Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng (monoclono antibody) để chuẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC







BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT KHÁNG THỂ
ĐƠN DÒNG (MONOCLONO - ANTIBODY) ĐỂ CHUẨN ĐOÁN
NHANH BỆNH VIRUS TRÊN TÔM NUÔI



CNĐT: ĐINH THƯƠNG VÂN











8284

HÀ NỘI - 2010






1

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG
NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
__________________
CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT
NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Hà nội, ngày 5 tháng 10 năm 2010.


BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng
(Monoclono-Antibody) để chẩn đoán nhanh bệnh virus trên tôm nuôi
Mã số đề tài: KC.06.16/06-10
Thuộc Chương trình: “Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ tiên tiến
trong sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lực”.
Mã số: KC.06/06-10

2. Chủ nhiệm đề tài:
Họ và tên: Đinh Thương Vân
Ngày, tháng, năm sinh: 31/07/1957 Nữ
Họ
c hàm, học vị: Tiến sĩ
Chức danh khoa học: Nghiên cứu viên chính
Điện thoại: Cơ quan: 04-37563386 Nhà riêng: 04-37673411
Mobile: 0904154789 Fax: 047914815
E-mail:
Tên cơ quan đang công tác: Viện Công nghệ sinh học
Địa chỉ: 18 Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Địa chỉ nhà riêng: 68/53/9 Đường Cầu Giấy , Hà Nội
3. Tổ chức chủ trì đề tài:
Tên tổ chức chủ trì đề
tài:
Viện Công nghệ Sinh học, Viện KH&CN Việt Nam
Điện thoại: : 04-8362599 Fax: 04-8363144
E-mail:
Website:
Địa chỉ: 18, Đường Hoàng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Họ và tên thủ trưởng cơ quan: Trương Nam Hải

2
Số tài khoản: 931. 01. 064
Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Ba Đình, Hà Nội
Tên cơ quan chủ quản đề tài : Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài/dự án:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ 28 tháng 4/ năm 2008 đến tháng 9/ năm 2010
- Thực tế thực hiện: từ tháng 4/năm 2008 đến tháng 9/năm 2010

2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2705 triệ
u đồng (Hai tỷ bảy trăm linh năm triệu đồng),
trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 2705 triệu đồng
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Thời gian
(Tháng, năm)
Kinh phí
(Tr.đ)
Ghi chú
(Số đề nghị
quyết toán)
1 2008 1199,75 2008 Lần 1: 840
Lần 2: 360
640
2 2009 1327,3 2009 Lần 1: 928
Lần 2: 399
916,009800
3 2010 177,95 1010 Lần 1: 124 686,607
Lần 2: 54 462,054045
TỔNG 2705 TÔNG 2705
c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đối với đề tài:
Đơn vị tính: Triệu đồng
Theo kế hoạch Thực tế đạt được
Số
TT
Nội dung
các khoản chi
Tổng SNK
H
Nguồn
khác
Tổng SN
KH
Nguồn
khác
1 Trả công lao động
(khoa học, phổ
thông)
750 750
2 Nguyên, vật liệu,
năng lượng
1620 1664,757645
3 Thiết bị, máy móc
100 133, 742 350
4 Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
30
CV xin
chuyển
mua máy

móc
5 Chi khác
205 156,5
CV xin
chuyển
công tác
phí nước
ngoài mua

3
hóa chất

Tổng cộng 2705 2704, 999

3. Các văn bản hành chính trong quá trình thực hiện đề tài/dự án:
Số
TT
Số, thời gian ban
hành văn bản
Tên văn bản
1 QĐ283/QĐ-
BKHCN ngày
28/11/2007
QĐ về viêc phê duyệt các tổ chức, cá nhân trúng tuyển chủ trì
thực hiện 06 đề tài cấp nhà nước năm 2008 (đợt II) thuộc
chương trình Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ
tiên tiến trong sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lực
Mã số: KC.06/06-10

2 QĐ 2474/QĐ-

BKHCN ngày
26/10/2007
QĐ về việc thành lập HĐKH và công nghệ cấp nhà nước tư
vấn tuyển chọn tổ chức cá nhân chủ trì đề tài để thực hiện
trong kế hoạch năm 2008 thuộc chương trình KHCN trọng
điểm cấp nhà nước giai đoạn 2006-2010
Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ tiên tiến trong
sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lự
c
Mã số: KC.06/06-10

3 QĐ 2831/QĐ-
BKHCN ngày
26/10/2007
QĐ về việc phê duyệt các tổ chức, cá nhân trúng tuyển chủ trì
06 đề tài cấp nhà nước năm 2008 thuộc chương trình
Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ tiên tiến trong
sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lực
Mã số: KC.06/06-10

QĐ253/QĐ-
BKHCN ngày
21/2/2008
QĐ Phê duyệt kinh phí 10 đề tài, 02 dự án SXTN trọng điểm
cấp nhà nước giai đoan 2008-2010. Nghiên cứu, phát triển và
ứng dụng công nghệ tiên tiến trong sản xuất các sản phẩm xuất
khẩu chủ lực, Mã số: KC.06/06-10

