Luận văn thạc sĩ nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng ức chế enzyme α glucosidase của loài địa hoàng (rehmannia glutinosa)

BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------

Họ và tên: Nguyễn Thị Dung

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE
CỦA LOÀI ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA GLUTINOSA)"

LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC

Hà Nội - 2021

n


BỘ GIÁO DỤC
VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
------------------------

Họ và tên: Nguyễn Thị Dung

TÊN ĐỀ TÀI LUẬN VĂN: “NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE
CỦA LỒI ĐỊA HỒNG (REHMANNIA GLUTINOSA)"
Chun ngành: Hóa hữu cơ
Mã số: 8440114
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Vũ Kim Thƣ

Hà Nội - 2021

n


LỜI CAM ĐOAN
Tôi là Nguyễn Thị Dung, Học viên cao học lớp CHE 2019B, Học viện Khoa
học và Công nghệ, chuyên ngành Hóa hữu cơ, mã số học viên 19803028 xin
cam đoan:
1. Đây là luận văn do bản thân tôi trực tiếp thực hiện dƣới sự hƣớng dẫn
của TS. Vũ Kim Thƣ.
2. Cơng trình này khơng trùng lặp với bất kì nghiên cứu nào khác đƣợc
cơng bố tại Việt Nam.
3. Các số liệu và thơng tin nghiên cứu là hồn tồn chính xác, trung thực
và khách quan, đã đƣợc xác nhận và chấp thuận của cơ sở nơi nghiên
cứu.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trƣớc pháp luật về những cam kết này.
Hà Nội, ngày….. tháng….. năm 2021
Ngƣời viết cam đoan

Nguyễn Thị Dung

n


LỜI CẢM ƠN
Luận văn đƣợc hồn thành tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam trong khuôn khổ đề tài Khoa học và Công nghệ
cấp Bộ mã số B2020-MDA-09.
Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Vũ Kim Thƣ
ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ em trong suốt q trình nghiên cứu và
hồn thành luận văn.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới PGS.TS. Phan Văn Kiệm
cùng tồn thể cán bộ phịng Nghiên cứu cấu trúc - Viện Hóa sinh biển, Viện
Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã nhiệt tình chỉ bảo, tạo mọi
điều kiện giúp đỡ em trong thời gian nghiên cứu.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Học viện Khoa học và
Cơng nghệ cùng tồn thể các giảng viên khoa Hóa, giảng viên của Học viện
đã dạy dỗ và chỉ bảo em trong suốt quá trình học tập tại Học viện.
Em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu và
chuyển giao Công nghệ - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã
tạo điều kiện thuận lợi cho em có thời gian theo học khóa học này.
Cuối cùng, em xin đƣợc gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè và ngƣời
thân đã ln ở bên động viên, giúp đỡ em trong quá trình em học tập và
nghiên cứu.
Hà Nội, ngày … tháng 11 năm 2021
Học viên

Nguyễn Thị Dung

n


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu
13
C-NMR
DEPT
DMSO
1
H-NMR
IC50
HMBC
HR-ESIMS
HSQC
NOESY
TLC
TMS
c.c.
D
E
M
A
W
ARG3D3
ARG6D3
ARG6
ARG12C1
ARG7

Tiếng Anh
Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy
Distortionless Enhancement by
Polarisation Transfer
Dimethylsulfoxide
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
Inhibitory concentratrion at 50%
Heteronuclear multiple Bond
Connectivity
High Resolution Electronspray
Ionization Mass Spectrum
Heteronuclear Single- Quantum
Coherence
Nuclear Overhauser Enhancement
Spectroscopy
Thin layer chromatography
Tetramethylsilane
Chromatography column
Dichloromethane
Ethyl acetate
Methanol
Acetone
Water

n

Diễn giải
Phổ cộng hƣởng từ hạt

nhân 13C
Phổ DEPT
(CH3)2SO
Phổ cộng hƣởng từ hạt
nhân proton
Nồng độ ức chế 50%
đối tƣợng thử nghiệm
Phổ tƣơng tác dị hạt
nhân qua nhiều liên kết
Phổ khối lƣợng phân
giải cao phun mù điện
tử
Phổ tƣơng tác dị hạt
nhân qua một liên kết
Phổ NOESY
Sắc ký lớp mỏng
Si(CH3)4
Cột sắc kí
CH2Cl2
CH3COOC2H5
CH3OH
(CH3)2CO
H2O
Hợp chất RG1
Hợp chất RG2
Hợp chất RG3
Hợp chất RG4
Hợp chất RG5

