nghiên cứu tách chiết enzyme alginate lyase từ vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thủy phân alginate

1

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ 5
MỞ ĐẦU 5
1. Tính cấp thiết của đề tài 7
2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài 8
3. Điểm mới và ý nghóa khoa học, thực tiễn của đề tài 8
Chương 1. TỔNG QUAN 9
1.1. Tổng quan về rong Nâu [1] 9
1.2. Tổng quan về Alginate 11
1.2.1. Alginate[1][11] 11
1.2.2. Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11] 12
1.2.2.1. Đặc điểm, cấu tạo của Alginic 12
1.2.2.2. Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate. 14
1.2.3. Tính chất của một số loại keo Alginate 15
1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase 18
1.4. Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA) 19
1.4.1. Những nghiên cứu trong nước 19
1.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước 21
1.5. Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu 23
1.5.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8] 23
1.5.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật 23
1.5.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6] 24
1.5.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận chế phẩm
enzyme[3][4][5][7] 25
1.5.4.1. Phương pháp nuôi cấy 25
1.5.4.2. Thu hồi chế phẩm enzyme 26
Chương 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28
2.1. Nội dung nghiên cứu. 28
2

2.2. Các phương pháp nghiên cứu[3][6][7][8] 29
2.3. Phương pháp bố trí thí nghiệm 29
2.3.1. Bố trí nghiệm phân lập chủng vi khuẩn trong tự nhiên có khả năng sinh
tổng hợp algL 29
2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh tổng
hợp algL cao 30
2.3.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của chủng vi sinh vật
được lựa chọn 32
2.3.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thu dòch enzyme algL từ môi trường sinh khối . 33
2.3.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm thử nghiệm phân cắt các loại Natri alginate khác
nhau bằng dung dịch enzyme thu được 34
2.3.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác đònh hoạt độ enzyme 35
2.3.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự
phát triển của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL 36
2.3.8. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các hợp chất kim loại
đến khả năng phân cắt của algL 38
Sơ đồ 2.3.8: Ảnh hưởng của các hợp chất kim loại đến khả năng phân cắt của algL 38
2.3.9. Sơ đồ bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả
năng phân cắt của algL 39
2.3.10. Sơ đồ bố trí thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để thu hồi algL
từ dòch enzyme 40
Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 41
3.1. Kết quả nghiên cứu phân lập chủng vi sinh vật trong tự nhiên có khả năng
sinh tổng hợp enzyme algL 41
3.2. Kết quả thí nghiệm lựa chọn chủng vi sinh vật có khả năng sinh algL cao 42
3.3. Kết quả thí nghiệm kiểm tra tính thuần khiết của vi sinh vật đã chọn 44
3.4. Kết quả thí nghiệm phân cắt các loại natri alginate bằng dung dòch
enzyme thu được 45
3

3.5 Kết quả đònh danh vi sinh vật 47
3.5.2. Kết quả nhuộm Gram và sinh hóa đònh danh bằng hệ thống IDS14GNR 48
3.5.3. Kết quả giải trình tự gene 16S trên máy CEQ 8000 và tra cứu trên
BLAST SEARCH 49
3.6. Kết quả thí nghiệm xác đònh hoạt độ enzyme 51
3.7. Kết quả thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển
của vi sinh vật và khả năng phân cắt của algL do vi sinh vật sinh ra 53
3.8. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của các ion kim loại đến khả
năng phân cắt của algL 54
3.9. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng phân cắt của
algL 56
3.10. Kết quả thí nghiệm chọn tác nhân kết tủa thích hợp để tách chiết algL từ
dòch enzyme 58
3.11. Đề xuất quy trình thu hồi chế phẩm enzyme algL từ vi khuẩn Klebsiella
sp 60
Chương 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 63
4.1. Kết luận 63

4.2. Đề xuất ý kiến 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 66
PHỤ LỤC 1. CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 70
PHỤ LỤC 2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN 75





4

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
E: Enzyme
S: Cơ chất Na-alginate
dd: dung dòch
OA: Oligo Alginate
vsv: vi sinh vật
algL: Alginate lyase
Na-alg: Natri alginate
EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid










5

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU, HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
STT

TÊN BẢNG Trang

1 Bảng 1.2.3. Nhiệt độ phân hủy của các loại Alginte khác nhau 16

2
Bảng
1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ oligo alginate đến khả
năng nảy mầm của hạt thóc giống
19
3 Bảng 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dung dòch Na-
alginate khác nhau
44
4 Bảng 3.5.2. Kết quả thử nghiệm sinh hóa đònh danh

47
5
Bảng 3.10. Ảnh hư
ởng của nhiệt độ đến hoạt động của alginate
lyase
55
TÊN HÌNH

1
Hình 1.2.2.1a
:Công thức cổ điển của hai đơn vò monomeric
trong axit Alginic

12
2 Hình 1.2.2.1b: Hình thể dạng ghế của axit Uronic 13
3 Hình 1.2.2.1c: Cấu tạo của axit Alginic 13
4

