ứng dụng của genomics và kỹ thuật chuyển gen trong cải tạo giống cây trồng

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP.HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT
Đề tài: ỨNG DỤNG CỦA GENOMICS VÀ KỸ
THUẬT CHUYỂN NẠP GEN TRONG CẢI
TIẾN GIỐNG CÂY TRỒNG
GVHD: ThS. Phạm Văn Lộc
Danh sách nhóm:
Nguyễn Khánh Dương 2008110036
Tống Thị Tường Vi 2008110356
Nguyễn Ngọc Luyến 2008110158
TP.HCM, ngày 26 tháng 3 năm 2014
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
BẢNG PHÂN CÔNG CÔNG VIỆC
STT Sinh viên thực hiện Công việc phụ trách
Thời gian thực
hiện
1 NGUYỄN KHÁNH DƯƠNG
Cây trồng biến đổi gen
Những thành tựu triển
vọng trong tạo giống cây
trồng chuyển gen
Ưu nhược điểm của cây
trồng biến đổi gen
Từ ngày 12/3 đến
ngày 26/3/2014
2 NGUYỄN NGỌC LUYẾN
Phương pháp chuyển gen
Từ ngày 12/3 đến
ngày 26/3/2014

3 TỐNG THỊ TƯỜNG VI
Thư viện DNA
Từ ngày 12/3 đến
ngày 26/3/2014
Tổng hợp word
Từ ngày 26/3 đến
ngày 28/3/2014
2
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
LỜI NÓI ĐẦU
Ngày nay, nghiên cứu cấu trúc và chức năng tổng thể của toàn bộ các gen (hệ gen,
bộ gen, genome) của một cơ thể sống, từ sinh vật đơn giản nhất đến phức tạp nhất
(người), là một hướng chuyên sâu khoa học công nghệ, được quan tâm cao độ và có tầm
quan trọng đặc biệt ở phạm vi toàn cầu. Đây là các nghiên cứu cơ bản, có tính đột phá, tạo
cơ sở khoa học toàn diện cho đổi mới công nghệ và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực phát
triển kinh tế - xã hội. Khoa học hệ gen (Genome Science) hay nghiên cứu hệ gen
(Genome Research), còn gọi là Hệ gen học (Genomics), là hướng nghiên cứu phát triển
rất nhanh, không những ở các nền kinh tế hàng đầu, mà còn ở các nước đang phát triển.
Từ hơn một thập kỷ qua, việc nghiên cứu đã đạt được những bước tiến đáng kể; trong đó
lĩnh vực công nghệ tế bào thực vật cũng đã có những nghiên cứu đáng được ghi nhận.
Một trong các kỹ thuật của công nghệ tế bào thực vật là kỹ thuật chuyển gen. Trước
đây, để tạo một giống mới các nhà tạo giống thường sử dụng phương pháp truyền thống
để tổ hợp các gen giữa hai cá thể thực vật tạo ra cá thể mang những tính trạng mong
muốn. Phương pháp này được thực hiền bằng cách chuyển hạt phấn của cây này sang
nhụy hoa của cây khác. Tuy nhiên phép lai chéo này bị hạn chế bởi nó chỉ thực hiện được
từ các cá thể cùng loài (lai gần), còn lai giữa những cá thể khác loài (lai xa) thường bị bất
thụ. Tuy nhiên lai gần cũng mất nhiều thơi gian để thu được kết quả mong muốn đồng
thời có thể có những biến dị và thông thường những tính trạng quan tâm không tồn tại
trong những loài có họ hàng gần nhau.
Kể từ năm 1984, người ta bắt đầu tạo được cây trồng chuyển gen và đến nay đã có

những bước tiến lớn. Nhiều cây trồng quan trọng chuyển gen ra đời như lúa, ngô, lúa mì,
đậu tương, cà chua , khoai tây…Các gen được chuyển là gen kháng vi sinh vật, virus gây
bệnh, kháng côn trùng phá hoại, gen có khả năng sản xuất protein mới, gen chịu hạn…
3
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 1: Cậu bé đang ăn khoai tây
ruột giàu beta-carotene. Các nhà khoa
học đang sử dụng biến đổi gen để tăng
cường tính chịu hạn và khả năng chịu
bệnh của khoai tây để phát triển trong
điều kiện khô cằn và chứa nhiều chất
dinh dưỡng hơn.
Nguồn: Hình ảnh củaTrung tâm
khoai tây quốc tế (CIP) năm 2006;
(www.ifpri.org/media/ HPNairobi /
BoyEating_OFSP.jpg)
Kỹ thuật chuyển gen cho phép người tạo giống cùng lúc đưa vào một loại cây trồng
những gen mong muốn có nguồn gốc từ những cơ thể khác nhau, không chỉ giữa các loài
có họ hàng gần nhau mà còn ở những loài rất xa nhau. Phương pháp này cho phép nhà tạo
giống thu được giống mới nhanh hơn và vượt qua những giới hạn của kỹ thuật tạo giống
truyền thống, đạt một bước tiến lớn trong ngành công nghệ sinh học thực vật.
Có thể nói công nghệ chuyển gen là một hướng công nghệ cao của công nghệ sinh
học hiện đại phục vụ sản xuất và đời sống. Triển vọng của công nghệ chuyển gen thực vật
là rất lớn, cho phép tạo ra các giống cây trồng mang đặc tính di truyền hoàn toàn mới có
lợi cho con người mà trong chọn giống thông thường phải trông chờ vào đột biến tự
nhiên. Đối với sự phát triển của công nghệ sinh học trong thế kỷ XXI thì công nghệ
chuyển gen sẽ có một vị trí đặc biệt quan trọng.
4
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
NỘI DUNG

