Nghiên cứu ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
ĐẠI HỌC Y DƯC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH



HUỲNH NGHĨA



NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG QUY TRÌNH XỬ LÝ
TẾ BÀO GỐC MÁU CUỐNG RỐN


CHUYÊN NGÀNH : BỆNH HỌC NỘI KHOA
Mã số: 3 01 31



TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC






TP. HỒ CHÍ MINH - Năm 2007




Công trình được hoàn thành tại : Đại Học Y Dược TP. Hồ Chí Minh

Người hướng dẫn khoa học :
1. PGS. Trần Văn Bé
2. PGS. TS. Trần Thò Liên Minh


Phản biện 1 : PGS.TS. Nguyễn Thò Thu Hà
Bệnh viện TW QĐ 108


Phản biện 2: PGS.TS. Nguyễn Anh Trí
Viện Huyết học Truyền máu Trung ương

Phản biện 3: TS. Nguyễn Tấn Bỉnh
Bệnh viện Truyền máu – Huyết học TP. Hồ Chí Minh

Luận án sẽ được bảo vệ tại Hội đồng chấm luận án cấp Nhà nước họp tại : Đại học
Y Dược TP. Hồ Chí Minh

Vào hồi 8 giờ 30 phút , ngày 02 tháng 12 năm 2007


Có thể tìm luận án tại:
- Thư viện quốc gia Việt Nam
- Thư viện khoa học tổng hợp TP. Hồ Chí Minh
- Thư viện Đại học Y Dược TP.Hồ Chí Minh

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN
1. Huỳnh Nghóa (2004) , “Tình hình thu thập, sàng lọc và xử lý máu cuống rốn tại
bệnh viện Truyền máu-Huyết học TP. Hồ Chí Minh”, Y học Việt Nam, tập 299(6) ,
tr. 5-12.
2. Huỳnh Nghóa, Trần Quốc Dũng , Lê Thò Dòu Hiền (2004) , “Bước đầu đánh giá chất
lượng sản phẩm tế bào gốc từ máu cuống rốn bằng các kỹ thuật đếm tế bào CD34+
và nuôi cấy khúm tế bào”, Y học Việt Nam, tập 299(6) , tr. 36-40.
3. Tran van Be, Tran van Binh, Nguyen tan Binh, Huynh Nghia, Bao Minh Hien
(2006), “Current status bone marrow transplantation at Blood transfusion and
Hematology Hospital, HoChiMinh City, VietNam“, The 11
th
Congress of the Asia
Pacific Bone Marrow Transplantation, Nagoza, Japan.








1
GIỚI THIỆU LUẬN ÁN
1. Đặt vấn đề :

Cho đến nay, nhiều nghiên cứu trên thế giới đã chứng
minh máu cuống rốn (MCR) có thể thay thế tủy xương dùng để
ghép cho các bện lý hệ tạo máu do các ưu điểm sau : (1) Dễ tiến
hành thu thập, (2) Tỉ lệ nhiễm virus thấp, nhất là CMV, (3) Có
nhiều người cho và thời gian tìm phù hợp HLA rút ngắn lại,(4)
Dung nạp miễn dòch tốt, ngay cả không phù hợp HLA từ 1-3 kháng
nguyên,(5) Tần xuất GVHD thấp và nhẹ, dễ dàng điều trò sau
ghép. Từ các lợi điểm trên mà các nước trên thế giới cũng như các
nước trong khu vực đã tiến hành tổ chức thu thập, xử lý và lưu trữ
tối đa các mẫu MCR bằng các công nghệ tiên tiến để sẵn sàng cho
điều trò cho bệnh nhân.
Tại Việt Nam, việc tìm hiểu các yếu tố trong MCR ở các
sản phụ người Việt Nam đã được Trung tâm Truyền máu Huyết
học TP. Hồ Chí Minh thực hiện và kết quả cho thấy MCR của các
sản phụ người Việt Nam đủ tiêu chuẩn của một sản phẩm sử dụng
trong ghép để thay thế cho các nguồn tế bào gốc từ tủy xương hoặc
máu ngoại biên. Do vậy, để tiến tới xây dựng một ngân hàng MCR
tại TP. Hồ Chí Minh đáp ứng các tiêu chuẩn quốc tế và thật sự
mang lại lợi ích cho cộng đồng, , chúng tôi tiến hành nghiên cứu
ứng dụng quy trình xử lý tế bào gốc máu cuống rốn . Thực hiện
nghiên cứu này, chúng tôi mong muốn đạt được các mục tiêu sau
đây :
1. Xây dựng và hoàn thiện quy trình tuyển mộ, sàng lọc người
cho trước thu thập MCR
2. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình kỹ thuật thu thập MCR
sau giai đoạn xổ nhau.

2
3. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình xử lý MCR bằng kỹ
thuật có chất trầm lắng HES (Hydroxy Ethyl-Starch).

4. Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế bào
máu gốc MCR ở nhiệt độ –196
0
C.
5. Chuẩn hóa và hoàn thiện các xét nghiệm sinh học: đếm số
lượng tế bào nhân , số lượng tế bào CD34 (+), nuôi cấy
khúm tế bào , đếm tế bào sống và các xét nghiệm sàng lọc
vi khuẩn, virus theo các giai đoạn để đánh giá chất lượng
sản phẩm tế bào gốc đạt tiêu chuẩn.
6. Đánh giá hiệu quả ứng dụng sản phẩm tế bào gốc MCR
được xử lý trong thực hành ghép tại Bệnh viện Truyền máu
Huyết học TP. Hồ Chí Minh.
2. Tính cấp thiết của đề tài :
Tổng kết 10 năm điều trò bệnh về máu tại Bệnh viện
Truyền máu Huyết học TP. Hồ Chí Minh cho kết quả : Các bệnh lý
ác tính chiếm: 50,24% trong tổng số bệnh nhân. Trong số này chỉ
đònh điều trò bằng ghép khoảng 20% (700 bệnh nhân). Nhưng vì
không tìm được người cho phù hợp để ghép, do đó dò ghép tuỷ
xương cho 3 bệnh nhân và 18 bệnh nhân tự ghép tế bào gốc máu
ngoại vi mới chỉ bằng 3% số bệnh nhân có chỉ đònh điều trò bằng
ghép. Các bệnh Hemoglobin và bệnh Thalassemia chiếm 12%
tổng số bệnh nhân . Trong loại bệnh này chỉ có dò ghép mà không
có tự ghép , trong đó tất cả các bệnh nhân thể nặng của bệnh
Thalassemia đều có chỉ đònh ghép, nhưng chỉ mới dò ghép được 2
bệnh nhân. Nguyên do không thể tìm người cho phù hợp là vì anh
em đồng huyết thống thì rất ít, mà người cho ngoài huyết thống thì
chúng ta chưa thành lập được cơ sở dữ liệu và ngân hàng tuỷ quốc
gia, cũng như chưa gia nhập hệ thống truy tìm quốc tế . Do vậy,

