Báo Cáo ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán trước và sau sinh bênh alpha thaiassemia

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN
TRƯỚC VÀ SAU SINH BỆNH ALPHA THALASSEMIA TẠI BỆNH NHI
TRUNG ƯƠNG
Lý Thị Thanh Hà
1
, Ngô Diễm Ngọc
1
, Nguyễn Thị Phương Mai
1
, Nguyễn Thị Tân Sinh
2
,
Dương Bá Trực
3
, Bùi Văn Viên
3
, Nguyễn Thanh Liêm
1,3

1
Khoa Di truyền và Sinh học phân tử - Bệnh Viện Nhi Trung Ương
2
Khoa sản, Bệnh Viện Bạch Mai
3
Khoa Huyết học lâm sàng- Bệnh Viện Nhi Trung Ương
Alpha thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể thường phổ biến nhất thế giới, do đột biến
trên vùng gen α globin gây ra sự giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α globin. Tại Đông Nam Á, tỷ lệ
người mang gen α thalassemia là 3,3% [2]. Mục tiêu: 1-Phát hiện đột biến mất đoạn và đột biến
điểm trên gen HbA1 và HbA2. 2-Chẩn đoán trước sinh cho thai phụ nguy cơ sinh con mắc HbH
và alpha thalassemia thể nặng. Đối tượng và phương pháp: 17 mẫu máu ngoại vi và 03 mẫu
dịch ối thai 17-18 tuần của gia đình có nguy cơ sinh con bị bệnh HbH và alpha thalassemia, được

sàng lọc đột biến thường gặp trên gen HbA1 và HbA2 bằng kỹ thuật Multiplex-PCR, C-ARMS-
PCR. Các đột biến khác được phát hiện bằng kỹ thuật giải trình tự gen HbA1, HbA2. Kết quả:
16/17 mẫu máu ngoại vi đều mang một đột biến trong 7 đột biến thường gặp trên gen α
globin bằng kỹ thuật Multiplex-PCR, C-ARMS-PCR. 01 mẫu máu ngoại vi phát hiện thấy đột
biến điểm hiếm gặp bằng kỹ thuật giải trình tự gene. 03 thai nhi là người bình thường mang gene
đột biến. Kết luận: Áp dụng thành công kỹ thuật Multiplex-PCR, C-ARMS-PCR và giải trình tự
gene trong việc phát hiện các đột biến trên vùng gene α globin, là cơ sở vững chắc cho chẩn đoán
trước sinh bệnh alpha Thalassemia.
Từ khoá: Alpha thalassemia, Chẩn đoán trước sinh, C-ARMS-PCR, Multiplex-PCR, giải
trình tự gene.
Bài báo đạt GIẢI BA tại Hội nghị Nhi khoa Việt Úc - 2010
(Tạp chí Nhi khoa, tập 3 - số 3&4, tháng 10 - 2010, trang 337-342)
I. ĐẶT VẤN ĐỀ
Alpha thalassemia là bệnh di truyền lặn nhiễm sắc thể (NST) thường do đột biến gen α-
globin nằm trên cánh ngắn NST 16 (16p13.3) quy định, gây giảm hoặc mất tổng hợp chuỗi α
globin. Alpha thalassemia là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố khắp thế
giới [2 ]. Đây là một trong những nguyên nhân hàng đầu, chiếm tới 60-90% các nguyên nhân gây
phù thai ở các nước Đông Nam Á [5]. Tại Việt Nam, tỷ lệ người mang gen bệnh phân bố trong
cả nước và khác nhau tùy từng địa phương, từng nhóm dân tộc. Trong đó, tỷ lệ người mang gene
đột biến mất đoạn dạng SEA ở Đông Nam Á là cao nhất, ở Bắc Thái Lan là 14%, Nam Trung
Quốc là 5.0-8.8%, Hồng Kông là 4.5%, Trung tâm Thái Lan là 3.7% , Bắc Đài Loan là
3.5%, [2].
Vùng gene α-globin gồm 2 gen: HbA1 (chiều dài 840bp, chứa 3 exon và 2 intron), và
HbA2 (chiều dài 830bp, chứa 3 exon và 2 intron). Theo nghiên cứu trên quần thể người Đông
Nam Á, các đột biến thường gặp gây alpha thalassemia gồm: mất đoạn lớn dạng SEA, Thailand,
Philipin, α 4.2, α 3.7, và các đột biến điểm HbQs, HbCs.
Đột biến trên vùng gene α-globin được chia thành 2 nhóm: nhóm gây mất hoàn toàn số
lượng chuỗi α globin, làm mất chức năng của gen α gây α
0
globin và nhóm làm giảm số lượng

