,… do giá
điều quá thấp và mất mùa liên tục. Tuy nhiên hiện nay ngành trồng điều đã và đang
phát triển mạnh, đạt được những thành tựu đáng ghi nhận. Năm 2004, cả nước có hơn
400.000 ha diện tích trồng điều, là năm cho sản lượng cao nhất của ngành điều từ

trước đến nay, đã xuất khẩu được 107.000 tấn nhân điều, tăng 25 % so với năm 2003,
giá trị kim ngạch xuất khẩu đạt 425 triệu USD, tăng 40 % so với năm 2003, trong đó
thị trường Mỹ chiếm 41 %, Trung Quốc 20 %, Úc 10 %, còn lại là các thị trường khác.
Năm 2004, Việt Nam chính thức trở thành nước xuất khẩu hạt điều đứng hàng thứ 2
thế giới, vượt qua Ấn Độ, chỉ đứng sau Brazil. Năm 2005, chỉ tiêu của ngành điều là
sản xuất chế biến khoảng 450.000 tấn điều thô, xuất khẩu 110.000 tấn nhân điều, giá
trị kim ngạch xuất khẩu đạt từ 430 – 450 triệu USD, phấn đấu hoàn thành kế hoạch
trồng mới 50.000 ha điều cao sản và đến năm 2010, toàn bộ diện tích điều trên cả nước
sẽ được thay bằng giống cao sản [4].












11
Bảng2.2. Tình hình sản xuất, xuất nhập khẩu nhân điều của Việt Nam.
Năm
Hạt điều thô (tấn) Xuất khẩu (tấn)
Giá trị kim
ngạch
(triệu USD)
Sản xuất
trong nước

Nhập khẩu
Hạt điều
thô
Nhân
điều
1986
1987
1988
1989
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
1530
1449
468
12.000
28.000
31.000
47.000
60.000

90.000
100.000
110.000
140.000
100.000
70.000
135.000
140.000
-












10.000
20.000
25.000
40.000
-
-
-
300
11.000

27.000
30.000
40.000
30.000
50.000

-
-
33,6
261
286
360
1.400
6.000
9.526
18.257
23.791
33.000
26.000
16.000
30.000
38.000
63.000




14
23
29

49
75
90
110
133
117
100
150
135
214








12
Bảng2.3. Thị phần xuất khẩu nhân điều của Việt Nam 3 năm 2000, 2001 và 2002.
STT Quốc gia và khu vực 2000 (%) 2001 (%) 2002 (%)
1
2
3
4
5
6
7
8
9

10
11
12
Hoa Kỳ
Trung Quốc
Úc
Anh
Hà Lan
Nhật
Canada
Hồng Kông
Đức
New Zealand
Đài Loan
Các nước khác
18
32
17
8
8
3
3
3
2
1
1
1
24
28
18

7
10
2,5
.2,5
4
1
1
1
5
33,7
20,3
10,8
5,3
10,9
2,2
2,3
4,8
1
1
1,1
6,6
Nguồn: [4].

13
Bảng2.4. Tình hình phát triển sản xuất điều tại Việt Nam dự kiến đến năm 2010.
ĐVT: ha

1997 2005 2010
Toàn quốc 250.000 340.000 500.000
Duyên hải Nam Trung Bộ
Quảng Nam
Quảng Ngãi
Bình Định
Phú Yên
Khánh Hòa
Ninh Thuận
Bình Thuận
61.000
4.000
3.000
15.000
8.000
7.000
3.000
21.000
100.000
10.000
10.000
15.000
15.000
15.000
10.000

25.000
180.000
25.000
25.000
25.000
20.000
25.000
20.000
40.000
Tây Nguyên
Kon tum
Gia Lai
Đắc Lắc
Lâm Đồng
27.000
500
10.500
10.000
6.000
60.000
16.000
17.000
15.000
12.000
120.000
25.000
35.000
30.000
30.000
Đông Nam Bộ

Đồng Nai
Bà Rịa – Vũng Tàu
Bình Dương
Bình Phước
Tây Ninh
Tp. Hồ Chí Minh
149.000
35.000
20.000
32.000
50.000
10.000
2.000
170.000
40.000
25.000
28.000
65.000
10.000
2.000
190.000
40.000
30.000
28.000
65.000
25.000
2.000
Đồng bằng sông Cửu Long 13.000 10.000 10.000
Nguồn: [4].