3

nếu quan niệm ghép tế bào gốc là phướng pháp điều trò tối ưu thì
nhu cầu tìm một nguồn tế bào khác khả thi như MCR để xử lý tạo
thành một sản phẩm trò liệu, tồn trử đông lạnh lâu dài trong một
ngân hàng, sẵn sàng để truy tìm và ghép cho bệnh nhân là nhu cầu
bức thiết hiện nay, phù hợp với đường hướng hiện đại hoá nền y
học nước nhà.
3. Những đóng góp mới của luận án :
- Xây dựng và hoàn thiện các bước tuyển chọn –sàng lọc
người cho MCR trước khi thu thập
- Chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình thu thập MCR sau giai
đoạn xổ nhau, bên cạnh đó đã rút ra nhiều kinh nghiệm trong tổ
chức và phối hợp giữa nhân viên chuyên môn và người thu thập
MCR. Chọn lựa thể tích MCR ≥ 60ml và điện di Hemoglobin trước
xử lý MCR là thích hợp để tránh lãng phí do số lượng tế bào nhân
thấp và mang mầm bệnh di truyền.
- Đã áp dụng và hoàn thiện quy trình xử lý MCR có chất HES
để tạo sản phẩm tế bào gốc ổn đònh
- Hoàn thiện quy trình lưu trữ đông lạnh tự động tế bào gốc
trong Nitơ lỏng -196
0
C. Đây là các kỹ thuật công nghệ sinh học
tiến tiến và có ý nghóa khoa học cao.
- Chuẩn hoá và hoàn thiện các xét nghiệm mới để đánh giá
số lượng và chất lượng của sản phẩm MCR bao gồm : đếm tế bào
CD34+, tế bào sống, nuôi cấy khúm tế bào được lồng ghép vào
trong các quy trình thu thập, xử lý và lưu trữ đông lạnh MCR
- Hoàn thiện quy trình dò ghép tế bào MCR cho các bệnh
nhân được chẩn đoán bệnh máu ác tính và β Thalassemia thể nặng.

4

Đóng góp lớn nhất của đề tài là đã chuẩn hóa và hoàn thiện
các quy trình của một ngân hàng MCR đạt tiêu chuẩn quy ước và
sản phẫm tế bào gốc MCR đảm bảo an toàn cho cuộc ghép.
4. Bố cục của luận án :
Luận án gồm 147 trang, bao gồm phần mở đầu 4 trang, tổng
quan tài liệu 43 trang, đối tượng và phng pháp nghiên cứu 23
trang, kết quả nghiên cứu 33 trang, bàn luận 40 trang, kết luận 2
trang và kiến nghò 2 trang.
Chương 1.TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Lược sử phát triển : Năm 1974, Konedtzon – Ogawa-cs đã
chứng minh có sự hiện diện tế bào gốc trong MCR. Năm 1984 –
1985, Bosey Edward, Broxmeyer-cs thực nghiệm ghép MCR trên
chuột, năm 1988, Gluckman và cs thực hiện ghép MCR đầu tiên
cho em bé mắc bệnh Fanconi thành công . Sau năm này, đã có rất
nhiều các nghiên cứu về sinh học, miễn dòch trên thế giới về tế bào
gốc của MCR , từ năm 1991-1997, hàng loạt các trường hợp ghép
MCR được thực hiện trên trẻ em và người lớn thành công ở các
mức độ khác nhau. Từ 1998 cho đế nay, trên thế giới cũng như
trong khu vực đã có nhiều ngân hàang MCR của nhà nước và tư
nhân được thành lập để thu thập, xử lý và lưu trữ lâu dài MCR để
ghép , và cho đến nay MCR được xem là nguồn tế bào gốc thay
thế cho tuỷ xương để ghép.
1.2 Tế bào gốc sự hình thành và phát triển : Chúng được hình
thành từ trung bì phôi thai ở túi noãng hoàng , từ ngày thứ 18.5
đã có hồng cầu và tế bào CD34+, ngày thứ 24 – 34 tế bào tiền
thân dòng lymphô và dòng tủy . Từ tuần lể thứ 7, gan là nơi tạo
máu , tháng thứ 3 lách là nơi tạo máu và từ tháng thứ 4- thứ 5, tủy
xương là nơi tạo máu cho đến tuổi trưởng thành . Đặc tính tạo dòng

