(Luận văn thạc sĩ) nghiên cứu thành phần hóa học cây lan kim tuyến ( anoectochilus setaceus blume) thu hái tại thanh hóa

KHOA Y DƯỢC

ici
n

ea

nd

Ph

arm
ac

--------

y,
VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

M

ed

NGUYỄN NAM PHƯƠNG

ho
ol

of

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN
(Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA

py

rig
h

t@

Sc

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Co

Hà Nội – 2019
1


KHOA Y DƯỢC

arm
ac

--------

y,

VN
U

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

nd

Ph

Người thực hiện: NGUYỄN NAM PHƯƠNG

ed

ici
n

ea

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY LAN KIM TUYẾN
(Anoectochilus setaceus Blume) THU HÁI TẠI THANH HÓA

ho
ol

of

M

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC

Khóa

: QH.2014.Y

ThS. Hà Thị Thanh Hương

Co

py

rig
h

t@

Sc

Người hướng dẫn: PGS.TS. Lê Quang Huấn

Hà Nội – 2019


y,
VN
U

LỜI CẢM ƠN

Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia Hà
Nội, với sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của Thầy Cô đã giúp cho em tiếp thu

được những kiến thức về lý thuyết và thực hành vô cùng hữu ích.

arm
ac

Khóa luận này là kết quả của việc tiếp thu, vận dụng những kiến thức đã
được học cũng như sự cố gắng nỗ lực của bản thân em tại Khoa Y Dược - Đại học
Quốc gia Hà Nội và phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh

Ph

học trực thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Lê Quang

ici
n

ea

nd

Huấn – phòng Công nghệ Tế bào Động vật – Viện Công nghệ sinh học trực thuộc
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và ThS. Hà Thị Thanh Hương –
Nghiên cứu viên Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược - Đại học
Quốc gia Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình giúp đỡ, quan tâm tạo điều kiện
thuận lợi để em có thể nghiên cứu và hồn thành khóa luận này.

M

ed

Em xin chân thành cảm ơn Ban chủ nhiệm Khoa Y Dược - Đại học Quốc gia
Hà Nội, Bộ môn Dược liệu – Dược học cổ truyền và các anh chị nghiên cứu viên

of

trong phịng Cơng nghệ Tế bào Động vật – Viện Cơng nghệ sinh học đã tạo điều
kiện giúp đỡ em thực hiện Khóa luận tốt nghiệp.

ho
ol

Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè, những người đã ln theo
sát động viên, quan tâm và tạo điều kiện trong thời gian em thực hiện khóa luận.

t@

Sc

Trong q trình nghiên cứu đề tài khó tránh khỏi thiếu sót. Em rất mong
nhận được những ý kiến đóng góp quý báu của Thầy Cơ để bài luận văn của em
được hồn thiện hơn.

rig
h

Em xin chân thành cảm ơn!

py

Hà Nội, ngày 20 tháng 02 năm 2019
Sinh viên

Co

Nguyễn Nam Phương

i


y,
VN
U

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT ....................................................... iv
DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ v

arm
ac

DANH MỤC CÁC HÌNH ............................................................................................. v
ĐẶT VẤN ĐỀ........ ........................................................................................................ 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN ......................................................................................... 2

Ph

1. Vài nét về chi Anoectochilus ..................................................................................... 2

1.1. Đặc điểm hình thái ................................................................................................. 2

nd

1.2.Phân bố........................................................................................................... ..........2

ea

1.3. Công dụng và tác dụng .......................................................................................... 2

ici
n

2. Tổng quan về cây Lan kim tuyến ........................................................................... 3
2.1.Vị trí phân loại........ ................................................................................................. 3

ed

2.2.Đặc điểm hình thái .................................................................................................. 4

M

2.3.Sinh học và sinh thái ............................................................................................... 5

of

2.4.Phân bố và tình trạng ............................................................................................. 5
2.5.Thành phần hóa học................................................................................................ 5

ho

ol

2.6.Cơng dụng............. ................................................................................................. 10

Sc

2.7.Tác dụng sinh học của một số hợp chất trong cây Lan kim tuyến ................... 10
2.7.1.Quercetin........... .................................................................................................. 10

t@

2.7.2.Isorhamnetin........ ............................................................................................... 11
2.7.3.Acid ferulic......... ................................................................................................. 12

rig
h

2.7.4.Các bài thuốc và sản phẩm được biết đến ....................................................... 13
2.8.Vấn đề cần giải quyết ............................................................................................ 13

Co

py

CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 14
2.1.Nguyên liệu, hóa chất ............................................................................................ 14
ii


y,

VN
U

2.2.Phương tiện nghiên cứu ........................................................................................ 14
2.3.Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 14
2.3.1.Phương pháp chiết xuất cao Lan kim tuyến .................................................... 14
2.3.2.Phương pháp định tính ...................................................................................... 17

arm
ac

.3.3.Phương pháp định lượng .................................................................................... 17
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ .......................................................................................... 20
3.1.Kết quả định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic ................................. 20

Ph

3.2.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic ............................................ 21

nd

3.2.1.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin trong dịch chiết bằng HPLC ............. 21
3.2.1.1.Điều kiện sắc ký ............................................................................................... 21

ea

3.2.1.2.Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống .............................................................. 21

ici
n

3.2.1.3.Định lượng Quercetin, Isorhamnetin ............................................................ 22
3.2.1.4.Kết quả định lượng Quercetin, Isorhamnetin ............................................. 25

ed

3.2.2.Định lượng Acid ferulic trong dịch chiết bằng HPLC .................................... 26