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Trang thiết bị thí nghiệm ................................................................ 11
Bảng 3.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG1 và hợp chất so sánh ............. 24
Bảng 3.2. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG2 và hợp chất so sánh ............. 28
Bảng 3.3. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG3 và hợp chất tham khảo ........ 35
Bảng 3.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG4 và chất so sánh .................... 41
Bảng 3.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất RG5 và hợp chất tham khảo ........ 46
Bảng 3.6. Tác động ức chế -glucosidase của mẫu nghiên cứu ..................... 48

n


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1 Một số hình ảnh về lồi Địa hồng .................................................... 4
Hình 3.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất RG1 và của hợp chất so sánh ........ 18
Hình 3.2. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất RG1 ............................................... 18
Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất RG1 .................................................... 19
Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của hợp chất RG1 ................................................... 20
Hình 3.5. Một số tƣơng tác HMBC chính của hợp chất RG1 ........................ 20
Hình 3.6. Phổ HMBC của hợp chất RG1 ....................................................... 21
Hình 3.7. Phổ HSQC của hợp chất RG1 ........................................................ 21
Hình 3.8. Phổ NOESY của hợp chất RG1 ...................................................... 23
Hình 3.9. Phổ CD của hợp chất RG1.............................................................. 23
Hình 3.10. Cấu trúc của hợp chất RG2 và của hợp chất so sánh ................... 25
Hình 3.11. Phổ HR-ESI-MS của hợp chất RG2 ............................................. 26
Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của hợp chất RG2 .................................................. 26
Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của hợp chất RG2 ................................................. 27
Hình 3.14. Phổ HSQC của hợp chất RG2 ...................................................... 28
Hình 3.15. Phổ NOESY của hợp chất RG2 .................................................... 30

Hình 3.16. Một số tƣơng tác HMBC chính của hợp chất RG2 ...................... 30
Hình 3.17. Phổ HMBC của hợp chất RG2 ..................................................... 31
Hình 3.18. Phổ CD của hợp chất RG2............................................................ 32
Hình 3.19. Cấu trúc hóa học của hợp chất RG3 ............................................. 32
Hình 3.20. Phổ 1H-NMR của hợp chất RG3 .................................................. 33
Hình 3.21. Phổ 13C-NMR của hợp chất RG3 ................................................. 33
Hình 3.22. Phổ HSQC của hợp chất RG3 ...................................................... 34
Hình 3.23. Phổ HMBC của hợp chất RG3 ..................................................... 35
Hình 3.24. Một số tƣơng tác HMBC chính của hợp chất RG3 ...................... 37
Hình 3.25. Cấu trúc hóa học của hợp chất RG4 ............................................. 37
Hình 3.26. Một số tƣơng tác HMBC chính của hợp chất RG4 ...................... 38
Hình 3.27. Phổ 1H-NMR của hợp chất RG4 .................................................. 38
Hình 3.28. Phổ 13C-NMR của hợp chất RG4 ................................................. 39
Hình 3.29 Phổ HMBC của hợp chất RG4 ...................................................... 40

n


Hình 3.30. Phổ HSQC của hợp chất RG4 ...................................................... 40
Hình 3.31. Cấu trúc hóa học của hợp chất RG5 ............................................. 43
Hình 3.32. Một số tƣơng tác HMBC chính của hợp chất RG5 ...................... 43
Hình 3.33. Phổ 1H-NMR của hợp chất RG5 .................................................. 44
Hình 3.34. Phổ 13C-NMR của hợp chất RG5 ................................................. 44
Hình 3.35. Phổ HMBC của hợp chất RG5 ..................................................... 45
Hình 3.36. Phổ HSQC của hợp chất RG5 ...................................................... 48

n


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. 1
LỜI MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................ 3
1.1. THÔNG TIN VỀ LOÀI ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA
GLUTINOSA) Ở VIỆT NAM ....................................................................... 3
1.1.1. Đặc điểm thực vật ........................................................................... 3
1.1.2. Tác dụng chữa bệnh trong dân gian ................................................ 4
1.2. MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI
NƢỚC ........................................................................................................... 5
1.2.1 Một số nghiên cứu trong nƣớc ......................................................... 5
1.2.2 Một số nghiên cứu trên thế giới ....................................................... 6
1.3 TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT CỦA LOÀI ĐỊA HOÀNG ........... 8
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU ................................................................................................................ 11
2.1. MẪU NGHIÊN CỨU .......................................................................... 11
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU ......................................................................... 11
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................................................ 11
2.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC) ................................................................ 11
2.3.2. Sắc ký cột (CC) ............................................................................. 12
2.4. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT.......... 12
2.4.1. Độ quay cực ([]D) ........................................................................ 12
2.4.2. Phổ khối lƣợng phân giải cao HR-ESI-MS .................................. 12
2.4.3. Phổ cộng hƣởng từ nhân (NMR) .................................................. 12
2.5. THỰC NGHIỆM .................................................................................. 13
2.6. THÔNG SỐ VẬT LÍ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT .. 15
2.6.1. Hợp chất RG1 (hợp chất mới) ...................................................... 15
2.6.2. Hợp chất RG2 (hợp chất mới) ...................................................... 15
2.6.3. Hợp chất RG3 ............................................................................... 16