5

của tế bào gốc tạo máu là các tế bào đa năng dần dần tự thay thế
để chuyển sang giai đoạn biệt hóa cao hơn và đồng thời mất dần
tính đa năng của chúng. Có 2 loại tế bào gốc tạo máu : (1) Tế bào
gốc tạo máu dài hạn : số lượng ít , non, chưa biệt hóa mang dấu ấn
CD34+, Thy+ và Lin-, chúng có khả năng tự tái tạo và biệt hóa
cao. (2) Tế bào gốc tạo máu ngắn hạn : trưởng thành, có khả năng
tái tạo trong 8 tuần và sinh ra các dưới nhóm CFU-E, CFU-
GEMM, và CFU-L.
1.3 Máu cuống rốn :
Đặc điểm sinh học : Chứa nhiều tế bào gốc , gấp 8 lần so với tủy
xương . Tần xuất tế bào gốc MCR/ml : BFU – E:8.10
3
, CFU – GM
: 13-24. 10
3
, CFU – GEMM: 1-10. 10
3
. Các tế bào đầu tiên trong
nuôi cấy lâu dài là CFU ( 5 tuần ) biệt hóa thành 1/13.000 TBĐN
và ( 8 tuần ) là 1/34.000 TBĐN. Tế bào gốc MCR mang tế bào
CD34+ cao, khoảng 1% TBĐN, tế bào CD34+HLADR- và
CD34+38- của MCR cao hơn tủy xương.
Đặc điểm miễn dòch học : MCR có khả năng dung nạp miễn dòch
cao hơn tủy xương vì tế bào lympho CD3 ít, tế bào NK thấp và đặc
biệt là tế bào Lympho T mang hoạt tính thấp ( ít tế bào CD4,CD8;
điểm tiếp nhận CCR5 cytokin thấp và IL10 cao) vì vậy phản ứng
GVHD thấp nhưng GVL vẩn còn hiện hữu.
1.4 Thu thập, xử lý và lưu trữ tế bào gốc : là các bước chính yếu
trong tổ chức và xây dựng các ngân hàng MCR. Trên thế giới đã có
nhiều nghiên cứu vế các quy trình này, tựu trung lại bao gồm các

quy trình sau: (1) quy trình sàng lọc và chọn lựa người cho MCR,
(2) quy trình thu thập MCR trước và sau xổ nhau, các tiêu chuẩn
quy ước để thu thập,(3) quy trình xừ lý MCR bao gồm : quay ly
tâm “ Top and Bottom”, có thêm chất trầm lắng (HES), phương

6
phạp lọc, các quy trình này có các lợi điểm khác nhau .(4) quy
trình lưu trữ đông lạnh tế bào gốc MCR, cho đến nay hầu hết các
ngân hàng đều chọn hế thống đông lạnh MCR với Nitơ lỏng (-
196
0
C), hệ thống đông lạnh có kiểm soát tốc độ.(5) Đặc biệt các
xét nghiệm đánh giá về số lượng và chất lượng máu cuống rốn
được lồng ghép vào các quy trình trên để đảm bảo tối ưu sản phẩm
MCR cho lưu trử lâu dài. Các xét nghiệm bao gồm: Đếm tế bào
nhân, tế bào CD34+, tế bào sống, sàng lọc vi khuẩn, virus, sàng
lọc bệnh hemoglobin, và nuôi cấy khúm tế bào.
1.5 Ứng dụng ghép tế bào gốc máu cuống rốn : Cho đến nay đã
có nhiều ngân hàng MCR được thành lập, tại Châu Á tính đến
5/2005 đã có trên 90.000 mẫu MCR được lưu trữ và 625 mẫu MCR
được ghép cả người lớn và trẻ em. Trên thế giới, cho đến 3/2006
đã có trên 100.000 mẫu được lưu trữ và 2530 trẻ em và 1697 người
lớn đã ghép MCR. 70 bệnh lý thuộc bệnh máu ác tính và di truyền
bẩm sinh được sử dụng MCR để điều trò . Sau 3 năm theo dõi ghép
MCR đối với trẻ em tỉ lệ sống không bệnh từ 48-78%, người lớn
26-53%. Các biến chứng sau ghép như GVHD thấp, tuy nhiên tỉ lệ
nhiễm trùng sau ghép cao hơn ghép tủy xương và tế bào gốc máu
ngoại vi bởi vì thời gian mọc bạch cầu hạt chậm hơn.
Chương 2. ĐỐI TƯNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng :

- Máu cuống rốn được thu thập từ những sản phụ theo tiêu chuẩn
chọn lựa để xử lý thành các đơn vò tế bào gốc MCR đạt tiêu chuẩn,
các mẫu này được lưu trữ lâu dài để sử dụng cho ghép.
-Các bệnh nhân bệnh bạch cầu cấp dòng tủy, bạch cầu cấp dòng
lymphô nhóm nguy cơ cao đạt lui bệnh sau hoá trò và bệnh

7
βThalassemia thể nặng , tuổi từ 5 đến 15 tuổi , có các chức năng
của tim, phổi, gan, thận bình thường.
2 2 Phương pháp nghiên cứu :
Chúng tôi áp dụng phương pháp thực nghiệm mô tả và ghép thử
nghiệm. Các bước nghiên cứu được thiết kế như sau :
2.2.1 Các sản phụ được sàng lọc và chọn lựa thu thập theo tiêu
chuẩn : lâm sàng bình thường và xét nghiệm virus B,C,HIV, VDRL
âm tính.
2.2.2 Các mẫu máu cuống (MCR) được thu thập từ các sản phụ
trên sau giai đoạn xổ nhau bằng hệ thống kín, vô trùng.
2.2.3 Các mẫu MCR đạt tiêu chuẩn (≥ 60ml + điện di
hemoglobin (-) được chọn lựa xử lý . Các mẫu MCR được xử lý
bằng kỹ thuật quay ly tâm có chất Hydroxyethyl starch (HES)
2.2.4 Các mẫu MCR được lưu trữ hệ thống đông lạnh tự động
với Nitơ lỏng ở nhiệt độ -196
0
C.
2.2.5 Các xét nghiệm để đánh giá số lượng và chất lượng của
mẫu MCR bao gồm số lượng tế bào nhân, tế bào CD34+, tế bào
sống, nuôi cấy khúm tế bào, xét nghiệm sàng lọc vi khuẩn, vi
nấm,virus,bệnh di truyền. Các xét nghiệm này được lồng ghép vào
các quy trình trên.
2.2.6 Các bệnh nhân được chọn lựa để thực hiện ghép tế bào

gốc từ MCR theo quy trình dò ghép tế bào gốc với các bước sau :
Điều kiện hóa trước ghép bằng Busulphan và Endoxan, tế bào gốc
MCR sau rã đông 37
0
C và được truyền ( ghép) cho bệnh nhân bằng
đường tónh mạch trung ương, phòng ngừa thải ghép bằng
Methotrexate và Cyclosporin, theo dõi và chăm sóc vô trùng sau
ghép.
Chương 3. KẾT QUẢ
Từ tháng 10/2002 cho đến 10/2005, chúng tôi đã khảo sát sàng
lọc trước thu thập và thu thập MCR với kết quả sau:
- Tư vấn và sàng lọc trước thu thập ở 486 sản phụ ở BV Từ Dũ.