chuỗi α globin gây α
+
globin. Đến nay, đã phát hiện được hơn 35 loại đột biến trên vùng gen α-
globin trong đó có hơn 20 loại mất đoạn lớn (mất đoạn 2 gene) và 15 đột biến mất đoạn nhỏ và
đột biến điểm (mất đoạn 1 gene).
Người bình thường trên hai NST 16 tương đồng có 4 gene alpha (αα/αα). Tùy thuộc vào số
gene bị đột biến, bệnh alpha thalassemia được chia thành 4 nhóm: mất 1 gene, mất 2 gene, mất 3
gene, mất 4 gene. Cá thể mất 1 gene (-α/αα) là người bình thường mang gene đột biến, không có
biểu hiện thiếu máu nhược sắc hoặc chỉ biểu hiện thiếu máu nhược sắc rất nhẹ. Cá thể mất 2 gene
( /αα ) hoặc (-α/-α) là người mắc alpha thalassemia thể nhẹ, có biểu hiện thiếu máu nhược sắc,
MCV và MCH giảm. Cá thể mất 3 gene (- -/-α ) là người bị bệnh Hemoglobin H (HbH), chỉ có 1
gene hoạt động để sinh ra alpha globin, sẽ có biểu hiện thiếu máu nhược sắc ở mức độ nhẹ đến
trung bình, MCV và MCH giảm. Người mắc HbH có thể kèm theo các biến chứng khác như: lá
lách to, sỏi mật tăng nguy cơ nhiễm trùng, vàng da, và cần truyền máu ở các mức độ khác nhau
trong từng trường hợp. Cá thể mất hoàn toàn 4 gene ( / ) hay còn gọi là Hemoglobin Bart. Đây
là thể nặng nhất của bệnh alpha thalassemia. Thai nhi mắc Hemoglobin Bart thường bị phù nhau
thai, thai chết lưu trong tử cung hoặc chết sớm sau sinh. Thể này đặc biệt phổ biến các nước
Đông Nam Á như Việt Nam, Thái Lan, Philippines [5]
Bệnh nhân và người mang gen bệnh alpha Thalasemia được chẩn đoán xác định dựa vào
đặc điểm lâm sàng và các xét nghiệm huyết học. Việc xác định các đột biến trên vùng gen alpha
globin bằng các kỹ thuật di truyền phân tử là điều kiện thiết yếu để thực hiện chẩn đoán trước
sinh bệnh alpha thalassemia cho các gia đình có tiền sử sinh con mắc HbH hoặc người mẹ có tiền
sử phù thai, thai chết lưu nhiều lần do mắc Hemoglobin Bart. Vì lý do đó, chúng tôi đã tiến hành
nghiên cứu với mục tiêu:
1. Phát hiện các đột biến trên gen HbA1 và HbA2 trên bệnh nhân alpha thalassemia.
2. Chẩn đoán trước sinh bệnh alpha Thalassemia.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
1. Đối tượng:
17 mẫu máu ngoại vi của người mang gene bệnh alpha Thalassemia được thu thập từ tháng

6/2009 đến 8/2010.
03 mẫu dịch ối của các thai phụ đã có tiền sinh con đầu được chẩn đoán mắc bệnh HbH.
Quy trình chọc hút dịch nước ối được tiến hành tại khoa Sản - Bệnh viện Bạch Mai
2. Phương pháp
* Nuôi cấy tế bào dịch ối: Dịch ối được nuôi cấy trong dung dịch Amniomax Fluid – là
môi trường nuôi cấy đặc hiệu chỉ cho tế bào dịch ối. Sau khi nuôi cấy từ 10 đến 14 ngày, các tế
bào dịch ối được thu hoạch và rửa sạch bằng dung dịch PBS 1X
* Tách chiết ADN từ mẫu máu ngoại vi và tế bào dịch ối sau nuôi cấy:
ADN được tách trực tiếp từ mẫu máu ngoại vi chống đông EDTA và tế bào dịch ối sau
nuôi cấy bằng Kit QiaAmp DNA mini kit (Qiagen)
* Kỹ thuật Multiplex PCR
Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR thay thế cho kỹ thuật
PCR cổ điển để nhận biết sự mất đoạn của 5 đột biến mất đoạn lớn. Trình tự mồi được thiết kế
theo Samuel S.Chong và cộng sự [1].