n

2.6.4. Hợp chất RG4 ............................................................................... 16
2.6.5. Hợp chất RG5 ............................................................................... 16
2.7. PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYM αGLUCOSIDASE ......................................................................................... 16
2.7.1. Vật liệu .......................................................................................... 16
2.7.2. Phƣơng pháp.................................................................................. 16
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................... 18
3.1. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG1 .......... 18
3.2. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG2 .......... 25
3.3. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG3 .......... 32
3.4. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG4 .......... 37
3.5. XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC CỦA HỢP CHẤT RG5 .......... 43
3.6. TÁC DỤNG ỨC CHẾ ENZYME α-GLUCOSIDASE ....................... 48
CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................... 50
DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ........................................... 51
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 52
PHỤ LỤC ....................................................................................................... 56
Bài báo Phytochemistry Letters, 43, 208-211, 2021................................... 56
KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH TÊN KHOA HỌC MẪU THỰC VẬT .............. 60
Phụ lục 1.1-1.22: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG1 ............................... 61
Phụ lục 2.1-2.19: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG2 ............................... 72
Phụ lục 3.1-3.16: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG3 ............................... 82
Phụ lục 4.1-4.16: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG4 ............................... 90
Phụ lục 5.1-5.18: CÁC PHỔ CỦA HỢP CHẤT RG5 ............................... 98

n


1

LỜI MỞ ĐẦU
Việt Nam là một nƣớc nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên có hệ
thực vật đa dạng và phong phú. Theo dự đốn có khoảng 12.000 lồi, trong đó
hiện đã biết khoảng 4.000 lồi đƣợc nhân dân ta dùng làm thảo dƣợc [1], [2].
Do đó, việc nghiên cứu các loài thảo dƣợc đã đƣợc dân gian sử dụng làm
thuốc nhằm tìm kiếm các hợp chất có hoạt tính cao trong phịng và chữa bệnh
là nhiệm vụ đặc biệt quan trọng đã và đang đƣợc các nhà khoa học trong và
ngoài nƣớc quan tâm. Các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên thể hiện ƣu
điểm so với các chất tổng hợp, do có độc tính thấp và khả năng dung nạp cao
trên cơ thể sinh vật. Vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính
sinh học các loại thảo dƣợc có ý nghĩa to lớn nhằm giải thích ý nghĩa khoa
học về tác dụng chữa bệnh của các cây thuốc và góp phần tạo cơ sở phát triển
các loại thuốc chữa bệnh phục vụ chăm sóc sức khỏe cho con ngƣời [3], [4].
Lồi Địa hoàng (Rehmannia glutinosa) là loài cây thảo, sống lâu năm, có
nguồn gốc từ vùng ơn đới ấm ở Trung Quốc. Địa hoàng là cây thuốc quý cho
2 vị thuốc: Sinh địa và Thục địa. Cả hai vị thuốc này đều là một trong những
thành phần đầu của vị thuốc Bắc [5]. Địa hoàng đã đƣợc sử dụng trong các
bài thuốc giảm đƣờng huyết, tác dụng lợi tiểu, cầm máu, kháng sinh… Trong
số nhiều tác dụng của Địa hoàng, đáng chú ý nhất là tiềm năng trong việc
chữa bệnh đái tháo đƣờng hay khả năng làm hạ đƣờng huyết trong máu.
Xuất phát từ nhu cầu rất lớn về việc tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc từ
thiên nhiên trong việc hỗ trợ và điều trị bệnh tiểu đƣờng, kết hợp với các bài
thuốc dân gian có tính an tồn và hiệu quả nên đề tài đƣợc thực hiện là:
"Nghiên cứu thành phần hóa học và đánh giá tác dụng ức chế enzyme αglucosidase của loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa)".
 Mục đích nghiên cứu:
- Phân lập một số hợp chất từ rễ củ loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa)
- Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập đƣợc

n

2
- Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất phân lập
đƣợc từ loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa)