8
- Tổ chức và thu thập được 1234 mẫu MCR – trong đó có 712
(57.6%) mẫu MCR ở Bệnh viện Hùng Vương và 522 (42.4%) mẫu
MCR ở Bệnh viện Từ Dũ.
3.1 Kết quả tư vấn và sàng lọc trước thu thập máu cuống rốn:
Chúng tôi đã tiến hành tư vấn, phát phiếu thăm dò ngẫu nhiên cho
486 sản phụ đến khám thai và sanh tại BV Từ Dũ kết quả cho thấy
gần 50% các trường hợp không đạt tiêu chuẩn trước khi quyết đònh
thu thập MCR.Các lý do loại bỏ trước khi thu thập MCR chủ yếu là
bệnh lý sản khoa và nhiễm trùng (37.2%).
3.2 Kết quả thu thập máu cuống rốn
3.2.1 Thời gian thu thập mẫu MCR : 4 phút 17 giây
3.2.2 Số lượng mẫu MCR thu thập : 1234 mẫu được thu thập,
đạt tiêu chuẩn 965 mẫu ( 78,2%), không đạt 269 mẫu(21.8%).
3.2.3 Thể tích MCR thu thập :Thể tích trung bình của mẫu
MCR thu thập trước xử lý là 81.71± 18.98 (60 - 207) ml.
3.2.4 Lý do loại bỏ MCR sau thu thập : Tỉ lệ loại bỏ trước khi

xử lý chủ yếu là do không đủ trọng lượng khá cao trên 50% các
trường hợp, kế tiếp là do bệnh lý hemoglobin (20%).
3.2.5 Đặc điểm sản khoa của người cho MCR:
Bảng 3.14:
Đặc điểm sản khoa của người cho MCR (n = 965)
Đặc điểm sản khoa Tần suất
(%)
Trung
bình
Độ lệch
chuẩn
- Tuổi mẹ (năm)
- Số lần sanh trước đây (lần)
+ 0
+ 1
+ 2
+ >3
- Tuổi thai ( tuần)
- Trọng lượng em bé(gram)
- Trọng lượng nhau (gram)
- Giới tính em bé
+ Nam
+ Nữ


468 (48.5)
346 (35.8)
127 (13.4)
24 (2.2)

445 (46.1)
520 (53.9)
27.89





39.25
3159.61
679.81

5.36





1.07
369.08
103.08

9
3.2.6 Đặc điểm mẫu MCR thu thập
Bảng 3.15:
Đặc điểm mẫu MCR thu thập (n = 965)
Đặc điểm Trung

bình
Độ
lệch
chuẩn
Thấp
nhất
Cao
nhất
- Thể tích MCR (ml)
- Thời gian thu thập (phút)
- SL hồng cầu/ml ( x 10
9
)
- SL hồng cầu/túi ( x 10
9
)
- Hb (g/dL)
- Hb / túi (g/dl) ( x 10
3
)
- SL TBN/ml ( x 10
3
)
- SL TBN/túi ( x 10
7
)
- SLTBCD34+/ túi (x10
6
)
( n=181)

81.71
4.17
3.4
297.28
11.36
994.88
10.23
84.36
2.36

18.98
1.5
0.5
130.83
2.42
494.80
3.15
35.79
1.97
60
2.7
2.5
159.39
9.9
434.0
4.63
30.86
0.78
207
5.8

4.91
849.43
17.4
3010.2
26.7
311.50
7.89
3.2.7 Kết quả khảo sát tương quan giữa yếu tố sản khoa
và mẫu MCR thu thập
Bảng 3.16
Tương quan giữa TP MCR và yếu tố sản khoa :
Phân tích đa biến
Thành phần
MCR
Các yếu tố
tương quan
Hệ số
tương quan
p
Thể tích MCR - Trọng lượng nhau 0.442 <0.001
Số lượng tế bào
nhân MCR
- Trọng lượng nhau
- Thể tích MCR
0.314
0.645

<0.001

Tế bào CD34+

- Tuổi mẹ
- Thể tích MCR
- Số lượng TBN
-0.164
0.332
0.645
<0.05
<0.05
<0.001


10
Bảng 3.17 Tương quan giữa thành phần MCR , yếu tố sản khoa
theo phân nhóm tế bào nhân
Số lượng TBN (n = 965)

Các yếu tố khảo sát
<80x10
7

n = 527
>80x10
7

n = 438
p
Tuổi sản phụ ( năm)
Số lần sanh
Tuổi thai ( tuần )
Trọng lượng em bé ( gr)

Trọng lượng nhau (gr)
Giới tính
Nam
Nữ
27.7 ± 5.3
1.72 ± 0.7
39.15 ± 1.06
3120 ± 365.47
649.75± 365.47

236
309
28.0± 5.49
1.68 ± 0.7
39.36± 1.09
3206. ± 367.94
709. 58 ± 107.65

203
204
>0.05
>0.05
>0.05
<0.001
<0.001

<0.05
Thể tích MCR (ml) 57.70 ± 14.20 113.80± 36.47

<0.001

Số lượng TBN (x 10
7
) 68.88 ± 12.61

91.79± 21.94

<0.001
Tế bào CD34+ trước xử
lý (x 10
6
) ( n= 181)
1.65± 13.2
n = 116
3.28± 9.3
n = 65
<0.001
Nhận xét: Với phân nhóm tế bào, các yếu tố sản khoa liên
quan bao gồm trọng lượng nhau, trọng lượng em bé, và nam > nữ
( p<0.001). Vế TP MCR, có liên quan chặt chẽ giữa thể tích MCR,
SL TBN và tế bào CD34+ với phân nhóm tế bào ( p<0.001)
3.3 Kết quả xử lý MCR
3.3.1 Đặc điểm mẫu MCR sau xử lý bằng kỹ thuật HES
- Tổng số mẫu xử lý: 965 mẫu ,
- Số mẫu loại bỏ sau xử lý: 5 mẫu (0.5%); chủ yếu là do lỗi kỹ
thuật trong tiến trình xử lý mẫu.

