bài giảng môn công nghệ enzyme

Trường Cao Đẳng Kinh tế Công nghệ TPHCM
Khoa Công nghệ Sinh học
**************************








C
C
Ô
Ô
N
N
G
G


N
N
G
G
H
H
Ệ
Ệ

E
E
N
N
Z
Z
Y
Y
M
M
E
E


(Tài liệu lưu hành nội bộ)




CBDG: ThS. Lê Thanh Hải

HIAST
TPHCM, 03/2013


CÔNG NGHỆ ENZYME i

MỤC LỤC
1.

MỞ ĐẦU 1

1.1.

Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme 1

1.2.

Khái niệm về enzyme 2

1.2.1.

Bản chất sinh học của enzyme 3

1.2.2.

Bản chất hóa học của enzyme 4

1.2.3.

Cấu trúc của enzyme 5

1.3.

Cơ chế tác dụng của enzyme 7

1.3.1.

Cơ chế xúc tác của enzyme 7

1.3.2.

Năng lượng xúc tác 8

1.3.3.

Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất 8

1.3.4.

Động học của phản ứng enzyme 9

1.3.5.

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme 10

1.3.5.1.

Nhiệt độ 10

1.3.5.2.

pH 11

1.3.5.3.

Chất kìm hãm 11

1.3.5.4.

Chất hoạt hóa 12

1.3.6.

Tính chất đặc hiệu của enzyme 13

1.4.

Phân loại enzyme 13

1.4.1.

Danh pháp quốc tế của enzyme 13

1.4.2.

Phân loại enzyme 14

1.4.2.1.

Oxydoreductase 14

1.4.2.2.

Transpherase 14

1.4.2.3.

Hydrolase 15

1.4.2.4.

Lipase 15

1.4.2.5.

Isomerase 15

1.4.2.6.

Ligase 15

1.5.

Phương pháp tách và làm sạch enzyme 15

1.5.1.

Các phương pháp phá vỡ tế bào 15

1.5.2.

Phương pháp gây biến tính chọn lọc 16

1.6.

Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme 17

1.6.1.

Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của E 17

1.6.2.

Đơn vị hoạt độ 17

2.

KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME 18

2.1.

Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme 18

CÔNG NGHỆ ENZYME ii

2.2.

Kỹ thuật cơ bản 19

2.2.1.

Các phương pháp cơ học tách enzyme 19

2.2.2.

Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật 19

2.2.2.1.

Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học: 20

2.2.2.2.

Phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải cơ học: 20

2.2.2.3.

Các phương pháp cô đặc 21

2.2.2.4.

Các phương pháp tinh sạch enzyme 21

2.2.2.5.

Tạo sản phẩm enzyme 21

3.

ENZYME CỐ ĐỊNH 22

3.1.

Chuyển hóa sinh học 22

3.1.1.

Chuyển hóa vật chất do enzyme tự do hay enzyme hòa tan 22

3.1.2.

Chuyển hóa vật chất bằng enzyme không hòa tan 22

3.1.3.

Chuyển hóa vật chất do các quá trình lên men 23

3.1.4.

Chuyển hóa vật chất do tế bào cố định 23

3.2.

Đặc điểm của enzyme cố định 23

3.3.

Phương pháp tạo enzyme cố định 23

3.3.1.

Các yếu tố ảnh hưởng đến enzyme cố định 23

3.3.2.

Phương pháp cố định enzyme 25

3.3.2.1.

Chất mang dùng để cố định enzyme 25

3.3.2.2.

Phương pháp cố định enzyme 25

3.4.

Ứng dụng của enzyme cố định 26

3.4.1.

Sản xuất fructose nhờ enzyme glucose isomerase 27

3.4.2.

Sản xuất L-amino acid nhờ enzyme aminoacylase cố định 28

4.

THU NHẬN ENZYME 28

4.1.

Chọn nguồn nguyên liệu 28

4.2.

Thu nhận enzyme 31

5.

ỨNG DỤNG CỦA ENZYME 32

5.1.

Tình hình ứng dụng enzyme trong công nghiệp trên thế giới 32

5.2.

Ứng dụng trong y học 34

5.3.

Ứng dụng trong hóa học 34

5.4.

Ứng dụng trong công nghiệp 34

5.4.1.

Ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm 34

5.4.2.

Ứng dụng trong công nghiệp dệt 36

5.4.3.

Ứng dụng trong công nghiệp thuộc da 36

5.5.

Ứng dụng trong nông nghiệp 36

TÀI LIỆU THAM KHẢO 36


CÔNG NGHỆ ENZYME 1

1. MỞ ĐẦU
1.1. Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme
Enzyme học là môn học nghiên cứu về vật chất phân tử có hoạt tính sinh học. Môn học này phát triển rất
mạnh nhờ những thành tựu của môn hóa sinh học, vi sinh vật học, di truyền học và cả những tiến bộ của
ngành hóa học và vật lý học.

Bảng 1.1. Những cột mốc quan trọng trong nghiên cứu và phát triển môn enzyme học[2]
STT Năm Nội dung nghiên cứu, phát triển
1
1833 Payen và Persoz tách được diastase từ malt
2
1874 Hansen là người đầu tiên tách được rennet từ bao tử cừu
3
1876 Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học là enzyme
4
1897
Hai anh em nhà Buchner chứng minh dịch chiết từ nấm men có thể chuyển hóa
đường glucose thành cồn và CO
2

5
1900 Rohm sử dụng enzyme protease trong công nghệ thuộc da
6
1913 Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa
7
1917
Boidin và Effront nghiên cứu α-amylase của B.subtilis và ứng dụng trong ngành
dệt
8
1920 – 1928 Will Slitter tinh sạch được enyzme
9
1926
Samner kết tinh được enyme urease
Northrop kết tinh được protease
10
1928 Fleming phát hiện ra penicilline

11
Thế chiến II
Bắt đầu sản xuất kháng sinh theo mô hình công nghiệp, sử dụng amyloglucosidase
đường hóa tinh bột. Sử dụng penicillineacylase trong sản xuất penicilline
12
1969
Tanabec co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid. Sử dụng
glucose isomerase trong sản xuất dịch đường giàu fructose
CÔNG NGHỆ ENZYME 2

13
1972
Boyer et al. đưa ra kỹ thuật di truyền. Kỹ thuật này có tác động tích cực trong
công nghệ enzyme
14
1973
Tanobe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bào
Winter và Ferch đưa ra công nghệ sản xuất protein
15
1984
Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acrylamide và một loại quá trình sản xuất có sự
tham gia của enzyme
16
1984 - nay
Đã phát hiện hàng trăm loại enzyme khác nhau, đưa vào sản xuất công nghiệp và
ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống. kỹ thuật enzyme cố định, tế
bào cố định đã đưa công nghệ enzyme đạt được nhiều kết quả cao
Diastase: là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân tinh bột thành maltose. Diastase là enzyme đầu tiên
được phát hiện ra. Nó được chiết tách từ malt vào năm 1833 bởi Anselme Payen và Jean-Francois Persoz
– nhà Hóa học tại nhà máy đường của Pháp. Tên “diastase” xuất phát từ tiếng Hy Lạp (diastasis), trong

dịch nha nóng, các enzyme này thủy phân tinh bột trong hạt đại mạch thành các đường hòa tan và vì thế
có thể tách phần bỏ malt với phần còn lại của hạt. Ngày nay, diastase là α, β hoặc γ-amylase.
Rennet là enzyme được sản xuất trong dạ dày của động vật có vú khi còn trong giai đoạn bú sữa mẹ và
thường được sử dụng để làm phomai. Rennet là một hỗn hợp enzyme, bao gồm: các enzyme thủy phân
protein (protease) gây đông tụ sữa, có thể tách phần sữa đông (phần chất rắn) và phần huyết thanh sữa
(phần chất lỏng). Những enzyme hoạt động trong dạ dày bê được gọi là chymosin hoặc rennin. Ngoài ra,
cũng có những enzyme quan trọng khác như: pepsin và lipase.
Protease: (còn gọi là peptidase hoặc proteinase) là enzyme thủy phân protein
α
αα
α
-amylase là enzyme thủy phân liên kết alpha của phân tử polysaccharide như tinh bột và glycogen thành
glucose và maltose. Alpha amylase được tìm thấy chủ yếu ở người và động vật có vú khác, ngoài ra,
chúng còn có mặt trong các loại hạt có chứa tinh bột và được tiết ra bởi một số loại nấm.
Urease: là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân ure thành carbon dioxide (CO
2
) và amoniac (NH
3
), hiện
diện trong vi khuẩn đường ruột. Urease được tìm thấy trong vi khuẩn, nấm men và thực vật.
1.2. Khái niệm về enzyme
Sinh vật được phân ra 2 nhóm dựa vào cấu tạo cơ thể của chúng: sinh vật đơn bào và sinh vật đa bào. Mặc
dù chúng có sự khác biệt rất lớn về cấu tạo cơ thể và những đặc điểm sinh lý khác nhau nhưng chúng đều
giống nhau về trao đổi chất với môi trường bên ngoài và một số đặc điểm về biến dị di truyền.
Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá trình trao đổi chất của cơ thể ở
trong tế bào và giữa tế bào với môi trường ngoài. Quá trình trao đổi chất bên trong tế bào và giữa tế bào
với môi trường bên ngoài là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Sự khác nhau giữa tế bào sống và vật
chất không phải sự sống chính là khả năng trao đổi chất này. Khi cơ thể không còn khả năng trao đổi chất
thì cơ thể sẽ chết. Do đó mối quan hệ giữ cơ thể với bên ngoài là mối quan hệ hữu cơ.
Quá trình trao đổi chất bao gồm quá trình dị hóa và quá trình đồng hóa. Quá trình dị hóa là quá trình phân

giải vật chất để cung cấp cho tế bào năng lượng và vật liệu xây dựng tế bào, quá trình này có thể xảy ra
trong tế bào hoặc ngoài tế bào.
Quá trình di hóa xảy ra trong tế bào là quá trình cung cấp năng lượng, vật chất cho quá trình tổng hợp vật
chất để tạo ra sinh khối nhằm làm đổi mới vật chất tế bào.
Quá trình dị hóa ngoài tế bào phần lớn chỉ đáp ứng như cầu về vật chất, giúp cho tế bào tổng hợp các
chất trong tế bào. Năng lượng tạo ra từ quá trình dị hóa ngoài tế bào thường được giải phóng ở dạng nhiệt
năng.
CÔNG NGHỆ ENZYME