1. Thư viện DNA:
Nhằm đáp ứng mục tiêu ứng dụng genomics trong cải tiến giống cây trồng người ta
cần có một cơ sở vật chất về genome một cách căn bản và đầy đủ. Đó là thư viện các
“DNA clone”. Yêu cầu tối thiểu DNA clone phải có là:
• Bản đồ liên kết gen ở mức độ phân tử trên từng nhiễm sắc thể
• Một thư viện DNA đủ lớn
• Một hệ thống chuyển nạp có khả năng mang một số lượng lớn gen mục tiêu chuyển vào
các cây được cải biên về di truyền.
Bản đồ phải đáp ứng điều kiện phủ kín trên nhiễm thể. Bản đồ RFLP, EST, SSR,
SNP sẽ cung cấp cho chúng ta những so sánh về kết qủa áp dụng để chúng ta lựa chọn.
Thư viện DNA sẽ có thể cho hiệu qủa tốt hơn gấp đôi nếu đó là thư viện BAC với kích
thước DNA gắn vào vectơ lớn hơn 100 kb (Gale 2002).
1.1 Kỹ thuật nhân bản gen:
Có nhiều cách để nhân bản những gen mục tiêu, trong đó nhân bản gen bằng kỹ
thuật PCR là thường sử dụng nhất.
• Kỹ thuật PCR:
PCA là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction (phản ứng chuỗi trùng
hợp – phản ứng khuếch đại gen). Đây là kỹ thuật của sinh học phân tử cho phép nhân lên
một đoạn gen DNA mong muốn từ hệ gen DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao,
kỹ thuật này được nhà khoa học người Mỹ - Kary Mullis và cộng sự phát minh năm 1985
tại công ty Cetus, mặc dù nguyên tắc này đã được mô tả chi tiết trước một thập niên bởi
Khorana và cộng sự (Kleppe và ctv, 1971; Panet và ctv, 1974) và được giới thiệu lần đầu
tại Hội thảo lần thứ 51 ở Cold Spring Harbor vào năm 1986 và ông đã nhận giải Nobel
5
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hóa sinh học vào năm 1993. Kể từ đó tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu
sinh học trên toàn thế giới.
 Nguyên lý:
o Nguyên lý nhân gen trong tế bào: DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định lên
đặc tính của cơ thể (ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA). Đối với

những sinh vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dưới dạng kết hợp
với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Ngoài ra, tại các cơ quan tử như ty
thể, lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid. Các phân tử DNA ở những tế
bào hoạt động bình thường chỉ được nhân bản trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để
thực hiện được quá trình này, đòi hỏi phải có mặt enzyme DNA polymerase, sự tham gia
của các đoạn mồi có trình tự bổ sung gắn vào sợi DNA khuôn và các dNTDs làm nguồn
cung cấp nucleotide. Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép được tháo
xoắn thành các sợi DNA sợi đơn. Dưới tác động của enzyme DNA polymerase quá trình
tổng hợp DNA được xảy ra theo lần lượt các nucleotide vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi
theo nguyên tắc bổ sung với khuôn DNA.
o Nguyên lý của kỹ thuật PCR: Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những
nguyên tắc cơ bản của sao chép DNA trong cơ thể nhưng có sự khác biệt:
+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase
+ Kết hợp với enzyme DNA polymerase chịu nhiệt để tổng hợp DNA mới
trong môi trường thích hợp.
+ Hệ thống điều nhiệt thích hợp cùng với các đoạn mồi được thiết kế chuyên
biệt chủ động.
Phương pháp PCR cho phép tổng hợp rất nhanh và chính xác từng đoạn DNA riêng
biệt. Đây thực sự là phương pháp hiện đại và thuận tiện cho việc xác định sự có mặt của
một gen nào đó trong tế bào với độ chính xác cao.
Phương pháp này dựa trên hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase
trong vi sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA
polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp, nhưng ở nhiệt độ thấp DNA xoắn chặt vì vậy
DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các sản phẩm của phân
6
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
tử. Nhưng khi các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao có thể lên đến
100
o
C thì các DNA sẽ bị biến tính (DNA dạng xoắn sẽ duỗi xoắn).

Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai
đoạn: giai đoạn biến tính, giai đoạn bắt cặp, giai đoạn kéo dài.
Trước đây, khi chưa có máy chu kỳ nhiệt, để thực hiện phản ứng PCR những trở
ngại khó khăn:
+ Lúc đầu enzyme Klenow polymerase được sử dụng bị phân hủy ở 95
o
C nên
phải thêm enzyme vào sau mỗi chu kỳ ở giai đoạn phân tách chuỗi DNA.
+ Để thay đổi chu kỳ nhiệt phải thay đổi 3 water bath ở 3 nhiệt độ khác nhau,
thay đổi chu kỳ nhiều như vậy có thể dẫn đến sai sót khi đếm số chu kỳ thực hiện
khi số chu kỳ lặp lại nhiều lần.
Việc tìm ra enzyme Taq polymerase và máy PCR tự động thay đổi cacs chu kỳ nhiệt
giúp cho kỹ thuật này phát triển mạnh và được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
nghiên cứu (McPherson và ctv., 1992).
Ngoài ra, một kỹ thuật mới về “map-based cloning” được phát triển gần đây, đó là
kỹ thuật “deletion tilling”. Kỹ thuật này bao gồm: (1) tạo ra số lượng phân tử bị mất đoạn,
trong đó có gen mục tiêu, (2) sử dụng đoạn phân tử chồng lấp tối thiểu để xác định gen
ứng cử viên trong khi mô phỏng (trường hợp genome lúa mì). Phương pháp này có thuận
lợi là không cần biến dị của gen mục tiêu hoặc vùng kế cận của nó. Hiện nay CGIAR rất
chú ý đến việc ứng dụng của kỹ thuật cải tạo giống.
1.2 Microarray:
Những gen tốt cũng có thể được thể hiện trong kỹ thuật phân tích microarray. Những
gen nhạy cảm với stress, sự thể hiện gen xảy ra khi bị stress, trở nên rất lý tưởng cho
nghiên cứu microarray. Thí nghiệm có tính chất điển hình về mảng của EST với RNA
được ly trích trong mô cây bị tổn thương do stress, và mô cây không bị stress, đã được
thiết kế để tìm hiểu về hiệu qủa của phân tích microarray. Người ta dự đoán có khoảng
25.000 gen trong genome cây Arabidopsis và 50.000 gen trong genome cây lúa sẽ được
7
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
phát hiện đầy đủ trong một tương lai gần (Gale 2002). Microarray được hình thành từ bộ

sưu tập EST từ thư viện cDNA, hoặc cDNA được sưu tập trên mô bị stress (do khô hạn,
mặn, thiếu lân, độ độc nhôm, v.v ). Thí dụ trong cây lúa, 10% gen sẽ điều tiết tăng hoặc
giảm trong vòng 1 giờ sau khi chúng bị xử lý trong môi trường mặn (Kawasaki và ctv.
2001). Người ta sẽ phát triển công nghệ tạo các "microarray" hay "gene chips" trong
nghiên cứu genome về chức năng. Những chips sinh học này rất hữu dụng trong tương lai
gần để tìm ra những gen mục tiêu có tính chất ứng cử viên (candidate genes) đối với từng
tính trạng mong muốn. Đây là bước đột phá có tính chất lịch sử trong qúa trình phát triển
ngành di truyền phân tử của loài người. Nhiều dòng đột biến mất đoạn, dòng du nhập gen
cho năng suất cao, có thể trồng ở nơi thiếu nước. Nhiều dòng thể hiện tính chống chịu hạn
và mặn rất tốt. Những nghiên cứu về chức năng như vậy cho phép chúng ta hiểu rõ hơn:
làm thế nào cây trồng có thể thích ứng với các stress, tìm ra các gen hữu ích cho công tác
lai tạo giống. Theo Tiến sĩ Leung, có hơn 100 gen giúp cây lúa kiểm soát tính kháng bệnh
hại đã được tìm thấy để tạo ra giống lúa kháng bệnh tốt hơn. Kỹ thuật mới về
"microarray" bao gồm một sự tập trung khoảng 20.000 gen trên một trình tự. Người ta
còn gọi đó là "chip" đóng vai trò như một cảm biến để tìm ra những thông tin di truyền
cần thiết. Phương pháp này cho phép chúng ta có thể lai cùng một lúc với rất nhiều
"probe". "Probe" là những chuỗi ký tự của cDNA, có nguồn gốc từ các gen chống chịu
với mức độ stress khác nhau. Phân tử mRNA đối với tính trạng chống chịu stress nào đó
được chuyển mã ngược thành cDNA. Phân tử cDNA này được dùng để lai với
"microarray", sau đó người ta xác định những "bản sao" dương tính. Thông qua nhiều giai
đoạn phát triển, sau qúa trình bình thường hóa, người ta phải đảm bảo rằng những chuỗi
ký tự này đồng nhất, sẵn sàng được xác định trên trình tự hoặc trên màng. Chip sinh học
này có thể được đóng hoặc mở khi cây ở điều kiện bình thường hoặc bị stress. Phương
pháp này không chỉ xác định gen mong muốn mà còn tìm hiểu cả qúa trình thể hiện gen.
2. Chuyển nạp gen ở thực vật:
Mục đích của công nghệ gen ở thực vật là tạo ra những cây biến đổi gen có những
đặc tính mới, các DNA ngoại lai được đưa vào tế bào thực vật và tồn tại bền vững trong
hệ gen (genome).
8
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC

Kỹ thuật chuyển nạp gen hiện đã trở nên thông dụng cho hầu hết các loài cây trồng,
nhưng hiệu qủa của nó vẫn còn là vấn đề cần được tiếp tục nghiên cứu cải tiến. Đặc biệt
đối với cây một lá mầm, hiệu qủa chuyển nạp gen đạt được khó hơn so với cây hai lá
mầm. Những cố gắng đầu tiên sẽ là công việc kiến trúc alen của gen mục tiêu gắn với
promoter có chức năng kiến tạo, thí dụ CaMV35S trong qúa trình chuyển nạp gen. Những
xét nghiệm về “transgenic” đầu tiên bao gồm kiến trúc dây “antisense”, sao cho thông tin
được thể hiện như mong muốn. Những xét nghiệm sau cùng sẽ là xem xét khả năng của
những alen đặc biệt của gen trong kiến trúc tương thích với những promoter thể hiện chức
năng hoạt động ở mô, ví dụ mô rễ, mô hạt ở trong một giai đoạn phát triển nào đó, nhằm
đạt được yêu cầu đề ra từ ban đầu.
Có hai hình thức chuyển gen chủ yếu là chuyển gen trực tiếp và chuyển gen gián
tiếp:
- Chuyển gen trực tiếp:
• Hấp thu DNA
• Siêu âm
• Lyposome
• Dùng xung điện
• Tia laze
• Vi tiêm
• Sung bắn gen
• Qua ống phấn
• Dùng silicon carbide
- Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn:
• Nhờ Agrobacterium
• Nhờ virus
2.1 Các phương pháp chuyển gen gián tiếp:
2.1.1 Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefacien:
Sử dụng vi sinh vật đất Agrobacterium (là vi khuẩn gram âm) để chuyển gen vào
thực vật là phương pháp hiệu quả và phổ biến nhất hiện nay nhờ vào khả năng gắn gen
ngoại lai vào hệ gen thực vật một cách chính xác và ổn định.

 Nguyên lý:
9
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Sử chuyển gen ở thực vật sử dụng A. tumefaciens dựa trên nguyên lý như hình sau:
Agrobacterium mang plasmid gây khối u ở thực vật, plasmid này chứa gen vir và vùng
cần chuyển (T-DNA). Gen quan tâm được chèn vào vùng (T-DNA). Các tế bào tổn thương
thực vật tiết ra hợp chất bảo vệ, hợp chất này kích thích sự biểu hiện gen vir ở
Agrobacterium. Vir protein tạo ra T-strand từ vùng T-DNA trên T-plasmid. Sau đó vi
khuẩn gắn vào tế bào thực vật. T-strand và một số protein vir chuyển vào tế bào thực vật
qua kênh vận chuyển. Trong tế bào thực vật, các protein vir tương tác với T-strand tạo ra
phức hệ (T-conplex). Phức hệ này vào nhân tế bào thực vật, T-DNA chèn vào bộ gen thực
vật và biểu hiện gen mong muốn.
Hình 2: Cơ chế chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium tumefaciens
10
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 3: Quy trình chuyển gen sắc tố beta-caroten từ cà rốt sang lá cây cà chua nhờ
Agrobacterium, sau đó nhân giống cây cà chua mới với đặc tính được tăng cường beta-
caroten. (theo tờ “Your World”)
 Sử dụng Agrobacterium để chuyển gen đã thu được nhiều kết quả , đặc biệt là chuyển gen
vào lúa mì và các cây lương thực quan trọng. Nhiều giống lúa chuyển gen có giá trị đặc
biệt như giống lúa Golden Rice có chứa hàm lượng vitamin A gấp nhiều lần so với giống
lúa thông thường. Nhờ giống lúa này đã giải quyết được vấn đề hết sức khó khăn về sự
thiếu vitamin A ở các nước đang phát triển, đặc biệt là Châu Phi.
• Ưu điểm:
• Gen ít bị đào thải.
• Số lượng bản sao ít hơn do đó tránh được hiện tượng ức chế lẫn nhau.
• Tồn tại bền vững trong cơ thể thực vật.
• Nhược điểm:
• Gây khối u cho cây hai lá mầm nhưng lại không gây khối u cho cây một lá
mầm. Trong khi đó cây 1 lá mầm là những cây lương thực quan trọng như lúa,

ngô, mì…
2.1.2 Chuyển gen gián tiếp nhờ virus:
Ngoài việc sử dụng vi khuẩn người ta còn sử dụng virus làm vector chuyển gen vào
cây trồng. Chuyển gen nhờ virus có thể thuận lợi do virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ
11
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
thể thực vật đồng thơi virus có thể mang đoạn DNA lớn hơn nhiều so với khả năng của
plasmid. Tuy nhiên, virus làm vector chuyển gen phải có những tiêu chuẩn sau:
- Hệ gen virus phải là DNA
- Virus có thể di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở vách tế bào
- Có thể mang đoạn DNA mới sau đó chuyển gen này vào thực vật
- Không gây tác hại đáng kể đối với thực vật
2.2 Các phương pháp chuyển gen trực tiếp
2.2.1 Chuyển gen bằng sung bắn gen (gene gun)
Hình 4: Súng bắn gen
 Nguyên lý:
Sử dụng những viên đạn có kích thước nhỏ (1 – 1,5 μm), có tỉ trọng cao (thường là
tungsten hay vàng) để đạt được một gia tốc cao khi đi xuyên qua vỏ và màng tế bào =>
đưa lớp DNA bọc bên ngoài của viên bi tiếp cận với bộ máy di truyền của tế bào. Sau khi
bắn, tách các mô, tế bào và nuôi cấy invitro để tái sinh cây. Các gen cần chuyển có thể tái
tổ hợp vào hệ gen của cây, từ đó tạo thành cây chuyển gen.
12
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 5: Sơ đồ nguyên lý hoạt động của súng bắn gen
• Ưu điểm:
• Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào. Quá trình chuyển gen
nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật
• Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong thời gian ngắn.
• Các vector mang gen tái tổ hợp có cấu tạo đơn giản.
• Chỉ cần mốt lượng nhỏ plasmid DNA.