M

3.2.2.1.Điều kiện sắc ký ............................................................................................... 26

of

3.2.2.2.Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống .............................................................. 27

ho
ol

3.2.2.3.Định lượng Acid ferulic .................................................................................. 28
3.2.2.4.Kết quả định lượng Acid ferulic ................................................................... 30

Sc

BÀN LUẬN....... ........ .................................................................................................. 31
KẾT LUẬN................................. ................................................................................. 33

t@

KIẾN NGHỊ........................ ......................................................................................... 33

rig
h

TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................... 34

Co

py

PHỤ LỤC

iii


Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao
HPLC

y,
VN
U

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT

(High Performance Liquid Chromatography)
Dung dịch

ACN

Acetonitril

MeOH

Methanol

PBS

Muối đệm phosphate

IC50

Nồng độ ức chế 50%

RLAR

Enzyme Lens Aldose Reductase

(NH4)2SO4

Amoni sunfat

KH2PO4

Kali đihiđrophotphat

MgSO4.7H2O

Magie sulfat

CaCl2.2H2O

Calcium Chloride

Ph

nd

ea

ici
n

ho
ol

Sc

UV

t@

Vis

Giá trị nồng độ
Tử ngoại
Khả kiến

STT

Số thứ tự

TB

Trung bình

Area

Diện tích píc

RT

Thời gian lưu

Tailling factor

Hệ số kéo đi

rig
h
py

ed

Nồng độ

C

Co

M

Natri clorua

of

NaCl

CV

arm
ac

dd

iv


y,
VN
U

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Lan kim tuyến..........................6
Bảng 3.1. Kết quả sắc ký dung dịch chuẩn ........................................................................................ 21
Bảng 3.2. Số liệu pha đường chuẩn .................................................................................................... 22

arm
ac

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Quercetin ........... 23

Bảng 3.4. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Isorhamnetin ..... 24
Bảng 3.5. Kết quả định lượng Quercetin ........................................................................................... 25

Ph

Bảng 3.6. Kết quả định lượng Isorhamnetin ..................................................................................... 26

nd

Bảng 3.7. Kết quả kiểm tra độ thích hợp của hệ thống .................................................................... 27

ea

Bảng 3.8. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ các dung dịch ...................................... 28
Bảng 3.9. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của Acid ferulic ........ 29

ed

ici
n

Bảng 3.10. Kết quả xác định nồng độ Acid ferulic trong mẫu thử .................................................. 30

M

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) ......................................................... 4

of

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo Quercetin, C15H10O7 ............................................................................ 11

ho
ol

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo Isorhamnetin, C16H12O7 ...................................................................... 12
Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo Acid ferulic, C10H10O4 ......................................................................... 12

Sc

Hình 2.1. Phổ hấp thụ của Quercetin ................................................................................................. 17

t@

Hình 2.2. Phổ hấp thụ của Isorhamnetin ........................................................................................... 18
Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Acid ferulic .............................................................................................. 18

rig
h

Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-Vis của mẫu cao lên men Lan kim tuyến .............................................. 20
Hình 3.2. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Quercetin................... 23

Co

py

Hình 3.3. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Isorhamnetin............. 24
Hình 3.4. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ Acid ferulic................ 29

v


y,
VN
U

ĐẶT VẤN ĐỀ

Theo thống kê của Viện Dược liệu, đến nay Việt Nam đã ghi nhận trên 5000 loài
thực vật và nấm, 408 lồi động vật và 75 loại khống vật có cơng dụng làm thuốc. Với
hệ sinh thái phong phú, Việt Nam được đánh giá là quốc gia có tiềm năng lớn về việc

arm
ac

nuôi dưỡng và phát triển các cây thuốc quý. Do đó xu hướng nghiên cứu và tìm kiếm
các hoạt chất tự nhiên có hoạt tính sinh học cao từ các loài thực vật làm dược phẩm
chữa bệnh đang ngày càng phát triển mạnh với những ưu điểm nổi bật của dược liệu là
độc tính thấp, dễ hấp thu và chuyển hóa trong cơ thể.

Ph

Họ Lan (Orchidaceae) là họ thực vật đa dạng nhất của Việt Nam, với tổng số 865

ea

nd

lồi thuộc 154 chi. Thơng thường Lan được sử dụng làm cảnh. Ngồi ra, có nhiều lồi

Lan còn được sử dụng làm thuốc. Chi Lan kim tuyến Anoectochilus ở Việt Nam hiện
thống kê được 12 loài, trong đó có lồi Lan kim tuyến Anoectochilus setaceus Blume

ici
n

được biết đến nhiều không những bởi giá trị làm cảnh mà bởi giá trị làm thuốc của nó
[1]. Do bị thu hái nhiều để bán làm thuốc từ rất lâu nên loài Lan kim tuyến đang bị đe
doạ nghiêm trọng, rất có thể sẽ bị tuyệt chủng ngồi tự nhiên nếu chúng ta khơng có

M

ed

biện pháp bảo tồn hữu hiệu. Hiện nay, Lan kim tuyến được xếp trong nhóm IA của
Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm cấm khai thác vì mục đích thương mại và nhóm

ho
ol

of

thực vật đang nguy cấp EN A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật
[2,3]. Nhằm bảo tồn và phát triển nguồn tài nguyên quý này, nhiều đơn vị nghiên cứu
trong cả nước đã tập trung vào việc nhân giống và ni trồng Lan kim tuyến.

t@

Sc

Khóa luận này được thực hiện nhằm mục đích tìm hiểu về thành phần hóa học
của cây Lan kim tuyến. Từ đó, định hướng về ứng dụng của loại dược liệu này góp
phần vào cơng cuộc bảo tồn và nâng cao hơn giá trị sử dụng. Khóa luận được thực hiện
với đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học cây Lan kim tuyến (Anoectochilus
setaceus Blume) thu hái tại Thanh Hóa” với mục tiêu:

Co

py

rig
h

1. Chiết xuất cao Lan kim tuyến.
2. Định tính một số hợp chất trong mẫu.
3. Xác định được hàm lượng của một số hợp chất trong mẫu cao bằng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.