Hình 1.2.2.1d
: Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức

cổ điển (công thức phối cảnh)
13

5 Hình 1.2.2.2a: Công thức cấu tạo Na-alginate 14
6 Hình 1.2.2.2b: Công thức cấu tạo Ca-alginate 15
7 Hình 1.4.2a: nh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate (Oligo-
M) chưa bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo-
G) chưa
bảo hoà lên sự dài ra của rể cây cà rốt và cây lúa
20
8 Hình 1.4.2b: Ảnh hưởng của nồng độ hổn hợp oligo-
G đến sự
dài ra của rể cây càrốt và lúa .
Hình 1.4.2c: Ảnh hưởng của mức độ đồng trùng hợp oligo-
G
đến sự dài ra của rể cây càrốt à lúa . Độ dài của rể xác đònh
sau 8 và 15 ngày. (nồng độ 0,75mg/ml)


21

9 Hình 3.1a: VSV có khuẩn lạc màu trắng sữa (C1) 40
10 Hình 3.1b: VSV có khuẩn lạc màu mỡ gà (C2) 40
6

11
Hình 3.3a. Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa trên môi trường
thạch I
43
12 Hình 3.3b. Khuẩn lạc vi sinh vật màu trắng sữa

trên môi trường
thạch chỉ có Na-
alginate 1,5% và soi dưới kính hiển vi vật kính
100x
43

13

Hình 3.5.1. Khuẩn lạc vi sinh vật phân lập trên các môi trường
khác nhau

46
14 Hình 3.5.2. Hình ảnh tế bào vi sinh vật phân lập được 47
15
Hình 3.5.3. Sơ đồ giải trình tự gene 16S của chủng vi sinh vật
phân lập
49
TÊN ĐỒ THỊ

1
Đồ thò 3.2. Mức độ hao tổn độ nhớt của dung dòch Na-
alginate
1% theo thời gian phân cắt
41

2
Đồ thò 3.4. Mức độ hao tổn độ nhớt của các dd Na-
alginate 1%
khác nhau theo thời gian phân cắt
44

3
Đồ thò 3.6a. Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dòch Na-
alginate
1% theo nồng độ Enzyme

50
4 Đồ thò 3.6b. Mức độ hao hụt độ nhớt của dung dòch Na-

alginate 1% theo nồng độ Enzyme
51

5
Đồ thò 3.7. Ả
nh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển
của Klebsiella sp và hoạt độ enzyme algL
52
6 Đồ thò 3.8. Ả
nh hưởng các ion kim loại đến hoạt lực của
enzyme algL
53
7 Đồ thò 3.9. Ảnh hưởng của
nhiệt độ đến khả năng phân cắt của
enzyme algL
55

7

MỞ ĐẦU
1. Tính cấp thiết của đề tài

Rong biển là nguồn lợi biển cung cấp các chất keo quan trọng như
Agar, Alginate, Carrageenan dùng trong công nghệ thực phẩm và các ngành
công nghiệp khác. Trên thế giới từ những năm 1980 rong biển đã được quan
tâm nghiên cứu. Năm 1930 công nghệ chế biến các chất Alginate, Manitol,
Agar phát triển mạnh và ngày càng ứng dụng nhiều trong thực tế, đặc biệt là
ở các nước Nhật Bản, Mỹ và Trung Quốc. Theo Luning (1990) tổng sản lượng
của Alginate là 35.000 tấn.[1]
Trên thế giới có nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng của Alginate
trong các ngành công nghiệp như: Thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, công
nghệ dệt, nông nghiệp, công nghệ sinh học, nghiên cứu khoa học…
Kết quả của các công trình nghiên cứu ứng dụng alginate trong nông
nghiệp cho thấy rằng, mạch alginate sau khi cắt mạch có tác dụng kích thích
sự sinh trưởng và phát triển đối với cây trồng [9][10][12][13][14]. Với ứng
dụng này, thiết nghó việc nghiên cứu các phương pháp cắt mạch alginate để
sản xuất chế phẩm kích thích tăng trưởng thực vật là rất cần thiết nhằm tăng
năng suất cây trồng và tạo ra các sản phẩm có giá trò tốt từ đó nâng cao giá trò
kinh tế là một hướng quan trọng đang được các nhà khoa hoc Việt Nam quan
tâm. Chính vì lẽ đó, đề tài “ Nghiên cứu tách chiết Enzyme Alginate lyase từ
vi sinh vật có trong rong biển và bước đầu ứng dụng nó để thuỷ phân
alginate” là rất cần thiết, góp phần ứng dụng công nghệ sinh học vào nông
nghiệp và đời sống sản xuất ở nước ta.