• Biểu hiện tạm thời của gen biến nạp có thể quan sát thấy trong vài ngày sau
biến nạp.
• Nhược điểm:
• Nhiều bản sao của gen có thể được chuyển vào tế bào cùng lúc, gây khó
khăn cho việc phân tích biểu hiện của gen, dẫn đến sự biểu hiện của các gen
không bền vững.
• Hiệu quả chuyển gen thấp
• Đòi hỏi thiết bị đắt tiền. Chi phí đầu tư đắt
2.2.2 Chuyển gen bằng xung điện (electroporation):
 Nguyên lý:
13
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Trong công nghệ di truyền thực vật, người ta sử dụng phương pháp xung điện để
chuyển gen vào tế bào trần (protoplast) làm cho bên ngoài môi trường có thể xâm nhập
vào bên trong tế bào. Người ta chuẩn bị protoplast với các plasmid tái tổ hợp đã mang gen
mong muốn cần chuyển vào thực vật.
Dùng thiết bị điện tạo điện thế cao (200 – 400/ V/cm) trong khoảng thời gian 4- 5
phần nghìn giây. Kết quả làm tế bào trần xuất hiện các lỗ thủng tạm thời giúp cho plasmid
có thể xâm nhập và gắn vào hệ gen của thực vật. Quá trình được thực hiện trong cuvett
chuyên dụng. Sau quá trình xung điện đem protoplast nuôi trong môi trường nuôi cấy
thích hợp, môi trường chọn lọc để các protoplast đã được biến nạp sau đó nuôi cấy
invitro, tái sinh cây và chọn lọc chuyển gen.
• Ưu điểm:
• Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định, đặc biệt đối với gen đơn.
• Nhược điểm:
• Hệ thống tái sinh của các tế bài trần của nhiều loài còn gặp khó khăn.
• Chưa được áp dụng nhiều, mới được sử sụng trong các nghiên cứu tạm thời
của gen.
2.2.3. Phương pháp chuyển gen bằng vi tiêm (microinjection).
 Nguyên tắc:

Phương pháp chuyển gen nhờ vi tiêm là phương pháp sử dụng các thiết bị hiển vi và
máy vi nhu động để chuyển gen trực tiếp vào tế bào. Đến nay các tế bào đã được sử dụng
phương pháp này để chuyển gen gồm cá tế bào protoplast, các tế bào tiền phôi của hợp tử
hay hạt phấn.
14
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 6. Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm
• Ưu điểm:
• Lượng DNA được biến nạp là tùy ý và xác định.
• DNA được đưa vào đúng vị trí mong muốn, thậm chí vào nhân tế bào.
• Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé, như hạt phấn, phôi
non mà các kỹ thuật khác không thể hiện được.
• Nhược điểm:
• Mỗi lần chuyển gen chỉ đưa được DNA vào một tế bào duy nhất, do vậy đây
là phương pháp tốn nhiều thời gian và công sức.
• Chỉ có thể thực hiện bởi các kỹ thuật viên có kỹ năng cao.
• Đòi hỏi thiết bị tương đối đắt tiền.
2.2.4. Phương pháp chuyển gen nhờ PEG (polyethylene glycol)
 Nguyên tắc:
Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương pháp chuyển gen
nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần.
Khi ở nồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa
mà kết dính với màn sinh chất. Sau đó bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độ cao của
Ca
2+
hoặc độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển vào trong tế bào protoplast.
• Ưu điểm:
• Hiệu quả chuyển gen cao, ổn định nếu quá trình biến nạp thành công.
• Không đòi hỏi thiết bị đắt tiền.
• Nhược điểm:

• Quá trình biến nạp khó điều khiển. Số bản copy của gen trong tế bào biến
nạo có thể lớn.
15
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
• Tần số biến nạp thành công có biến động giữa các thí nghiệm.
• Dễ dẫn đến hiện tượng dung hợp của các tế bào trần, gây khó khăn cho việc
phân tích biểu hiện của gen.
• Đòi hỏi một hệ thống tái sinh tế bào trần, vốn còn gặp khó khăn ở nhiều loài
cây trồng.
Một số phương pháp chuyển gen khác:
• Phương pháp dùng siêu âm:
Siêu âm là một phương pháp mới dựa trên tác động của sóng siêu âm có thể tạo ra
sự biến động của màng tế bào. Sự biến động này gây ra sự xáo trộn ở màng tế bào, dẫn
đến sự xâm nhập các phân tử lạ vào trong tế bào.
Phương pháp này thường dùng kết hợp với các phương pháp chuyển gen nhờ
Agrobacterium để tặng hiệu quả của sự tiếp xúc của vi khuẩn vào trong tế bào thực vật,
giúp làm tăng hiệu quả chuyển gen lên 100 – 1400 lần.
• Chuyển gen trực tiếp qua ống phấn:
DNA theo đường ống phấn chui vào bầu nhị cái và tạo ra sự chuyển gen ngay sau
khi hạt phấn mọc qua vòi nhị và sự thụ tinh xảy ra.
Sự chuyển gen qua ống phấn tốt nhất được thực hiện ngay sau quá trình thụ tinh xảy
ra ở noãn, nhưng tế bào sinh dục cái chưa kịp phân chia. Sự chuyển gen sẽ được thực hiện
với một số tế bào sinh sản cái duy nhất và sau khi tái sinh cây sẽ tránh được xuất hiện thể
khảm
 Một số trương hợp khác người ta kết hợp các phương pháp với nhau. Chẳng hạn trong
chuyển gen ở ngô, người ta sử dụng kết hợp phương pháp súng bắn gen để gây tổn
thương tế bào biến nạp trước khi chuyển gen bằng Agrobacterium.
3. Cây trồng biến đổi gen:
3.1 Khái niệm cây trồng biến đổi gen:
Cây trồng biến đổi gen là cây trồng mới được được áp dụng kỹ thuật di truyền hiện

đại để làm biến đổi cấu trúc ADN của nhân tế bào nhằm tạo ra các tính trạng mới theo ý
16
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
muốn của con người như tính kháng sâu bệnh, tính thích nghi, phẩm chất, màu sắc của
nông sản.
Về bản chất của cây trồng biến đổi gen là sự biến đổi vật chất di truyền, tiếp nhận
những gen mới, kết quả là xuất hiện những tính trạng mới. Quá trình biến đổi vật chất di
truyền (thêm gen mới) nhờ vào công nghệ chuyển gen hiện đại. Nếu so sánh quá trình
biến đổi gen với quá trình đột biến trong tự nhiên thì về bản chất của hai quá trình này
gần giống như nhau. Bởi vì quá trình tiến hóa của sinh vật đều dựa vào quá trình biến đổi
vật chất di truyền, trong đó đột biến đóng vai trò quan trọng.
Dưới tác động của các nhân tố gây đột biến, vật chất di truyền được biến đổi theo
hai hướng: thêm đoạn gen hay bớt đoạn gen. Quá trình thêm đoạn nhờ công nghệ chuyển
đổi gen tương tự như quá trình thêm đoạn AND trong đột biến tự nhiên. Tuy nhiên hai
quá trình này có nhiều điểm khác nhau:
- Quá trình chọn lọc tự nhiên chỉ giữ lại những biến dị có lợi cho quá trình tiến hóa
của loài.
- Kỹ thuật chuyển gen cây trồng chỉ giữ lại tính trạng định hướng trước theo ý muốn
của con người nhằm vào mục đích kinh tế hoặc chất lượng và không đóng góp gì cho sự
tiến hóa của loài.
3.2 Tình hình sử dụng cây trồng biến đổi gen
3.2.1 Ngoài nước
Các lĩnh vực thử nghiệm đầu tiên của thực vật biến đổi gen xảy ra ở Pháp và Mỹ
trong năm 1986, khi cây thuốc lá được thiết kế để đề kháng với thuốc diệt cỏ. Năm
1987, Viện di truyền thực vật Ghent (Bỉ), được thành lập bởi Marc Van Montagu và
Jeff Schell, được các Công ty đầu tư để phát triển kỹ thuật di truyền trên cây thuốc lá với
khả năng chống chịu côn trùng bằng cách thể hiện gen mã hóa cho protein diệt côn
trùng từ loài vi khuẩn BT (Bacillus thuringiensis).
Trung Quốc là quốc gia đầu tiên cho phép thương mại hóa cây thuốc lá biến đổi gen
kháng virus vào năm 1992.