Quá trình tổng hợp vật chấ
t cho t
lượng từ các phản ứ
ng do quá trình d
của sinh vật đối với môi trườ
ng xung quanh.
Hình
Sản phẩm của quá trình trao đổ
i ch
 Sản phẩm bậc 1
 Sản phẩm bậc 2
Sản phẩm bậc 1: là các sản phẩ
m đư
Các sản phẩm này sẽ đượ
c tham gia tr
Sản phẩm bậc 2: là các sản phẩ
m c
bào. Trong quá trình tổng hợ
p, m
theo mà sẽ thoát ra khỏi tế

bào. Hi
sinh tổng hợp thừa
có liên quan ch
truyền, nhiều khi điều chỉnh hệ
gen s
chất được tạ
o ra do quá trình phân gi
(quá trình dị hóa ngoài tế
bào). M
dị hóa trong tế bào)
Quá trình trao đổi chất liên tụ
c đư
chấ
t trong thiên nhiên. Quá trình chuy
nhiều chu trình chuyể
n hóa các ch
không chỉ ở trong tế bào sinh vậ
t mà c
này được xúc tác bởi một loạ
i protein đ
bào được gọi là enzyme ngoạ
i bào. Các enzyme th
nội bào và enzyne ngoại bào đề
u đư
1.2.1. Bản chất sinh học củ
a enzyme
Nhiều nhà khoa học đã nghiên c
ứ
sinh vật sống tổng hợ
p nên và tham gia vào cá

Như vậy, bản chất sinh học củ
a enzyme là s
sinh hóa trong và ngoài tế
bào sinh v
 Enzyme được tạo ra trong t
ế
tạp và được điều khiển, kiể
m soát r
 Enzyme tham gia phản ứ
ng c
 Enzyme tham gia phản ứ
ng trong đi
enzyme được tổng hợ
p và ho
độ của cơ thể và của tế
bào sinh v
động trong khoảng 30 - 40
o
C

t cho t
ế bào chỉ xảy ra trong tế bào. Quá trình này th
ư
ng do quá trình d
ị hóa. Như vậy, quá trình trao đổi chất đượ
c xem như h
ng xung quanh.

Hình
1.1. Hệ thống mở của tế bào sinh vật

i ch
ất tạo ra 2 dạng sản phẩm:
m đư
ợc tạo ra cả trong quá trình phân giải và cả
trong quá trình t
c tham gia tr
ực tiếp nên vật chất tế
bào và tham gia các các quá trình t
m c
ũng được tạo ra từ quá trình tổng hợp và
quá trình phân gi
p, m
ột số vật chất được tạ
o ra không tham gia vào quá trình trao
bào. Hi
ện tượng này được coi như quá trình sinh tổ
ng h
có liên quan ch
ặt chẽ đến hệ di truyền có trong tế
bào. Do đó, vi
gen s
ẽ thu được lượng lớn các sản phẩm sinh tổ
ng h
o ra do quá trình phân gi
ải sẽ không tham gia vào quá trình trao đổ
i ch
bào). M
ột số vật chất khác thoát ra khỏi tế
bào vào môi trư
c đư

ợc xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự

t trong thiên nhiên. Quá trình chuy
ển hóa theo con đường sinh vật đóng vai tr
ò r
n hóa các ch
ất có trong thiên nhiên. Các phản ứng sinh h
ọ
t mà c
ả ở ngoài môi trường, bao quanh tế
bào đó. Các ph
i protein đ
ặc biệt gọ
i là enzyme. Các enzyme tham gia các ph
i bào. Các enzyme th
ực hiện trong tế bào gọ
i là enzym
u đư
ợc tổng hợp trong tế bào.
a enzyme

ứ
u về enzyme và đã đi đến thống nhất:
enzyme là m
p nên và tham gia vào cá
c phản ứng sinh học
a enzyme là s
ản phẩm của các quá trình sinh họ
c và th
bào sinh v

ật. Các loại enzyme đều có những đặ
c tính chung như sau:
ế
bào sinh vật: quá trình tổng hợp enzyme là mộ
t quá trình h
m soát r
ất chặt chẽ
ng c
ả trong tế bào sống và cả khi enzyme đượ
c tách kh
ng trong đi
ều kiện nhiệt độ ôn hòa. V
ì trong quá trình s
p và ho
ạt động trong điều kiện nhiệt độ của tế
bào và nhi
bào sinh v
ật thường là nhiệt độ thấp. Phần lớn nhiệ
t đ
C

3
ư
ờng phải thu nhận năng
c xem như h
ệ thống mở

trong quá trình t
ổng hợp.
bào và tham gia các các quá trình t

ế bào.
quá trình phân gi
ải của tế
o ra không tham gia vào quá trình trao
đổi chất tiếp
ng h
ợp thừa. Hiện tượng
bào. Do đó, vi
ệc điều chỉnh hệ di
ng h
ợp thừa. Môi số vật
i ch
ất nằm ở ngoài tế bào
bào vào môi trư
ờng (quá trình trình

biến đổi liên tục của vật
ò r
ất quan trọng trong rất
ọ
c xảy ra thường xuyên
bào đó. Các ph
ản ứng sinh học
i là enzyme. Các enzyme tham gia các ph
ản ứng ngoài tế
i là enzym
e nội bào. Cả enzyme
enzyme là m
ột loại protein được
c và th

ực hiện các phản ứng
c tính chung như sau:

t quá trình h
ết sức phức
c tách kh
ỏi tế bào sống
ì trong quá trình s
ống của tế bào,
bào và nhi
ệt độ của cơ thể. Nhiệt
t đ
ộ cơ thể sinh vật dao
CÔNG NGHỆ ENZYME 4

 Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giai đoạn đầu đến giai đoạn
giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học. Quá trình chuyển hóa này được
thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme. Các enzyme này lần
lượt thay thế nhau xúc tác để các phản ứng lần lượt xảy ra, để cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số
chất khác và giải phóng năng lượng. Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành chu kỳ chuyển hóa
khép kín. Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứng trước
sẽ là cơ chất cho phản ứng sau
 Enzyme có thể thực hiện một phản ứng: Các phản ứng thường xảy ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện
chúng trong ống nghiệm). Trong tế bào thường không xảy ra phản ứng enzyme đơn (một phản ứng)
mà thường xảy ra các phản ứng theo chuỗi phản ứng.
 Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít. Trong khi đó, các phản ứng hóa học
được xúc tác vởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi năng lượng rất lớn. Nhờ có hoạt động xúc tác của
enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trong điều kiện năng lượng ôn hòa.
 Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng. Gen quyết định tổng hợp ra một loại
enzyme. Mỗi một enzyme quyết định một phản ứng sinh hóa. Các nhà khoa học đưa ra cơ chế sau:

Một gen => một enzyme => một phản ứng
Như vậy, gen quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của enzyme. Cơ chế này có một ý
nghĩa rất lớn trong việc điều khiển tổng hợp enzyme trong tế bào sinh vật.
1.2.2. Bản chất hóa học của enzyme
Nếu tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học của chúng, ta sẽ thấy chúng
thuộc 2 nhóm:
1. Nhóm enzyme đơn cấu tử:
Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóa học duy nhất là protein.
Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi là enzyme đơn cấu tử
2. Nhóm enzyme đa cấu tử
Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có 2 thành phần:
 Apoprotein hay apoenzyme: Phần protein thuần
 Agon: Phần thứ 2 là thành phần không phải protein. Phần này thường là những chất hữu cơ đặc hiệu
có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác.
Ở những enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trò xúc tác nhưng nếu thiếu thành phần thứ hai
(các chất hữu có đặc hiệu) thì enzyme không thể hoạt động được. Chính vì thế, chất hữu cơ đặc hiệu này
còn được gọi là chất cộng tác (cofactor).
Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein, cũng có thể gắn rất lỏng với phần
protein. Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành thẩm tích qua màng. Ở đây xảy ra 2 hiện tượng:
 Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt với protein bằng liên kết đồng hóa trị được gọi là nhóm phụ
(prosthetic)
 Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ dàng tách chúng ra khỏi protein được
gọi là coenzyme
Tuy nhiên, sự phân biệt này chỉ mang tính chất tương đối. Ngoài ra các nhà khoa học cũng cho thấy,
trong thành phần của những enzyme có sự hiện diện của một số kim loại. Các kim loại này thường là một
trong những thành phần của chất hữu cơ đặc hiệu
Ví dụ: trong hệ enzyme cytochrome, catalase, peroxydase, sắt (Fe) gắn chặt với nhân porphyrin.
Các kim loại có trong thành phần của enzyme thường rất dễ tách ra khỏi enzyme. Trong trường hợp
enzyme mất kim loại, chúng sẽ mất hoạt tính. Khi ta đưa các kim loại tương ứng vào các enzyme, hoạt
tính enzyme lại được khôi phục. Tính chất này mang tính chất thuận nghịch. Vai trò của kim loại trong

hoạt động của enzyme vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cũng cho rằng, có thể kim
loại đóng vai trò liên kết giữa enzyme và cơ chất, liên kết giữa apoenzyme và coenzyme, tham gia trực
tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và peroxydase.
CÔNG NGHỆ ENZYME 5

Bảng 1.2. Một số enzyme có chứa kim loại [2]
STT Enzyme Kim loại
1
Hệ cytochrome, catalase, peroxydase Sắt (Fe)
2
Polyphenoloxydase Đồng (Cu)
3
Carbonic anhydrase Kẽm (Zn)
4
Peptidase
Mangan (Mn), Sắt (Fe),
Magie (Mg)
5
Phosphatase Magie (Mg)
6
Arginase Mangan (Mn)
1.2.3. Cấu trúc của enzyme
Enzyme là protein đặc biệt. Ngoài cấu trúc giống như cấu trúc bình thường của một protein, enzyme còn
có cấu trúc rất đặc biệt liên quan đến hoạt động của enzyme. Không phải toàn bộ các phần của enzyme
đều tham gia vào hoạt động xúc tác, mà chỉ có những bộ phận rất đặc biệt mang tính đặc hiệu trong phân
tử protein mới tham gia xúc tác phản ứng. Bộ phận đặc hiệu này được gọi là trung tâm hoạt động của
enzyme
Trung tâm hoạt động của enzyme bao gồm:
 Những nhóm hóa học, những liên kết peptide tiếp xúc trực tiếp với cơ chất.
 Những nhóm hóa học, những liên kết peptide không tiếp xúc trực tiếp với cơ chất nhưng có chức