8

2. Mục đích, nhiệm vụ và nội dung nghiên cứu của đề tài
 Mục đích, nhiệm vụ
Đề tài nhằm phân lập, tuyển chọn chủng vi sinh vật trong tự nhiên có
khả năng sinh tổng hợp alginate lyase cao. Tiến hành nuôi cấy chủng vi sinh
vật đã tuyển chọn trong môi trường thích hợp sau đó lựa chọn phương pháp

thích hợp để thu nhận chế phẩm alginate lyase từ môi trường nuôi cấy và bước
đầu nghiên cứu ứng dụng cắt mạch alginate.
Xác đònh hoạt độ của enzyme alginate lyase theo phương pháp đo độ
nhớt dung dịch alginate 1% trước và sau khi phân cắt.
3. Điểm mới và ý nghóa khoa học, thực tiễn của đề tài
 Điểm mới của đề tài
Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên về phân cắt alginate bằng
phương pháp sinh học.
Enzyme alginate lyase có thể ứng dụng được vào nông nghiệp để sản
xuất ra chế phẩm tăng trưởng thực vật ít độc hại cho con người và góp phần
giảm làm giảm ô nhiễm môi trường.
 Ý nghóa khoa học và thực tiễn
Kết quả của đề tài góp phần làm phong phú thêm những hiểu biết về
công nghệ sinh học và ứng dụng của nó vào các lónh vực của đời sống xã hội
đặc biệt là trong công nghệ sản xuất enzyme, nông nghiệp và một số ngành
công nghiệp khác.
Kết quả của đề tài cũng mở rộng đầu ra cho ngành công nghiệp
alginate của Việt Nam. Bên cạnh đó các công ty sản xuất thuốc tăng trưởng
thực vật cũng có thể ứng dụng để sản xuất ra một chế phẩm tăng trưởng thực
vật ít gây độc hại cho con người và môi trường.

9

Chương 1
TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về rong Nâu [1]
 Ngành rong Nâu là một trong những ngành có giá trò kinh tế cao. Rong
Nâu có trên 190 chi, hơn 900 loài, phần lớn sống ở biển, số loài và số chi tìm
thấy trong nước ngọt không nhiều lắm. Rong có cấu tạo nhiều tế bào dạng
màng giả, dạng phiến, dạng sợi đơn giản, một hàng tế bào chia nhánh, dạng

ống hoặc phân nhánh phức tạp hơn dạng cây có gốc, rễ, thân, lá. Rong sinh
trưởng ở đỉnh, ở giữa, ở gốc các lóng. Ngoài ra, do các tế bào rong dạng phiến
chia cắt sinh trưởng khuếch tán gọi là sinh trưởng bề mặt.
 Thành phần hoá học của rong Nâu
+ Sắc tố
Sắc tố rong Nâu là diệp lục tố (Chlorophyl), diệp hoàng tố
(Xanthophyl), sắc tố màu nâu (Fucoxanthin), sắc tố đỏ (Caroten). Tuỳ theo tỷ
lệ các loại sắc tố mà rong có màu từ nâu – vàng nâu – nâu đậm – vàng lục.
Nhìn chung sắc tố của rong Nâu khá bền.
+ Gluxit
− Monosachride
Monosacharide quan trọng trong rong Nâu là đường Manitol được
Stenhouds phát hiện năm 1884 và được Kylin (1913) chứng minh thêm.
Manitol có công thức tổng quát là : HOCH
2
– (CHOH)
4
– CH
2
OH
Manitol tan được trong ancol, dễ tan trong nước có vò ngọt. Hàm lượng
từ 14 ÷ 25% trọng lượng khô tuỳ thuộc vào điều kiện sống.
− Polysacharide
10


Alginic: là một polysacharide tập trung giữa ở vách tế bào, là thành
phần chủ yếu tạo thành tầng bên ngoài của màng tế bào rong Nâu
Alginic và muối của nó có nhiều công dụng trong ngành công nghiệp,
nông học, y học và thực phẩm.

Hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu khoảng 2 ÷ 4% so với rong
tươi và 13 ÷ 15% so với rong khô. Hàm lượng phụ thuộc vào loại rong, điều
kiện đòa lý môi trường mà rong sinh sống. Theo tài liệu tổng kết của Miyake
(1995) cho thấy hàm lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở các vùng biển
Liên Xô cũ là 13 ÷ 40%
Theo tài liệu phân tích của các chuyên gia Bộ Thuỷ sản cho thấy hàm
lượng Alginic trong các loại rong Nâu ở Hải Phòng là 22 ÷ 40%, trong khi đó,
rong Nâu ở vùng biển Phú Yên và Khánh Hoà cao hơn hẳn.
Hàm lượng Alginic có trong các loài rong ở Miền Trung Việt Nam là
khá cao, dao động từ 12,3 ÷ 39,4% so với trọng lượng khô tuyệt đối, tuỳ thuộc
vào loài và vùng đòa lý. Trong đó, loài rong S. mcclurei và Turbinaria ornata
có hàm lượng Alginic cao nhất khoảng 35,9 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối. Nếu
so sánh tất các vùng biển thì rong ở vùng biển Khánh Hoà có hàm lượng
Alginic cao hơn cả (từ 26,2 ÷ 39,4% rong khô tuyệt đối).
− Axit Fucxinic: có tính chất giống với axit Alginic. Axit Fucxinic tác
dụng với axit Sunfuric tạo thành hợp chất có màu tuỳ thuộc vào nồng độ axit
Sunfuric.
− Fuccoidin: là loại muối giữa axit Fuccoidin với các kim loại hoá trò
khác nhau như Ca, Cu, Zn. Fuccoidin có tính chất gần giống với axit Alginic,
nhưng hàm lượng thấp hơn Alginic.
− Laminarin: Laminarin là tinh bột của rong Nâu, thường gặp ở dạng bột
không màu, không mùi và có hai loại hoà tan và không hoà tan trong nước.
11