Cây trồng biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận cho bán tại Mỹ năm 1994 là cây cà
chua FlavrSavr có thời gian bảo quản lâu hơn.
17
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Năm 1994, Liên minh Châu Âu (EU) đã phê chuẩn cây thuốc lá thiết kế có khả năng
chịu thuốc diệt cỏ bromoxynil, là cây trồng biến đổi gen đầu tiên trên thị trường ở Châu
Âu.
Năm 1995, khoai tây biến đổi gen BT đã được phê duyệt an toàn của Cơ quan Bảo
vệ môi trường, là cây trồng thực phẩm biến đổi gen đầu tiên được chấp thuận tại Hoa Kỳ.
Năm 2009 có 25 quốc gia nghiên cứu, sản xuất, nhập khẩu cây trồng biến đổi gen,
trong đó chủ yếu là các nước phát triển và đang phát triển (15 nước). Diện tích cây biến
đổi gen khoảng 180 triệu ha, trong đó Hoa Kỳ 62,5 triệu ha, Argentina 21 triệu
ha, Brazil 15,8 triệu ha, Ấn Độ 7,6 triệu ha, Canada 7,6 triệu ha
Theo đánh giá của Clive James, giám đốc của ISAAA (Cơ quan dịch vụ quốc tế về
tiếp thu các ứng dụng công nghệ sinh học trong nông nghiệp). Chỉ trong 15 năm sau khi
thương mại hóa, cây trồng công nghệ sinh học biến đổi gen vượt 180 triệu ha trong năm
2010, trong đó có 154 triệu nông dân ở 29 quốc gia hiện đang được hưởng lợi từ công
nghệ mới này. Với sự gia tăng 87 lần chưa từng có từ năm 1996 đến 2010, cây trồng công
nghệ sinh học là công nghệ cây trồng được áp dụng nhanh nhất trong lịch sử của nông
nghiệp hiện đại.
Trong năm 2010, các nước đã phát triển các loại cây trồng biến đổi gen nhất là Hoa
Kỳ (45%), Brazil (17%), Argentina (15%), Ấn Độ (6%), Canada (6%), Trung Quốc (2%),
Paraguay (2%), Pakistan (2%), Nam Phi (1%) và Uruguay (1%).
Tại Mỹ trong năm 2010 cây trồng giống biến đổi gen đã chiếm: 93% diện tích trồng
đậu tương, 93% bông, 86% ngô và 95% của củ cải đường. Trong đó giống đậu tương biến
đổi gen được ghép vào gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate. Bông và ngô được chuyển
vào cả 2 gen chống thuốc diệt cỏ glyphosat và gen diệt côn trùng BT (được chuyển từ loài
vi khuẩn Bacillus thuringiensis).
Năm 2010 là kỷ niệm 15 năm thương mại hóa cây trồng biến đổi gen, 1996-2010.
Diện tích cây trồng biến đổi gen (tính theo luỹ kế) giai đoạn 1996-2010 vượt 1 tỷ ha

(tương đương với tổng diện tích rộng lớn của Mỹ hoặc Trung Quốc), rõ ràng điều đó cho
thấy cây trồng biến đổi gen đang được chấp nhận và phát triển mạnh.
18
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 7: Tốc độ phát triển của cây trồng biến đổi gen
3.2.2 Trong nước
Tại Việt Nam, cây trồng biến đổi gen đã được đầu tư nghiên cứu và khảo nghiệm từ
năm 2006 sau khi “Chương trình trọng điểm phát triển và ứng dụng công nghệ sinh học
trong lĩnh vực nông nghiệp và phát triển nông thôn đến năm 2020” được phê duyệt tại
Quyết định số 11/2006/QĐ-TTg.
19
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 8: Mô hình khảo nghiệm ngô biến đổi gen tại Bà Rịa – Vũng Tàu.
Vào năm 2011, việc đưa ngô biến đổi gen vào sản xuất thương mại tại Việt Nam
được dự kiến triển khai vào năm 2012 sau hai đợt khảo nghiệm trên diện rộng. Tuy nhiên,
vào thời điểm đó, nhiều nhà khoa học trong nước cho rằng, việc triển khai cây trồng biến
đổi gen cần phải nghiên cứu kỹ và có những bước đi thận trọng.
Đến 2013, Bộ NN&PTNT đã công nhận kết quả khảo nghiệm 5 giống ngô biến đổi
gen để trình Bộ Tài nguyên - Môi trường cấp phép an toàn sinh học. Tuy nhiên, cho tới
hiện tại, Bộ NN&PTNN cũng chỉ mới triển khai một số mô hình trồng bắp biến đổi gen
tại 6 tỉnh thành với quy mô 1,5 - 2ha/giống/mô hình.
4. Những thành tựu triển vọng trong tạo giống cây trồng chuyển
gen
4.1 Golden Rice
Gạo Vàng (Golden Rice - GR) là gạo biến đổi gen với khả năng sản xuất
Beta - carotene, là tiền chất của Vitamin A. Nó được gọi là Gạo Vàng vì nó có đặc
tính màu cam/màu vàng nhạt, đó là màu sắc của carotenoid (là một dạng sắc tố hữu
20
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài

nấm và một vài loài vi khuẩn).
Công nghệ mới này lần đầu tiên được phát triển bởi Tiến sĩ Ingo Potrykus
của Viện Công nghệ Liên bang Thụy Sĩ tại Zurich và Tiến sĩ Peter Beyer từ Đại
học Freiburg của Đức từ năm 1991 đến năm 2000 với kinh phí khoảng 100 triệu USD
(Ho 2001; Shiva 2001). Thời điểm đầu tiên nó được tài trợ bởi các tổ chức như Quỹ
Rockefeller, Viện Công nghệ Liên bang Thụy Sĩ, Chương trình Công nghệ sinh học của
Cộng đồng Châu Âu và Văn phòng Liên bang Thụy Sĩ cho Giáo dục và Khoa học
(Ho 2001).
(Theo “Who need Golden Rice.PDF”)
Hình 9: Giống lúa vàng chuyển gen giàu beta-carotene
Công nghệ sản xuất lúa vàng được khởi xướng từ năm 1999, nhưng do những bất
đồng về chính trị nên mãi tới 10 năm sau nó mới được đưa ra trồng thử nghiệm tại
Philipinnes nhờ cố gắng của Hội đồng nhân đạo về giống lúa vàng (GRHB), cơ quan này
đã tiến hành phân tích và làm thông tư tưởng cho 6 quốc gia ở khu vực Đông Nam Á.
Giống lúa vàng được ra đời năm 1999 bằng cách được cài xen hai gen đảm nhận
chức năng đóng mở, tạo ra giống lúa màu vàng, hạt giàu hàm lượng beta - carotene (tiền
vitamin A) và màu sắc vàng của gạo chính là thể hiện mức độ giàu vitamin A.
21
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
4.2 Lúa chịu hạn và lụt
Một trong những sản phẩm GM có khả năng giúp con người khắc phục nạn đói thiếu
lương thực là loại lúa GM chịu được hạn hán, lũ lụt có tên là SNORKEL1 và
SNORKEL2. Đây là những giống lúa mới do các nhà khoa học Nhật Bản tạo ra có năng
suất cao thân cao rất phù hợp ở những chân ruộng thường xuyên bị úng lụt như Thái Lan
và Campuchia.