năng trực tiếp trong quá trình xúc tác
Phần còn lại đóng vai trò như một cái khung, giữ cho cấu trúc không gian thích hợp với khả năng xúc tác.
Nếu bị tác động bởi các điều kiện bên ngoài như nhiệt độ, pH, nồng độ các chất, bộ khung này sẽ biến đổi
cấu trúc không gian. Từ đó làm thay đổi sâu sắc hoạt tính enzyme.
Phần của phân tử enzyme không có liên quan đến hoạt tính enzyme, nếu bị tác động, bị mất đi hoặc bị
biến đổi sẽ hoàn toàn không ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme
Trung tâm hoạt động của enzyme thường chứa các amino acid có nhóm hóa học hoạt động mạnh như
amino acid serine, histidine, cysteine, lysine, arginine, glutamic acid, aspartic acid, tryptophan. Các nhóm
hóa học này hoạt động có khả năng gắn với cơ chất để tạo thành phức chất enzyme - cơ chất. Những
nhóm hóa học hoạt động mạnh bao gồm:
 Nhóm NH
2
của lysine
 Nhóm -SH của cysteine
 Nhóm γ-carboxyl của glutamic acid
Các gốc amino acid tạo ra trung tâm hoạt động của enzyme thường không nằm cạnh nhau trong chuỗi
polypeptide thẳng (cấu trúc bậc 1). Trong thực tế, chuỗi popypeptide của enzyme tồn tại ở trạng thái
không gian (cấu trúc bậc 3, bậc 4) nên các amino acid thường tồn tại gần nhau theo cấu trúc không gian.
Do cấu trúc không gian như vậy, trung tâm hoạt động được tạo thành.
Trong trung tâm hoạt động của enzyme người ta còn thấy có ion kim loại. Các ion kim loại có mặt trong
trung tâm hoạt động của enyzme có vai trò xúc tác rất lớn.
Ngoài các gốc amino acid, ion kim loại, các nhà khoa học còn cho thấy các nhóm chức của coenzyme
cũng được coi như một phần cấu tạo của trung tâm hoạt động của enzyme.
CÔNG NGHỆ ENZYME 6

Mỗi một enzyme thường có 1 trung tâm hoạt động. Tuy nhiên cũng có enzyme có 2 trung tâm hoạt động
(alcohol hydrogenase của gan), thậm chí có enzyme có tới 4 trung tâm hoạt động (alcohol dehydrogenase
của nấm men)
Hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động có liên quan tới cơ chất. Các nhà khoa học khi nghiên cứu vấn
đề này đã đưa ra 3 quan điểm quan trọng:

1. Chỉ những cơ chất có cấu trúc phân tử thích hợp với trung tâm hoạt động của enzyme mới có thể
kết hợp được với trung tâm hoạt động của enzyme để tạo thành phức hợp enzyme-cơ chất.
Theo quan điểm này, cơ chất có cấu trúc phân tử trùng với trung tâm hoạt động là hiện tượng kết hợp rất
chặt chẽ và mang tính đặc hiệu cao. Chính vì thế, mỗi loại enzyme chỉ có thể tham gia xúc tác phản ứng
cho một loại cơ chất nhất định.
2. Các loại enzyme thường tạo ra trung tâm hoạt động có cấu trúc không gian nhất định.
Các trung tâm hoạt động thường được hình thành sẵn ở các enzyme. Chính những trung tâm hoạt động
của enzyme quyết định cho phép những cơ chất cấu trúc tương ứng với trung tâm hoạt động mới được kết
hợp vào. Quan điểm này do Fisher đề xướng. Thuyết của Fisher tuy đã giải thích được các hiện tượng gắn
kết giữa cơ chất và trung tâm hoạt động của enzyme nhưng nhiều kết quả thực nghiệm, thuyết này chưa
giải thích được trọn vẹn
3. Thuyết trung tâm hoạt động linh hoạt của Koshland được nhiều nhà khoa học chấp nhận hơn.
Theo thuyết này, các nhóm chức của trung tâm hoạt động của enzyme tự do chưa có thể tham gia xúc tác
ngay. Chính cơ chất là tác nhân tác động làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của
enzyme. Chính tác động cảm ứng này của cơ chất làm cho các gốc amino acid, các nhóm chức của trung
tâm hoạt động di chuyển, định hướng một cách thích hợp, chính xác để gắn cơ chất vào trung tâm hoạt
động và thực hiện quá trình xúc tác.
Như vây, Koshland cho rằng trung tâm hoạt động của enzyme chỉ được tạo thành khi có sự tác động cảm
ứng của cơ chất. Chính cơ chế mềm dẻo này của trung tâm hoạt động đã giải thích được sự cạnh tranh
giữa cơ chất và các chất không phải cơ chất nhưng lại có cấu trúc không gian giống cơ chất. Khi đó, các
chất giống cơ chất chiếm chỗ trong trung tâm hoạt động của enzyme và phản ứng cơ chất không xảy ra.

Hình 1.2. Mô hình của Fisher giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất
CÔNG NGHỆ ENZYME 7


Hình 1.3. Mô hình của Kosland giải thích cơ chế tác động của enzyme với cơ chất
1.3. Cơ chế tác dụng của enzyme
1.3.1. Cơ chế xúc tác của enzyme
Mọi vi sinh vật đều được cấu tạo từ tế bào. Các tế bào luôn luôn tiến hành quá trình trao đổi chất với môi

trường bên ngoài bằng những phản ứng sinh hóa. Các phản ứng xảy ra luôn luôn được xúc tác bởi các
enzyme của tế bào. Như vậy, enzyme đóng vai trò rất quan trọng trong sinh lý của tế bào. Tác động của
enzyme vào các phản ứng sinh hóa mang 2 ý nghĩa đối với tế bào:
1. Làm giảm năng lượng hoạt hóa phản ứng
Tất cả các phản ứng sinh hóa trong tế bào sinh vật đều được thực hiện trong điều kiện ôn hòa, trùng với
nhiệt độ của cơ thể. Các phản ứng enzyme thường không đòi hỏi nhiệt độ cao, do đó nó đảm bảo cho mọi
hoạt động sinh lý bình thường của tế bào. Trong khi đó, năng lượng chi phí cho những phản ứng hóa học
thường rất cao.
Đặc điểm làm giảm năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme có ý nghĩa rất lớn trong sinh lý của sinh
vật. Đặc điểm này gắn liền với quá trình tiến hóa của sinh vật, nếu nhiệt độ cơ thể tăng sẽ lảm rối loạn
toàn bộ quá trình sinh lý của tế bào. Khi đó cơ thể sẽ chuyển từ trạng thái sinh lý bình thường sang trạng
thái bệnh lý. Cơ thể ở trạng thái bệnh lý là kết quả của sự rối loạn các phản ứng enzyme. Chính vì thế,
việc duy trì trạng thái sinh lý bình thường của tế bào hay của cơ thể đồng nghĩa với việc duy trì hoạt động
hài hòa của các phản ứng enzyme
2. Enzyme tham gia vào các phản ứng sinh hóa thường làm tăng tốc độ phản ứng
Tốc độ phản ứng tăng sẽ làm tăng mức độ chuyển hóa cơ chất. Như vậy quá trình trao đổi chất của tế bào
sẽ tăng. Kết quả là tế bào sẽ tăng nhanh về số lượng và khối lượng. Như vậy, enzyme không chỉ đóng vai
trò duy trì trạng thái sinh lý của tế bào mà còn đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển và sinh sản của
tế bào, duy trì sự chuyển hóa vật chất trong các chu trình chuyển hóa trong thiên nhiên. Nhờ có hoạt động
của enzyme mà khối lượng cơ chất được chuyển hóa trong một đơn vị thời gian trong tế bào lớn gấp hàng
ngàn lần khối lượng tế bào.
Bản chất của các phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của các enzyme, các cơ chất sẽ được
hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản
phẩm của phản ứng. Dưới tác dụng của enzyme, cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc
hóa học, mà còn thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu, nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ
enzyme – cơ chất. Phức hệ này thường không bền. Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy
ra rất nhanh và đòi hỏi ít năng lượng.
Giai đoạn thứ hai: khi cơ chất tạo phức với enzyme sẽ bị thay đổi cả cấu hình không gian, cả về mức độ
bền vững của các liên kết. Kết quả là các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm

Giai đoạn thứ ba: Đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm quá trình phản ứng được tạo thành và tách ra
khỏi enzyme
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme:

Trong đó: E – enzyme (enzyme) S – Cơ chất (substrate) P – Sản phẩm (products)
E + S ES E + P
CÔNG NGHỆ ENZYME 8


Hình 1.4. Cơ chế xúc tác của enzyme
1.3.2. Năng lượng xúc tác
Enzyme tham gia hầu hết các phản ứng sinh hóa trong cơ thể sống. Nhờ hoạt động xúc tác của enzyme,
các tế bào có thể chuyển hóa lượng cơ chất rất lớn. Enzyme sử dụng nguồn năng lượng nào và sử dụng
năng lượng bằng cách nào để tiến hành quá trình xúc tác mà khả năng xúc tác lại lớn như vậy?
Các nhà khoa học đưa ra 2 cách sử dụng năng lượng liên kết để tiến hành quá trình xúc tác:
Thứ nhất: enzyme sử dụng năng lượng liên kết để làm giảm năng lượng hoạt hóa. Năng lượng này được
giải phóng trong quá trình hình thành liên kết yếu trong tương tác qua lại giữa enzyme và cơ chất.
Thứ hai: enzyme sử dụng năng lượng liên kết tạo phản ứng xúc tác đặc hiệu thông qua cơ chế sau:
 Giảm entropy: enzyme và cơ chất luôn ở trạng thái chuyển động trong dung dịch lỏng. Nếu không có
năng lượng liên kết, enzyme sẽ rất khó định hướng tác động lên cơ chất, giữ cơ chất và định hướng
phản ứng.
 Làm mất vỏ nước bao quanh: nhờ tương tác yếu giữa enzyme và cơ chất có khả năng làm giảm toàn
bộ liên kết hydrogen tồn tại giữa cơ chất và nước bao quanh
 Năng lượng liên kết do các tương tác yếu tạo ra ở trạng thái chuyển tiếp được sử dụng làm căng hoặc
uốn khúc cơ chất, tạo điều kiện cho enzyme xúc tác phản ứng dễ dàng
 Năng lượng liên kết tạo ra cấu hình không gian của enzyme sao cho phù hợp với cấu hình không gian
của cơ chất
1.3.3. Sự tạo thành phức hợp enzyme – cơ chất
Brown và Henri là những nhà khoa học đầu tiên đưa ra thuyết “phức hợp trung gian”. Sau đó, Michaelis
và Menten phát triển thêm.