Laminarin có hàm lượng từ 10 ÷ 15% trọng lượng rong khô tuỳ thuộc vào loại
rong, vò trí đòa lý và môi trường sinh sống của rong Nâu.
− Cellulose: là thành phần cấu tạo nên vỏ cây rong. Hàm lượng Cellulose
trong rong Nâu nhiều hơn rong Đỏ.
+ Prôtêin: Prôtêin trong rong Nâu không cao lắm nhưng khá hoàn hảo.
Do vậy rong Nâu có thể làm thực phẩm. Prôtêin trong rong Nâu thường ở

dạng liên kết với Iod tạo Iod hữu cơ có giá trò cao như: MonoIodInzodizin,
DiIodInzodizin.
Hàm lượng prôtêin rong Nâu ở vùng biển Nha Trang dao động 8,05 ÷
21,11% so với trọng lượng khô. Hàm lượng axit amin cũng đáng kể và có giá
trò cao trong prôtêin của rong biển.
+ Chất khoáng
Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong rong Nâu thường lớn hơn nước
biển. Chẳng hạn: Iod của rong biển lớn hơn trong nước biển từ 80 ÷90 lần.
Hàm lượng Ba lớn hơn trong nước biển là 1.800 lần.
Hàm lượng khoáng ở vùng biển Nha Trang dao động trong từ 15,51 ÷
46,30% phụ thuộc vào mùa vụ và thời kỳ sinh trưởng
1.2. Tổng quan về Alginate
1.2.1. Alginate[1][11]
Alginate là thuật ngữ thường dùng cho các loại muối của axit alginic,
nhưng cũng có thể xem là tất cả các dẫn xuất của axit alginic hay chính bản
thân axit alginic. Ở một số nơi thì thuật ngữ “algin” được dùng thay cho
alginate. Alginate tồn tại trong các thành tế bào của rong Nâu dưới dạng muối
canxi, Magiê, natri của axit alginic. Alginate được hình thành nhờ phản ứng
đồng trùng hợp không phân nhánh của axit α – L – guluronic và axit β – D –
manuronic. Sự khác nhau giữa các block là về kích thước và sự thay đổi các
12

đoạn manuronic (M) và guluronic (G) cũng như sự tồn tại của các block ngẫu
nhiên. Cấu trúc của alginate chòu ảnh hưởng của nguồn rong biển cũng như
điều kiện phát triển của rong. Người ta rất quan tâm đến tỷ lệ M/G vì nó
quyết đònh đến tính chất của gel được tạo thành. Nếu tỷ lệ này càng nhỏ thì
khả năng tạo gel của alginate càng cao và ngược lại.
Alginate cũng có thể được sinh tổng hợp từ một loại vi sinh vật robacter
vinelandii, tuy nhiên sản phẩm alginate do vi sinh vật sản sinh ra có khả năng
tạo gel kém, ít có tính thương mại nên thường chỉ được đề cập đến trong công

tác giảng dạy.
1.2.2. Công thức cấu tạo của axit alginic và muối alginate [1],[11]
1.2.2.1. Đặc điểm, cấu tạo của Alginic
Alginic thuộc polysacharide nhưng có chứa nhóm carboxyl (-COOH )
trong phân tử nên thường gọi là axit alginic hay polysacharide có tính axit
yếu.
Theo Niwa (1940) cho rằng đơn vò cấu trúc của Alginic là Uronic có công
thức phân tử là (C
24
H
30
O
23
)
n
, Chapman thì cho rằng Alginic là dạng trùng hợp
thoát nước của D.Mamuronic có công thức (C
5
H
9
O
5
COOH)
n
và công thức hoá
học tương đương của Alginic là (C
6
H
8
O

6
)
n
. Hai thuyết tương tự nhau,
n = 80 ÷83 do vậy có sự trùng hợp rất lớn.


III.1.2.2. Một số tính chất của các alginate.



Hình 1
.2.2.1a
:Công thức cổ điển của hai đơn vò
monomeric trong axit Alginic

13







Theo các tài liệu hoá sinh gần đây mô tả cấu tạo của Alginic gồm các
axit D.Manuronic liên kết với L.Lunuronic bằng liên kết 1 – 4 mạch thẳng
không phân nhánh

Alginic là polymer gồm nhiều axit Manuronic (M) kết hợp với Guluronic
(G) tạo mạch thẳng không phân nhánh và có thể liên kết theo hình phẳng sau:






Trên phân tử Alginic, các phân tử M và G sẽ tổ hợp thành các block theo
dạng hình sau đây:
Hình
1.2.2.1b
: Hình thể dạng ghế của axit Uronic

Hình 1.2.2.1d: Cấu tạo axit alginic theo mô hình các công thức cổ điển
(công thức phối
cảnh)
Hình 3: Cấu tạo của Alginic axit
Hình 1.2.2.1c: Cấu tạo của axit Alginic
14

1.2.2.2. Đặc điểm, cấu tạo của các keo Alginate.