Năm
Vùng/Tỉnh



14
2.1.7. Tình hình canh tác cây điều của tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu
Bà Rịa – Vũng Tàu là tỉnh mới thành lập năm 1991, thế mạnh là công nghiệp dầu
khí và du lịch, ngoài ra còn phát triển mạnh cây công nghiệp như cao su, cà phê, tiêu,
điều, đem lại nguồn thu nhập khá cao, chủ yếu là cho các huyện của tỉnh. Cũng như
các địa phương khác, cây điều được trồng ở tỉnh chủ yếu là trồng từ hạt, có độ tuổi
trung bình cao. Trong những năm gần đây đang phát triển mạnh cây điều cao sản cho
năng suất cao và ổn định hơn so với các giống điều địa phương. Đất nông nghiệp của
tỉnh khá màu mỡ, có diện tích đất đỏ bazan lớn, cùng với điều kiện khí hậu khá ổn
định, nhiệt độ trung bình trong năm là 24
o
C – 28
o
C, có mùa khô và mùa mưa phân
biệt, hệ thống thủy lợi phát triển và rộng khắp,…là những điều kiện thuận lợi cho phát
triển cây điều.
Bảng2.5. Sản lượng điều tại tỉnh BR – VT phân theo đơn vị hành chính.
ĐVT: tấn

1996 2000 2001 2002 2003
Tổng số
TP. Vũng Tàu
TX. Bà Rịa
H. Tân Thành
H. Châu Đức

H. Xuyên Mộc
H. Long Đất
H. Côn Đảo
6.257
153
109
1.630
1.387
2.589
384
6
5.102
48
73
413
742
3.575
250
1
6.010
48
71
812
1.272
3.575
231
1
7.316
24
72

1.462
1.447
4.009
301
1
10.417
28
143
1.462
2.206
6.138
440
1
(Nguồn: Sở Nông Nghiệp – Phát Triển Nông Thôn tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu;
Cục Thống kê tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu.)
Nói chung, giá trị đóng góp của các loại nông sản vào tổng thu nhập của toàn tỉnh
không nhiều, song có một vai trò quan trọng trong sự phát triển chung của tỉnh, góp



15
phần đem lại thu nhập tương đối cho một bộ phận khá đông những người nông dân,
giúp ngăn chặn tình trạng phân hóa giàu nghèo giữa thành thị và nông thôn. Với những
vùng đất khô cằn, bạc màu thì cây điều là giải pháp thích hợp nhất để giúp bà con có
được thu nhập cao. Tỉnh chủ trương đến năm 2010 thay thế dần các giống điều địa
phương, trồng lâu năm, cho năng suất không cao, không ổn định bằng các giống điều
cao sản cho năng suất cao, ổn định, kháng sâu bệnh và chất lượng đồng đều, phấn đấu
đến năm 2010 đạt 16.000 tấn/năm (Sở Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn tỉnh BR –
VT). Chính vì vậy, việc đánh giá từng vùng quần thể và nhận diện các giống có giá trị
cao là rất cần thiết.