11
Bảng 3.18 : Đặc điểm mẫu MCR sau xử lý (n = 960)
Đặc điểm
mẫu MCR sau xử lý

Trung
bình
Độ
lệch
chuẩn
Thấp
nhất
Cao
nhất

- Thể tích MCR (ml)
- Thời gian xử lý ( phút)
- Số lượng hồng cầu /ml ( x 10
9
)
-Số lượng hồng cầu/túi ( x 10
9
)
- Hb (g/dL)
- Hb / túi (g/dl) ( x 10
3
)
- Số lượng TBN/ml ( x 10
3
)
- Số lượng TBN/túi ( x 10
7
)
-Số lượng TBCD34+/ túi ( x10
6

)
( n=181 )
23.40
76
4.69
117.72
18.04
427.06
10.23
84.36
2.26

0.56
8
0.44
11.26
5.4
123.84
3.15
35.79
1.87
22
61
4.2
97.86
13.02
309.90
4.63
30.86
0.51

24.5
93
6.05
145.80
49,40
1136.20
26.7
311.50
6.79


3.3.2 Kết quả giảm thể tích và loại bỏ hồng cầu sau xử lý
Bảng 3.19
: Kết quả giảm thể tích và loại bỏ hồng cầu sau xử lý

n=960
Thể tích
(ml)
Số lượng hồng
cầu/túi
( x 10
9
)
Hb
(g/dL)
p
Trước xử lý
Sau xử lý
81.71± 18.98
24.73± 7.07

297.28 ± 130.83
117.72±11.26
18.04±5.4
9.11± 3.2
Tỉ lệ %
giảm
69.7% 55.41% 50.54%


<0,001

Nhận xét
: tỉ lệ giảm thể tích > 60% và loại bỏ hồng cầu > 50%

12
3.3.3 Kết quả tăng số lượng TBN và tế bào CD34+ sau xử lý
Bảng 3.20:
Khả năng tăng số lượng tế bào nhân và tế bào CD34 +
sau xử lý
Mẫu MCR
(n=960)
Tế bào nhân
(x 10
6
/ml)
Tế bào đơn
nhân
(x 10
6
/ml)

Tế bào
CD34+
(x 10
3
/ml)

p

Trước xử lý
Sau xử lý
10.23 ± 14.06
32.86 ± 3.23
4.21± 2.66
19.14± 12.15
9.94± 6.13
36.86± 7.55

Số lần tăng
3.21 4.54 3.7

<0,001
Nhận xét: Sau xử lý khả năng gia tăng tế bào nhân và tế bào
CD34+ trên gấp 3 lần và tế bào đơn nhân hơn gấp 4 lần.
3.3.4 So sánh kết quả SLTBN và TBĐN trung bình của túi MCR
trước và sau xử lý
Bảng 3
.21: Kết quả SLTBN, TBĐN của MCR trước- sau xử lý
Mẫu MCR (n=960) SLTBN
(x 10
7

)
Tế bào đơn nhân
(x 10
7
)
p
Trước xử lý
Sau xử lý
81.74± 35.10
75.01± 37.04
36.78± 25.73
33.23± 24.75
Tỉ lệ % giảm tế bào 8.2% 9.6%

>0.05
Nhận xét: Tỉ lệ giảm SLTBN, TBĐN là 8.2%, 9.6% ( p>0.05)
3.3.5 So sánh kết quảTBCD34+ túi MCR trước và sau xử lý
Bảng 3.22
: Kết quả tế bào CD34+ toàn bộ trước và sau xử lý
Tế bào CD34
+ (x 10
6
)
Tỉ lệ % giảm tế bào
CD34+ sau xử lý
p
Trước xử lý
Sau xử lý
2.36 ± 1.97
2.26± 1.85

4.2

>0.05
Nhận xét: Sau xử lý tỉ lệ mất TB CD34+ là 4.2% với( p >0.05)

13
3.3.6 So sánh kết quả đếm TB sống túi MCR trước và sau xử lý
Bảng 3.23
: Kết quả đếm tế bào sống trước - sau xử lý MCR
Số mẫu
( n = 57 )
Tỉ lệ %
tế bào sống
Tỉ lệ % giảm tế
bào sống
p
Trước xử lý
Sau xử lý
97.6± 1.5
95.5± 2.5

2.1

>0.05
Nhận xét: Sau xử lý tỉ lệ mất tế bào sống là 2.1 % với p >0.05.

3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào tạo khúm sau xử lý MCR
3.4.1 Số lượng và kết quả nuôi cấy khúm tế bào sau xử lý : Số
mẫu nuôi cấy: 180 mẫu, số mẫu nuôi cấy thu hoạch được: 171 mẫu

, 9 mẫu loại bỏ do nhiễm trùng : 4 , do kỹ thuật : 2, môi trường bò
hư : 3 mẫu
3.4.2 Kết quả chung các TP khúm mọc sau nuôi cấy tế bào
Bảng 3.24
: Kết quả của nuôi cấy khúm tế bào của MCR sau xử lý
Mẫu MCR nuôi cấy
(n = 171)
Trung
bình
Độ
lệch
chuẩn
Thấp
nhất
Cao
nhất
- BFU-E (mL) ( x10
3
)
- CFU-GM (mL) ( x10
3
)
- CFU-GEMM (mL) ( x10
3
)
- CFU-Total (mL) ( x10
3
)
4.54
13.35

13.91
31.68
2.13
6.02
6.75
13.92
1.0
4.0
5.0
10
10.0
28
32
65
- BFU-E ( túi) ( x10
4
)
- CFU-GM/ (túi) ( x10
4
)
- CFU-GEM ( túi) ( x10
4
)
- CFU-Total (túi) ( x10
4
)
10.64
31.17
32.42
74.13