1


y,
VN
U

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
1. Vài nét về chi Anoectochilus
1.1. Đặc điểm hình thái

Chi Lan kim tuyến (Anoectochilus) là một chi thực vật có hoa thuộc họ Lan

(Orchidaceae) và phân họ cùng tên (Orchidoideae). Cái tên "Lan kim tuyến" hay "Lan

arm
ac

kim hoàn” bắt nguồn từ những đường gân rất đẹp trên phiến lá của các loài lan này.

Phần lớn chúng là các thực vật sinh sống trên nền đất có kích thước nhỏ, tuy
nhiên một vài loài sinh sống trên các bờ đá, với bộ lá màu xanh lục hoặc mang các màu

Ph

sắc khác (tùy theo lồi), có bề mặt mịn như nhung và mang một mạng lưới gân lá phức

ea

nd

tạp. Cụm hoa ở ngọn trung tâm mang một vài hoa mọc chúc xuống đất và bao phủ bởi
lông với một cánh môi rất lớn và nổi bật. Tràng hoa cùng với đài hoa ở mặt lưng tạo
thành một cấu trúc giống như chiếc mũ trùm đầu. Mỗi hoa có hai nhụy và hai nhị [25].

ici
n

1.2. Phân bố

ed

Chi Anoectochilus (Orchidaceae), bao gồm hơn 40 loài, phổ biến khắp các vùng

nhiệt đới, từ Ấn Độ, Himalayas, Đông Nam Á đến Hawaii.
Trong số các loài thực vật này, A. formosanus và A. koshunensis chỉ phân bố ở

M

Đài Loan (Trung Quốc) và Okinawa (Nhật Bản).

ho
ol

of

Anoectochilus roxburghii, phân bố ở miền nam Trung Quốc, Nhật Bản, Sri
Lanka, Ấn Độ và Nepal [17].

1.3. Công dụng và tác dụng

t@

Sc

Một số loài thuộc chi này được sử dụng trong các loại thuốc dân gian Trung
Quốc, chẳng hạn như A. formosanus Hayata, A. koshunensis Hayata, và A. roxburghii
(Wall.) Lindl.

Co

py

rig

h

Theo y học cổ truyền Đài Loan, A. formosanus Hayata tươi hoặc khô nấu nước
uống trị các chứng bệnh đau ngực, đau bụng, tiểu đường, viêm thận, sốt, huyết áp cao,
liệt dương, rối loạn gan, lá lách và chứng đau nhói ngực. Người Trung Quốc cho rằng
uống trà làm từ A. formosanus Hayata chữa các chứng bệnh gan và phổi [23,30].
Đại học ông nghệ Y dược và ao đẳng Y học Quốc gia Dương Minh Đài Loan
đã sử dụng A. formosanus Hayata làm thuốc kháng viêm, hạ sốt, giảm suy nhược cơ
2


thể và kháng virus c m A. Nhiều nghiên cứu đã phát hiện A. formosanus Hayata chứa

y,
VN
U

hợp chất chuyển hoá arachidonic acid liên quan đến chức năng tim mạch. Dịch
chiết A. formosanus Hayata có khả năng kháng virus, kháng sưng viêm và bảo vệ gan.
Chiết xuất của cây A. formosanus khơ có chứa 4-hydroxycinnamic acid, β-sitosterol,
β-D-glucopyranosyloxy và butanoid glucosides acid [28]. Gần đây, một hợp chất 3(R)3- β-D-glucopyranosyloxy butanolide tên là thương mại kinsenoside được chiết xuất

arm
ac

từ A. formosanus và A. koshunensis chống tăng huyết áp hiệu quả [29].

Anoectochilus roxburghii, còn được gọi là "Vua thảo dược" để điều trị sốt, bệnh

Ph

về phổi, viêm màng phổi, bệnh về gan, tăng huyết áp và trẻ em suy dinh dưỡng ở
Trung Quốc (Viện Y học cổ truyền Trung Quốc Phúc Kiến 1982).

ici
n

ea

nd

Tuy nhiên, thơng tin khoa học về hoạt tính sinh học, chức năng sinh lý và hiệu
quả lâm sàng cụ thể của cây lan thảo dược này cịn hạn chế. Khơng có báo cáo nghiên
cứu về các thành phần hóa học của A. roxburghii và có rất ít hồ sơ dược lý (Li et al.
1995) bởi vì các nguồn tự nhiên của A. roxburghii phần lớn đã cạn kiệt.