HĐ01/HĐ-
CNSH/DTKC.06-

Hợp đồng nghiên cứu khoa học và công nghệ
QĐ2070/QĐ-
BKHCN ngày
18/9/2008
QĐ phê duyệt đấu thầu mua sắm tài sản của đề tài thuộc
Chương trình Nghiên cứu, phát triển và ứng dụng công nghệ
tiên tiến trong sản xuất các sản phẩm xuất khẩu chủ lực
Mã số: KC.06/06-10

CV 374/CNSH ngày
28/8/2008
Tờ trình về kế hoạch mua thiết bị dùng cho TN thuộc đề tài
KC.06.16/06-10
CV 381/CNSH ngày
10/9/2008
Công văn về kế hoạch mua hóa chất và thiết bị cho TN thuộc
đề tài KC.06.16/06-10
CV 203/VPCT-
HCTH ngày
26/8/2008
CV cho phép điều chỉnh giá mua thiết bị thuộc đề tài KC-
06.16/06-10

4
QĐ262/QĐ-CNSH
ngày 24/9/2008
QĐ thành lập Hội đồng đấu thầu mua sắm tài sản năm 2008 đề
tài KC.06.16/06-10
QĐ277/QĐ-CNSH
ngày 06/10/2008

QĐ phê duyệt hồ sơ và danh sách đơn vị tham gia đấu thầu
năm 2008 đề tài KC.06.16/06-10
QĐ307/QĐ-CNSH
ngày 22/10/2008
QĐ phê duyệt nhà thầu trúng tuyển gói thầu ”mua sắm thiết
bị” thuộc đề tài KC.06.16/06-10
QĐ308/QĐ-CNSH
ngày 22/10/2008
QĐ phê duyệt nhà thầu trúng tuyển gói thầu ”mua hóa chất vật
tư” thuộc đề tài KC.06.16/06-10
CV52/CNSH ngày
20/2/2009
Công văn kế hoạch mua hóa chất
CV66/CNSH ngày
2/3/2009
Công văn xin điều chỉnh và kế hoạch mua hóa chất và vật tư
tiêu hao của đề tài không qua đấu thầu
CV80/CNSH ngày
12/3/2009
Công văn xin điều chỉnh và kế hoạch mua hóa chất
CV 111/VPCT-
TCKT ngày
31/3/2009
Lập bảng kê kinh phí chi thanh toán cho các sản phẩm, nội
dung công việc đã hoàn thành của đề tài, dự án
CV 112/VPCT-
TCKT ngày
31/3/2009
Hướng dẫn báo cáo quyết toán kinh phí hàng năm của đề tài
QĐ 237/QD-CNSH

ngày 16/6/2009
QĐ về việc thành lập Hội đồng nghiệm thu chuyên đề
QĐ 93/VPCT-
HCTH ngày
23/3/2009
Về việc điều chỉnh một số hạng mục kinh phí của đề tài
KC06.16/06-10
QĐ 439/QD-
BKHCN ngày
30/3/2009
QĐ phê duyệt kế hoạch đấu thầu mua sắm tài sản của đề tài
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng
(Monoclono-Antibody) để chẩn đoán nhanh bệnh virus trên
tôm nuôi
Mã số: KC.06/06-10

QĐ135/QD-CNSH
ngày 13/4/2009
QĐ thành lập Hội đồng đấu thầu mua sắm tài sản năm 2009
thuộc đề tài KC.06.16/06-10
QĐ144/QD-CNSH
ngày 23/4/2009
QĐ phê duyệt nhà thầu trúng tuyển gói thầu ”mua hóa chất vật
tư” thuộc đề tài KC.06.16/06-10
CV90/CNSH ngày
15/3/2010
Công văn xin điều chỉnh kinh phí điện nước cho nội dung
mua hóa chất và vật tư tiêu hao của đề tài
QĐ 93/VPCT-
THKH ngày

24/3/2009
Về việc điều chỉnh một số hạng mục kinh phí của đề tài
KC06.16/06-10

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài, dự án:
Số
TT
Tên tổ chức
đăng ký theo
Thuyết minh
Tên tổ chức đã
tham gia thực
hiện
Nội dung
tham gia chủ yếu
Sản phẩm chủ yếu
đạt được

5
1
Viện Nghiên
cứu nuôi trồng
thủy sản 1

TT quốc gia
giống hải sản
miền Bắc
- Cung cấp mẫu tôm
nhiễm bệnh để viện
CNSH tách chiết tinh

chế WSSV
- Thu thập các mẫu ấu
trùng tôm (post larvae
10-15) nhiễm MBV
- Kiểm tra que thử tại
các cơ sở nuôi tôm của
Viện
- Cung cấp 3000
tôm post nhiễm
WSSV
- Cung cấp 5000
tôm post nhiễm
MBV
- Kiểm tra 200 que
thử tạ
i các cơ sở
nuôi tôm
2
Viện Kỹ thuật
Hóa sinh và tài
liệu nghiệp vụ