2.2. Các kỹ thuật đánh giá tính đa dạng di truyền và phát hiện chỉ thị phân tử
2.2.1. Giới thiệu chung về tính đa dạng di truyền và chỉ thị phân tử
Tế bào là đơn vị của sự sống, được phân ra làm 2 loại: Tế bào tiền nhân
(Prokaryote) và tế bào nhân thật (Eukaryote). Bộ máy di truyền của 2 loại tế bào trên
được hình thành từ 2 loại nucleic acid: DNA (Deoxyribonucleic acid) và RNA
(Ribonucleic acid). Ở sinh vật có tế bào nhân thật (Eukaryote), thông tin di truyền là
phân tử DNA – là chuỗi xoắn kép mạch đôi gồm 2 chuỗi polynucleotide song song, có
trình tự các nucleotide bắt cặp bổ sung với nhau. Các nucleotide được cấu tạo từ 3
thành phần: nhóm photphat, đường ribose và một trong 4 loại bazơ hữu cơ (adenine,
cytoxine, thymine và guanine). Có 4 loại nucleotide khác nhau: A (nucleotide có chứa
base adenine), T (nucleotide có chứa base thymine), C (nucleotide có chứa base
cytoxine) và G (nucleotide có chứa base guanine). Các nucleotide trong cùng một
mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết photphat và 2 mạch đơn sắp xếp đối song
với nhau theo nguyên tắc bổ sung A – T, G – C [1] [5] [8].
Trong một loài, các giống khác nhau có trình tự bộ gene khác nhau. Trình tự bộ
gene của các cá thể trong một giống cũng có thể khác nhau, do sự xuất hiện của một
loại đột biến nào đó. Đôi khi sự khác biệt này lại có ý nghĩa về mặt di truyền, do đột
biến xuất hiện tại vị trí của một gene nào đó trong bộ gene của một cá thể, làm cho
gene đó không biểu hiện hay biểu hiện khác đi thành một tính trạng khác với những cá
thể khác cùng giống. Sự khác biệt về di truyền như vậy được gọi là tính đa dạng di
truyền [1].



16
Sự khác nhau về di truyền của các cá thể trong cùng một giống (hay giữa các
giống trong cùng một loài) có thể biểu hiện hay không biểu hiện thành những tính
trạng bên ngoài. Người ta thường tìm kiếm những dấu hiệu để nhận ra được sự khác
nhau về di truyền giữa các cá thể (hoặc giữa các giống), gọi là những chỉ thị [1].
Có 3 loại chỉ thị thường được sử dụng:

- Chỉ thị hình thái.
- Chỉ thị allozyme.
- Chỉ thị phân tử.
2.2.1.1. Chỉ thị hình thái
Gene thể hiện bản chất di truyền sẽ được liên kết với một tính trạng hình thái
nào đó mà người ta có thể phát hiện được. Tuy nhiên nếu dựa vào những chỉ thị loại
này để lập bản đồ gene và chọn lọc sẽ mất thời gian, số lượng chỉ thị ít do không phải
tất cả những tính trạng kiểu hình nào ta cũng có thể nhận diện được, đồng thời độ
chính xác và độ tin cậy thấp.
2.2.1.2. Chỉ thị allozyme
Là những chỉ thị protein. Mỗi protein là sản phẩm biểu hiện của một hay một
vài gene, do vậy người ta dựa vào điều này để tìm ra những chỉ thị. Dựa vào hàng loạt
những enzyme giống nhau được mã hóa bởi những allen khác nhau nằm cùng trên một
locus. Do sự khác nhau về điện tích của aminoacid, allozyme có thể được phân tách
bằng điện di. Nhiều enzyme bất biến trong quần thể và hầu hết sự đa hình của những
enzyme này chỉ do một vài biến đổi nhỏ. Kết quả mà chỉ thị allozyme đem lại khả
quan hơn so với chỉ thị hình thái do có số lượng chỉ thị có thể phát hiện được nhiều
hơn, tuy nhiên số lượng chỉ thị cũng vẫn ít, không đáp ứng cho những nghiên cứu sâu
rộng.
2.2.1.3. Chỉ thị phân tử – chỉ thị DNA
Là những chỉ thị phân tử DNA được tạo ra nhờ những kỹ thuật sinh học phân
tử. Có thể nói rằng kể từ khi con người biết đến sự hiện diện của gene và khi Watson
và Crick phát minh ra cấu trúc của chuỗi DNA năm 1955, các kỹ thuật sinh học phân
tử được phát minh ngày càng nhiều và càng ngày càng tỏ ra là công cụ đắc lực cho