 Đối tƣợng nghiên cứu:
Mẫu Rehmannia glutinosa đƣợc thu hái ở Việt Trì (Phú Thọ)
 Nhiệm vụ nghiên cứu của luận văn:
- Tổng quan nghiên cứu về loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa)
- Phân lập và xác định cấu trúc các hoạt chất từ loài Địa hoàng (Rehmannia
glutinosa)
- Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase của loài Địa hoàng
(Rehmannia glutinosa)

n


3
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. THƠNG TIN VỀ LỒI ĐỊA HOÀNG (REHMANNIA GLUTINOSA) Ở

VIỆT NAM
1.1.1. Đặc điểm thực vật
Chi Địa hoàng (danh pháp khoa học: Rehmannia) thuộc họ Cỏ chổi
(Orobanchaceae) gồm 6 loài. Các loài trong chi Rehmannia là các loại cây
thảo mộc sống lâu năm. Chúng có hoa lớn và đƣợc trồng làm cây cảnh trong
vƣờn tại châu Âu và Bắc Mỹ, cũng nhƣ đƣợc sử dụng trong y học tại châu Á.
Loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa) là lồi cây thảo, sống lâu năm, có
nguồn gốc từ vùng ôn đới ấm ở Trung Quốc. Địa hoàng là cây thuốc quý cho

2 vị thuốc: Sinh địa (tức là củ Địa hồng cịn sống) và Thục địa (tức là củ Địa
hồng đã đƣợc nấu chín). Cả hai vị thuốc Sinh địa và Thục địa đều là một
trong những thành phần đầu của vị thuốc Bắc. Trƣớc kia ở nƣớc ta chƣa có
cây Địa hồng. Năm 1958 ta nhập giống từ Trung Quốc. Viện Dƣợc liệu đã
nghiên cứu di thực thuần hóa và đƣa vào phát triển trồng đại trà, hiện đƣợc
trồng nhiều tại Bắc Ninh, Hải Dƣơng, Hƣng Yên, Thái Bình, Nam Định, Vĩnh
Phúc và Thanh Hóa. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của rễ củ lồi
Địa hồng cho biết sự có mặt của các hợp chất khung iridoid, phenethyl
alcohol, glycoside, cyclopentanoid monoterpene và norcarotenoid [6].

n


4

Hình 1.1 Một số hình ảnh về lồi Địa hồng
1.1.2. Tác dụng chữa bệnh trong dân gian
Theo “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, tập I của Võ Văn Chi, Địa hồng tƣơi có
vị ngọt, đắng, tính hàn, có tác dụng thanh nhiệt, mát máu. Sinh Địa hồng (củ
Địa hồng khơ) có vị ngọt, tính hàn, có tác dụng tƣ âm dƣỡng huyết. Thục
Địa hồng có vị ngọt, mùi thơm, tính hơi ơn, có tác dụng ni thận, dƣỡng
âm, bổ huyết, làm đen râu tóc. Địa hồng đã đƣợc sử dụng trong các bài thuốc
giảm đƣờng huyết, tác dụng cầm máu, lợi tiểu, kháng sinh [2].
Theo Đỗ Huy Bích, tập I, Địa hoàng đã đƣợc sử dụng nhƣ là một loại thảo
dƣợc trong các bài thuốc dân gian để chữa đái tháo đƣờng, suy nhƣợc cơ thể,
suy nhƣợc thần kinh, tăng huyết áp, xơ cứng động mạch, chữa viêm thanh
quản, viêm bàng quan mạn tính, chữa sốt rét, kinh nguyệt khơng đều, rong
huyết, ho khan, lao phổi, chữa chứng âm hƣ, tinh huyết suy kém...[1].
Theo kết quả nghiên cứu dƣợc lý hiện đại (nguồn “Những cây thuốc và vị
thuốc Việt Nam” của GS Đỗ Tất Lợi) thì nƣớc sắc sinh Địa hồng có tác dụng

hạ đƣờng huyết, tác dụng chống viêm rõ rệt trong thử nghiệm in vivo; ngoài
ra sinh Địa hồng có tác dụng cƣờng tim, hạ áp, cầm máu, bảo vệ gan, lợi
tiểu, chống phóng xạ, chống nấm. Thực nghiệm đã chứng minh sinh địa và
thục địa có thể làm giảm tác dụng ức chế chức năng vỏ tuyến thƣợng thận của
corticoid [7].

n


5
Trong số nhiều tác dụng của Địa hoàng, đáng chú ý nhất là tiềm năng trong
việc chữa bệnh đái tháo đƣờng hay khả năng làm hạ đƣờng huyết trong máu.
1.2. MỘT SỐ CƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGỒI NƢỚC
1.2.1 Một số nghiên cứu trong nƣớc
Theo tra cứu, ở Việt Nam có nhóm tác giả Đỗ Thị Hà (Viện dƣợc liệu, năm
2018) công bố nghiên cứu ban đầu về thành phần hóa học từ rễ củ cây Địa
hồng thơng báo 05 hợp chất tinh khiết đã đƣợc phân lập là: daucosterol (1),
rehmapicrogenin (2), astragalin (3), verbascosid (4) và catalpol (5).