4.99
14.02
15.79
32.31
2.3
9.3
11.6
23.3
23.3
65.4
74.5
154.1


14
3.4.3 Kết quả khảo sát tương quan giữa yếu tố sản khoa , thành
phần MCR và các khúm mọc sau nuôi cấy tế bào
Phân tích đa biến
Thành phần khúm
mọc sau nuôi cấy
MCR
Các yếu tố
tương quan
Hệ số
tương quan
p
BFU-E -Trọng lượng em bé
-Thể tích MCR
-Tế bào CD34+
0.269

0.656
0.734

<0.001

CFU-GM -Trọng lượng em bé
-Thể tích MCR
-Tế bào CD34+
0.220
0.709
0.674

<0.001
CFU-GMME -Trọng lượng em bé
-Thể tích MCR
-Tế bào CD34+
0.216
0.691
0.765
<0.05
<0.001
<0.001
CFU-total -Trọng lượng em bé
-Thể tích MCR
-Tế bào CD34+
0.287
0.738
0.784

<0.001

3.5 Kết quả sàng lọc tế bào MCR thu thập
3.5.1 Kết quả sàng lọc bệnh lây lan
Bảng 3.25
: Kết quả sàng lọc bệnh lây lan qua mẫu MCR
Mẫu MCR sàng lọc
(n = 965)
Số mẫu
dương tính
Tỉ lệ
(%)
- HBsAg 23 2.40
- anti HCV 15 1.58
- anti HIV (1+2) 4 0.40
- HTLV1 3 0.32
-VDRL 0 0.00
- IgM CMV ( n: 789) 7 0.88

15
3.5.2 Kết quả sàng lọc vi khuẩn, vi nấm
Bảng 3.26:
Tỉ lệ nhiễm vi khuẩn, vi nấm trước - sau xử lý MCR
Mẫu MCR sàng lọc
(n = 965)
Số mẫu cấy
dương tính
Tỉ lệ
(%)
Hệ số
chênh
Trước xử lý 18 1.86 Vi

trùng
Sau xử lý thêm 2 trường hợp ( 20) 2.07
0.2%
Trước xử lý 7 0.72 Vi
nấm
Sau xử lý thêm 1 trường hợp(8) 0.82
0.1%
Trước xử lý 25 2.59 Tổng
cộng
Sau xử lý Dương tính thêm 3 (28) 2.90
0.31%
Nhận xét: Tổng số trường hợp cấy dương tính vi khuẩn-nấm sau
xử lý thêm 3 trường hợp(0.31%)
3.5.3 Kết quả sàng lọc bệnh hemoglobin
Bảng 3.27:
Kết quả sàng lọc bệnh hemoglobin (trước khi xử lý)
Mẫu MCR sàng lọc
(n = 965)
Số mẫu
bất thường
Tỉ lệ
(%)
- Hemoglobin A2 28 2.90
- Hemoglobin E 20 2.07
- Hemoglobin H 12 1.24
Tổng cộng 60 6.21
3.6 Kết quả MCR dự trữ đông lạnh (- 196
0
c) sau xử lý
3.6.1 Kết quả số lượng mẫu MCR được lưu trữ : 960 mẫu lưu trữ,

89 mẫu ( 8.9%) loại bỏ sau lưu trữ, chủ yếu do bệnh lý lây nhiễm
52 mẫu ( 5.31%)

16
3.6.2. Kết quả thăm dò tế bào sống của mẫu mcr được lưu trữ
theo thời gian
Bảng 3.28:
Kết quả đếm tế bào sống theo thời gian lưu trữ
Mẫu MCR 6 tháng
(n=10)
1 năm
(n=8)
2 năm
(n=10)
3 năm
(n=9)
Tỉ lệ (%) tế bào sống 94.5% 93.6% 92.8% 92.4%
p >0.05
Nhận xét: Không có sự khác biệt về đếm SLTB sống theo thời
gian lưu trữ đông lạnh (p> 0.05).
3.6.3 Kết quả thành phần của mẫu MCR trước và sau lưu trữ
theo thời gian
Bảng 3.29:
Kết quả so sánh TP MCR trước - sau lưu trữ theo thời
gian
Mẫu MCR
( n = 5 mẫu)
6 tháng

1 năm

2 năm

3 năm

Trước 83.1± 22.5 76.2±
23.4
89.7± 27.4 70.1± 19.8 TBN/túi
(x 10
7
)
Sau 82.4±12.6 74.3±16.9 85.9±26.9 68.7±21.6
Trước 94.5% 93.6% 92.8% 92.4% tế bào
sống
(%)
Sau 93.5% 92.7% 91.4% 90.8%
Trước 96.30±28.4 85.30±18.
2
74.30±22.5 66.30±17.4 CFU-
Total
Sau 90.5±13.5 83.7±20.9 70.0±12.5 62.8±23.5
p >0.05
Nhận xét: Theo thời gian lưu trữ đông lạnh, thành phần MCR
không có sự thay đổi về số lượng cũng như chất lượng (p>0.005).

17
3.7 Kết quả thực nghiệm ghép tế bào MCR
3.7.1 Đặc điểm bệnh nhân chọn ghép tế bào gốc MCR:
- Tổng số : 5 bệnh nhân . - Giới tính : nam: 02; nữ: 03.
- Tuổi trung bình: 10± 4 (6 – 15 tuổi)

- Chẩn đoán : AML: 2 trường hợp , ALL :1 trường hợp ,
Thalassemie thể nặng : 2 trường hợp
3.7.2 Số lượng tế bào gốc MCR được truyền :
- Số lượng TBN : 1.85 ± 0.2 x 10
7
/kg , Tế bào CD34+: 0.36 ± 0.03
x 10
5
/kg , CFU – Total : 1.58 ± 0.3 x 10
4
/kg
3.7.3. Kết quả mọc mảnh ghép : 5 trường hợp đều mọc mảnh
ghép, Thời gian mọc mảnh ghép trung bình: - BCHTT ( >0,5 x
10
9
/l) : 41.4 ± 17.5 ngày (22 - 67 ngày), TC ( SLTC >20 x 10
9
/l) :
60.6 ± 21.3 ngày (29 - 89 ngày).
3.7.4. Kết quả thời gian sống sau ghép :
Thời gian sống trung bình: 23 ± 5.53 tháng.
Còn sống: 2 bệnh nhân ; tử vong: 3 bệnh nhân.