17
công tác nghiên cứu khoa học do số lượng chỉ thị nhiều hơn hẳn so với 2 loại chỉ thị
trên (Tansley và ctv, 1980), độ tin cậy cao hơn và thuận tiện hơn nhiều. Càng ngày

người ta càng tìm ra được nhiều kỹ thuật đánh giá đa dạng di truyền và phát hiện chỉ
thị, tuy nhiên có thể được chia ra làm 2 nhóm:
 Những kỹ thuật dựa trên kỹ thuật PCR (PCR based): RAPD, STS, SSR,
SSCP, AFLP,…
 Kỹ thuật dựa trên kỹ thuật lai DNA – DNA (Non PCR based): điển hình là
RFLP [1] [8].
2.2.2. Kỹ Thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms)
Đây là kỹ thuật sinh học phân tử nhằm phát hiện sự khác nhau về di truyền giữa
các cá thể, giữa các giống trong cùng một loài dựa vào sự khác nhau về số lượng và
kích thước của những đoạn DNA được tạo ra do sử dụng những enzyme cắt giới hạn
(restriction enzymes) cắt toàn bộ bộ gene của những cá thể hay giống được nghiên
cứu, sau đó những đoạn DNA được cắt ra này được lai với những probe được đánh dấu
huỳnh quang đã biết, kết quả được quan sát qua màu huỳnh quang phát ra. Sử dụng
đoạn probe chuyên biệt với loài hay giống cần nghiên cứu. Nguyên lý của kỹ thuật này
dựa vào hiện tượng đột biến làm mất hay xuất hiện một vị trí cắt giới hạn, vì vậy kỹ
thuật RFLP có thể phát hiện đột biến mặc dù mức độ tin cậy không cao [1].
2.2.3. Kỹ thuật SSCP (Single – Strand Conformation Polymorphism)
Kỹ thuật này dựa trên giả thuyết: sự khác biệt giữa các DNA do sự thay đổi cấu
trúc của dây đơn DNA có cấu trúc hình học khác nhau, làm cho DNA dịch chuyển trên
gel với tốc độ và khoảng cách di chuyển khác nhau. Sau khi thực hiện phản ứng PCR,
làm biến tính DNA thành dây đơn, điện di và nhuộm bạc. Kỹ thuật SSCP có quy trình
thực hiện khó nhưng kết quả có độ tin cậy không cao [1].
2.2.4. Kỹ thuật STS (Sequence – Tagged Sites)
Do Olson và ctv đề xuất năm 1989, dựa trên nguyên lý: Trình tự một đoạn DNA
chuyên biệt cho loài, thông qua kỹ thuật PCR nhân bản đoạn DNA đó lên hàng triệu
lần và phát hiện qua điện di [6]. Kỹ thuật này có nhược điểm là phải biết trình tự gene
của đối tượng nghiên cứu.

18
2.2.5. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)
Kỹ thuật này dựa trên nguyên lý: Giữa những giống khác nhau có một đoạn DNA
ổn định và chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotides được lặp lại
nhiều lần (simple sequence repeat), tiến hành phản ứng PCR sử dụng các primer
chuyên biệt nhân bản đoạn DNA chuyên biệt này lên. Điều quan trọng là phải biết
được những trình tự lặp lại chuyên biệt này để thiết kế primer cho từng giống. Kỹ
thuật SSR có độ tin cậy cao, chủ yếu được dùng để định danh những giống hay những
loài rất gần nhau về mặt di truyền [6].
2.2.6. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA)
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn
(khoảng 10 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngẫu nhiên những
đoạn DNA có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá
thể hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR – RAPD ở điều kiện như
nhau sẽ tạo ra số lượng các đoạn bằng nhau và chiều dài các đoạn tương ứng bằng
nhau. Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra
số lượng và chiếu dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD
có thể phát hiện đột biến. Kỹ thuật RAPD giúp nhận diện những chỉ thị phân tử trội [1]
[6].
Nguyên lý của kỹ thuật RAPD được minh họa trong hình 2.1.