Năm 2003, nghiên cứu về thân và rễ củ loài Địa hồng đã cơng bố cấu trúc
hóa học của 17 hợp chất 2,4-Dimethoxy-2-methyl-6H-pyran-3-one (6), muối
calcium của rehmapicroside (7): norcarotenoids: rehmapicrogenin (8), 5,6dihydroxy1,1,5-trimethylcyclohexyl (9), rehmaionoside A (10); 2-formyl-5hydroxymethylfurane (11), the iridoid rehmaglutin D (12), iridoid glycosides
(13–17) and phenylethyl alcohol glycosides (18–22) [8].

n


6

1.2.2 Một số nghiên cứu trên thế giới

Loài Địa hoàng (Rehmannia glutinosa) có nguồn gốc từ vùng ơn đới ấm ở
Trung Quốc, do đó đã có một số nhóm tác giả Trung Quốc nghiên cứu về
thành phần hóa học và hoạt tính của các chất phân lập từ lồi Địa hoàng.

n


7
Mƣời một glycoside iridoid, Rehmaglutoside A−K (23−33) đƣợc phân lập
từ củ khơ của lồi Rehmannia glutinosa. Trong các thử nghiệm in vitro tại
nồng độ 10 µM thì các hợp chất 25, 29 và 31−33 cho thấy các hoạt động
bảo vệ gan vừa phải chống lại độc tính do D-galactosamine gây ra trong tế
bào HL-7702 [9].

Năm 2014, nghiên cứu của nhóm tác giả Wei-Sheng Feng thông báo hai hợp
chất ionone glycosides, frehmaglutoside G (34) và frehmaglutoside H (35) và
sáu hợp chất rehmapicroside (36), sec-hydroxyaeginetic acid (37), dihydroxyβ-ionone (38), trihydroxy-β-ionone (39), rehmaionoside A (40) và

n


8
rehmaionoside C (41) đƣợc phân lập từ dịch chiết ethanol của củ khơ lồi Địa
hồng [10].

Nhƣ vậy những nghiên cứu về thành phần hóa học của lồi Địa hồng đã chỉ
ra các loại chất gồm iridoid, phenethyl alcohol glycoside, norcarotenoids,
ionone glycosides. Về hoạt tính hóa học của các hợp chất đã phân lập đƣợc
mới chỉ đƣợc nghiên cứu rất hạn chế.
1.3 TÁC DỤNG HẠ ĐƢỜNG HUYẾT CỦA LOÀI ĐỊA HOÀNG

Đái tháo đƣờng, còn gọi là bệnh tiểu đƣờng, là một nhóm bệnh rối loạn
chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hc mơn insulin của tụy bị thiếu
hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đƣờng trong máu luôn

n


9
cao; trong giai đoạn mới phát thƣờng làm bệnh nhân đi tiểu nhiều, tiểu ban
đêm và do đó làm khát nƣớc. Bệnh đái tháo đƣờng diễn biến âm thầm nhƣng
khi nặng lại nhanh chóng gây ra những biến chứng nặng nề nhƣ: mù lòa, cắt
cụt chi, suy thận, tai biến mạch máu não và bệnh lý tim mạch [11], [12].
Những năm gần đây, tỉ lệ ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng ở các quốc gia có
thu nhập trung bình tăng lên rõ rệt, trong đó có Việt Nam. Nƣớc ta đƣợc liệt
vào nƣớc có số ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng tăng nhanh nhất, theo Thống
kê của Bộ Y tế năm 2018, Việt Nam hiện có khoảng 3,5 triệu ngƣời mắc đái
tháo đƣờng, con số này dự báo tăng lên 6,1 triệu vào năm 2040. Mặc dù số
ngƣời mắc bệnh đái tháo đƣờng lớn nhƣ vậy, nhƣng do vẫn còn rất nhiều
ngƣời chƣa có nhận thức đúng về căn bệnh đƣợc coi là "kẻ giết ngƣời thầm
lặng" này khiến căn bệnh này không ngừng gia tăng.
Hiện nay, phƣơng pháp phổ biến là sử dụng Tân dƣợc uống mỗi ngày để giúp
làm giảm lƣợng đƣờng trong máu để ngừa biến chứng do đƣờng huyết tăng
cao. Các nhóm Tân dƣợc hỗ trợ điều trị tiểu đƣờng thƣờng bao gồm các loại
nhƣ kích thích tiết hoặc làm tăng độ nhạy, ức chế hấp thu glucose ở ruột, tăng
sinh glucose ở gan, giảm cảm giác thèm ăn… Tân dƣợc tác dụng nhanh,
nhƣng khi ngƣng thì mất tác dụng cũng nhanh, chủ yếu tác dụng tốt trong thời
gian đầu. Nhƣng điều quan trọng là, khi càng sử dụng, theo thời gian sẽ bị
“nhờn thuốc”. Với liều lƣợng ngày càng tăng, đến một lúc nào đó, việc sử
dụng thuốc tân dƣợc bắt đầu trở nên vô hiệu và còn gây ra nhiều tác dụng phụ