Viện Kỹ thuật
Hóa sinh và tài
liệu nghiệp vụ

- Chọn màng phù hợp
để gắn sinh phẩm
- Tìm nồng độ thích
hợp của các sinh phẩm

để gắn màng một cách
hiệu quả nhất
- Xác định độ nhạy và
độ đặc hiệu và độ bền
của que thử đã chế tạo

5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài, dự án:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)
Số
TT
Tên cá nhân đăng ký
theo Thuyết minh
Tên cá nhân đã tham gia
thực hiện
Nội dung
tham gia
chính
Sản phẩm
chủ yếu
đạt được
1 TS. Đinh Thương Vân TS. Đinh Thương Vân
Chủ nhiệm
2 TS. Lê Thị Tâm TS. Lê Thị Tâm
Tham gia
3 PGS. TS. Đinh Duy
Kháng
PGS. TS. Đinh Duy Kháng
Tham gia
4 TS. Đỗ Thị Thảo TS. Đỗ Thị Thảo

Tham gia
5
TS. Đồng Văn Quyền TS. Đồng Văn Quyền Tham gia
6
ThS. Hà Thị Thu ThS. Hà Thị Thu Thư kí
7
TS. Phạm Anh Tuấn Th.S Nguyễn Thị Thu
Hiền
Tham gia
8
ThS. Nguyễn Hữu Ninh KS.Nguyễn Thị Phương Tham gia
9
CN. Võ Anh Tú KS.Nguyễn Viết Vương Tham gia
10
ThS. Lê Trọng Văn ThS. Lê Trọng Văn Tham gia
11
ThS. Bạch Thị Như Quỳnh Tham gia
12
ThS. Nguyễn Thị Hoa Tham gia
13

ThS. Trần Minh Trí
Tham gia
14

CN. Hoàng Thế Yên
Tham gia

6
Lý do thay đổi: Việc thay đổi cán bộ tham gia đề tài chủ yếu do điều kiện bận công

tác, thay đổi công tác, học tập ở nước ngoài

6. Tình hình hợp tác quốc tế:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm, tên tổ chức hợp tác, số
đoàn, số lượng người tham gia )
Ghi
chú*
1 Trao đổi kinh nghiệm với
BIOTEC Thái Lan về sản xuất
kháng thể đơn dòng kháng VP28
của virus gây bệnh đốm trắng và
Polyhedrin của MBV. Sử dụng
các kháng thể đơn dòng này để
chế tạo que thử phát hiện nhanh
virus gây bệnh đốm trắng và
MBV. Một đoàn: 2 người, 10
ngày
Trong thời gian 2008 đề tài đã có
quan hệ với đối tác là GS. Paisarn
Sithigorgul, Dept. of Biology,
Faculty of Science,
Srinakharinwirot University,

Bangkok,Thailand. Giáo sư đã
cung cấp các tài liệu liên quan
cùng một số sinh phẩm đã và s
ẽ
đươc chuyển cho đề tài sau những
lần qua Việt Nam công tác, điều
này giúp cho đề tài thực hiện được
thuận lợi. Chính vì vậy đề tài nhận
thấy không cần thiết lắm để tổ
chức cho đoàn đi nước ngoài


- Lý do thay đổi (nếu có):
7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT
Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa
điểm )
Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm )
1 Hội thảo Tổ chức 3 hội thảo cấp Viện Công nghệ sinh
học với mục đích thảo luận các kết quả nghiên
cứu, nghiệm thu các chuyên đề
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 15 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo
sát trong nước và nước ngoài)
Thời gian
Từ tháng 4/2008 đến tháng
9/2010)

Số
TT
Các nội dung, công việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Theo kế
hoạch
Thực tế đạt
được
Người,
cơ quan
thực hiện
1
Tạo ra được quy trình công nghệ
sản xuất kháng thể đơn dòng
kháng protein vỏ của WSSV và
MBV

10/2008 10/2008 Viện Công
nghệ sinh học
2
Tạo ra được các dòng tế bào lai
(Hybridoma) sinh kháng thể đơn
Viện Công
nghệ sinh học

7
dòng kháng protein vỏ của WSSV
và MBV
3

Tạo ra được quy trình công nghệ
sản xuất bộ thử phát hiện nhanh,
chính xác WSSV và MBV trên
tôm nuôi

10/2009 10/2009 Viện kỹ thuật
hóa sinh và tài
liệu nghiệp vụ-
Tổng cục kỹ
thuật- Bộ
Công an; Viện
CNSH
4
Sử dụng quy trình công nghệ đã
tạo ra để sản xuất được được 500
bộ thử cho mỗi loại bệnh đạt chất
lượng tương đương hàng ngoại
nhập.