19

Hình 2.1 Nguyên lý kỹ thuật RAPD
2.2.6.1. Các bƣớc tiến hành kỹ thuật RAPD
 Bước 1: Tách chiết DNA
DNA được tách chiết có chất lượng tốt (tương đối sạch và không bị gãy
nhiều).

5
`
5
`
5*
5* 3
`
3
`
3
`
3
`
Primer ngẫu nhiên
Thực hiện PCR với những
primer ngẫu nhiên
Sau phản ứng PCR, kết quả
đem điện di phát hiện band.



20
Sử dụng phương pháp của Doyle và Doyle (1988) [1] [13]. Phương pháp
này sử dụng CTAB (Hexadecyltrimethylammoniumbromid) – một chất tẩy cation hình

thành phức hợp với những polysaccharide, protein, polyphenol,…. Phức hợp này sau
đó được tách ra khỏi dung dịch tách chiết bằng hỗn hợp chloroform – isoamyl alcohol,
bằng cách hình thành 2 pha: pha thứ nhất là dung dịch sạch ở phía trên có chứa DNA,
pha thứ hai đặc hơn ở dưới chứa chloroform và tất cả những thành phần cần loại bỏ
khác (polysaccharides, protein,…). Sau khi ly tâm, thu được DNA.
Thông thường quy trình ly trích DNA ở thực vật gồm 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Phá vỡ màng tế bào và màng nhân. Tế bào lá được
nghiền với dịch trích EB (extraction buffer) để phá vỡ màng tế bào, giải phóng các
thành phần có trong tế bào ra ngoài môi trường dịch trích.
Giai đoạn 2: Làm biến tính protein, loại bỏ protein và các thành phần
hữu cơ khác (polysaccharides, polyphenols, lipids,…).
Giai đoạn 3: Tủa DNA bằng isopropanol hay ethanol 100 %, thường
tủa bằng isopropanol lạnh trước, sau đó tiếp tục tủa bằng ethanol 100 % kết hợp với
muối.
Một số vấn đề có thể gặp phải khi tách chiết DNA:
DNA bị phân hủy hoặc bị gãy.
Có RNA trong mẫu DNA.
Có polysaccharide trong mẫu DNA.
Có polyphenol trong mẫu DNA.
Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA được trình
bày trong bảng 2.6.







21
Bảng 2.6. Thành phần và tác dụng của từng chất dùng để tách chiết DNA.

Thành phần Tên gọi Bản chất Tác dụng
pH Ức chế hoạt động của
những enzyme phân hủy
(như enzyme DNase hoạt
động ở pH=7).
Tris-HCl Dung dịch đệm Duy trì pH phù hợp.
EDTA ethylenediamine
-tetraacetate
Ức chế những enzyme
phân hủy DNA.
sodium acetat. Muối -Kết hợp với ethanol 100%
kết tủa và rửa sạch DNA.
-Bảo vệ DNA.
CTAB hexadecyltrime-
thylammonium-
bromide.
Chất tẩy cation. -Hòa tan màng tế bào.
-Biến tính protein.
-Thành lập phức hợp với
những protein, polysaccha-
ride.
CIA chloroform-
isoamylalcohol.
Chiết xuất protein và
những polycaccharide.
isopropanol Kết tủa DNA.
ß-mercaptoetha-
nol
Tác nhân phá
hủy màng nhân

và kháng lại sự
oxi hóa.
-Ức chế quá trình oxi hóa.
-Phá vỡ màng nhân.
-Bảo vệ DNA khỏi những
quinone, disulfite, peroxi-
dase, polyphenoloxydase.
ethanol 100% -Kết tủa DNA.
-Rửa sạch DNA. Có thể
gây hại cho DNA do vậy
phải kết hợp với muối.
ethanol 70% Rửa sạch DNA. Không
gây hại cho DNA do ở
nồng độ thấp.