Theo thuyết này, enzyme sẽ kết hợp với cơ chất, tạo ra một phức hợp không gian giữa enzyme và cơ chất.
Do tác dụng của enzyme, cơ chất bị biến đổi mạnh và cuối cùng tạo ra sản phẩm. Sự tạo thành phức hợp
enzyme - cơ chất thường xảy ra rất nhanh và về bản chất thì phức hợp này hoàn toàn không bền vững.
Các tính chất này của phức hợp enzyme và cơ chất phụ thuộc rất nhiều ở bản chất hóa học của cơ chất
Để tạo thành phức hợp enzyme - cơ chất có đến năm loại liên kết tham gia. Các liên kết này có đặc tính
riêng và năng lượng liên kết khác nhau. Các liên kết này bao gồm: liên kết phối trí, liên kết hydrogen, liên
kết ion, liên kết kị nước lực Van der Waals và liên kết do chuyển dịch điện tích
Enzyme là những phần tử protein có phân tử lượng lớn. Trên bề mặt của phân tử enzyme tồn tại rất nhiều
nhóm hóa học đặc hiệu. Các nhóm chức này đóng vai trò quan trọng trong định hướng và giúp cơ chất
enzyme tiếp cận với nhau. Khi enzyme và cơ chất tương tác với nhau thường tạo ra liên kết yếu, tạo ra
năng lượng kết hợp . Năng lượng được tạo ở từng liên kết yếu này thường nhỏ, nhưng có nhiều năng
lượng liên kết nên tổng năng lượng trong phản ứng enzyme là rất lớn.
Enzyme sẽ sử dụng nguồn năng lượng này để làm giảm năng lượng trong phản ứng enzyme. Năng lượng
giảm trong phản ứng enzyme được chuyển qua hệ thống các chất tham gia phản ứng. Lượng năng lượng
giảm trong quá trình hoạt hóa phải bằng lượng năng lượng các chất tham gia phản ứng nhận được.
CÔNG NGHỆ ENZYME 9

Theo ý kiến của các nhà khoa học, đầu tiên cơ chất phải được hoạt hóa để chuyển sang trạng thái chuyển
tiếp tạm thời để tương tác với cơ chất tạo nên phức enzyme – cơ chất (ES). Sau đó phức hợp này lại được
hoạt hóa để chuyển thành trạng thái chuyển tiếp tạm thời sang phức hợp EP (P là sản phẩm). Sau đó phức
hợp EP lại chuyển sang trạng thái tạm thời khác để tạo thành P và giải phóng E tự do. Năng lượng của sản
phẩm sẽ thấp hơn mức năng lượng của cơ chất ban đầu. Toàn bộ quá trình phản ứng được diễn giải chính
thức như sau
E + S => ES => EP => E + P
Năng lượng cần thiết để làm giảm năng lượng hoạt hóa quá trình xúc tác, đồng thời cũng tạo ra tính đặc
hiệu cho phân tử enzyme. Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng nhận biết, chọn lọc cơ chất để tiến hành
các phản ứng riêng theo bản chất từng loại enzyme.
1.3.4. Động học của phản ứng enzyme
Năm 1913 hai nhà khoa học Michaelis và Menten đưa ra mô hình động học để giải thích phản ứng được
xúc tác bởi enzyme và lập phương trình phản ánh quan hệ giữa vận tốc phản ứng với nồng độ cơ chất và

enzyme. Theo mô hình này, enzyme và cơ chất sẽ kết hợp với nhau, tạo nên phức hợp enzyme – cơ chất
(ES). Phức hợp ES sẽ lại được chuyển hóa tiếp tục để tạo thành sản phẩm (P) và giải phóng enzyme (E).
Enzyme được giải phóng lại thực hiện những phản ứng mới.
Hai nhà khoa học trên đã đưa ra mô hình chuyển hóa trong phản ứng enzyme với một cơ chất duy nhất
như sau:

Trong đó: k
1
, k
2
, k
3
, k
4
: là hằng số vận tốc của các phản ứng tương ứng.
Khi nghiên cứu động học phản ứng enzyme, người ta thường xác định vận tốc ban đầu của phản ứng khi
 Lượng sản phẩm P tạo thành chưa đáng kể nên K4 là hằng số vận tốc phản ứng tạo ES từ P và E nhỏ
nhất và xấp xỉ bằng 0.
 Đồng thời nồng độ cơ chất rất lớn so với nồng độ enzyme tổng [E
o
]. Ngoài ra, phản ứng chuyển hóa
từ ES thành E + P là phản ứng quan trọng nhất, quyết định toàn bộ quá trình chuyển hóa S thành P.
Vận tốc phản ứng ES thành P + E tỷ lệ với nồng độ ES, khi nồng độ ES càng cao thì vận tốc phản ứng
càng cao nên:
V
i
= k
3
[ES] (1)
Giả sử nồng độ enzyme ban đầu được kí hiệu là [Eo], nồng độ phức enzyme – cơ chất là [ES], nồng độ

enzyme tự do khi phản ứng đạt được điểm cân bằng là [E]. Ta sẽ có:
[E] = [Eo] – [ES] (2)
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng enzyme sẽ phụ thuộc tuyến
tính với nồng độ cơ chất. Ta có thể tính được vận tốc phản ứng trong trường hợp sau:
Vận tốc phản ứng thuận: V
1
= k
1
[E][S] (3)
Vận tốc phản ứng nghịch: V
2
= k
2
[ES] (4)
Vận tốc phản ứng tạo ra sản phẩm: V
3
= k
3
[ES] (5)
Trong giai đoạn cân bằng, sự phân ly ES sẽ cân bằng với sự tạo ra ES. Khi đó vận tốc phản ứng sẽ là:
V1 = V2 + V3 (6)
Thay (2, 3, 4, 5) vào (6) ta được:
k
1
([Eo] – [ES])[S] = (k
2
+ k
3
)[ES] (7)
Từ đó ta có: [ES] = k

1
[Eo][S]/(k
1
[S] + [k
2
+ k
3
]) (8)
Nếu chia 2 vế cho k1, thay (k2 + k3)/k1 = km (hằng số michaelis – menten) ta sẽ có:
[ES] = [Eo][S]/(k
m
+ [S]) (9)
k
4

k
2

k
1

k
3

E + S ES E + P
CÔNG NGHỆ ENZYME 10

Khi [S] >> [Eo] tất cả enzyme đều tham gia tạo phức ES và vận tốc phản ứng Vi sẽ đạt cực đại (Vmax),
ta có [ES] = [Eo]
Vận tốc cực đại: V

max
= k
3
[Eo] (10)
Có thể viết:
V
i
/V
max
= [ES]/[Eo] = 1/(1+k
m
/[S]) (11)
Phương trình Michaelis – Menten
V
i
= V
max
[S]/(k
m
+ [S]) (12)

Hình 1.5. Phương trình Michaelis Menten
 Nếu [S]<<km: ở nồng độ cơ chất thấp, V phụ thuộc tuyến tính vào [S]
 Nếu [S]>>km: vận tốc phản ứng đạt cực đại, không phụ thuộc vào [S]. Như vậy [S] đã đủ lớn đến
mức nào đó, nếu tiếp tục tăng [S], V cũng không tăng theo
 Nếu [S] = km; vận tốc phản ứng bằng ½ vận tốc cực đại
Người ta dễ dàng xác định được km và Vmax bằng cách nghịch đảo cả 2 vế của phương trình michaelis –
menten:
1/V
i

= (k
m
+ [S])/(V
max
[S]) (13)
Phương trình này là phương trình tuyến tính có dạng y = ax + b
Nếu vẽ đồ thị, đường thẳng sẽ cắt trục tung ở 1/Vmax và cắt trục hoành ở -1/km và độ nghiêng bằng
km/Vmax

Hình 1.6. Phương trình nghịch đảo của Michaelis Menten
Từ phương trình trên, ta dễ dàng xác định được vị trí Vmax, km trong thí nghiệm xác định tốc độ Vi của
phản ứng enzyme với nồng độ cơ chất ban đầu khác nhau.
1.3.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng enzyme
1.3.5.1. Nhiệt độ
Nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến phản ứng enzyme. Tốc độ phản ứng enzyme không phải lúc nào cũng
tỷ lệ thuận với nhiệt độ phản ứng. Tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhiệt độ nhất định. Vượt
quá nhiệt độ đó, tốc độ phản ứng enzyme sẽ giảm đến mức triệt tiêu.
Người ta thường sử dụng hệ số nhiệt Q10 để biểu thị ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng. Nhiệt
độ tương ứng với tốc độ phản ứng enzyme cao nhất được gọi là nhiệt độ tối ưu. Phần lớn enzyme hoạt
CÔNG NGHỆ ENZYME 11

động mạnh nhất ở nhiệt độ 40 – 50
o
C. Nhiệt độ tối ưu của những enzyme khác nhau là hoàn toàn khác
nhau. Một số enzyme khác có nhiệt độ tối ưu ở 60
o
C, một số khác lại có nhiệt độ tối ưu ở 70
o
C, thậm chí
có một số enzyme của vi khuẩn Bacillus subtilis lại hoạt động mạnh ở 90

o
C
Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ bị giảm. Khi đó enzyme không có khả
năng phục hồi lại hoạt tính.
Ngược lại, ở nhiệt độ 0
o
C enzyme bị hạn chế hoạt động rất mạnh, nhưng khi đưa nhiệt độ lên từ từ hoạt
tính enzyme sẽ tăng dần đều đến mức tối ưu.
Nhiệt độ tối ưu của một enzyme phụ thuộc rất nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo
vệ. Người ta thường sử dụng nhiệt độ để điều khiển hoạt động của enzyme và tốc độ phản ứng trong chế
biến và bảo quản thực phẩm.

Hình 1.7. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến phản ứng enzyme
1.3.5.2. pH
pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc biệt ảnh hưởng đến độ bền
của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến phản ứng của enzyme
Nhiều enzyme hoạt động rất mạnh ở pH trung tính. Tuy nhiên cũng có nhiều enzyme hoạt động ở pH acid
yếu. Một số khác lại hoạt động mạnh ở pH kiềm và cả pH acid.
VD: một số protease hoạt động ở pH kiềm (protease kiềm), một số lại hoạt động ở pH acid (protease acid)
và một số protease lại hoạt động ở pH trung tính (protease trung tính)
Người ta thường sử dụng ảnh hưởng của pH để điều hòa phản ứng trong bảo quản, chế biến lương thực,
thực phẩm, trong tuyển chọn giống vi sinh vật…

Hình 1.8. Ảnh hưởng của pH đến phản ứng enzyme
1.3.5.3. Chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các phản ứng enzyme, làm giảm
hoạt tính của enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính
chất vật lý của chúng.
Các chất gây kìm hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu cơ và
cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghĩa rất lớn trong điều khiển các quá trình trao đổi ở tế bào sinh vật.

Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận nghịch. Trong trường
hợp các chất kìm hãm thuận nghịch, phản ứng giữa enzyme và chất kìm hãm sẽ nhanh chóng đạt được
trạng thái cân bằng.
CÔNG NGHỆ ENZYME 12

Các chất kìm hãm kết hợp với enzyme bằng liên kết đồng hóa trị. Theo đó, các chất kìm hãm gắn rất chặt
vào enzyme, tạo thành phức enzyme – chất kìm hãm (EI). Phức hợp này bị phân rã rất chậm. Tùy thuộc
vào bản chất của chất kìm hãm mà người ta chia ra những chất kìm hãm sau:
Chất kìm hãm cạnh tranh: các chất kìm hãm cạnh là những chất có cấu trúc tương tự như cấu trúc của
cơ chất. Chúng thường là những chất kìm hãm thuận nghịch. Chúng có khả năng kết hợp với trung tâm
hoạt động của enzyme. Khi đó, chúng sẽ chiếm vị trí của cơ chất trong trung tâm hoạt động. Nếu chất kìm
hãm đã chiến được vị trí trong trung tâm hoạt động thì cơ chất sẽ không còn cơ hội tiếp cận với trung tâm
này. Cơ chế loại trừ lẫn nhau của chất kìm hãm và trung tâm làm giảm số lượng các enzyme kết hợp với
cơ chất. Kết quả là hoạt động của enzyme sẽ giảm.
Vì có cấu trúc không gian giống nhau, nên các chất cạnh tranh và cơ chất đều có xu hướng chiếm vị trí
trong trung tâm hoạt động. Vận tốc phản ứng lúc này phụ thuộc vào 2 yếu tố:
 Phụ thuộc vào nồng độ cơ chất và nồng độ chất canh tranh. Nếu nồng độ cơ chất đủ lớn sẽ loại trừ
được hiện tượng cạnh tranh.
 Phụ thuộc vào ái lực giữa cơ chất và chất cạnh tranh với enzyme
Chất kìm hãm không cạnh tranh:
Nếu như trong cơ chế kìm hãm cạnh tranh, các chất kìm hãm chiếm trung tâm hoạt động của enzyme thì
cơ chế kìm hãm không cạnh tranh, chất kìm hãm không chiếm trung tâm hoạt động của enzyme mà là ở
một vị trí ngoài trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả sự kết hợp này, chất kìm hãm làm thay đổi cấu
trúc không gian của phân tử enzyme theo chiều hướng bất lợi cho hoạt động xúc tác. Vì thế các chất kìm
hãm làm giảm hoạt động của enzyme.
Khi chất kìm hãm không cạnh tranh kết hợp với enzyme sẽ làm vận tốc phản ứng enzyme bị giảm mặc dù
quá trình này không làm thay đổi ái lực giữa enzyme và cơ chất. Mức độ kìm hãm của chất kìm hãm
không cạnh tranh không phụ thuộc vào tương quan nồng độ cơ chất và chất kìm hãm. Cơ chất dù có
lượng lớn bao nhiêu cũng không loại trừ được tác dụng kìm hãm của chất kìm hãm.
Các chất kìm hãm không cạnh tranh có thể là các chất sau:

1. Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng: các sản phẩm của phản ứng có thể đóng vai trò như chất kìm
hãm không cạnh tranh. Nếu như phản ứng xảy ra do chất A và chất B, có sự tham gia của enzyme để tạo
thành sản phẩm P1 và P2 thì enzyme có ái lực với cả P1, P2 và cả chất A và B. Khi đó sản phẩm P1, P2
được xem là chất kìm hãm không cạnh tranh
2. Kìm hãm do thừa cơ chất: trong phản ứng enzyme thông thường thì: E + S <=> ES => E + P
Khi ES được tạo thành rất có thể có một cơ chất gắn với ES tạo thành ESS làm chúng không thể chuyển
hóa tạo tiếp tục được để tạo sản phẩm và giải phóng enzyme tự do.

Hình 1.9. Chất kìm hãm cạnh tranh

Hình 1.10. Chất kìm hãm không cạnh tranh
1.3.5.4. Chất hoạt hóa
Các chất có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme. Các chất hoạt hóa
enzyme có bản chất hóa học rất khác nhau. Chúng có thể là những anion, các ion kim loại từ ô thứ 11 đến
ô thứ 55 trong bảng hệ thống tuần hoàn, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp. Tuy nhiên, các chất hoạt
hóa chỉ có tác dụng ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này, chúng sẽ gây ức chế hoạt động của
enzyme
CÔNG NGHỆ ENZYME


Ở nồng độ hoạt hóa, các chất ho
ạ
khả năng phá vỡ một số liên kế
t
chức năng trong trung tâm hoạ
t đ
1.3.6. Tính chất đặc hiệu củ
a enzyme
Tính chất đặc hiệu là biểu hiệ
n kh

chất đặc hiệu rất cao. Tính chấ
t đ
chất xúc tác khác.
Mỗi một loại enzyme chỉ có kh
ả
một kiểu phản ứng nhất đị
nh. Tính ch
1. Đặc hiệu kiểu phản ứng
Tính chất đặc hiệu kiểu phản ứ
ng bi
chuyển hóa nhất đị
nh trong các ki
thủy phân…
2. Đặc hiệu cơ chất
Khi tham gia vào các phản ứ
ng , các lo
nhiên không phải cơ chất nào c
ũng có kh
enzyme. Người ta phân tích đặ
c hi
A – đặc hiệu tuyệt đối
Là khả năng xúc tác củ
a enzyme đ
có khả ngăng xúc tác đối với mộ
t cơ ch
B – đặc hiệu tương đối
Là khả năng xúc tác củ
a enzyme tác d
C – đặc hiệu quang học (đặc hiệ
u l

Là khả năng xúc tác củ
a enzyme đ
và trans)
1.4. Phân loại enzyme
1.4.1. Danh pháp quốc tế củ
a enzyme
Khi số lượng enzyme mới đượ
c phát hi
người tìm ra nó. Dần dầ
n, theo th
ấy có tính chất gần giố
ng nhau ho
những quy ước quốc tế về tên gọ
enzyme đó thuộc nhóm nào và b
ả
Theo quy ước quốc tế, tên gọi c
ủ
kiểu phản ứng mà chúng
tham gia. Theo đó, tên g

ạ
t hóa thường làm nhiệm vụ chuyể
n nhóm hydrogen ho
t
trong phân tử tiền enzyme hoặc các chấ
t có tác d
t đ
ộng của enzyme

Hình 1.11. Chất hoạt hóa enzyme

a enzyme

n kh
ả năng xúc tác của enzyme đối với cơ chất nh
ấ
t đ
ặc hiệu của enzyme cho thấy sự khác biệt rấ
t l
ả
năng xúc tác cho sự chuyển hóa một hay nhiề
u cơ ch
nh. Tính ch
ất đặc hiệu của enzyme biểu hiệu ở một số
ki
ng bi
ểu hiện ở chỗ, mỗi enzyme chỉ có thể
xúc tác cho m
nh trong các ki
ểu phản ứng như phản ứng oxy hóa khử, phản
ứ
ng , các lo
ại cơ chất phải gắn với trung tâm hoạ
t đ
ũng có kh
ả năng tiếp cận và gắn được vào vớ
i trung tâm ho
c hi
ệu cơ chất theo mức độ sau:
a enzyme đ
ối với một cơ chất nhất định. Ngoài cơ chấ

t này ra, enzyme
t cơ ch
ất nào khác nữa.
a enzyme tác d
ụng lên một kiểu liên kết hóa học nhất định

u l
ập thể)
a enzyme đ
ến một trong 2 dạng đồng phân quang học củ
a cơ ch
a enzyme

c phát hi
ện còn ít, người ta thường gọ
i tên enzyme theo ý thích c
n, theo th
ời gian, số lượng enzyme tìm ra ngày một nhiề
u và nh
ng nhau ho
ặc giống nhau, người ta phân loạ
i chúng thành t
ọ
i enzyme để khi nghiên cứu và ứng dụ
ng chúng ai c
ả
n chất hóa học của chúng ra sao.
ủ
a enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệ
u c

tham gia. Theo đó, tên g
ọi của 1 enzyme thường có 2 ph
ầ
13
n nhóm hydrogen ho
ạt những chất có
t có tác d
ụng phục hồi các nhóm
ấ
t định. Enzyme có tính
t l
ớn giữa enzyme và các
u cơ ch
ất nhất định theo
ki
ểu đặc hiệu sau:
xúc tác cho m
ột kiểu phản ứng
ứ
ng chuyển vị, phản ứng
t đ
ộng của enzyme. Tuy
i trung tâm ho
ạt động của
t này ra, enzyme
này không

a cơ ch
ất (đồng phân cis
i tên enzyme theo ý thích c

ủa từng
u và nh
ững enzyme tìm ra
i chúng thành t
ừng nhóm và đưa ra
ng chúng ai c
ũng có thể hiểu được
u c
ủa chúng cùng với tên
ầ
n:
CÔNG NGHỆ ENZYME 14

Phần đầu là tên cơ chất: trong trường hợp phản ứng đó là phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là tên
gọi của 2 cơ chất viết cách nhau hai chấm.
Phần sau chỉ khái quá bản thân của phản ứng:
Ví dụ: enzyme urease có tên gọi hệ thống là carbanite-amideohydrolase
Các enzyme thường ở cuối tên có đuôi “…ase”
Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme vì thói quen nên vẫn được gọi theo tên cũ, không theo hệ thống phân
loại. Ví dụ như trypsin, chimotrypsin, pepsin…
1.4.2. Phân loại enzyme
Năm 1960, hiệp hội hóa sinh quốc tế (IUB) đã thống nhất phân loại enzyme ra làm 6 lớp và được đánh số
thứ tự từ 1 đến 6. Các số thứ tự này là cố định cho mỗi lớp. Mỗi lớp lại chia ra làm nhiều tổ, mỗi tổ lại
chia ra làm nhiều nhóm, chính vì thế, theo hệ thống phân loại, mỗi enzyme thường có 4 chữa số: số thứ
nhất chỉ lớp, số thứ 2 chỉ tổ, số thứ 3 chỉ nhóm, số thứ 4 chỉ enzyme
1. Oxydoreductase: các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử
2. Transpherase: các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị
3. Hydrolase: các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân
4. Liase: các enzyme xúc tác cho phản ứng phân cắt không cần nước, loại nước tạo thành liên kết đôi
hoặc kết hợp phân tử nước vào liên kết đôi