Biểu đồ Kaplan Meier về thời gian sống toàn bộ sau ghép MCR
40 3020100
1.2
1.0
.8
.6
.4
.2
27.20± 8.9 tháng

18

Chương 4. BÀN LUẬN
Từ tháng 2/2002 Ỉ 2/2005, chúng tôi đã nghiên cứu ứng
dụng các quy trình xử lý tế bào gốc MCR của các nước tiến tiến và
từng bước cải tiến để phù hợp với điều kiện Việt Nam. Với kết quả
trên, chúng tôi có những bàn luận sau:
4.1 Về tư vấn và sàng lọc sản phụ trước khi thu thập : Gần hơn
50% trường hơp loại bỏ trước khi thu thập, kết qủa này phù hợp
nghiên cứu của Viện Trường đại học Lafe ( Valencia) và ngân
hàng MCR Hodkaido, Nhật Bản ( p>0.05). Qua khảo sát này, cần
thiết phải có kế hoạch chi tiết trong việc sàng lọc và tư vấn trước
khi thu thập MCR cho các sản phụ, điều quan trọng cần phải có sự
đồng ý của sản phụ trước khi thu thập MCR.
4.2 Về quy trình thu thập MCR:
4.2.1 Kỹ thuật thu thập MCR : Với 1234 mẫu MCR thu thập,
chúng tôi áp dụng kỹ thuật trong hệ thống kín và sau giai đoạn xổ

nhau. Kết quả thu thập không có ảnh hưởng tiến trình sanh, cũng
như sức khoẻ của sản phụ và em bé, điều này cũng phù hợp nghiên
cứu tác giả trong và ngoài nước (p>0.05). Các kinh nhghiệm trong
tiến trình thu thập : (1) thiết kế phòng thu thập gần phòng sanh, (2)
hợp tác chặt chẽ giữa nhân viên thu thập và nhân viên sản khoa,(3)
Thao tác vô trùng và dụng cụ chuẩn bò đầy đủ, (4) Cần có xe
chuyên dùng đề thu thập. Thời gian thu thập không ảnh đến thể
tích thu thập và không khác biệt với tác giả khác (p>0.05).
4.2.2 Thể tích thu thập MCR : Có sự khác biệt tác giả Trần
Văn Bé ( 59.3±16ml) có lẻ do chúng tôi loại bỏ các mẫu MCR
<60ml. Kết quả của chúng tôi không có sự khác biệt tác giả
Yamada (84.2±25.3ml) và Armitage S (79±15ml) với p>0.05.

19
4.2.3 Khảo sát sự tương quan yếu tố sản khoa và thể tích
MCR: Với phân tích đơn biến và đa biến, chúng tôi nhận thấy
trọng lượng nhau có liên quan với thể tích MCR ( r=0.422,
p<0.001), kết qủa này tương đồng tác giả Solven.P với ( r=0.322,
p<0.001).
4.2.4 Về thành phần tế bào nhân : Số lượng tế bào nhân
trong nghiên cứu này không có sự khác biệt các nghiên cứu trong
nước ( p>0.05), nhưng có sự khác biệt nghiên cứu tác giả nước
ngoài ( p<0.05) , có lẻ do thể tạng, kỹ thuật thu thập, yếu tố xã
hội…So với tiêu chuẩn ghép ( TBN=3.7 x 10
7
/kg), mẫu MCR của
chúng tôi có thể ghép trên trẻ em < 30kg là 75% và trên người lớn
>50kg là 38%. Khi phân tích đa biến yếu tố sản khoa, thể tích
MCR liên quan với TBN, chúng tôi nhận thấy không có sự khác
biệt tác giả Solva P và Nagakawa ( p>0.05), trong đó trọng lượng

nhau và thể tích MCR có liên quan lần lượt là (r=0.341) và (
r=0.654). Với chọn ngưỡn TBN 80x 10
7
, chúng tôi nhận thấy có sự
khác biệt rõ rệt giữa TBN< 80x 107 và TBN≥80x10
7
, kết qủa này
tương đồng nghiên cứu Solves.P ( p>0.05).
4.2.5 Về thành phần tế bào CD34+ : Có sự khác biệt kết quả
của chúng tôi với các tác giả Trần Văn Bé và Trần Quôc Dũng (
p<0.05), có lẻ do thể tích MCR thu thập của chúng tôi cao hơn.
Tuy nhiên, không có sự khác biệt tác giả Nagakawa và Solves.P.
Với tiêu chuẩn ghép của tế bào CD34+ là 1.7x 10
5
/kg, mẫu MCR
của chúng tôi đủ đảm bảo số lượng tế bào CD34+ để ghép.
4.3 Quy trình kỹ thuật xử lý máu cuống rốn
4.3.1 Tiêu chuẩn trước khi xử lý : So với tiêu chuẩn của tác
giả trong và nước ngoài , chúng tôi nhận thấy với thể tích MCR thu

20
thập ≥60ml, điện di Hemoglobin (-), và số lượng tế bào nhân
≥80x10
7
là hợp lý trong điều kiện Việt Nam.
4.3.2 Kỹ thuật xứ lý MCR : Chúng tôi chọn kỹ thuật xữ lý
MCR bằng kỹ thuật quay ly tâm có chất HES vì (1) hệ thống xử lý
kín, (2) chất HES rẽ tiền và không độc đối với bệnh nhân, (3) Khả
năng giảm thể tích và loại bỏ hồng cầu cao, (4) Làm bằng tay nên
giá thành rẽ.