 Natri Alginate.
Công thức phân tử: (C
5
H
7
O
4
COONa)
n.
Công thức cấu tạo:

Hình
1.2.2.1e
: G block

Hình 1.2.2.1f: M block
Hình 1.2.2.1g: MG block
Hình 1.2.2.2a: Công thức cấu tạo Na-alginate
15



 Canxi Algiante.
Công thức phân tử: [(C
5
H
7
O
4
COO)
2
Ca)]
n.

Công thức cấu tạo:



 Alginate Amonium
1.2.3. Tính chất của một số loại keo Alginate
Muối alginate của kim loại hoá trò I ( Natri alginate ) dễ hòa tan trong
nước, tạo dung dòch keo nhớt, có độ dính và độ nhớt cao, khi làm lạnh không
đông và khi khô trong suốt có tính đàn hồi.
Muối Alginate của kim loại hóa trò II ( Alginate Canxi, Alginate
Magiê,…) không hoà tan trong nước, tuỳ theo kim loại mà có màu khác nhau.
Khi muối ẩm thì dẻo dễ biến hình, khi khô rất cứng, rất khó thấm nước, nhờ
có tính chất này mà Alginate có rất nhiều ứng dụng trong các lónh vực khác
nhau.
Bột Alginate dễ bò giảm độ nhớt nếu không được bảo quản ở nhiệt độ
thấp.
Khác với Agar thì khi giảm nhiệt độ thì dung dòch Alginate không bò
đông lại, ngay cả khi làm lạnh và tan giá thì độ nhớt và bề ngoài cũng không
thay đổi.
Hình 1.2.2.2b: Công thức cấu tạo Ca-alginate
16

Propyleneglycol Alginate ( PGA) với 80 – 85% nhóm -COOH được
ester hoá có tác dụng nhỏ nhất với ion Canxi, do đó hợp chất này được ứng
dụng trong công nghiệp sữa. PGA giảm tính hoà tan khi pH môi trường < 4.
pH = 2 thì PGA bò kết tủa.
Các loại Alginate khác nhau thì sẽ bò phân huỷ ở các nhiệt độ khác
nhau. Theo nghiên cứu của Kenfikato – Khoa Thuỷ sản Trường Đại học
Hokaido, Nhật Bản cho thấy nhiệt phân hủy của các Alginate trong bảng sau:
Alginate
Nhiệt độ phân hủy (

o
C )
Axit Alginic
Na – Alginate
(1)
Na – Aginate
(2 )

Ca – Algiante
Al – Alginate
Fe – Alginate
186
221,5
231,5
204,5
196
218,5
Bảng 1.2.3. Nhiệt độ phân hủy của các loại Alginate khác nhau
 Độ nhớt và trọng lượng phân tử.
Dung dòch Alginate tạo nên độ nhớt cao khi hoà tan trong nước. Độ
nhớt của nó tăng theo nồng độ Alginate hoà tan và giảm theo chiều tăng của
nhiệt độ. Trọng lượng phân tử trung bình của Alginate được đo bằng độ nhớt
và khả năng thẩm thấu theo phương trình sau đây:
η = K.M
γ
Trong đó:
η: độ nhớt
M: khối lượng phân tử trung bình
K, γ : hệ số thực nghiệm.
17

Trọng lượng phân tử trung bình của Alginate được xác đònh bằng phương
pháp độ nhớt (Viscometric method).
18

1.3 Một số nghiên cứu về alginate lyase
R. Scott Doubet và Ralph S. Quatrano (1982), thuộc trường Đại học
Oregen State. Nghiên cứu phân lập các vi khuẩn biển có khả năng sinh Lyase
đặc hiệu cắt mạch Alginate. Cho thấy các Alginate lyase được chiết rút từ
môi trường của một số vi sinh vật đã được phân lập. Các lyase này được sinh
ra nhờ môi trường có alginate tự nhiên và có hoạt tính với cả block của axit
manuronic và axit guluronic của chuỗi polymer alginate. Lyase đặc hiệu đối
với axit guluronic được tách chiết từ môi trường, trong khi đó lyase đặc hiệu
với axit manuronic được tách chiết từ tế bào vi khuẩn.[20]
Năm 1992, Manabu Kitamikado, Chao-Huang Tseng, Kuniko
Yamaguchi và Takashi Nakamura thuộc trường Đại học Fukuoka, Nhật Bản.
Nghiên cứu hai chủng vi sinh vật sinh enzyme alginate lyase. Cho thấy các
algiante lyase ngoại bào được tinh sạch từ Vibrio harveyi Al-128 và V.
alginolyticus ATCC 17749. Sự hình thành enzyme này đầu tiên cắt đứt liên
kết α 1,4 bao gồm các đơn vò L-guluronate và sau đó là cắt đứt các liên kết
beta 1,4 bao gồm các đơn vò D-manuronate. Phân tử lượng của enzyme này
được xác đònh khoảng từ 47.000 đến 57.000 Da và có điểm đẳng điện lần lượt
là 4,3 và 4,6. Enzyme từ chủng AL-128 hầu như hoạt động ở môi trường có
nồng độ NaCl từ 0,3 đến 1,0 M. Còn môi trường hoạt động tối thích của
enzyme từ chủng ATCC 17749 là sự có mặt của CaCl
2
có nồng độ từ 5 đến 10
mM.[17]
Năm 2000, Wataru Hashimoto, Osamu Miyake, Keiko Momma,
Shigeyuki Kawai và Kousaku Murata thuộc trường Đại học Kyoto, Nhật Bản.