nhƣ làm đau dạ dày, làm thận suy yếu dẫn đến khả năng suy thận về sau. Khi
mất tác dụng hoặc tác dụng giảm dần thì đƣờng huyết bắt đầu trồi sụt lên
xuống, tuyến tụy suy yếu dần, đây cũng là lúc bắt đầu xuất hiện các biến
chứng tiểu đƣờng. Do đó cơ chế của việc hỗ trợ điều trị của Tây y là theo cơ
chế “đối kháng”, còn cơ chế của Đơng y theo cơ chế điều hịa, bồi bổ giúp cơ
thể đạt trạng thái qn bình. Theo Đơng y nói chung, việc hỗ trợ điều trị các
bệnh đều trên cơ sở từ nguồn gốc sinh ra bệnh, trên cơ chế bồi bổ, điều hịa và
phục hồi dần cơng năng của các cơ quan giúp cơ thể vận hành theo cơ chế
“thuận theo tự nhiên”. Bởi vì thực tế cơ thể con ngƣời khi sinh ra hầu hết ai

n


10
cũng khỏe mạnh, có cơ chế tự đề kháng, tự phục hồi, nhƣng một thời gian
theo nhịp sống hiện đại, thói quen ăn uống khơng điều độ, sử dụng các hóa
phẩm độc hại, lạm dụng các sản phẩm Tây y làm cho con ngƣời mất dần khả
năng tự nhiên vốn có.
Muốn hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng hiệu quả, đầu tiên phải đƣa đƣờng huyết
về mức an toàn, sau đó cần hỗ trợ bồi bổ giúp cơng năng các tạng đƣợc phục
hồi dần giúp đƣờng huyết ổn định lâu dài. Do đó, các nhà khoa học mong
muốn tìm ra những liệu pháp chữa bệnh tiểu đƣờng theo cơ chế “thuận theo tự
nhiên”, nghĩa là nghiên cứu, tìm kiếm các hợp chất có nguồn gốc từ thiên
nhiên có hoạt tính hạ đƣờng huyết để tạo ra các sản phẩm chữa bệnh an tồn
và hiệu quả lâu dài [13], [14].
Đã có hơn 1000 lồi cây đƣợc xác định có khả kiểm sốt glucose máu và ít
tác dụng phụ [15], trong đó một số cây đã đƣợc nghiên cứu ở trên thế giới và
Việt Nam nhƣ lá ổi, lá vối, lá sen, bằng lăng nƣớc, trà xanh, khổ qua, quế,
giảo cổ lam, cây dừa cạn,...[16], [17], [18], [19]. Mới đây nhất, có cơng bố về
việc nghiên cứu tìm ra 02 hoạt chất mới giúp hạ đƣờng huyết trong dây thìa

canh Việt Nam đƣợc thực hiện bởi nhóm các nhà khoa học, giáo sƣ của Đại
học Quốc gia Seoul (Hàn Quốc) và nhóm các nhà nghiên cứu của công ty
Nam dƣợc Việt Nam [20]. Về loài Địa hoàng, mặc dù đã đƣợc sử dụng kết
hợp trong một số bài thuốc dân gian để chứa một số bệnh tuy nhiên theo tìm
hiểu thì ở Việt Nam mới chỉ có một số nghiên cứu về quy trình trồng trọt, thu
hoạch Địa hồng và chế biến Thục địa [21] và một số hợp chất [8], [22]
đƣợc cơng bố. Tuy nhiên chƣa thực sự có cơng trình nào nghiên cứu tồn
diện về thành phần hóa học và cơ sở khoa học của những ứng dụng trong
các bài thuốc dân gian của Địa hoàng đặc biệt là tác dụng hạ đƣờng huyết
của loài này.