Hình 10: Giống lúa chuyển gen chịu hạn và lụt
Để tạo ra giống lúa này các nhà khoa học đã tìm ra cặp gen có tên là SNORKEL
giúp cho cây trồng phát triển nhanh khi sống trong môi trường nước nhiều giúp lá phát
triển trên mặt nước. Mỗi khi nước dâng cao, lúa lại tích lũy hormone ethylene hormone

này đến lượt nó kích hoạt các gen SNORKEL làm cho thân lúa phát triển nhanh và cứng
cáp hơn.
4.3 Chuối chuyển gen chống suy dinh dưỡng:
Chuối là sản phẩm rất phổ biến ở các quốc gia châu Phi, đặc biệt là Uganda nơi
được xem là thực phẩm chủ đạo, trung bình mỗi người dân Uganda ăn tới 1 kg chuối/
22
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
ngày. Mặt trái của loại chuối khi dùng làm thực phẩm là thiếu hụt sắt và vitamin A nên
nhiều người dân ở đây bị suy dinh dưỡng.
Hình 11: Chuối chuyển gen có hàm lượng sắt và beta-caroten cao
Để hạn chế tình trạng này các chuyên gia ở ĐH Bách khoa Queenland (Australia) đã
lai tạo cho ra đời giống chuối chuyển gen có tên là Cavendish Banana, có hàm lượng sắt
và beta carotene cao. Giống chuối mới này hiện đang được trồng thử nghiệm tại Australia
và sẽ đưa sang trồng tại Uganda vào cuối năm 2011.
5. Các hướng chính tạo cây trồng chuyển gen cải thiện giống cây
trồng
5.1. Chuyển gen kháng sâu
Trong nông nghiệp người sử dụng thuốc trừ sâu vi sinh Bt do vi khuẩn Bacillus
thuringiensis tạo ra.Vi khuẩn này sản xuất ra các protein kết tinh rất độc đối với côn trùng
nhưng không gây độc với động vận có xương sống.
Tinh thể protein độc tố của vi khuẩn này khi vào một côn trùng sẽ bị các enzyme
protease phân giải thành các đoạn peptit, trong đó có đoạn khối lượng khoảng 68.000
23
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
dalton chứa khoảng 1200 axit amin làm hỏng ruột côn trùng. Các gen mã hóa độc tố này
nằm trên plasmid của vi khuẩn, được gọi chung là Cry (Crystal)
Hình 12: Cây bắp được chuyển gen chống lại sâu bệnh ở các nước châu Âu
5.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Nguyên tắc chung là phải tìm được gen kháng lại cơ chế gây hại của thuốc trừ cỏ:
- Nâng cao hoạt tính của các enzyme bị hại do thuốc trừ cỏ

- Tạo ra các enyme đột biến không bị ảnh hưởngcủa thuốc trừ cỏ
- Tạo các enzyme làm mất tính độc của thuốc trừ cỏ.
Ví dụ:
Thuốc diệt cỏ kìm hãm quang hợp Bromoxynil
Đưa gen mã hóa enzyme nitrilaza (phân lập từ VK đất Klebiella ozaenae) có thể bất
hoạt bromoxynil trước khi nó hoạt động
24
CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỰC VẬT GVHD: Th.S PHẠM VĂN LỘC
Hình 13: Enzyme Nitralaza làm bất hoạt Bromoxynil
5.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus
Có nhiều hướng tạo cây kháng bệnh virus bằng kỹ thuật chuyển gen:
- Chuyển gen mã hoá cho protein vỏ của virut
- Chuyển gen tạo các ribozyme (enzyme phân giải virus)
- Chuyển các gen đối mã với RNA của virus.
Trong đó kỹ thuật chuyển gen mã hóa vỏ protein của virus thường được dung phổ
biến. Virus có cấu tạo 2 phần: Phần lõi là Axit nucleic ( DNA hoặc RNA) và phần vỏ là
protein . Khi có mặt gen mã hóa protein vỏ của virus trong tế bào của cây thì sẽ gây hiệu
ứng kìm hãm sự tổng hợp protein vỏ của gen tạo vỏ ở virus, do vậy virus không nhân lên
được.
Nhiều loại cây trồng được chuyển gen tạo vỏ của nhiều loại virus nên đã kháng được
các virus gây bệnh như: đu đủ kháng virus gây bệnh đốm vòng, cây thuốc lá kháng virus
khảm dưa chuột, khoai tấy virus xoăn lá…
25