8/2010 8/2010 Viện kỹ thuật
hóa sinh và tài
liệu nghiệp vụ-
Tổng cục kỹ
thuật- Bộ
Công an

III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI, DỰ ÁN
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra:
a) Sản phẩm Dạng I:

Yêu cầu khoa học
cần đạt

Số
TT
Tên sản phẩm

Theo kế hoạch Thực tế
đạt được
Ghi chú

1 Các dòng tế bào lai
(Hybridoma) tạo kháng thể
đơn dòng kháng protein vỏ
của WSSV

02 dòng tế bào
lai
02 dòng tế
bào lai
Phản ứng đặc
hiệu với VP28
của WSSV
2 Các dòng tế bào lai
(Hybridoma) tạo kháng thể
đơn dòng kháng protein vỏ
của MBV
02 dòng tế bào
lai
02 dòng tế

bào lai
Phản ứng đặc
hiệu với
polihedrin của
MBV
3 Que thử phát hiện nhanh
WSSV

500 500 Độ nhạy và độ
đặc hiệu của que
thử sẽ được đánh
giá dựa trên việc
so sánh với kit
của nước ngoài và
các kỹ thuật khác
4 Que thử phát hiện nhanh
MBV
500 200 Độ nhạy và độ
đặc hiệu của que
thử sẽ được đánh
giá dựa trên việc
so sánh với kit
của nước ngoài và
các kỹ thuật khác

8

b) Sản phẩm Dạng II:

1

Quy trình công nghệ sản
xuất kháng thể đơn dòng
kháng protein Polyhedrin
của MBV
01 quy trình 01 quy trình Sản xuất được
kháng thể đơn
dòng kháng
protein
Polyhedrin của
MBV
2
Quy trình công nghệ sản
xuất kháng thể đơn dòng
kháng protein VP28 của
virus đốm trắng
01 quy trình 01 quy trình Sản xuất được
kháng thể đơn
dòng kháng
protein vỏ VP28
của WSSV
3
Quy trình công nghệ sản
xuất bộ thử phát hiện nhanh
MBV
01 quy trình 01 quy trình Sản xuất được bộ
thử phát hiện
nhanh MBV
4 Quy trình công nghệ sản
xuất bộ thử phát hiện nhanh
WSSV

01 quy trình 01 quy trình Sản xuất được bộ
thử phát hiện
nhanh WSSV

c) Sản phẩm Dạng III:
Số
TT
Tên sản phẩm và chỉ
tiêu chất lượng chủ
yếu
Đơn
vị đo
Số lượng
Theo kế
hoạch
Thực tế
đạt được
1
Báo cáo định kì 6
tháng/lần
Báo cáo 04 04 04
2
Báo cáo tóm tắt Báo cáo 15 15 15
3
Báo cáo trung gian
(Chuyên đề)
Báo cáo 03 03 03
4
Báo cáo thống kê Báo cáo 05 05 05
5

Các số liệu nhật kí thí
nghiệm
Báo cáo 03 03 03
6
Bài báo Bài báo 04 04 04
7
Đào tạo sau đại học:
Thạc sĩ
2 2 01 Th.S
01 TS
8
Phiếu đăng kí bản
quyền giải pháp hữu
ích về que thử phát hiện
nhanh WSSV
Phiếu 1 1 1

d) Kết quả đào tạo:
Số lượng
Số
TT
Cấp đào tạo, Chuyên ngành
đào tạo
Theo kế hoạch Thực tế đạt
được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)

9

1 Thạc sỹ 2 1 2008
2 Tiến sỹ 0 1 2011
- Lý do thay đổi (nếu có):

đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây
trồng:
Kết quả
Số
TT
Tên sản phẩm
đăng ký
Theo
kế hoạch
Thực tế
đạt được
Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
1
Phiếu đăng kí bản quyền giải
pháp hữu ích về que thử phát
hiện nhanh WSSV
01 01


2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài, dự án mang lại:
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ công
nghệ so với khu vực và thế giới…)
- Đề tài đã ứng dụng một cách thành công các kỹ thuật sinh học phân tử trong việc sản

xuất thành công kháng thể đa dòng cũng như kháng thể đơn dòng và các que thử
nhanh sử dụ
ng kháng thể đơn dòng để chẩn đoán bệnh ở tôm nói riêng và thủy sản nói
chung mà ởViệt Nam, cho đến nay chưa có cơ sở nào nghiên cứu sản xuất thành công
kháng thể đơn dòng vì vậy các sản phẩm dạng II & III của đề tài có tính thời sự và
khoa học cao.
- Đã tạo ra những quy trình kỹ thuật như: quy trình công nghệ sản xuất kháng thể đơn
dòng kháng protein Polyhedrin của MBV. Quy trình công nghệ sản xuất kháng thể đơn
dòng kháng protein VP28 của virus
đốm trắng. Quy trình công nghệ sản xuất bộ thử
phát hiện nhanh WSSV và quy trình công nghệ sản xuất bộ thử phát hiện nhanh MBV
góp phần phát triển lĩnh vực khoa học chẩn đoán virus tôm nói riêng và chẩn đoán
bệnh tôm nói chung, tăng cường quản lý nhà nước về nhập khẩu que thử chẩn đoán
bệnh tôm
- Đưa công nghệ sản xuất kháng thể đơn dòng thành công cụ đắc lực cho công tác chẩn
đoán, điề
u trị bệnh cho gia súc, vật nuôi và con người đồng thời nâng cao năng lực tiếp
cận các lĩnh vực khoa học hiện đại trong lĩnh vực kháng thể đơn dòng
- Góp phần đưa sinh học phân tử kết hợp phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng
làm tăng độ nhạy và độ đặc hiệu của công tác chẩn đoán và điều trị bệnh
- Góp phần nâng cao năng lực của cán bộ nghiên c
ứu tham gia đề tài, trong lĩnh vực
kháng thể đơn dòng và góp phần đào tạo nhân lực, góp phần đưa nền khoa học nước ta
từng bước hội nhập khu vực và quốc tế trong lĩnh vực công nghệ sinh học hiện đại sản
xuất kháng thể đơn dòng tạo kit chẩn đoán nói chung và tạo kit chẩn đoán trong lĩnh
vực thủy sản nói riêng
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:
(Nêu rõ hiệ
u quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản
phẩm cùng loại trên thị trường…)