* C-ARMS-PCR
C-ARMS-PCR (Combine Amplification Refractory Mutation System Polymerase Chain
Reactions) là kỹ thuật Multilpex PCR được sử dụng để sàng lọc các đột biến. Phản ứng này
dùng các mồi đặc hiệu có trình tự đầu 3’ bổ sung với alen đột biến và một mồi chung ngược
chiều với với mồi đặc hiệu alen [4]. Sự có mặt của đột biến được thể hiện bằng sản phẩm ADN
khuếch đại với các kích thước khác nhau đã biết trước. Kỹ thuật này được dùng để phát hiện và
xác định kiểu gene của đột biến.
* Giải trình tự vùng gene alpha globin và phân tích kết quả
Giải trình tự gene được thực hiện trên máy ABI 3130. Kết quả được phân tích bằng phần
mềm Chromas và Chromas Pro, sau đó được đưa lên Ngân hàng gene (Gene Bank) để so sánh
với trình tự gen alpha thalasemia chuẩn.

III. KẾT QUẢ
Từ tháng 6/2009 đến 8/2010, 17 mẫu máu ngoại vi của người mang gene bệnh alpha
Thalassemia và 3 gia đình có tiền sử sinh con đầu mắc HbH được tiến hành xét nghiệm di truyền
xác định đột biến trên gen HbA1 và HbA2 tại Khoa Di truyền và Sinh học phân tử BV Nhi
Trung ương.







MK: Marker 1kb. (1): Mẫu chứng bình thường. (2): Mẫu chứng mất đoạn SEA. (3): Mẫu chứng
mất đoạn α3.7. (4): Mẫu chứng mất đoạn α4.2. (5): Mẫu chứng mất đoan SEA và α3.7 (HbH).
(6): Mẫu chứng mất đoan SEA và α4.2 (HbH). (7): Mẫu DNA của người bố mất đoạn α4.2. (8):
Mẫu DNA của người mẹ mất đoạn SEA. (9): Mẫu DNA của thai nhi mất đoạn SEA


MK: Marker 100bp. (1): Mẫu chứng bình thường. (2): Mẫu chứng dị hợp đột biến HbCs. (3):
DNA của người dị hợp đột biến HbQs. (4). DNA của thai nhi dị hợp tử đột biến HbQs




IV. BÀN LUẬN:
Về các bước tiến hành sàng lọc đột biến gen trên 17 mẫu bệnh phẩm, chúng tôi tiến hành
kỹ thuật Multiplex PCR và C-ARMS-PCR để phân tích bước một đối với 5 loại đột biến có tần
suất gặp cao nhất đối với quần thể người Đông Nam Á: SEA, Thailand, Philipin, α3.7, α4.2, phát
hiện 11 mẫu đều mang một đột biến dị hợp tử. 6 mẫu còn lại được tiến hành sàng lọc bước thứ 2

đối với 2 loại đột biến HbQs, HbCs, phát hiện 5 mẫu đều mang một đột biến dị hợp tử. 1 mẫu
không phát hiện thấy mang đột biến nào trong số 7 đột biến thường gặp đã sàng lọc. Trường hợp
này chúng tôi tiến hành giải trình tự gen HbA1 và HbA2 để phát hiện các đột biến khác. Từ kết
quả trên, chúng tôi nhận thấy kỹ thuật Multiplex PCR và C-ARMS-PCR có độ đặc hiệu cao, thay
thế cho kỹ thuật PCR cổ điển, cho phép sàng lọc nhiều loại đột biến trong cùng một phản ứng,
cho kết quả chính xác, giảm thời gian và giá thành xét nghiệm. Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy
trình tự các bước sàng lọc như đã trình bày ở trên, với kết quả thu được, hoàn toàn phù hợp với
đặc điểm tần suất của các loại đột biến thường gặp với quần thể nghiên cứu của chúng tôi. Do
đó, các bước sàng lọc này sẽ được áp dụng rộng rãi hơn trong các nghiên cứu tiếp theo về bệnh
lý này.
Về tần suất của 7 đột biến thường gặp trên gen alpha Thalassemia trên 17 mẫu nghiên cứu,
có 16 mẫu mang ít nhất một đột biến dị hợp tử, trong đó tần suất alen đột biến loại SEA chiếm tỷ
lệ cao nhất (%). Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trên thế giới, như Thái Lan, Đài Loan,
Malaysia [3].
Trong 7 đột biến thường gặp được sàng lọc bằng phương pháp PCR, không phát hiện thấy
trường hợp nào mang các đột biến loại Thailand, Philipin và α3.7. Tuy nhiên, trong một số
nghiên cứu, các đột biến này được tìm thấy trên một số quần thể lân cận như: Đài Loan và người
Đông Nam Á (1-2%) [1] . Do đó, để có kết luận về tần suất gặp của 3 loại đột biến này, chúng tôi
sẽ tiếp tục tiến hành nghiên cứu khảo sát trên một cỡ mẫu lớn hơn.
Đối với 1 mẫu nghiên cứu không phát hiện thấy mang đột biến nào trong số 7 loại đột biến
thường gặp, chúng tôi đã tiến hành giải trình tự vùng gen alpha globin và phát hiện thấy một đột
biến điểm (ATG>A-G). Đây là đột biến mất một nucleotit (T) tại codon ATG, là codon đầu tiên
của gene HbA2. Theo các nghiên cứu đã công bố, đây là loại đột biến khá hiếm gặp, trên thế giới
cho đến nay chỉ có hai trường hợp được công bố mang đột biến này, một ở Thái Lan [5] và một ở
Việt Nam [5]. Đây là một phát hiện bước đầu mang nhiều ý nghĩa, đóng vai trò quan trọng trong
việc nghiên cứu phát hiện các đột biến hiếm gặp và đột biến mới trên gen alpha Thalassemia.
Đối với chẩn đoán trước sinh bệnh alpha Thalassemia, chúng tôi đã tiến hành chẩn đoán
trước sinh cho 3 gia đình có tiền sử sinh con đầu mắc HbH. Các sản phụ được tiến hành chọc ối
tại thời điểm thai được 16-18 tuần tuổi. Hai thai nhi được phát hiện mang đột biến dị hợp tử hoặc
từ bố hoặc từ mẹ bằng phương pháp PCR, là người lành mang gen bệnh. Một thai nhi là con của