5. Isomerase: các enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa
6. Ligase: các enzyme xúc tác cho phản ứng tổng hợp có sử dụng liên kết giàu năng lượng của ATP…
1.4.2.1. Oxydoreductase
Đây là enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử. Các enzyme này là những enzyme phức tạp. Chúng
bao gồm 2 thành phần. Phần coenzyme của chúng là NAD+, NADP+, FMN, FAD, heme…. Lớp enzyme
này được phân hóa thành những nhóm sau:
A- Dehydrogenase: nhóm này tham gia vào các phản ứng tách H trực tiếp từ cơ chất và chuyển chúng đến
NAD+, NADP+, FMN, FAD.
Các dehyrogenase xúc tác cho giai đoạn đầu của chuỗi hô hấp, vận chuyển đồng thời cả proton và
electron. Ngoài ra, chúng còn tham gia xúc tác cho chiều ngược lại, chuyển H từ NADH+H+ hoặc
NADPH+H+, FMNH2, FAD-H2 đến cơ chất và khử cơ chất. Đây là những phản ứng đóng vai trò rất
quan trọng trong quá trình tổng hợp
B – Oxydase: đây là phản ứng xúc tác cho quá trình chuyển electron đến oxy. Chúng hoạt hóa oxy làm
cho chúng có khả năng kết hợp với proton có trong môi trường. Lớp enzyme này tác dụng trực tiếp với
oxy
C – Oxygenase: đây là enzyme xúc tác cho phản ứng kết hợp trực tiếp oxy vào phân tử của hợp chất hữu
cơ có vòng thơm
Nhóm này có 2 loại, oxygenase và hydroxylase, oxygenase xúc tác cho phản ứng kết hợp toàn bộ phân tử
oxy. Hydrogenase xúc tác cho phản ứng kết hợp một nửa phân tử oxy (thường ở dạng OH) vào hợp chất
hữu cơ
D – Peroxydase: đây là enzyme có coenzyme là heme, xúc tác cho phản ứng oxy hóa các hợp chất hữu cơ
khi có H
2
O
2

1.4.2.2. Transpherase
Transpherase cũng thuộc lớp enzyme phức tạp. Coenzyme của transpherase có bản chất hóa học rất khác
nhau tùy theo vào bản chất của nhóm được chuyển vị. Lớp transpherase bao gồm những enzyme tiêu biểu
sau:

A – acyltranspherase: enzyme này tham gia chuyển hóa nhóm acyl thông qua coenzyme A, tạo thành
phức CoAS-acyl. Khi đó, nhóm carboxyl của acid kết hợp với nhóm –SH của coenzyme A tạo thành liên
CÔNG NGHỆ ENZYME 15

kết thioester giàu năng lượng. Các enzyme này có vai trò quan trọng trong chuyển hóa lipid và phân giải
glucose
Glucosyltransferase: enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng vận chuyển đường hexose, pentose từ
chất cho đến chất nhận khác nhau, thường gặp nhất là nhóm OH của một gốc saccharide khác hoặc của
gốc phosphate, nguyên tử nitrogen của nhân vòng.
Ngoài ra, enzyme này cũng tham gia xúc tác cho quá trình tạo cấu trúc phân nhánh trong phân tử
glycogen, amylopectin
Phosphotransferase: enzyme này tham gia xúc tác chuyển hóa gốc phosphoryl. Trong phản ứng này
thường có sự tham gia của ATP với ý nghĩa như một chất cho. Gốc phosphate được chuyển từ ATP đến
nhóm hydroxyl của alcohol hay saccharide
1.4.2.3. Hydrolase
Hydrolase tham gia xúc tác cho các quá trình thủy phân. Chính vì thế, nước là thành phần không thể thiếu
được của những phản ứng do enzyme này tham gia. Có rất nhiều enzyme thuộc lớp enzyme này như:
A – peptide hydrolase: enzyme này tham gia xúc tác phản ứng thủy phân peptide, tạo thành những phân
tử thấp và các amino acid.
Các enzyme peptide hydrolase thủy phân các liên kết peptide ở giữa chuỗi peptide gọi là endopeptide
hydrolase hay proteinase. Đại diện cho endopeptide hydrolase là pepsin, trypsin, chymotrypsin. Các
enzyme peptide hydrolase thủy phân các liên kết peptide ở đầu chuỗi peptide gọi là exo peptide hydrolase
hay peptidase
Năm 1960, Hartley chia proteinase ra làm 4 nhóm chính:
 Proteinase serine: trong enzyme này, gốc serine đóng vai trò xúc tác ở trung tâm hoạt động. Nhóm
này bao gồm trypsin, chymotrypsin, elastase, các proteinase làm đông máu, acrosin
 Proteinase thiol: trong trung tâm hoạt động có nhóm –SH trực tiếp tham gia phản ứng, bao gồm
papain, bromelin, ficin
 Proteinase kim loại: trong trung tâm hoạt động, kim loại có đóng vai trò quan trọng trong xúc tác
 Proteinase acid (aspartic proteinase): trong trung tâm hoạt động có nhóm gammar carboxyl

B – lipase: enzyme này tham gia quá trình xúc tác cho phản ứng thủy phân triglycerol (dầu thực vật và
mỡ động vật) tạo thành acid béo tự do và glycerol. Chúng xúc tác phản ứng thủy phân lần lượt từng liên
kết chứ không phải cắt đứt cả 3 liên kết ester cùng một lúc.
1.4.2.4. Lipase
Pyruvate decarboxylase: enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 ra khỏi phân tử pyruvic
acid, tạo thành aldehyde tương ứng là acetaldehyde. Đây là phản ứng quan trọng trong lên men rượu.
Enzyme này là enzyme đa cấu tử, coenzyme của chúng ta là thiamipiro phosphate
Fumarate hydrolase: enzyme này là xúc tác cho phản ứng tách thuận nghịch phân tử nước khỏi malic
acid tạo thành fumaric acid (acid có một nối đôi)
1.4.2.5. Isomerase
Enzyme này xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp giữa galactose và glucose. NAD+ trong
enzyme này tham gia trực tiếp trong phản ứng.
1.4.2.6. Ligase
Enzyme này tham gia xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic acid, tạo thành oxaloacetic acid. Chúng
cần acetyl-coA và Mg
2+
cho phản ứng xúc tác. Biotin là chất mang CO
2
đã hoạt hóa và chuyển thành acid
pyruvic
1.5. Phương pháp tách và làm sạch enzyme
1.5.1. Các phương pháp phá vỡ tế bào
Enzyme là loại protein được tạo thành trong tế bào, phần lớn chúng tồn tại trong tế bào. Các enzyme này
thường không có khả năng di chuyển qua màng sinh học. Do đó, việc tách chúng ra khỏi tế bào là diều rất
khó khăn.
CÔNG NGHỆ ENZYME 16

Để thu nhận enzyme nội bào, người ta phải phá vỡ tế bào bằng nhiều phương pháp. Các phương pháp phá
vỡ tế bào thường sử dụng như:
1. Phương pháp cơ học: nghiền bi, nghiền có chất trợ nghiền như bột thủy tinh, cát thạch anh, đồng hóa

bằng thiết bị đồng hóa…
2. Phương pháp vật lý: dùng sóng siêu âm
3. Phương pháp hóa học: dùng các loại dung môi, butylic, acetone, glycerol, ethylacetate.
Có 3 khó khăn trong khi tách enzyme khỏi tế bào cần phải hết sức lưu ý:
 Enzyme có trong tế bào sinh vật với lượng không lớn so với các thành phần khác. Do đó, việc tách để
thu nhận thành phần nhỏ này là điều rất khó.
 Enzyme là chất hữu cơ không bền, chúng rất dễ bị biến tính khi bị tác động của các yếu tố bên ngoài.
 Enzyme là protein. Protein enzyme luôn luôn đi cùng những loại protein không phải enzyme nhưng
lại có tính chất hóa lý rất giống protein enzyme. Do đó, việc tách protein enzyme ra khỏi các loại
protein không phải lúc nào cũng đạt được kết quả tốt và không phải không gặp những khó khăn nhất
định
1.5.2. Phương pháp gây biến tính chọn lọc
Sau khi phá vỡ tế bào, người ta thường sử dụng nước, dung dịch đệm, dung dịch muối trung tính để tách
enzyme ra khỏi sinh khối đã xử lý theo những phương pháp trên. Dịch chiết thu được người ta gọi là chế
phẩm enzyme thô. sở di gọi là chế phẩm enzyme thô vì trong chế phẩm này ngoài enzyme còn có nước,
protein không phải enzyme các thành phần của tế bào.
Như vậy việc làm sạch enzyme chính là việc loại các protein không phải là enzyme (đôi khi loại bỏ cả các
protein – enzyme không mong muốn), nước, các thành phần khác của tế bào khỏi enzyme. Công việc này
hoàn toàn không dễ dàng. Do đó, việc làm sạch enzyme đòi hỏi người làm nghiên cứu về enzyme, ngoài
sự hiểu biết về enzyme ra còn phải nắm vững rất nhiều thao tác kỹ thuật khác nhau để tránh gây mất tính
hoạt động của enzyme.
Để loại bỏ những thành phần không phải là enzyme ta đang cần, người ta thực hiện một số phương pháp
sau:
1. Phương pháp gây biến tính chọn lọc: phương pháp này dựa trên sự tác động của nhiệt độ, pH làm
biến tính chọn lọc các loại protein tạp. Phương pháp này chỉ thích hợp với enzyme chịu aicd và bền nhiệt.
Người ta đưa nhiệt độ của dung dịch enzyme lên 50 – 70oC và pH < 5. ở điều kiện này những enzyme
không bền nhiệt và không chịu được pH thấp sẽ bị biến tính. Sau đó bằng phương pháp ly tâm hoặc
phương pháp lọc để loại bỏ các thành phần không phải enzyme mà ta mong muốn.
2. Phương pháp kết tủa phân đoạn: dựa trên cơ sở về khả năng kết tủa của các enzyme ở nồng độ muối
khác nhau, người ta thường sử dụng (NH4)2SO4 để kết tủa phân đoạn enzyme. Bằng cách này, người ta