2. Tổng quan về cây Lan kim tuyến

ed

2.1. Vị trí phân loại

 Lan Kim Tuyến có tên khoa học là Anoectochilus setaceus Blume

M

 Tên đồng nghĩa

of

 Chrysobaphus roxburghii Wall. 1826


ho
ol

 Anoectochilus roxburghii (Wall.) Wall. ex Lindl. 1840
Anoectochilus regalis Blume. 1858

 Bộ: Asparagales

Sc

 Họ: Phong lan Orchidaceae
 Phân họ: Orchidoidea

t@

 Chi: kim tuyến (Anoectochilus)
 Loài: A. setaceus

Co

py

rig
h

 Tên gọi khác: kim cương, kim tuyến, kim tuyến tơ, lan gấm, mộc sơn, thạch
tùng

3


2.2. Đặc điểm hình thái

y,
VN
U

Lan kim tuyến là cây thảo, mọc ở đất, có thân rễ mọc dài, thân trên đất mọng
nước và có nhiều lơng mềm, mang 2 - 4 lá mọc xịe sát đất. Lá hình trứng, gần trịn ở
gốc, chóp hơi nhọn và có mũi ngắn, cỡ 3 - 4 x 2 - 3 cm, có màu khác nhau với mạng
gân thường nhạt hơn (màu lục sẫm với mạng gân màu lục nhạt hay màu nâu, đỏ với
mạng gân màu vàng, lục hay hồng). Cuống lá dài 2 - 3 cm. Cụm hoa dài 10 - 15 cm,

arm
ac

mang 4 - 10 hoa mọc thưa. Lá bắc hình trứng, chóp nhọn, dài 8 - 10 mm, màu hồng.
Hoa thường màu trắng, dài 2,5 - 3 cm. Các mảnh bao hoa dài khoảng 6 mm, môi dài
đến 1,5 cm, ở mỗi bên gốc mang 6 - 8 dải hẹp, chóp phiến rộng, chẻ hai sâu, hốc chứa

Hình 1.1. Cây Lan kim tuyến (Anoectochilus setaceus Blume) [19]

Co

py

rig

h

t@

Sc

ho
ol

of

M

ed

ici
n

ea

nd

Ph

mật dài 7 mm, bầu dài 1,3 cm, màu lục, có nhiều lơng mềm [2].

4


2.3. Sinh học và sinh thái

y,
VN
U

Mùa hoa của cây là tháng 2 đến tháng 4. Tái sinh bằng chồi từ thân rễ và hạt, ít
và sinh trưởng rất chậm. Mọc dưới tán rừng nguyên sinh, hầu hết là nguyên thủy, rậm.
Chúng sinh sống trên sườn n i đá granit, riôlit, phiến sét, ở độ cao 500 - 1600 m, rải
rác thành từng nhóm, vài ba cây trên đất ẩm, rất giàu mùn và lá cây rụng [2].

arm
ac

2.4. Phân bố và tình trạng

 Thế giới: Ấn Độ, Nepan, Butan, Trung Quốc, Mianma, Thái Lan, Lào,
ampuchia, Malaixia, Inđônêxia.
 Lào Cai: núi Phan Xi Păng, xã Liêm Phú.

Ph

 Trong nước

nd

 Kon Tum: núi Ngọc Linh, Vườn Quốc gia hư Mom Ray.
 Đắk Lắk: Vườn Quốc gia hư Yang Sin.

ea

 Lâm Đồng: Vườn Quốc gia Bidoup - Núi Bà.

ici
n

 Phú Thọ: Vườn Quốc gia Xuân Sơn.

 Sơn La: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Tà Sùa.

ed

 Hà Nội: Vườn Quốc gia Ba Vì.

 Thanh Hóa: Khu Bảo tồn Thiên nhiên Xn Liên, Pù Lng.

of

M

 Tình trạng
Lồi có khu phân bố rộng nhưng với số lượng cá thể khơng nhiều, tái sinh chậm

Sc

ho
ol

và địi hỏi điều kiện sống ngặt nghèo ngày càng hiếm. Chúng đã bị khai thác liên tục
trong nhiều năm, hiện đã trở nên giảm sút rõ rệt và có nguy cơ bị tuyệt chủng. Do đó,
Lan kim tuyến đã được xếp trong nhóm IA của Nghị định 32/2006/NĐ-CP, nghiêm

cấm khai thác vì mục đích thương mại và nhóm thực vật đang nguy cấp EN
A1a,c,d trong sách đỏ Việt Nam năm 2007, phần thực vật [2,3].

t@

2.5. Thành phần hóa học

Co

py

rig
h

Từ các phân đoạn ethyl acetate và phân đoạn n-butanol của dịch chiết ethanol của
toàn bộ cây Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. (Orchidaceae) đã phân lập được
nhiều hợp chất. Trên cơ sở phương pháp quang phổ, cấu trúc của các hợp chất này đã
được làm sáng tỏ là cirsilineol (1), quercetin (2), quercetin 7-O-β-D-glucopyranoside
(3), quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (4), isorhamnetin (5), isorhamnetin-7-O-β-Dglucopyranoside (6), isorhamnetin-3-O-β-D-glucopyranoside (7), kaempferol-3-O-β–
5


D-glucopyranoside (8), kaempferol-7-O-β-D-glucopyranoside (9), isorhamnetin-3-O-

y,
VN
U

β-D-rutinoside (10) [10,12,16,17].
Ferulic acid (11) [16], p-coumaric acid (12) [10], sorghumol (13), friedelin (14)

[18], sitosterol (15), stigmasterol (16), campesterol (17), daucosterol (18), succinic acid
(19) và tinh dầu [14,16,18].