n


11
CHƢƠNG 2. NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. MẪU NGHIÊN CỨU
Mẫu Rehmannia glutinosa đƣợc thu hái ở Việt Trì (Phú Thọ) ngày 6/03/2020.
Mẫu đƣợc giám định bởi TS. Nguyễn Thế Cƣờng, Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam giám định. Mẫu tiêu bản
đƣợc lƣu giữ tại Viện Hoá sinh biển - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam (xem
Kết quả giám định mẫu tại phần Phụ lục).
2.2. NGUYÊN VẬT LIỆU
Bảng 2.1. Trang thiết bị thí nghiệm
Tên trang thiết
TT
bị
1 Máy siêu âm

Thuộc phịng thí

nghiệm

Mơ tả vai trị của
thiết bị
đối với đề tài

Tình
trạng

Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập
các hợp chất

Tốt

2 Máy cất quay Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập
chân khơng
các hợp chất

Tốt

3 Máy hứng phân Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập
đoạn
các hợp chất

Tốt

4 Đèn UV

Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập
các hợp chất

Tốt

5 Cột sắc ký

Viện Hóa sinh biển Chiết xuất, phân lập
các hợp chất

Tốt

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Sắc ký lớp mỏng (TLC)
Sắc ký lớp mỏng đƣợc thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DCAlufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng

n


12
đèn tử ngoại ở hai bƣớc sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là
dung dịch H2SO4 10% đƣợc phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng
từ từ đến khi hiện màu.
2.3.2. Sắc ký cột (CC)

Sắc ký cột đƣợc tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thƣờng và
pha đảo. Silica gel pha thƣờng có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240-430 mesh).
Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical Ltd.).
Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem. Ind. Co., Ltd.).
2.4. PHƢƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

Phƣơng pháp chung để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất là kết hợp

giữa các thông số vật lý với các phƣơng pháp phổ hiện đại bao gồm:
2.4.1. Độ quay cực ([]D)
Độ quay cực đƣợc đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện
Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam.
2.4.2. Phổ hối lƣợng ph n giải cao HR-ESI-MS
Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent Accurate mass 6530
QTOF LC MS tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
2.4.3. Phổ cộng hƣởng từ nh n (NMR)
Phổ NMR đo trên các máy (chất nội chuẩn là TMS):
+ BRUCKER AVANCE 500 MHz, Viện Hoá học - Viện Hàn lâm
KH&CN Việt Nam.
Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:
 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân một chiều (1D-NMR): 1H-NMR,
NMR, DEPT.

n

13

C-


13
 Phổ cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều (2D-NMR): HMBC, HSQC,
NOESY.
 Phổ lƣỡng sắc tròn (CD): đƣợc ghi lại bằng máy đo quang phổ Chirascan
(Applied Photophysics, Surrey, UK) của Viện Hóa sinh biển, Viện hàn lâm KH
& CN Việt Nam.
Dung môi đƣợc sử dụng là CD3OD. Việc lựa chọn dung môi đo phụ

thuộc vào bản chất của từng mẫu, theo ngun tắc dung mơi phải hịa tan
hồn tồn mẫu thử.
2.5. THỰC NGHIỆM
Để có thể thu đƣợc các hợp chất từ cây Địa hoàng, đầu tiên áp dụng
phƣơng pháp chiết lỏng rắn. Sử dụng dung mơi chiết có độ phân cực trung
bình là methanol với mục đích khảo sát cả các hợp chất có độ phân cực ít đến
trung bình và khá phân cực. Trong quá trình chiết, sử dụng nhiệt độ nhằm rút
ngắn thời gian chiết và tăng hiệu suất chiết.
Để tách thô các phân đoạn giúp cho quá trình phân lập trên sắc ký cột
thuận lợi chúng tơi sử dụng phƣơng pháp chiết phân bố lỏng lỏng với việc sử
dụng các dung môi không tan vào nhau và phân bố chất vào các pha khác
nhau. Dung môi chiết đƣợc tăng dần độ phân cực từ ít phân cực đến phân cực
nhiều. Quá trình làm giầu chất đƣợc kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng trƣớc khi
tiến hành phân tách bằng các loại sắc ký cột với các loại chất hấp phụ khác
nhau. Đối với những hỗn hợp khó có khả năng tách trên sắc ký pha thƣờng cần
thiết sử dụng chất phấp phụ khác đó là silice gel ngƣợc pha (YMC) với chiều
dài mạch chất hấp phụ khác nhau (RP-8 hoặc RP-18) nhằm tăng thêm khả
năng tách. Trong quá trình tách, điều cần lƣu ý là làm sao cho hệ dung môi
kiểm tra trên TLC và trên cột là giống nhau và phải lựa chọn chiều dài cột,
đƣờng kính cột phù hợp với khối lƣợng chất cần tách cũng nhƣ Rf của từng
chất trong hỗn hợp.