được một số protein tạp ở giai đoạn đầu của quá trình làm sạch enzyme. Ngoài muối (NH4)2SO4 ra,
người ta còn sử dụng một số dung môi hữu cơ để kết tủa enzyme. Phương pháp kết tủa này thường làm
biến tính rất nhanh. Vì thế trước khi tiến hành kết tủa, người ta tiến hành làm lạnh các chất kết tủa và cả
dung dịch enzyme
3. Phương pháp hấp thụ chọn lọc: người ta có thể hấp thụ trực tiếp vào dung dịch enzyme, hoặc cho
dung dịch enzyme chảy qua một cột, trong cột có chứa chất hấp thụ. Chất hấp thụ được sử dụng rộng rãi
là hydrocyapatite. Người ta có thể thực hiện một trong hai cách sau: hoặc là hấp thụ enzyme hoặc là hấp
thụ protein tạp. Để tránh làm biến tính enzyme, người ta thường thực hiện quá trình hấp thụ ở nhiệt độ
0oC. Sau khi hấp thụ người ta lại tiến hành quá trình chiết enzyme (quá trình phản hấp thụ) bằng dung
môi thích hợp.
4. Phương pháp sắc ký: dựa trên cơ sở của phản ứng trao đổi giữa protein tan trong nước và tác nhân trao
đổi ion, người ta áp dụng phương pháp người ta sử dụng phương pháp sắc ký trao đổi ion để làm sạch
enzyme. Người ta thường sử dụng tác nhân trao đổi ion sau:
 Nhựa trao đổi ion
 Dẫn xuất ester của cellulose như carboxymethyl-cellulose, diethylamino-ethyl-cellulose (DEAE-
cellulose), triethylamino-ethyl-cellulose
CÔNG NGHỆ ENZYME 17

Người ta thường sử dụng DEAE –cellulose hơn cả. Ưu điểm của DEAE-cellulose là ngoài tạp chất
protein, các loại nucleic acid đều được loại khỏi enzyme.
 Sephadex là dẫn xuất của polysaccharide dextran. Trong chất này các phân tử của chúng thường liên
kết với nhau bởi các liên kết ngang nhờ tác dụng của epichohydrin, tạo thành “sàng phân tử”. Số
lượng liên kết ngang càng nhiều, kích thước sàng phân tử càng nhỏ.
Khi tiến hành lọc, các chất phân tử có kính thước nhỏ sẽ khuếch tán vào bên trong các hạt sephadex đã
được ngâm trong dung dịch đệm. Các phân tử có kích thước lớn hơn không có khả năng đi vào hạt sẽ
được chiết nhanh ra khỏi cột. phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật enzyme.
Hiện nay, chưa có một phương pháp chuẩn nào thật sự hiệu quả trong việc làm sạch enzyme. Do đó, việc
làm sạch enzyme chỉ thật sự có hiệu quả khi ta biết lựa chọn các phương pháp riêng, kết hợp với nhau, tạo
ra một hệ thống nối tiếp nhau một cách hài hòa nhất.
1.6. Phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme

1.6.1. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của E
Người ta xác định khả năng xúc tác của enzyme thông qua việc xác định hoạt độ hoạt động của enzyme.
Người ta cũng không thể định lượng enzyme trực tiếp mà phải xác định gián tiếp thông qua hoạt độ hoạt
động của chúng hoặc thông qua khả năng làm giảm cơ chất sau một thời gian phản ứng.
Hiện nay, nhiều phòng thí nghiệm sử dụng một trong 3 nhóm phương pháp sau để xác định khả năng xúc
tác của enzyme:
 Tiến hành đo lượng cơ chất bị mất đi hay lượng sản phẩm được tạo thành sau một thời gian nhất định
và lượng enzyme đã xác định trước. phương pháp này được áp dụng rộng rãi và đã được xác định là
tương đối chính xác.
 Tiến hành xác định thời gian cần thiết để thu nhận được một lượng biến đổi nhất định của lượng cơ
chất hay lượng sản phẩm tương ứng với một lượng enzyme nhất định
 Tiến hành chọn nồng độ enzyme cần thiết để trong một thời gian nhất định sẽ thu được sự biến đổi
nhất định về cơ chất hay về sản phẩm.
Bảng 1.3. Các nhóm phương pháp xác định khả năng xúc tác của enzyme [2]
Phương pháp Các thông số cố định Các thông số thay đổi
1
Thời gian
Nồng độ enzyme
Lượng cơ chất và sản phẩm
2
Lượng cơ chất hay sản phẩm
Nồng độ enzyme
Thời gian
3
Thời gian
Lượng cơ chất hay sản phẩm
Nồng độ enzyme
1.6.2. Đơn vị hoạt độ
Khả năng xúc tác của enzyme được xác định thông qua hoạt độ hoạt động của enzyme. Hoạt độ hoạt động
của enzyme được xác định thông qua đơn vị hoạt độ. Người ta biểu diễn đơn vị hoạt độ qua những đơn vị

sau:
a - đơn vị hoạt độ quốc tế (UI): đơn vị hoạt độ quốc tế là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển
hóa 1 micromol cơ chất trong 1 phút ở điều kiện tiêu chuẩn
b - katal (kat): đơn vị kat là lượng enzyme có khả năng xúc tác làm chuyển hóa được 1mol cơ chất sau 1
giây ở điều kiện tiêu chuẩn
1UI = 16,67nano kat (nkat)
CÔNG NGHỆ ENZYME 18

c - hoạt độ riêng: hoạt độ riêng của một chế phẩm enzyme là số đơn vị UI (hoặc một đơn vị katal) ứng
với 1 ml dung dịch (nếu là dung dịch) hoặc 1mg protein (nếu là bột khô) của chế phẩm enzyme. Khi biết
được khối lượng phân tử của enzyme ta hoàn toàn có thể tính được hoạt độ riêng của phân tử.
d - hoạt độ riêng của phân tử: hoạt độ riêng của phân tử enzyme là số phân tử cơ chất được chuyển hóa
bởi một phân tử enzyme trong một đơn vị thời gian.
Việc xác định hoạt độ của enzyme thường được các nhà khoa học đưa ra những phương pháp rất cụ thể
cho từng loại enzyme, ứng với từng loại cơ chất. Tuy nhiên, khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme
cần lưu ý những điểm cơ bản sau:
 Khi tiến hành xác định hoạt độ của enzyme cần phải cho lượng cơ chất trong một giới hạn thích hợp
đủ thừa để bão hòa enzyme. Lượng cơ chất cho vào không được quá nhiều. Nếu lượng cơ chất quá
nhiều sẽ gây ức chế hoạt động của enzyme
 Đối với những enzyme dễ mất hoạt tính cần phải có chất hoạt hóa hoặc làm bền enzyme, thì cần phải
cho những chất này vào trước khi cho cơ chất vào để thực hiện phản ứng.
 Khi xác định hoạt độ enzyme cần chú ý phải thực hiện trong điều kiện pH cố định và thích hợp với
hoạt động tối ưu của enzyme nghiên cứu. pH thường thay đổi tùy thuộc vào cơ chất và dung dịch đệm
 Khi xác định hoạt độ enzyme cần lưu ý đến nhiệt độ. Các nhà khoa học cho rằng không nên xác định
hoạt độ enzyme ở nhiệt độ tối ưu của enzyme mà ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu đó một ít để
tránh khả năng làm biến tính enzyme khi có sự biến động về nhiệt độ
 Thời gian xác định hoạt độ enzyme chỉ nên kéo dài khoảng 5 - 10 phút, không nên kéo dài quá, dễ
gây giảm hoạt độ của enzyme. Tuy nhiên, cũng có những trường hợp kéo dài đến 24 giờ đối với
những enzyme có khả năng hoạt động yếu. Trong trường hợp phải kéo dài thời gian, cần thiết phải
cho chất ức chế hoạt động hoặc tiêu diệt vi sinh vật

Ngoài ra, hiện nay trên thế giới có rất nhiều cách biểu thị đơn vị hoạt độ của enzyme như:
MWU – đơn vị biểu thị lượng enzyme cần thiết chuyển hóa một mg tinh bột hòa tan đến dextrin trong 30
phút ở điều kiện thí nghiệm;
SKB – là lượng enzyme cần thiết để dextrin hóa 1g beta-dextrin giới hạn để kích thước xác định sau 1 giờ
ở điều kiện thí nghiệm
2. KỸ THUẬT CƠ BẢN TRONG CÔNG NGHỆ ENZYME
2.1. Ý nghĩa của kỹ thuật tinh sạch trong công nghệ enzyme
Công nghệ enzyme được bắt đầu từ giai đoạn sản xuất chế phẩm enzyme thô và kết thúc ở giai đoạn tạo
thành chế phẩm tinh khiết.
Bắt đầu từ chế phẩm enzyme thô, người ta tiến hành tinh sạch enzyme bằng nhiều kỹ thuật khác nhau.
Các kỹ thuật tinh sạch thường đưa đến những kết quả quan trọng như sau:
Khối lượng chế phẩm enzyme sẽ được giảm dần qua từng bước tinh sạch. Chế phẩm enzyme thô thường
chứa những thành phần cơ bản sau:
 Nước chiếm khối lượng lớn nhất
 Protein không có hoạt tính sinh học
 Các tạp chất từ tế bào (nếu là nguồn động vật và thực vật), môi trường nuôi cấy (nếu là nguồn từ vsv)
 Enzyme (hay protein có hoạt tính sinh học)
Như vậy, quá trình tinh sạch là quá trình loại bỏ ba phần trên, chỉ nhận sản phẩm cuối là protein có hoạt
tính sinh học. Việc loại bỏ thành phần đầu không thể thực hiện trong một giai đoạn mà phải thực hiện qua
nhiều giai đoạn khác nhau, ở mỗi giai đoạn ta sẽ loại bỏ được một phần không phải là enzyme ra khỏi hỗn
hợp. Khi các thành phần không phải là enzyme được loại dần ra, khối lượng chế phẩm sẽ giảm theo.
Như vậy, nếu enzyme được tinh sạch theo những kỹ thuật khác nhau sẽ thu nhận những giá trị quan trọng
sau:
 Giảm khối lượng. Trị số này có nghĩa cho việc đóng bao bì, vận chuyển, sử dụng và bảo quản.
 Tăng được hoạt tính enzyme có ý nghĩa rất lớn trong quá trình sử dụng sau này.
 Tăng giá trị kinh tế thông qua giá thành sản phẩm
Để giải quyết được trong những mục tiêu trên, ta thực hiện những kỹ thuật cơ bản sau:
CÔNG NGHỆ ENZYME 19