mẫu nghiên cứu mang đột biến điểm ATG>A-G như đã trình bày ở trên, đã được áp dụng kỹ
thuật giải trình tự gen để phát hiện đột biến này, và chúng tôi đã không phát hiện thấy đột biến
này của người mẹ trên trình tự gen của thai nhi, mà thai nhi chỉ mang đột biến dị hợp tử từ người
bố, do đó thai nhi là người lành mang gen bệnh.
Xác định kiểu đột biến và kiểu gen trên các bệnh nhân alpha Thalassemia và bố mẹ của
bệnh nhân là yêu cầu bắt buộc với chẩn đoán trước sinh bệnh alpha Thalassemia trong những lần
sinh con tiếp theo. Đối với mẫu bệnh phẩm dịch ối, thời gian thích hợp để tiến hành chẩn đoán
trước sinh là khi thai nhi được 16-18 tuần tuổi. Thời điểm này được xem là tương đối muộn ở
một số nước trình độ y học phát triển ứng dụng kỹ thuật sinh thiết gai rau ở tuần thai thứ 8-10.
Thời điểm chẩn đoán trước sinh trong ba tháng đầu của thai kỳ có ý nghĩa quan trọng trong việc
tránh các nguy cơ phù thai, thai chết lưu ở các giai đoạn sau của thai kỳ cho những thai phụ có
tiền sử mang thai mắc huyết sắc tố Bart, và đối với các quyết định đình chỉ thai nghén của gia
đình người bệnh. Do vậy, việc kết hợp với các đơn vị sản khoa, sử dụng mẫu bệnh phẩm gai rau
trong chẩn đoán trước sinh sẽ là hướng phát triển trong các nghiên cứu tiếp theo của chúng tôi.

V. KẾT LUẬN
Trong 7 đột biến sàng lọc, alen đột biến dạng SEA gặp với tần suất cao nhất 59%, đột biến
HbQs: 17,6%, HbCs: 11,8%, α4.2: 5,9%.
Tiến hành chẩn đoán trước sinh thành công cho 3 gia đình có tiền sử sinh con đầu mắc
HbH, trong đó cả 3 gia đình có thai có thai là người lành mang gen bệnh.
Áp dụng thành công kỹ thuật Multilex PCR và C-ARMS PCR trong việc sàng lọc các đột
biến thường gặp và kỹ thuật giải trình tự gene alpha để phát hiện các đột biến ít gặp trong chẩn
đoán sau sinh và trước sinh, góp phần giảm thiểu tỷ lệ sinh con mắc bệnh alpha Thalassmia, và
nâng cao chất lượng dân số.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Samuel S.Chong, Corinne D.Boehm, Douglas R. Higgs vaf Garry R.Cutting. 2000.
Single-tube multiplex PCR screen for common deletion determinants of alpha thalassemia. Blood
journal 95: 360-362
2. Samer A Bleibel, Robert J Leonard, Jennifer L Jones-Crawford, Abdullah Kutlar, Linda

K Hendricks. Emedicine
3. Suthat Fucharoen, Vip Viprakasit. HbH disease: clinical course and disease modifiers.
American Society of Hematology
4. Yong-Chui Wee, Kim-Lian Tan, Kek-Heng Chua, Elizabeth George, Jin-Ai mary Anne
Tan. 2009. Molecular characterisation of Haemoglobin Constant Spring and Haemoglobin
Quong Sze with a Combine-Amplification Refractory Mutation System. Malaysian Journal of
Medical Sciences, Vol.16, No.3.
5. Disorders of Hemoglobin, Second edition.