n


14
Lồi Rehmannia glutinosa phơi khơ (10kg) đƣợc chiết bằng MeOH 3
lần, mỗi lần 20 lít thu đƣợc 2,2 kg cặn chiết MeOH. Cặn chiết này đƣợc phân
bố đều trong 5 lít nƣớc cất và đƣợc chiết phân lớp lần lƣợt với
dichloromethane và ethyl acetate thu đƣợc cặn CH2Cl2 (250 g), cặn EtOAc

(120 g) và phần tan trong nƣớc. Phần tan trong nƣớc đƣợc cô quay để loại bớt
dung môi sau đó đƣợc chạy qua cột Dianion và đƣợc gradient bằng hệ dung
môi rửa giải với độ phân cực tăng dần (methanol : nƣớc - 25:75 → 100:0, v:v)
thu đƣợc 4 phân đoạn là RGW1 (80,2 g), RGW2 (7,1 g), RGW3 (10,6 g) và
RGW4 (6,3 g).
Phân đoạn RGW2 (7,1 g) đƣợc phân tách trên cột silica gel pha đảo với
hệ dung môi methanol : nƣớc – 1:2, v:v) thu đƣợc 4 phân đoạn RGW2A (1,5
g), RGW2B (1,45 g), RGW2C (1,47 g) và RGW2D (0,8 g). Phân đoạn
RGW2A (1,5 g) đƣợc phân tách trên cột silica gel pha thƣờng với hệ dung
môi rửa giải dichloromethane : methanol – 3:1, v:v) thu đƣợc hợp chất RG5
(250 mg). Phân đoạn RGW2B (1,45 g) đƣợc phân tách trên cột silica gel pha
thƣờng với hệ dung môi rửa giải ethyl acetate : methanol – 8:1, v:v) thu đƣợc
hợp chất RG3 (18,0 mg). Tiếp tục sử dụng sắc ký cột silica gel
pha thƣờng với hệ dung môi rửa giải dichloromethane : acetone – 1:1,
v:v) với phân đoạn RGW2D (0,8 g) thu đƣợc hợp chất RG4 (11,0 mg).
Phân đoạn RGW3 (10,6 g) đƣợc tách trên cột silica gel pha đảo với hệ
dung môi acetone : nƣớc – 1:1, v:v) thu đƣợc 4 phân đoạn RGW3A (1,2 g),
RGW3B (1,5 g), RGW3C (3,2 g) và RGW3D (2,2 g). Phân đoạn RGW3A
(1,2 g) đƣợc sử dụng sắc kí cột silica gel pha thƣờng kết hợp với hỗn hợp
dung môi rửa giải dichloromethane : methanol – 4:1, v:v) thu đƣợc RG2 (5,0
mg). Tiếp tục phân tách RGW3B (1,5 g) bằng sắc kí cột silica gel pha đảo với
hệ dung môi acetone : nƣớc – 2:1, v:v) thu đƣợc RG1 (45 mg).
Nhƣ vậy, sử dụng phối hợp các phƣơng pháp sắc ký cột silica gel pha
thƣờng, pha đảo, sắc ký bản mỏng bằng các hệ dung mơi thích hợp đã phân
lập đƣợc 05 hợp chất từ phân đoạn nƣớc của cây Địa hoàng.

n


15

Sơ đồ phân lập lồi Rehmannia glutinosa

2.6. THƠNG SỐ VẬT LÍ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT
2.6.1. Hợp chất RG1 (hợp chất mới)
RG1: Rehmatinoside E (chất mới)
Dạng bột màu trắng.
CTPT: C36H56O17; M = 760; [α]D25 = –56.0 (c 0.1 MeOH).
HR-ESI-MS m/z: 783.3414 [M + Na]+ (Tính tốn lý thuyết cho
[C36H56O17Na]+, 783.3410).
CD (rel): 226 (+0.18), 265 (-0.49) (c = 1.0 × 10-3 M, MeOH)
Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD và 13C-NMR: xem Bảng 3.1 trang 24).
2.6.2. Hợp chất RG2 (hợp chất mới)
RG2: Rehmatinoside F (chất mới)
Dạng bột màu trắng
CTPT: C36H56O16; M = 744; [α]D25: –68.0 (c 0.1, MeOH)

n