Nghiên cứu xác đònh phân tử lượng của alginate lyase của Sphingomonas sp.
Chủng A1 là một trong những enzyme cắt mạch Alginate. Kết quả cho thấy
alginate bò cắt mạch tạo thành các oligoalginate bởi ba loại enzyme ( A1-I {66
19

kDa}, A1-2 {25 kDa}, A1-3 {40 kDa}) được sinh ra từ tế bào chất. Các
enzyme này và gene của chúng được phân lập từ các vi sinh vật phát triển ở
vùng có mặt alginate.[19]
Yuan-Hong Wang, Guang-Li Yu, Xin-Min Wang, Zhi-Hua LV, Xia
Zhao, Zhi Hong Wu, Wei-Shang Ji (2006). Nghiên cứu sự tinh sạch và đặc
tính của alginate lyase được sinh ra từ Vibrio sp. Cho biết các lyase này được
tinh sạch bởi sự kết hợp giữa chất lắng amonium sulfate và diethylaminoethyl
trong cột sắc ký Shephacel. Kết quả cho thất phân tử lượng của các alginate
lyase khoảng 62,5 kDa, với nhiệt độ và pH hoạt động tối ưu lần lượt là 25
0
C
và 7,0. Khả năng hoạt động của lyase tăng khi có mặt EDTA và Zn
2+
, nhưng
bò kìm hãm bởi Ba
2+
. Lyase này đặc hiệu cắt đứt liên kết beta-D-1,4
manuronic của chuỗi alginate.
Xiao Ting Fu, Sang Moo Kim (2007), Khoa Sinh học và Công nghệ
Biển Trường Đại học Quốc Gia Kangnung, Hàn Quốc, nghiên cứu tinh sạch
và tính chất của alginate lyase từ vi khuẩn biển Agarivorans albus. Kết quả
nghiên cứu cho thấy rằng alginate lyase là một chuỗi polypeptit có khối lượng
phân tử 60 Kda và có điểm đẳng điện là 5,5 – 5,7. pH và nhiệt độ tối thích
cho hoạt động của enzyme này lần lượt là 7,0 và 40
0

C. Hoạt lực của enzyme
bò mất hoàn toàn bởi sự thẩm tích và phục hồi trở lại khi thêm 0,1 M Na
+
hoặc
K
+
.[21]
1.4. Những nghiên cứu về Oligo alginate (OA)
1.4.1. Những nghiên cứu trong nước
Năm 2002, Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt đã sản xuất chế phẩm tăng
trưởng thực vật T&D bằng cách chiếu xạ tia gamma lên phân tử alginate để thu
nhận OA có khối lượng phân tử thấp hơn.
20

Năm 2002, Trần Thái Hòa và Nguyễn Thò Ái Nhung ở Trường Đại học
Khoa học, Đại học Huế nghiên cứu ảnh hưởng của oligo alginate đến khả
năng nảy mầm của hạt thóc giống. Oligoalginate dùng để thí nghiệm được tạo
ra bằng 3 phương pháp : chiếu xạ, phân cắt bằng kiềm và axit mạnh. Kết quả
như sau:[10]
STT
Tổ hợp nồng
độ tối ưu
Sức nảy
mầm (%)

Chênh lệch %
so với mẫu đối
chứng
Tăng % so
với đối

chứng
Điểm chất
lượng cây
mầm
1 A
1
50ppm 92,4 + 10,5 111,3 9
2 A
2
40ppm 91,6 + 9,7 111,8 9
3 A
3
30ppm 94,7 + 12,8 115,6 9
4 Đối chứng 81,9 7
Bảng 1.4.1. Ảnh hưởng của nồng độ Oligo alginate đến khả năng nảy
mầm của hạt thóc giống
Năm 2005 cũng tại Trường Đại học Khoa học Huế, tác giả Võ Thò Mai
Hương cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của OA đến sự phát triển của một số
giống cây ngắn ngày và có kết luận như sau:
− Oligoalginate có khả năng kích thích sự sinh trưởng, tăng sự tích lũy
chất khô và năng đẻ nhánh của lúa. Tại nồng độ OA 80 ppm hàm lượng chất
khô đạt cao nhất (tăng 25,40% so với đối chứng), số nhánh/cây cao nhất (tăng
21,10%) và trọng lượng hạt/chậu cao nhất (tăng 32,41).
− OA thể hiện rõ rệt tác dụng kích thích lên sinh trưởng của cây ngò.
Nồng độ OA tối thích là 60 ppm. Tại nồng độ này trọng lượng tươi của ngò
tăng 165,145%, năng suất tăng 60,76%. Tất cả các lô có xử lý OA đều có
năng suất cao hơn so với đối chứng.
21