arm
ac

Năm 2008, He và cộng sự đã phân lập được hai loại sorghumol acyl este mới đó
là Sorghumol 3-O-Z-p-coumarate và sorghumol 3-O-E-p-coumarate, một alkaloid mới
là anoectochine (20) và một chất đã được biết đến từ trước sorghumol [15]. Cụ thể các
hoạt chất được xác định có cơng thức cấu tạo hóa học như sau.

nd

Ph

Bảng 1.1: Cấu trúc hóa học các hợp chất đã phân lập được từ cây Lan kim tuyến

ea

OCH3
OH
O

ici
n

H3CO

HO

O

OH

O

O

(2) quercetin

ho
ol

of

(1) cirsilineol

OH

M

OH

OH

ed

H3CO

OH

OH
O

t@

HO

Sc

OH

OH
OH

OH

O

HO

O
OH

O

HO

OH

O

O

OH

rig
h

HO

OH

O

O
HO

(3) quercetin 7-O-β-D-glucopyranoside

OH

OH

Co

py

��nh vai trò chữa bệnh của cao Lan kim tuyến [32].

OH

O

nd

HO

Ph

OH

O

ici
n

OH

ea

OH

ed

Hình 1.2. Cơng thức cấu tạo Quercetin, C15H10O7

M

2.7.2. Isorhamnetin

t@

Sc

ho
ol

of

Isorhamnetin thể hiện một sự ức chế mạnh mẽ đối với hoạt tính enzyme Lens
Aldose Reductase ở chuột (RLAR) in vitro, IC50 được xác định là 1,4 mM và có tác
dụng ức chế tích tụ sorbitol. Isorhamnetin ngăn ngừa rối loạn chức năng nội mạc, sản
xuất superoxide và sự biểu hiện quá mức của p47phox (tiểu đơn vị tế bào học 47
kilodalton của phức hợp đa protein được tìm thấy trong bạch cầu trung tính) gây ra
bởi angiotensin II. Isorhamnetin ngăn ngừa các tổn thương tế bào trong cơ thể và hoạt
động chống oxi hóa. Do vậy, isorhamnetin dường như là một loại thuốc mạnh chống lại
ung thư thực quản do khả năng không chỉ ức chế sự tăng sinh mà còn gây ra apoptosis

Co

py

rig
h

của tế bào. Đây là hợp chất có tiềm năng lớn để bào chế một loại thuốc mới có tác
dụng phịng ngừa và/hoặc điều trị bệnh tiểu đường và các biến chứng của bệnh tiểu
đường [8], [9], [13], [22].

11


y,
VN
U
arm
ac

Ph

Hình 1.3. Cơng thức cấu tạo Isorhamnetin, C16H12O7

nd

2.7.3. Acid ferulic

M

chống oxy hoá [22].

ed

ici
n

ea

Acid ferulic, giống như nhiều hợp chất phenol tự nhiên khác, được sử dụng như là
thuốc chống viêm, giảm đau, bức xạ tia cực tím, chống tắc nghẽn động mạch

(antithrombotic), trung hòa các gốc tự do (anti- reeradical) và tăng cường sức đề kháng
của cơ thể con người. Ở trong lâm sàng, nó được sử dụng để điều trị các bệnh như bệnh
tim mạch vành, tai biến mạch máu não, viêm mạch máu, giảm bạch cầu và giảm tiểu
cầu. Nó cũng được sử dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm với tác dụng như một chất

of

Xu và cộng sự (2015) đã chứng minh Acid ferulic có tác dụng phịng chống xơ
gan. Đây là minh chứng về tác dụng bảo vệ gan của cây Lan kim tuyến. Do vậy, một

ho
ol

trong các nội dung nghiên cứu của đề tài là xác định (định tính và định lượng) Acid
ferulic trong cao chiết từ Lan kim tuyến [31].
OH

O
OH

Co

py

rig
h

t@

Sc

O

Hình 1.4. Cơng thức cấu tạo Acid ferulic, C10H10O4
12


2.7.4. Các bài thuốc và sản phẩm được biết đến

y,
VN
U

Bài thuốc chữa thần kinh suy nhược, mất ngủ: 25 g lan gấm, 12 g hoa nhài, 10
g hoa thiên lý, 8 g tâm sen, 8 g ngưu tất, 15 g mạch môn, 10 g huyền sâm, 20 g quyết
minh tử, 8 g cam thảo đất, 12 g hoài sơn, sắc uống. Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm 3
lần trong ngày, dùng 3 – 5 thang.

arm
ac

Bài thuốc chữa kém ăn: 25 g lan gấm, 8 g liên nhục, 6 g sơn tra, 5 g trần bì, 20 g
huyền sâm, 5 g quyết minh tử, 10 g hoài sơn, sắc uống. Mỗi ngày sắc 1 thang, chia làm
3 lần trong ngày, dùng 5 – 7 thang.
Bài thuốc chữa ho khạc ra máu: 30 g lan gấm, 15 g ngưu tất, 15 g quyết minh

Ph

tử, 20 g hoài sơn, 20 g huyền sâm, 25 g mạch môn, sắc uống. Mỗi ngày sắc 1 thang,

nd

chia làm 3 lần trong ngày, dùng 5 – 7 thang [6].