2.2. Kỹ thuật cơ bản

2.2.1. Các phương pháp cơ học tách enzyme
Các phương pháp cơ học được ứng dụng nhiều để tách enzyme khỏi tế bào và các thành phần khác gồm 2
phương pháp:
 Phương pháp ly tâm: ly tâm là tách vật chất rắn ra khỏi dung dịch. Trong công nghệ enzyme, phương
pháp ly tâm thường được ứng dụng khá rộng rãi để thu nhận dung dịch enzyme, dung dịch này chứa
các enzyme ngoại bào. Enzyme nội bào nằm trong tế bào sinh vật muốn thu nhận enzyme nội bào ta
cần phải tiến hành phá vỡ tế bào.
Phần lớn enzyme ngoại bào là enzyme hòa tan. Như vậy khi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi
các thành phần rắn là dung idjch enzyme thô. Dung dịch enzyme thô này còn chứa thành phần sau:
 Protein có hoạt tính sinh học
 Các chất hòa tan khác
 Nước
Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch. Dịch thu được chưa phải
là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vì còn chứa protein không hoạt động, nước
và các chất hòa tan khác.
Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người ta thường tiến hành ly
tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ
thấp.
Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịch enzyme bằng máy ly
tâm liên tục. Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm là thời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên
tục và không gây ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme.
 Phương pháp lọc: trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lên men,
người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào, enzyme ngoại bào hòa
tan.
Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch. Lọc là một phương pháp khi thực hiện
thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tế bào thường rất nhỏ và độ nhớt của dung dịch
thường rất cao. Cả hai yếu tố này đều làm cản trở quá trình lọc. Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện
tích bề mặt vật liệu lọc, áp suất khi lọc, độ nhớt dịch lọc…
Trong công nghiệp sản xuất enzyme, người ta thường sử dụng các kiểu sau:
 Lọc ép: thường được sử dụng trong trường hợp dung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ. Phương

pháp này sử dụng để lọc enzyme rất có hiệu quả.
 Lọc chân không: là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu và trong sản xuất
các sản phẩm sinh học có hoạt tính. Trong đó lọc chân không quay được sử dụng nhiều hơn cả.
 Lọc theo dòng chảy cắt ngang: trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sản xuất enzyme sử
dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang. Theo đó, dòng dung dịch lọc sẽ chảy song song
bề mặt nguyên liệu lọc. Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệu lọc và đi xuống phía dưới. Phương
pháp này có ưu điểm là làm giảm sức đề kháng quá trình lọc của vật liệu rắn.
 Lọc thông thường: phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay, ở một số nhà máy
vẫn còn sử dụng. Phương pháp này dần được thay bằng phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu
quả hơn.
2.2.2. Các phương pháp phá vỡ tế bào sinh vật
Mục đích của việc phá vỡ tế bào là giải phóng toàn bộ các chất có trong tế bào. Cùng với các chất có
trong tế bào được giải phóng ra ngoài là enzyme nội bào.
Đối với tế bào động vật và tế bào thực vật ta phải tiến hành nghiền nát trước khi thực hiện các quá trình
trích ly, lọc, cô đặc, làm sạch và sấy
Đối với tế bào vsv phải tiến hành tách bằng phương pháp ly tâm hoặc bằng phương pháp lọc. Phần dịch
lọc thu được của một trong hai phương pháp này là dịch chế phẩm enzyme ngoại bào. Phần sinh khối vsv
sau khi ly tâm hoặc lọc chứa enzyme nội bào. Việc phá vỡ tế bào động vật và thực vật không mấy khó
CÔNG NGHỆ ENZYME 20

khăn nhưng phá vỡ tế bào vsv rất phức tạp vì tế bào vsv vừa có kích thước nhỏ, vừa có thành tế bào có
cấu trúc khá đặc trưng. Do đó, phá vỡ tế bào vsv đòi hỏi phải có những phương pháp đặc biệt.
2.2.2.1. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học:
Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảo được hoạt tính của enzyme
nội bào.
 Đối với tế bào động vật (thường sử dụng toàn bộ cơ quan hay mô bào) có chứa enzyme và cần phải
được trữ ở nhiệt độ thấp để tránh mất hoạt tính enzyme. Trước khi trữ lạnh cần loại bỏ mỡ hoạt các
thành phần khác bám theo mô bào đó, mẫ cần được xử lý nhanh và phải được thu nhận enzyme trong
thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mổ.
 Đối với tế bào và mô thực vật cũng cần phải được làm sạch và được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu

nhận enzyme ngay.
 Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học. Riêng đối với tế bào
vsv, việc phá vỡ tế bào gặp phải khó khăn nhất định:
 Thứ nhất: tế bào vsv có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương pháp nghiền nếu
không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả.
 Thứ hai: vsv là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường (đb là mt lỏng) có nhiều cơ chất
thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tương ứng. Các enzyme ngoại bào này hòa
han trong mt và dễ dàng tách chúng ra khỏi dung dịch nuôi cấy. Do đó trong công nghiệp, trừ
trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào người ta mới tiến hành nghiền tế bào ở vsv
Phương pháp đồng hóa áp lực cao: là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào vsv.
Huyền phù tb vsv sẽ được nén với một áp suất cao, chúng va chạm rất mạnh vào vành ống. Tb bị phá vỡ
bởi lực cắt và sức nén.
Phương pháp nghiền ẩm: là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất enzyme.
Trong quá trình nghiền, người ta sử dụng những viên bi thủy tinh có kích thước 0,2 – 1mm để tăng quá
trình phá vỡ tế bào. Trong nhiều trường hợp, người ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt
thủy tinh vì hạt thủy tinh có độ ma sát cao hơn
2.2.2.2. Phá vỡ tế bào bằng phương pháp không phải cơ học:
Ngoài 2 phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phương pháp sau:
Phương pháp hóa học: dựa vào khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh, hoặc khả năng oxy hóa mạnh
của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào. Phương pháp này không đòi hỏi áp suất cao, nên ít chi phí và
dễ thực hiện. Tuy nhiên, vì trong quá trình thực hiện, người ta sử dụng hóa chất nên các hóa chất này
thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòi hỏi quá trình tách rất phức tạp. Một trong những hóa chất sử dụng
nhiều là acetone
Phương pháp vật lý: là sử dụng siêu âm, thường được sử dụng trong quy mô ptn chưa sử dụng trong công
nghiệp. Phương pháp vật lý là tạo shock nhiệt hoặc shock thẩm thấu. Nguyên tắc của phương pháp này là
khi đưa nhiệt độ của huyền phù tb xuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt lên 40oC khi đó thành
tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu được huyền phù tế bào vỡ. Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm
bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệu suất phá vỡ tế bào không cao.
Phương pháp sinh học: có 2 phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân và
phương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào.

Phương pháp tự phân là tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải một số thành phần
của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tb và là của tb đó. Bình thường các
enzyme này không hoạt hoạt động mạnh, nhưng nếu điều kiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tb mà trùng
với mức độ hoạt độ tối ưu của chúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế
bào.
Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong phá vỡ thành tế bào các loại nấm men. Người ta thường
tiến hành tự phân huyền phù tế bào nấm men ở nhiệt độ 48 – 52
o
C trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ.
Phương pháp này có nhiều nhược điểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không
chỉ thủy phân các chất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí enzyme cũng bị phá
hủy. Phương pháp này hiện không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.
CÔNG NGHỆ ENZYME 21

2.2.2.3. Các phương pháp cô đặc
Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều. Để xử lý mọt khối lớn dung dịch enzyme
phải tốn ít nhiều công sức chi phí cho xử lý này rất cao. Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme
thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao. Chính vì thế phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm mục đích:
 Làm tăng hoạt tính của enzyme
 Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này
 Tăng khả năng bảo quản enzyme
 Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản
 Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất
Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp sau:
Phương pháp nhiệt: sử dụng nhiệt để cô đặc enzyme thường khó khăn vì enzyme là protein rất nhạy cảm
với nhiệt độ. Quá trình cô đặc nhiệt là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dung dịch
giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũng tăng cao. Tuy nhiên phải
chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong một khoảng cho phép thì hoạt tính enzyme mới được
bảo toàn.
Phương pháp kết tủa: enzyme là một phức hợp protein có khả năng kết tủa với một số dung môi

 Kết tủa bằng muối: muối nồng độ cao có thể tác dụng với phân tử nước bao quanh protein enzyme và
làm chuyển hóa điện tích, làm thay đổi tính hòa tan của enzyme. Trong công nghiệp thường sử dụng
muối ammonium sulfate. Nhiệt độ tiến hành kết tủa: 35 – 40oC, nồng độ muốn: 20 – 80%
 Kết tủa bằng dung môi hữu cơ: dung môi hữu cơ có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng hòa tan của
enzyme, ảnh hưởng solvat hóa của phân tử nước xung quanh phân tử enzyme bị thay đổi, tương tác
giữa các phân tử enzyme sẽ tăng lên. Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng
ethanol và acetone để kết tủa enzyme. Nhiệt độ kết tủa: 3 – 10oC, tỷ lệ và nồng độ các dung môi hữu
cơ dùng để kết tủa enzyme được xác định bằng thực nghiệm cho từng loại enzyme và từng nồng độ
enzyme có trong dung dịch enzyme.
 Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện: protein là chất lưỡng cực. Mức độ hòa tan của enzyme phụ thuộc
vào pH. Kết tủa enzyme ở điểm đẳng điện thường thực hiện ở quy mô nhỏ. Thời gian tạo điểm đẳng
điện và thời gian lưu để tạo kết tủa bền vững thường làm thay đổi hoạt tính enzyme.
Phương pháp siêu lọc: là phương pháp sử dụng màng lọc có lỗ lọc siêu nhỏ. Được sử dụng rộng rãi để
thu nhận các chất có khối lượng phân tử trong khoảng 1000 – 300.000Da. Người ta thường sử dụng
cellulose acetate và các polymer hữu cơ như: poly sulfone, polyvinylidene và polypropylene làm nguyên
liệu màng lọc.
2.2.2.4. Các phương pháp tinh sạch enzyme
Có 3 phương pháp tinh sạch enzyme chính:
 Phương pháp kết tinh
 Phương pháp điện di
 Phương pháp sắc ký
 Sắc ký lọc gel
 Sắc ký trao đổi ion
 Sắc kí ái lực
2.2.2.5. Tạo sản phẩm enzyme
Sau khi được làm sạch, người ta tiến hành thực hiện giai đoạn cuối cùng là tạo sản phẩm, đóng bao. Chế
phẩm enzyme có thể được tạo thành các loại sản phẩm sau: enzyme dạng dung dịch, enzyme dạng huyền
phù, enzyme dạng bột khô, enzyme dạng viên nhỏ
Enzyme dạng dung dịch hay ở dạng huyền phù: có nhược điểm là rất khó bảo quản. do đó người ta
thường đưa chúng vào dung dịch các chất bảo quản. mặt khác khi sử dụng người ta cũng phải giữ nó

trong điều kiện nhiệt độ nhất định, không được bảo quản ở nhiệt độ cao
Enzyme ở dạng bột khô hoặc ở dạng viên nhỏ: thường dễ dàng bảo quản và khả năng bảo quản rất lâu.
ngoài ra, các chế phẩm enzyme này thường dễ vận chuyển.