− OA làm tăng số hoa/cây và tỷ lệ hoa hữu hiệu và năng suất của lạc ở

tất cảc các nồng độ nghiên cứu. Sản lượng lạc tăng 1,77 – 7,48 tạ/ha và đạt
cao nhất (26,83 tạ/ha, tăng 38,66%) ở nồng độ OA tối thích (80 ppm).
1.4.2. Những nghiên cứu ngoài nước
Năm 2003, các nhà nghiên cứu ở Trường Đại học Nagasaki, Nhật Bản
đã nghiên cứu khả năng kích thích sự phát triển rể cây cà rốt và lúa của các
Oligo uronate chưa bảo hoà từ alginate. Các oligo uronate chưa bảo hoà được
chuẩn bò nhờ một enzyme alginate lyase tiêu hoá polymannuronate ( PM ) và
polyguluronate ( PG ), được tinh sạch từ Pseudomonas sp. Sự phát triển của rể
được xác đònh bởi sự dài ra của rể cây càrốt và cây lúa được ủ trong môi
trường có chứa 0,8% agar trong bóng tối. PG và PM không có khả năng kích
thích sự phát triển rể nhưng khi ta trộn lẫn các enzyme tiêu hoá PG thì nó lại
có khả năng kích thích sự phát triển của rể của hai loại cây này ở nồng độ tối
thiểu là 0,5mg/ml, khả năng kích thích sự phát triển rể là cực đại ở nồng độ
0,75 mg/ml.







Hình 1.4.2a: Ảnh hưởng của hỗn hợp Oligomanuronate (Oligo-M) chưa
bảo hoà và hỗn hợp Oligoguluronate (Oligo-G) chưa bảo hoà lên sự dài ra
của rể cây cà rốt (a) và cây lúa (b).
Độ dài của rể (cm)

Thời gian (ngày)
Độ dài của rể (cm)
T
hời gian (ngày)

Độ dài của rể (cm)

22

Hạt giống của hai loại cây này được đặt trong môi trường agar ở 25
0
C,
trong bóng tối. Khi chiều dài của rể đạt từ 1 – 1,5cm sau 5 – 6 ngày thì tiến
hành cắt rể và đem ủ trong môi trường có chứa hổn hợp oligo-G và oligo-M ở
nồng độ 0,5mg/ml. Rể được ủ trong bóng tối và xác đònh chiều dài sau 4 – 5
ngày ủ.[13]











Hai nhà nghiên cứu Iwasaki và Matsubara, Viện Nghiên cứu Thực
phẩm thuộc Quận Kagawa, Takamatsu, Nhật Bản đã nghiên cứu việc tinh chế
các oligosacharide alginate với khả năng kích thích phát triển rể của cây rau
diếp. Kết quả cho thấy, natri alginate được thuỷ phân bởi alginate lyase từ
Corynebacterium sp., và sau đó tinh chế sản phẩm nhờ quá trình siêu lọc
(UF). Khi xử lý dung dòch oligo natri alginate bằng phương pháp siêu lọc dưới
áp suất 0,15 Mpa, tốc độ của dòng chảy khoảng 0,6m/s, hầu hết các alginate

không được phân cắt được loại bỏ hoàn toàn. Phần alginate được giữ lại là
một hỗn hợp của disacharide tới octosacharide và có khả năng kích thích sự
phát triển chiều dài rể cây rau diếp ( khoảng 2 lần so với mẫu đối chứng) ở
Độ dài của rể (cm)

Nồng độ (mg/ml)

Hình
1.4.2b
:

Ảnh hưởng của nồng
độ
hỗn hợp oligo-G đến sự dài ra của rể cây
càrốt (□) và lúa (■). Độ dài của rể xác
đònh sau 8 và 14 ngày.
Hình
1.4.2c
:

Ảnh hưởng của mức độ
đồng trùng hợp oligo-G đến sự dài ra
của rể cây càrốt (□) và lúa (■). Độ
dài của rể xác đònh sau 8 và 15
ngày. (nồng độ 0,75mg/ml)
Độ dài của rể (cm)

23

nồng độ trong khoảng 200 – 300 µg/ml. Mức độ ảnh hưởng khác nhau của các

oligoalginate được xác đònh bằng cách thử từng oligoalginate có mức độ phân
cắt mạch khác nhau. Tri-, tetra-, penta- và hexasacharide đều có khả năng
kích thích sự phát triển rể của cây rau diếp. [14]
1.5. Tổng quan sơ lược về các phương pháp nghiên cứu
1.5.1. Phương pháp phân lập vi sinh vật[6],[8]
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng vi sinh vật đó từ mẫu vật
hoặc quần thể vi sinh vật ban đầu để thu giống ở dạng thuần khiết.
Các vi sinh sinh vật thuần khiết chỉ bao gồm các tế bào được sinh ra từ tế
bào ban đầu. Hầu hết các ứng dụng công nghệ sinh học đều liên quan đến
việc sử dụng giống thuần.
Phần lớn các phương pháp phân lập giống thuần khiết đều dựa trên kỹ
thuật pha loãng, thường gồm các bước sau: chuẩn bò mẫu, tăng sinh mẫu ( nếu
số lượng vi sinh vật có trong mẫu ít ), pha loãng mẫu, cấy mẫu lên môi trường
thạch đặc hiệu, ủ mẫu ở điều kiện thích hợp, kiểm tra và phát hiện khuẩn lạc
đặ trưng, chọn khuẩn lạc đặc trưng đem tạo giống thuần và kiểm tra giống
thuần.
1.5.2. Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Bảo quản giống vi sinh vật hay còn gọi là giữ giống vi sinh vật. Bảo
quản nhằm làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất của tế bào vi sinh vật,
ngăn cản sự sinh sản của chúng, đồng thời không làm thay đổi phẩm chất ban
đầu của giống, có nghóa là giống được bảo quản tốt thì sẽ có các quá trình
sinh lý, sinh hóa giống như ban đầu nếu gặp được điều kiện sinh trưởng giống
như ban đầu. Giống đem đi bảo quản phải ở trạng thái thuần khiết và trong
trạng thái sinh, lý tốt.
24