ed

ici
n

ea

Hiện nay, các sản phẩm từ cây Lan kim tuyến đã bắt đầu được sản xuất dưới
dạng thực phẩm bảo vệ sức khỏe và giới thiệu ra thị trường như “Langambian G” của
Công ty cổ phần cây thuốc và hương liệu Việt gồm các thành phần thảo dược quý như
Lan kim tuyến, Vạn Thọ, Linh Chi, Cucurmin có tác dụng giúp chống oxy hóa, bảo vệ
tăng cường chức năng gan trong các trường hợp viêm gan virus, xơ gan, gan nhiễm
mỡ, giải độc gan, hạn chế tổn thương gan do rượu bia hóa chất, hóa trị, xạ trị. Một sản

M

phẩm khác từ Lan kim tuyến là “Lamgambian M” (cũng là sản phẩm của Công ty cổ

ho
ol

of

phần cây thuốc và hương liệu Việt) dành cho người bị mỡ trong máu cao, người bị xơ
vữa mạch máu, người có sức đề kháng kém, người hóa trị, xạ trị gồm các thành phần từ
một số thảo dược quý như Lan kim tuyến, Allicin, Rutin.

2.8. Vấn đề cần giải quyết

t@

Sc

Ở nước ta, hiện chưa có một cơng trình nghiên cứu chính thức nào về công dụng
làm thuốc của cây Lan kim tuyến mà chỉ biết nó theo dạng đồn thổi, thiếu tính kiểm
chứng. Do đó, cơng dụng chữa “bách bệnh” của loại cây này cũng mới chỉ là dư luận,
thiếu tính khoa học, cần được nghiên cứu rõ.

Co

py

rig
h

Một trong những mục tiêu nghiên cứu của khóa luận này chính là định tính và
định lượng một số hợp chất có tác dụng chữa bệnh có trong cao Lan kim tuyến.

13


y,
VN
U

CHƯƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1. Nguyên liệu, hóa chất

arm
ac

Tồn bộ cây Lan kim tuyến được thu hái từ vùng núi thuộc huyện Nơng Cống
tỉnh Thanh Hóa. Mẫu được cho vào trong túi bảo quản có chứa hạt hút ẩm silicagel, tại
phịng thí nghiệm được bảo quản ở -20o trước khi mang tách chiết.
Dược liệu được phơi, sấy khô, cắt và tán nhỏ tới độ mịn khoảng 3-4 mm để tăng
khả năng khuếch tán của dung môi.

Ph

Nấm men là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae.

nd

Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae: (NH4)2SO4, KH2PO4,
MgSO4.7H2O, CaCl2.2H2O, NaCl, cao nấm men, glucoza, nước, đệm PBS.

ea

Dung môi công nghiệp dùng trong chiết xuất: methanol, ethanol, ACN.

ici
n

2.2. Phương tiện nghiên cứu

Thiết bị, máy móc, dụng cụ: que cấy, đèn cồn, đĩa petri, màng lọc, giấy

ed

lọc, giấy bao gói, bơng khơng thấm nước, bông y tế.

of

M

Các dụng cụ cần thiết dùng trong quá trình thực nghiệm: bình tam giác, ống đong,
ống nghiệm, pipet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh các kích thước...
Thiết bị đo phổ hấp thụ NanoDrop-1000 (USA).

ho
ol

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC Shimadzu.

Sc

Máy ly tâm.
Tủ lạnh.

t@

2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp chiết xuất cao Lan kim tuyến

Co

py

rig
h

Công nghệ lên men là công nghệ mới được sử dụng trong nghiên cứu này để thu
nhận cao có các hoạt chất quý, có tác dụng chữa bệnh từ cây Lan kim tuyến. Trong
công nghệ lên men ứng dụng trong đề tài nghiên cứu này sẽ sử dụng chủng nấm
Saccharomyces cerevisiae để thu nhận cao thay cho công nghệ tách chiết truyền thống

14


y,
VN
U

bằng nước hoặc bằng cồn nhằm tăng hiệu quả tách chiết và tăng tính đa dạng các chất
có hoạt tính sinh học trong sản phẩm chiết xuất.

Nấm men là các lồi nấm đơn bào. Kích thước đường kính mỗi tế bào men chỉ
vào khoảng 1/100 mm. Chúng phân bố rộng rãi trong thiên nhiên, đặc biệt chúng có

arm
ac

nhiều ở vùng đất trồng nho và các nơi trồng hoa quả. Nhiều lồi nấm men có khả năng
lên men rượu bia. Từ lâu người ta đã biết sử dụng nấm men để sản xuất rượu bia. Nấm

Ph

men sinh sôi nhanh, tế bào lại chứa nhiều vitamin, acid amin không thay thế, hàm
lượng protein chiếm tới 50% trọng lượng khô của tế bào nên nhiều loại nấm men còn
được sử dụng để sản xuất protein. Ngồi ra nấm men cịn được sử dụng trong cơng

nd

nghệ sản xuất bánh mì. Tuy nhiên, cũng có nhiều loại nấm men có hại gây bệnh cho
người và gia s c, làm hư hại lương thực, thực phẩm.

ici
n

ea

Nấm men dùng trong sản xuất bia thường là các chủng thuộc
giống Saccharomyces. Chúng có khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng trong môi
trường nước mạch nha như các loại đường hoà tan, các hợp chất nitơ (các acid amin,
peptit), vitamin và các nguyên tố vi lượng…qua màng tế bào.

ed

Nấm men được sử dụng là chủng lên men nổi Sacchromyces cerevisiae.