10
Việc phát hiện nhanh các bệnh virus ở tôm nuôi bằng que thử nhanh, dễ sử dụng,
không cần đầu tư máy móc thiết bị đắt tiền, có thể thử ngay ngoài hiện trường là nhu
cầu cấp thiết đối với người nuôi tôm hiện nay. Trong kế hoạch tổng thể về phát triển
nuôi trồng thủy sản, ngành nuôi tôm càng ngày càng được chú trọng và phát triển vì
kim ngạch xuất khẩu tôm đã có những đóng góp rất lớn cho kim ngạch xu
ất khẩu
chung của cả nước. Việc ngăn ngừa, giảm thiểu thiệt hại do dịch bệnh trong ngành
nuôi tôm cần phải được quan tâm đúng mức, trong đó, các kit chẩn đoán nhanh bệnh ở
tôm đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực này.
- Giảm chi phí sản xuất, hạ giá thành sản phẩm tôm tăng thu nhập cho người nuôi tôm
do giá thành que thử sản xuất rẻ hơn nhập khẩu
Đưa nước ta hội nhập bình
đẳng với trào lưu phát triển thủy sản công nghệ cao của
khu vực
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài, dự án:
Số
TT
Nội dung
Thời gian
thực hiện
Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận
chính, người chủ trì…)
I
Báo cáo định kỳ
I. Kết quả Kiểm tra định
kì

Lần 1 13/11/2008 Lần1

1.CĐ: các vấn đề liên quan đến
kháng thể đơn dòng của WSSV
2.Số liệu về chọn lọc các dòng tế
bào lai sinh kháng thể đơn dòng
3.Số liệu về tinh chế WSSV từ mô
của Cambarus clarkii
4. Sè liÖu vÒ thu nhận ấu trùng
tôm nhiễm MBV
5.Số liệu về tạo dịch báng trong
chuột BALB/c. Thu nhận, tinh chế
kháng thể đơn dòn .Găn kháng thể
đơn dòng đã tinh chế với nhũ
vàng
6.Quy trình công nghệ s
ản xuất
kháng thể đơn dòng kháng protein
vỏ của WSSV
7. CĐ: Tinh chế polihedrin bằng
li tâm siêu tốc.
8. Dung hợp tế bào để tạo kháng
thể đơn dòng kháng Polyhedrin
của MBV
8. Sè liÖu vÒ thu nhận ấu trùng
tôm nhiễm MBV

9.Hoạt chất Polyhedrin
10. Sè liÖu vÒ xác định MBV bằng
hiển vi và PCR

1- Đã nêu được lý thuyết của
KTDD, ứng dụng trong chẩn
đoán bệnh tôm, ứng dụng sản
xuất KTDD để chế tạo b
ộ kit
chẩn đoán bệnh
2- Đã thu số liệu về KTDD đặc
hiệu và có ái lực cao với VP28
tự nhiên của WSSV, gây MD,
dung hợp tế bào lai
3- Thu số liệu và tinh chế
WSSV từ 250 mẫu tôm nghi bị
nhiễm
- Đã thu số liệu từ 167 mẫu
nhiễm virus. Tỷ lệ nhiễm virus
đốm trắng là 66,8%
4- Đã thu số liệu từ 98 mẫu
nhiễm MBV xác định bằng
PCA và soi mô . Tỷ lệ nhi
ễm
là 79,2%
5- Thu số liệu về tạo dịch báng
trong chuột BALB/c. Thu
nhận, tinh chế kháng thể đơn
dòn Gây báng cho 10 chuột
BALB/c thí nghiệm. Kết quả
đạt 60%KTDD tinh chế đạt
21,02mg/ml
6- Đã xây dựng quy trình
7- Đã nêu được nội dung về

11
11. Sè liÖu vÒ sử dụng Polyhedrin
tinh chế g©y miễn dịch cho chuột
thuần chủng BALB/c
12. Sè liÖu kiểm tra đáp ứng miễn
dịch của chuột bằng ELISA.
13.Số liệu về các tế bào lai sinh
kháng thể đơn dòng có tính đặc
hiệu cao với polihedrin của MBV
14.CĐ: Kháng thể đa dòng, kháng
thể đa dòng kháng IgG của chuột
15.Số liệu sản xuất kháng thể đa
dòng kháng WSSV. MBV
16.Số liệu sản xuấ
t kháng thể đa
dòng kháng IgG của chuột

tinh chế polihedrin bằng li tâm
siêu tốc.
8-Thu số liệu ttừ 250 mẫu tôm
nghi bị nhiễm MBV
9-Đang thu số liệu
10-Thu số liệu từ 198 con tôm
nhiễm MBV được xác đinh
bằng PCR và soi mô
11- Thu thập số liệu về sử
dung polyhedrin tinh chế gây
MD cho chuột thuần chủng:10
chuột chia lam 5 lô