22
 Bước 2: Thực hiện phản ứng PCR: Phản ứng PCR được thực hiện với các
primer ngắn, thiết lập điều kiện phản ứng nghiêm ngặt để hạn chế tạo ra những sản
phẩm không chính xác.
 Bước 3: Điện di phát hiện: Kết quả PCR – RAPD được điện di trên gel
agarose.
2.2.6.2. Những ƣu điểm của kỹ thuật RAPD
 Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không
cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản. Chất
lượng DNA khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh. Khả năng
nhân bản cao.
 Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử

dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và nhận
diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao [6].
2.2.6.3. Những hạn chế của kỹ thuật RAPD
 Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao, không ổn định (thể hiện ở mức
độ lặp lại giống nhau thấp).
 Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa
hình thấp và độ tin cậy không cao. Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và có độ
tin cậy không cao [1] [6].
2.2.6.4. Ứng dụng của kỹ thuật RAPD
Kỹ thuật RAPD được phát minh và sử dụng ngay sau khi kỹ thuật PCR ra đời,
mặc dù cho kết quả có độ tin cậy không cao nhưng vẫn còn được sử dụng do ưu điểm
dễ thực hiện và chi phí thấp. Những ứng dụng của kỹ thuật RAPD:
 Đánh giá đa dạng di truyền: Đã được áp dụng trên các đối tượng: cúc lai,
cà phê, bắp, đậu nành, lúa mì, lúa mạch, dâu tây, khoai tây, cà chua,…
 Nhận diện chỉ thị phân tử: Ở Việt Nam, nghiên cứu đa dạng di truyền và
mối tương quan giữa kiểu gene RGA và kiểu hình phản ánh bệnh đạo ôn của một số
giống lúa ở Việt Nam (Lã Tuấn Nghĩa và ctv, 1999) [1] [6].



23
 Xây dựng bản đồ gene: Sử dụng phương pháp BSA kết hợp kỹ thuật RFLP
và RAPD lập bản đồ gene tms – 1 của dòng lúa TGMS (5460S) (Wang và ctv, 1995)
[1] [6].
2.2.7. Kỹ thuật AFLP
2.2.7.1. Nguyên lý kỹ thuật AFLP
Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism – đa hình chiều
dài những đoạn DNA được nhân bản) là kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại do Zebeau
và Vos (1993) phát minh ra, sau đó được Vos và cộng sự (1995), Vos và Kuiper (1997)
tiếp tục phát triển. Kỹ thuật này dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng

những cặp primer đặc biệt được thiết kế sẵn, điều kiện phản ứng PCR được thiết lập
nghiêm ngặt giúp nhân bản một cách có chọn lọc những đoạn DNA được cắt giới hạn
từ bộ gene của đối tượng nghiên cứu. Những đoạn DNA được nhân bản có độ dài
khoảng từ 60 – 500 basepairs. Kỹ thuật AFLP giúp đánh giá mức độ đa dạng di truyền
của quần thể và phát hiện chỉ thị phân tử với độ tin cậy cao [1] [6] [17] [18]. Nguyên
lý kỹ thuật AFLP được trình bày trong hình 2.2.











Hình 2.2 Nguyên lý kỹ thuật AFLP



24
2.2.7.2. Các bƣớc của kỹ thuật AFLP [17]
Kỹ thuật AFLP bao gồm 5 bước cơ bản:
 Bước 1: Tách chiết DNA. Tương tự như ở kỹ thuật RAPD, tuy nhiên chất
lượng DNA sử dụng cho kỹ thuật AFLP phải tốt hơn nhiều so với kỹ thuật RAPD.
 Bước 2: Cắt giới hạn và gắn adapter
Bước này gồm có hai giai đoạn:
Giai đoạn cắt toàn bộ bộ gene tạo những đoạn DNA ngắn bằng 2
enzyme cắt.