4.3.3 Kết quả xử lý MCR: Chúng tôi nhận thấy có sự tương
đồng về thể tích MCR, sự thu hồi tế bào nhân, tế bào đơn nhân, tế
bàoCD34+ của nghiên cứu chúng tôi với tác giả khác trong và
nước ngoài , tỉ lệ thu hồi > 85% sau xử lý ( p>0.05). Duy chỉ có 2
điểm bất lợi trong kỹ thuật này là (1) thời gian để xử lý mẫu nhiều
(>70 phút), (2) khả năng loại bỏ hồng cầu không đồng nhất do tốc
độ trầm lắng khác nhau của chất HES tùy thuộc vào người cho.
4.3.4 Kết quả nuôi cấy tế bào sau xử lý: So sánh kết qủa nuôi
cấy khúm tế bào với các tác giả nước ngoài, chúng tôi nhận thấy có
sự khác biệt về số lượng khúm tế bào mọc ( p<0.05). Sự khác biệt
có thể giải thích là do việc nhận diện các khúm mọc còn mang tính
chủ quan, môi trường nuôi cấy cần phải được chuẩn hóa…Tuy
nhiên, việc mọc khúm tế bào ở tuần thứ 2 cũng là tiêu chuẩn đánh
giá chức năng của mẫu MCR. Phân tích đa biến giữa yếu tố sản
khoa,thành phần MCR và nuôi cấy khúm tế bào, chúng tôi nhận
thấy có sự liên quan chặt chẽ trọng lượng nhau, thể tích MCR, tế
bào nhân, tế bào CD34+với CFU-total, kết quả này không có sự
khác biệt tác giả nước ngoài( p>0.05).
4.5 Quy trình dự trữ đông lạnh MCR sau xử lý -196
0
C:
Chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt về các thông số
bao gồm : số lượng TBN, TB CD34+, TB sống và CFU của sản

21
phẩm MCR trước và sau lưu trử MCR ở -196
0
C vào các thời điểm
6 tháng, 1 năm, 2 năm và 3 năm ( p>0.05). Kết qủa này không có
sự khác biệt tác giả nước ngoài ( nghiên cứu lưu trữ trên 10 năm).

4.6 Về kết quả lây nhiễm virus :
Tỉ lệ nhiễm vius của MCR thấp hơn nhiều tỉ lệ nhiễm trong
dân số Việt Nam (p<0.001), điều này chứng minh mẫu MCR ít
chưa nguồn nhiễm virus. Tuy nhiên, chúng tôi nhận thấy tỉ lệ
nhiễm MCR của chúng tôi cao hơn tác giả nước ngoài (p<0.05),
vấn đề này cần thiết phải sàng lọc tất cả người cho MCR trước khi
thu thập.
4.7 Về các xét nghiệm đánh giá chất lượng tếâ bào gốc MCR:
Sau 3 năm nghiên cứu chúng tôi đã hoàn thiện và chuẩn hóa
các xét nghiệm để đánh giá chất lượng của sản phẩm MCR được
lồng ghép vào các quy trình trên. Cho đến nay, vẫn chưa có xét
nghiệm nào thật sự đánh giá được chức năng của tế bào gốc, vì vậy
sự kết hợp các xét nghiệm bao gồm số lượng tế bào nhân, tế bào
CD34+, tế bào sống và nuôi cấy khúm tế bào là cần thiết cho một
ngân hàng MCR.
4.8 Về kết qủa thực nghiệm ghép tế bào gốc MCR :
5 trường hợp ghép MCR của chúng tôi đều mọc mảnh ghép,
với thời gian sống trung bình 27.20± 8.9 tháng. Khi so sánh với các
mẫu MCR được ghép tại bệnh viện chúng tôi được cung cấp từ
ngân hàng MCR Tokyo, chúng tôi nhận thấy không có sự khác biệt
về tỉ lệ mọc mảnh ghép, thời gian mọc mảnh ghép của bạch cầu
hạt, của tiểu cầu và thời gian sống toàn bộ sau ghép ( p>0.05). Với
kết qủa thành công ban đầu này, sản phẩm MCR của chúng tôi đủ
đảm bảo an toàn cho cuộc ghép.


22
KẾT LUẬN

Qua nghiên cứu quy trình điều chế sản phẩm tế bào gốc từ

MCR của 1234 mẫu MCR, chúng tôi rút ra 6 kết luận sau:
(1) Đã tổ chức quy trình sàng lọc và tuyển chọn sản phụ trước
khi thu thập đạt tiêu chuẩn cho MCR theo quy ước.
(2) Đã chuẩn hóa và hoàn thiện quy trình kỹ thuật thu thập
MCR từ sản phụ mới sinh sau giai đoạn xổ nhau với kết quả thể
tích MCR >60ml (78.2%), và có sự liên quan chặt chẽ giữa trọng
lượng nhau thai và thể tích MCR thu thập.
(3) Đã chuẩn hoá và hoàn thiện quy trình xử lý TBG tạo máu
(kỹ thuật HES) với kết quả sau xử lý sản phẩm TBG tạo máu đạt
tiêu chuẩn về cả số lượng và chất lượng tế bào gốc > 85% .
(4) Đã chuẩn hoá và hoàn thiện quy trình lưu trữ sản phẩm tế
bào gốc được điều chế từ MCR với chất bảo quản DMSO 10% và
dự trữ trong Nitơ lạnh -196
0
C theo quy trình tự động hóa. Số mẫu
MCR lưu trữ đạt tiêu chuẩn 874 mẫu (91.1%) và theo thời gian lưu
trữ đông lạnh, thành phần MCR không có sự thay đổi về số lượng
cũng như chất lượng (p>0.005).
(5) Đã chuẩn hóa hoàn thiện quy trình đánh giá số lượng và
chất lượng của sản phẩm tế bào gốc từ MCR bao gồm:
9 Các xét nghiệm về số lượng tế bào gốc: Đếm số lượng tế
bào nhân, đếm tế bào CD34+.
9 Các xét nghiệm về chất lượng MCR: đếm tế bào sống,
nuôi cấy khúm tế bào (BFU-E, CFU-GM, CFU-GEMM).
9 Các xét nghiệm về cấy vi khuẩn, nấm và các bệnh lây
nhiễm của mẫu MCR: HBsAg là 2.86%; anti HBc là 0.32%; anti-
HCV là 1.59%; anti HTLV1 là 0.32%; nhiễm khuẩn khi thu thập là
2.54%; anti CMV là 0.88%; anti HIV: 0.4%; VDRL là 0%.