12- Chuột đáp ứng MD tôt
nhất với KN VP28 liều
50µl/con/lần
13- Tế bào Myeloma dòng:
P3X-Ag18 đạt 83,5%
Sp2/0-Ag10 đạt 89,82%
14- 15-16- Đã nêu được lý
thuyết về KT đa dòng, sản xuất
KT đa dòng kháng IgG của
chuột


Lần 2
20/10/2009
Lần 2

1. Số liệu về chọn lọc các dòng tế
bào lai sinh kháng thể đơn dòng
2. Tạo dịch báng trong chuột
BALB/c.
3. Gắn kháng thể đơn dòng đã tinh
chế với nhũ vàng

1-2-3-Hoàn thành thu số liệu,
Hoàn thành báo cáo và được
cơ quan chủ trì đề tài nghiệm
thu
4. Báo cáo về sàng lọc tế bào lai
sinh kháng thể đơn dòng có tính
đặc hiệu cao với polihedrin của

MBV
5. Quy trình công nghệ sản xuất
kháng thể đơn dòng kháng protein
vỏ của WSSV
6. Báo cáo về sản xuất KT đa
dòng
7. Các số liệu cho quy trình công
nghệ sản xuất bộ thử phát hiện
nhanh MBV
4-5-6-Hoàn thành thu số liệu,
Hoàn thành báo cáo và được
cơ quan chủ trì đề tài nghiệm
thu







8. Báo cáo về nghiên cứu chọn
màng phù hợp để gắn sinh phẩm;
tìm nồng độ thích hợp của các
sinh phẩm để gắn màng một cách
hiệu quả nhất
9. Thu thập số liệu nghiên cứu
Thu các số liệu về điểm nhận
dạng, xác định phản ứng trên
màng, nồng độ, độ nhạy và độ
đặc hiệu

12
xác định độ nhạy và độ đặc hiệu
của que thử đã chế tạo với các
kháng nguyên đã sản xuất trong
phòng thí nghiệm

10. Bản hướng dẫn kỹ thuật sử
dụng và tiếp cận thị trường với
que thử WSSV và MBV (lần 1)
Quy định cụ thể các bước sử
dụng sản phẩm

11. Các số liệu nghiên cứu kiểm
tra que thử trên tôm nhiễm bệnh
đốm trắng (WSSV)
Thu số liệu đầy đủ rõ ràng về
độ nhạy, dộ đặc hiệu, phản ứng
chéo
III
Lần 3 10/3/2010 Lần 3

1. Các số liệu cho quy trình công
nghệ sản xuất bộ thử phát hiện
nhanh MBV
2. Báo cáo về nghiên cứu chọn
màng phù hợp để gắn sinh phẩm;
tìm nồng độ thích hợp của các
sinh phẩm để gắn màng một cách
hiệu quả nhất

3. Quy trình công nghệ sản xuất
bộ thử phát hiện nhanh WSSV
4. Quy trình công nghệ sản xuất
bộ thử phát hiện nhanh MBV

Hoàn thành quy trình
Hoàn thành báo cáo
Hoàn thành quy trình
IV Lần 4 28/9/2010


1. Bản hướng dẫn kỹ thuật sử
dụng tiếp cận thị trường với que
thử WSSV và MBV
2. Báo cáo kết quả kiểm tra que
thử trên tôm nhiễm bệnh đốm
trắng (WSSV)

3. Báo cáo kết quả kiểm tra que
thử trên tôm nhiễm bệnh MBV

4.Que thử phát hiện nhanh WSSV
5.Que thử phát hiện nhanh MBV
6.Báo cáo tổng kết đề tài
- Hoàn thành bản hướng dẫn
kỹ thuật sử dụng tiếp cận th
ị
trường với que thử WSSV và
MBV đạt chất lượng như quy
định trong hợp đồng

- Thu các kết quả kiểm tra que
thử trên tôm nhiễm bệnh đốm
trắng (WSSV). Hoàn thành
báo cáo
- Thu các kết quả kiểm tra que
thử trên tôm nhiễm bệnh
MBV. Hoàn thành báo cáo

- Hoàn thành 500 que thử phát
hiện nhanh WSSV, đạt độ
nhạy và độ đặc hiệu
- Hoàn thành 500 que thử phát
hiện nhanh MBV, đạt độ nhạy
và độ đặc hiệu