Giai đoạn gắn những adapter: Adapter là một chuỗi sợi đôi DNA đầu
dính gồm một trình tự khoảng 20 nucleotide đã biết có khả năng bắt cặp bổ xung với
những đoạn DNA vừa được cắt. Mục đích để tạo ra những khuôn DNA có trình tự 2
đầu đã biết, để trong 2 phản ứng PCR sau này người ta sử dụng những primer có trình
tự bổ sung với trình tự của các adapter đã gắn.
Để không cho các đoạn DNA vừa được cắt ra không bắt cặp lại với nhau,
giai đoạn cắt và gắn adapter được thực hiện đồng thời và được coi như một bước.
 Bước 3: Nhân bản tiền chọn lọc (Pre – selective amplification)
Thực hiện phản ứng PCR thứ nhất, sử dụng những sản phẩm đã gắn
adapter từ bước 2 làm khuôn DNA, primer nhân bản tiền chọn lọc là những chuỗi
DNA mạch đơn có trình tự bổ sung với các adapter đã sử dụng ở bước 2 và cộng thêm
1 nucleotide ở đầu 3
’
.
Primer nhân bản tiền chọn lọc MseІ = trình tự bổ sung với trình tự
của adapter MseI + 1 nucleotide (thường là C).
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ sung với trình tự
của adapter EcoRI + 1 nucleotide (thường là A).
Mục đích để tạo ra sự chọn lọc đầu tiên – tiền chọn lọc ở mức độ thấp
những đoạn DNA được cắt và gắn adapter, đồng thời tăng số lượng của những đoạn có
thể nhân bản (là những đoạn có khả năng bắt cặp với các primer nhân bản tiền chọn
lọc). Với việc thêm 1 nucleotide sẽ giảm bớt được nhiều đoạn có gắn với adapter.



25
Bước này có thể kiểm tra kết quả bằng cách điện di trên gel agarose 1,5 %.
 Bước 4: Nhân bản chọn lọc (Selective amplification)
Thực hiện phản ứng PCR thứ hai sử dụng các primer nhân bản chọn lọc có
trình tự tương tự như primer nhân bản tiền chọn lọc, cộng thêm 2 hay 3 nucleotide ở

đầu 3
’
. Mục đích chính của bước này nhằm chọn lọc tối đa các đoạn DNA đã được cắt
giới hạn và gắn adapter đã được nhân bản ở bước 3, chỉ nhân bản những đoạn DNA có
trình tự 2 đầu hoàn toàn bổ xung với trình tự của các primer nhân bản chọn lọc, qua đó
làm giảm nhiều độ phức tạp của kết quả.
Primer nhân bản chọn lọc MseІ = trình tự bổ xung với trình tự của
adapter MseI + 2 hay 3 nucleotide.
Primer nhân bản tiền chọn lọc EcoRІ = trình tự bổ xung với trình tự
của adapter EcoRI + 3 nucleotide + chất phát màu huỳnh quang (giúp phát hiện sản
phẩm khi điện di).
Bảng 2.7. Những primer EcoRІ nhân bản chọn lọc.
Những primer EcoRІ nhân bản chọn
lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc
lớn.
Những primer EcoRІ nhân bản chọn
lọc dùng cho bộ gene có kích thƣớc
nhỏ.
EcoRІ-ACT FAM
EcoRІ -ACA FAM
EcoRІ -AAC NED
EcoRІ -ACC NED
EcoRІ -AGC NED
EcoRІ -AAG JOE
EcoRІ -AGG JOE
EcoRІ -ACG JOE
EcoRІ-TG FAM
EcoRІ-TC FAM
EcoRІ-AC FAM
EcoRІ-TT NED

EcoRІ-AT NED
EcoRІ-TA JOE
EcoRІ-AG JOE
EcoRІ-AA JOE