M

Đặc điềm hình thái: Sacchromyces cerevisiae sinh trưởng và phát triển ở nhiệt độ

of

cao, lơ lửng trên bề mặt là chủ yếu, nhiệt độ lên men từ 10 – 25oC.
Môi trường nuôi cấy men Sacchromyces cerevisiae

ho
ol

Môi trường nuôi cấy Saccharomyces cerevisiae cụ thể như sau:
5g

 KH2PO4:

1g

 MgSO4.7H2O:

0,5 g

t@

Sc

 (NH4)2SO4:

 CaCl2.2H2O:

0,1 g

 NaCl:

0,1 g

 Glucoza:

30 g

 Cao nấm men:

Co

py

rig
h

1g

 Nước:

1000 g

Sau thời gian ni cấy ở 25-30oC trong ba tuần thì ly tâm 300 vòng/ph t để thu
sinh khối tế bào.
15


Quy trình chiết xuất cao

Cắt, nghiền nhỏ nguyên liệu

arm

ac

Nguyên liệu Lan kim tuyến tươi

y,
VN
U

Sinh khối tế bào thu được rửa 2 lần với đệm PBS, pH=7,5 trước khi sử dụng.

Ph

Bổ sung nước cất vào nguyên liệu theo tỉ lệ: 5 phần nước: 1 phần nguyên liệu

ea

nd

Bổ sung nấm men, đường vào hỗn hợp

ici
n

Đậy kín nắp bình lên men, lắc đều và để ở nhiệt độ phòng 5-7 ngày.

ed

Thỉnh thoảng lắc nhẹ và xả bớt khí.

of

M

Lọc lấy dịch lên men và đun đến lên 70 oC.

ho
ol

Ly tâm 10 000 vòng/phút, thời gian 10 phút.

Sc

Loại bỏ cặn ly tâm. Thu dịch ly tâm và cô thành cao.

phổ hấp thụ UV và phân tích HPLC.

Co

py

rig
h

t@

Chiết với methanol, định tính và định lượng bằng phương pháp đo

16

y,
VN
U

2.3.2. Phương pháp định tính
Sử dụng phổ hấp thụ UV (sử dụng thiết bị đo phổ hấp thụ là NanoDrop-1000
(USA)) để định tính các hoạt chất Quercetin, Acid ferulic và Isorhamnetin trong mẫu
cao Lan kim tuyến.

arm
ac

Quercetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 268 nm và 412 nm.
Isorhamnetin có đỉnh hấp thụ cực đại ở 265 nm và 375 nm.
Acid erulic có đỉnh hấp thụ cực đại ở 320 nm.

Ph

Kết quả định tính các hợp chất trong Lan kim tuyến theo phương pháp phổ hấp
thụ UV đã được công bố được trình bày tại các hình sau: [7,11,21,26,27].

Hình 2.1. Phổ hấp thụ của Quercetin

Co

py

rig
h

t@

Sc

ho
ol

of

M

ed

ici
n

ea

nd

Quercetin (Hình 2.1), Isorhamnetin (hình 2.2) và Acid ferulic (hình 2.3)

17


y,
VN
U
arm
ac

Ph

Hình 2.3. Phổ hấp thụ của Acid Ferulic

Co

py

rig
h

t@

Sc

ho
ol

of

M

ed

ici
n

ea

nd

Hình 2.2. Phổ hấp thụ của Isorhamnetin

18


y,
VN
U

2.3.3. Phương pháp định lượng
Định lượng các hợp chất Quercetin, Isorhamnetin và Axit ferulic trong cao Lan
kim tuyến bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với thiết bị HPLC Shimadzu.

ác pha động thường được sử dụng bao gồm sự kết hợp có thể trộn lẫn của nước

arm
ac

với dung mỗi hữu cơ khác nhau (phổ biến nhất là acetonitrile và methanol). Một số kỹ
thuật HPLC sử dụng dung môi không nước. Thành phần nước trong pha động có thể có
axit (axit formic, photphoric hay trifluoroacetic) hoặc muối để hỗ trợ sự phân tách các

Ph

thành phần mẫu. Thành phần pha động có thể được giữ cố định (rửa giải đẳng dịng)
hoặc thay đổi (rửa giải gradient) trong q trình phân tích sắc ký. Rửa giải đẳng dòng

nd

đặc biệt hiệu quả trong phân tách những thành phần mẫu không khác nhau nhiều về ái

ea

lực của chúng với pha động. Với rửa giải gradient thành phần của pha động được thay

ici
n

đổi từ thấp tới cao để tăng sức rủa giải. Sức rửa giải của pha động được phản ánh bằng
thời gian lưu của mẫu, sức rửa giải cao thì thời gian lưu của mẫu ngắn. Thời gian lưu

ed

của một chất là thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi chất đó ra khỏi cột đạt
giá trị cực đại cho píc trên sắc ký đồ. Thời gian lưu được đo trong những điều kiện đặc

M

trưng và được xem là đặc điểm nhận biệt của chất đem phân tích. Q trình sắc ký xảy

of

ra do các cơ chế: hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hoặc rây phân tử.

ho
ol

Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi và phổ biến vì nhiều lý do: có
độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ

Co

py

rig
h

t@

Sc

phân hủy nhiệt.