- Đ
ã hoàn thành báo cáo tổng
hợp kết quả nghiên cứu khoa

13
hoc công nghệ đề tài
V
Nghiệm thu cơ sở
9/2010 - Báo cáo tổng hợp và các tài
liệu đầy đủ, rõ ràng
- Phương pháp hiện đại, đáng
tin cậy
- Sửa chữa vài lỗi chính tả, rút
ngắn báo cáo tóm tắt, kết luận

rút ngắn
- Đề nghị tiếp tục pha 2



Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)

Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)





TS. Đinh Thương Vân
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

i

MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT v
MỤC LỤC HÌNH ix
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1 4
TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Tình hình nuôi tôm trên thế giới và tại Việt Nam 4
1.2. Một số đặc điểm của virus WSSV và MBV 7
1.2.1. Virus gây hội chứng đốm trắng (White spot syndrome virus-WSSV) 7

1.2.2. Monodon Baculovirus (MBV) 10
1.3. Kháng thể 12
1.3.1. Kháng thể đa dòng 14
1.3.2. Kháng thể đơn dòng và ứng dụng trong chẩn đoán WSSV và MBV 15
1.3.2.1. Kháng thể đơn dòng 15
1.3.2.2. Kháng thể đơn dòng và ứng dụng trong chẩn đoán bệnh ở tôm 18
1.3.2.2.1. Lý thuyết chung về chọn lọc các dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn
dòng 18
1.3.2.2.2. Cộng hợp kháng thể
đơn dòng với chất nhũ vàng (Gold colloid) 20
1.3.3. Tình hình nghiên cứu về kháng thể đơn dòng và chế tạo que thử 21
1.4. Nghiên cứu lựa chọn màng trong chế tạo kit thử nhanh 24
1.4.1. Sơ đồ cấu tạo và bố trí các loại màng trong que thử dạng sắc ký miễn dịch 24
1.4.2. Màng hút mẫu 26
1.4.3. Màng mang kháng thể gắn vàng 27
1.4.4. Màng gắn kháng thể 28
1.4.5. Màng hấp thụ 33
1.4.6. Các loại nguyên liệu khác 35
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36
2.1. Vật liệu nghiên cứu 36
2.2. Hóa chất và thiết bị nghiên cứu 36
2.2.1. Hóa chất 36
2.2.2. Thiết bị 36
2.3. Phương pháp nghiên cứu 37
2.3.1. Gây miễn dịch trên động vật 37
2.3.1.1. Gây miễn dịch cho chuột 37
2.3.1.2. Gây miễn dịch cho thỏ 37
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

ii

2.3.2. Phương pháp lấy tế bào nuôi dưỡng (feeder cell) 38
2.3.3. Phương pháp nuôi cấy tế bào Myeloma 39
2.3.4. Dung hợp tạo tế bào lai (hybridoma) sinh kháng thể 40
2.3.5. Tạo dòng tế bào lai (hybridoma) sinh kháng thể đơn dòng 41
2.3.6. Sản xuất dịch báng chuột chứa kháng thể đơn dòng 42
2.3.7. Phương pháp tinh sạch kháng thể 42
2.3.8. Phương pháp ELISA sàng lọc các dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng có ái
lực và tính đặc hiệu cao 44
2.3.10. Phương pháp western blot 45
2.3.11. Phương pháp tinh chế polyhedrin 46
2.3.12. Phương pháp nghiên cứu chế tạo que thử 49
2.3.12.1. Xử lý màng 51
2.3.12.2 Qui trình định lượ
ng kháng thể lên vạch test và control line 52
2.3.12.3. Qui trình đưa kháng thể cộng hợp vàng lên màng 54
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 56
3.1. Tạo kháng thể đa dòng kháng protein VP28 của vỏ virus đốm trắng 56
3.1.1. Thiết kế vector biểu hiện pET21 – VP28 trong tế bào E.coli 56
3.1.2. Biểu hiện gen vp28 trong tế bào E.coli BL21 DE3 57
3.1.3. Tinh sạch protein VP28 tái tổ hợp bằng cột ái lực Ni
2+
57
3.1.4. Thu nhận kháng thể kháng VP28 58
3.2. Qui trình công nghệ tạo kháng thể đơn dòng kháng protein VP28 61
3.2.1. Gây miễn dịch cho chuột bằng protein VP28 tái tổ hợp gây bệnh đốm trắng
(WSSV) 61
3.2.2. Dung hợp tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên VP28 với tế bào myeloma
để tạo tế bào lai hybridoma sinh kháng thể đơn dòng. 62
3.2.3. Tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 66