Có nhiều phương pháp bảo quản giống vi sinh vật, như phương cấy
chuyền đònh kỳ lên môi trường mới , phương pháp giữ giống trên môi trường
thạch có phủ lớp dầu khoáng, phương pháp giữ giống trên cát hay hạt, hay
phương pháp đông khô.

1.5.3. Phương pháp nghiên cứu hình thái vi sinh vật.[6]
Vi sinh vật là những cơ thể sống vô cùng nhỏ bé. Phần lớn các vi sinh
vật không thể quan sát bằng mắt thường mà phải nhờ đến độ phóng đại của
kính hiển vi. Chính vì thế, kính hiển vi là một dụng cụ vô cùng quan trọng,
không thể thiếu trong việc nghiên cứu đặc tính hình thái của vi sinh vật cũng
như hình dáng, kích thước, khả năng di động, sự hình thành bào tử, sinh sản….
Các tiêu bản tạm thời được sử dụng để quan sát hình thái vi sinh vật
Đối với tiêu bản tạm thời có nhuộm màu, thuốc nhuộm vi sinh vật phải
không độc hoặc ít độc đối với vi sinh vật cần quan sát và phải pha loãng đến
nồng độ nhất đònh để đảm bảo vi sinh vật vẫn còn sống và di động.
Tế bào sống và tế bào chết có thể phân biệt khi nhuộm màu với xanh
methylene. Methylene có màu xanh khi không có sự hiện diện của hydro và
không có màu khi có mặt của hydro. Khi các tế bào ở trạng thái nghỉ ( trạng
thái ở pha ổn đònh trên đường cong sinh trưởng ), mặc dù còn sống nhưng
không có khả năng khử màu xanh của methylene thành không màu. Do đó,
nên quan sát tế bào ở giai đoạn đầu của pha tăng trưởng.
Cũng có thể nghiên cứu hình thái vi sinh vật bằng phương pháp nhuộm
của Christian Gram. Nhuộm Gram không những giúp phân biệt vi khuẩn nhờ
các đặc điểm của hình thái và sự sắp xếp của tế bào mà còn cung cấp thông
tin về lớp vỏ tế bào. Khi nhuộm theo phương pháp này tế bào vi khuẩn Gram
dương có lớp vỏ tế bào tạo bởi peptidolycan sẽ có màu tím còn vi khuẩn Gram
25

âm có lớp vỏ tế bào mỏng hơn ( do có ít peptidolycan ) và được bao bọc bởi
lớp màng mỏng sẽ có màu hồng.
1.5.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme và thu nhận
chế phẩm enzyme[3][4][5][7]
1.5.4.1. Phương pháp nuôi cấy
Để thu được enzyme có hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật khác nhau
về nguyên tắc. Phương pháp nuôi cấy bề mặt hay phương pháp nuôi cấy bề

sâu hay còn gọi là nuôi cấy chìm, trong nuôi cấy chìm có phương pháp nuôi
cấy chìm hai bước.
1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Trong phương pháp nuôi bề mặt vi sinh vật phát triển trên bề mặt của
môi trường dinh dưỡng đặc trưng ở thể rắn đã được làm ẩm và vô trùng. Trong
môi trường dinh dưỡng người ta thường cho thêm các chất cảm ứng cần thiết
cho sự tổng hợp enzyme nào đó hoặc một số chất dinh dưỡng bổ sung nguồn
nitơ,photpho như nước chiết ngô, khoai tây, dòch chiết nấm men… Để đảm bảo
độ xốp của môi trường cần có các chất tạo độ xốp như trấu tỷ lệ từ 10 – 20%.
Trước khi gieo cấy vi sinh vật môi trường cần phải được vô trùng để đảm bảo
không bò lây nhiểm vi sinh vật lạ trong khi nuôi. Để nuôi cấy be mặt người ta
thường dùng mành mành hoặc khung đục lỗ để trong phòng kín.
Phương pháp nuôi bề mặt thường thích hợp để nuôi cấy các tế bào nấm
mốc vì khả năng phát triển mạnh nên ít bò tạp nhiễm.
2. Phương pháp nuôi cấy chìm
Phương pháp nuôi cấy chìm vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng
có sục khí và khuấy đảo liên tục. Nguồn cung cấp cacbon phụ thuộc vào từng
loại vi sinh vật sinh enzyme. Trong thực tế sản xuất người ta còn dùng cả một
số sản phẩm thủy phân của tinh bột để tạo nguồn cacbon dễ dàng được đồng