19


y,
VN
U

CHƯƠNG III. KẾT QUẢ

3.1. Kết quả định tính Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic

Phổ hấp thụ UV của mẫu cao Lan kim tuyến mà đề tài đã thực hiện được trình
bày tại hình 3.1.

arm
ac

Trong đó: Trục tung: absorbance: độ hấp thụ
Trục hồnh: wavelength: bước sóng

Ph

Kết quả trên hình 3.1, cho thấy trong cao lên men Lan kim tuyến có các đỉnh hấp

Hình 3.1. Phổ hấp thụ UV-Vis của mẫu cao lên men Lan kim tuyến

Co

py

rig
h

t@

Sc

ho
ol

of

M

ed

ici
n

ea

nd

thụ cực đại đặc trưng cho Quercetin, Isorhamnetin và Axit Ferulic.

20


y,
VN
U

3.2. Định lượng Quercetin, Isorhamnetin, Acid ferulic
3.2.1. Định lượng Quercetin, Isorhamnetin trong dịch chiết bằng HPLC
3.2.1.1. Điều kiện sắc ký
 Thiết bị: HPLC Shimadzu

arm
ac

 Cột Rp18; 250 x 4,6 mm; 5µm. Seri cột: H16-248657
 Bảo vệ cột: Rp18; 4 x 3 mm
 Nhiệt độ cột: 400C
 Detector: PDA, λ = 370 nm

Ph

 Tốc độ dịng: 1,5mL/phút
 Autosampler: 40C

nd

 Thể tích tiêm: 50 µL

ea

 Pha động: ACN : 0.5% phosphoric acid = 72:28 (%)

ici
n

3.2.1.2. Kiểm tra độ thích hợp của hệ thống

ed

Tiến hành sắc ký 6 lần trên cùng một dung dịch chuẩn có nồng độ Quercetin 6
µg/mL + Isorhamnetin 1 µg/mL theo điều kiện trên.

M

Kết quả được trình bày trong bảng 3.1:

of

Bảng 3.1. Kết quả sắc ký dung dịch chuẩn

ho
ol

Area

RT

Tailing factor

Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin Quercetin Isorhamnetin

t@

Sc

1989319
2996851
3988101
4989629
5993409
6982313
989937

rig
h

TB

159635
155802

158037
154855
155532
153933
156299

10.468
10.442
10.355
10.370
10.390
10.430
10.409

20.227
20.183
20.012
20.049
20.089
20.184
20.124

Co

py

Độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu < 1
Độ lệch chuẩn tương đối của đáp ứng < 2
=> chứng tỏ hệ thống có tính thích hợp cao

21

0.712
0.723
0.710
0.705
0.711
0.707
0.711

0.702
0.717
0.682
0.693
0.702
0.687
0.697


y,
VN
U

3.2.1.3. Định lượng Quercetin, Isorhamnetin
Cách pha đường chuẩn Quercetin:

Pha dãy dung dịch chuẩn Quercetin có nồng độ 1,5 – 15 µg/mL.
Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ.

arm

ac

Dựng phương trình hồi quy tuyến tính.

Ph

Hồ tan chính xác 25 mg chất chuẩn Quercetin vào bình định mức 50mL, hịa tan
và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ Quercetin
khoảng 500 µg/mL => thu được dd (1).

Cách pha đường chuẩn Isorhamnetin:

nd

Hút 1,2mL dd (1) hòa tan trong 20 mL MeOH (~ 30 µg/mL)(WS Quercetin)

ea

Pha dãy dung dịch chuẩn Isorhamnetin có nồng độ 0,2 – 2 µg/mL.

ici
n

Tiến hành sắc ký, lấy đáp ứng píc tại mỗi nồng độ.

ed

Dựng phương trình hồi quy tuyến tính.

Hồ tan chính xác 5 mg chất chuẩn Isorhamnetin vào bình định mức 10mL, hịa

of

M

tan và thêm vừa đủ thể tích bằng MeOH để thu được dung dịch có nồng độ
Isorhamnetin khoảng 1000 µg/mL => thu được dd (2)

ho
ol

Hút 1mL dd (2) hịa tan trong bình 25mL MeOH (40 µg/mL) => thu được dd (3)
Hút 1mL dd (3) hòa tan trong bình 10mL MeOH (4 µg/mL) (WS Isorhamnetin)

Sc

S1

S2

S3

S4

S5

t@

Bảng 3.2. Số liệu pha đường chuẩn

Nồng độ Quercetin (µg/mL)

1.5

3

6

12

15

Thể tích WS Quercetin (µL)

50

100

200

400

500

Nồng độ Isorhamnetin (µg/mL)

0.2

0.5

1.0

1.5

2.0

Thể tích WS Isorhamnetin (µL)

50

125

250

375

500

Thể tích MeOH (µL)

900

775

550

225

0

Co

py

rig
h

Mẫu

22


y,
VN
U

Bảng 3.3. Kết quả khảo sát mối tương quan giữa nồng độ và diện tích píc của
Quercetin
S1

S2

S3

S4

Nồng độ (µg/mL)

1.5

3

6

12

Area

225255

496074

978191

Phương trình hồi quy

Y = 132610.6333X – 21443.7500 (R2 = 0.9999)

S5
15

arm
ac

Mẫu

2483795

nd

Ph

1971054

2500000

ea

y = 132610.6333x - 21443.7500
R² = 0.9999

ici
n

1500000

ed

Area

2000000

5.000

10.000

15.000

20.000

Nồng độ (µg/mL)

Sc

ho
ol

0
0.000

of

500000

M

1000000

Co

py

rig
h

t@

Hình 3.2. Đường biểu diễn mối tương quan giữa diện tích píc và nồng độ
Quercetin

23