3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của dòng tế bào bằng Elisa 68
3.2.5. Nhân nuôi lượng lớn tế bào hybrid kháng VP28 tự nhiên dòng WS-E4C2. 69
3.2.6. Thu nhận kháng thể đơn dòng của dòng WS-E4C2 kháng VP28 70
3.2.7. Tóm tắ
t qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein vỏ VP28 của virus
WSSV gây bệnh đốm trắng trên tôm 71
3.2.8. Tinh sạch kháng thể đơn dòng của dòng WS-E4C2 kháng VP28 72
3.2.9. Xác định một số đặc tính của kháng thể đơn dòng của dòng WS-E4C2 72
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

iii

3.3. Gắn chất nhũ vàng với kháng thể đơn dòng kháng VP28 74
3.4. Tinh chế protein polyhedrin và virion của MBV 75
3.4.1. Xét nghiệm mẫu tôm bị nhiễm MBV 75
3.4.2. Tinh chế protein polyhedrin và virion của MBV 77
3.5. Qui trình công nghệ tạo kháng thể đơn dòng kháng polyhedrin của MBV 80
3.5.1. Gây miễn dịch cho chuột bằng protein polyhedrin tự nhiên tinh sạch từ tôm
bệnh còi (MBV) 80
3.5.2. Kết quả dung hợp tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên polyhedrin với tế
bào myeloma để tạo tế bào lai hybridoma sinh kháng thể đơn dòng 82
3.5.3. Tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn 86
3.5.4. Kiểm tra tính
đặc hiệu của dòng tế bào thu được 88
3.5.5. Thu nhận kháng thể đơn dòng kháng polyhedrin 89
3.5.6. Tóm tắt qui trình sản xuất kháng thể đơn dòng kháng protein polyhedrin của
MBV 90
3.5.7. Tinh sạch kháng thể đơn dòng kháng MBV 91
3.6. Nuôi cấy, duy trì và bảo quản dòng tế bào sinh kháng thể đơn dòng kháng WSSV,
MBV 92

3.6.1. Tỉ lệ sống sau các đợt cấy chuyển 92
3.6.2. Kết quả đánh thức tế bào 93
3.7. Nghiên cứu chế tạo kit thử nhanh chẩn đoán virus WSSV và MBV 95
3.7.1. Chọn màng và nồng độ phù hợp để
gắn sinh phẩm 95
3.7.1.1. Lựa chọn màng hút mẫu 95
3.7.1.2. Lựa chọn và tối ưu hoá hệ đệm 97
3.7.1.3. Xử lý màng hút mẫu 97
3.7.2. Lựa chọn và phương pháp xử lý màng mang kháng thể gắn vàng 98
3.7.2.1. Lựa chọn màng mang kháng thể gắn vàng 98
3.7.2.2. Xử lý màng chứa kháng thể cộng hợp 99
3.7.2.3. Lượng chứa của màng chứa kháng thể cộng hợp 100
3.7.2.4. Tối ưu hoá hệ đệm xử lý màng chứa kháng thể cộng hợp 100
3.7.2.5. Thử nghiệ
m khả năng giải phóng kháng thể khỏi màng 101
3.6.2.6. Thử nghiệm tốc độ dẫn mẫu 102
3.7.3. Ảnh hưởng của các thông số kỹ thuật của màng đến các chỉ tiêu của test 103
3.7.3.1. Khoá các gốc tự do trên màng trải kháng thể 105
3.7.3.2. Kiểm tra lượng mẫu thử trên 1 cm2 màng 106
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

iv

3.7.4. Kết quả lựa chọn các thành phần khác của test 107
3.7.4.1. Tấm đế 107
3.7.4.2. Túi vỏ ngoài của test 107
3.7.4.3. Chất chống ẩm 107
3.7.5. Nghiên cứu lựa chọn nồng độ các sinh phẩm sử dụng trong que thử 108
3.7.5.1. Định dạng phản ứng nhận biết WSSV/MBV trên màng que thử 108
3.7.5.2. Tối ưu nồng độ kháng thể bắt giữ tại test line và control line cho test kiểm

tra nhanh WSSV 110
3.7.5.3. Tối ưu nồng độ kháng thể bắt giữ tại T và C cho test ki
ểm tra nhanh MBV
111
3.7.5.4. Kết quả tối ưu nồng độ kháng thể cộng hợp vàng 112
3.8. Bản hướng dẫn kỹ thuật sử dụng và tiếp cận thị trường với que thử WSSV và MBV
112
3.8.1. Cấu tạo và tính năng của que thử 112
3.8.2. Hướng dẫn sử dụng 113
3.9. Xác định giới hạn phát hiện của test 114
3.9. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu 115
3.10. Thống kê các kết qu
ả đề tài chính đã đạt được so với đăng kí trong hợp đồng
KH&CN với Bộ Khoa học và Công nghệ 117
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 119
4.1. KẾT LUẬN 119
4.2. KIẾN NGHỊ 120
TÀI LIỆU THAM KHẢO 121
PHỤ LỤC 140

Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

v

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

KTĐD Kháng thể đơn dòng (Monoclonal antibody)
BM Tế bào lai (Hydridoma cell)
M Myeloma
KN-KT Kháng nguyên – kháng thể
Fab Phần liên kết kháng nguyên
Fc Phần dễ kết tinh phản ứng
H Hypoxanthin
T Thymidin
KT đa dòng Polyclonal antibody
WSSV White spot syndrome virus
TVS Taura sydrome virus
MBV Monodon Baculo virus
YHV Yellow heard virus
IHHNV Infectous hypodemal and hemato poeitic necrosis
IgG Immunoglobulin G
DMSO Dimethyl sulfoxide
T Test
C Control
IPTG Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
HAT Hyposanthine amino protein thymidine
HT Hyprsanthine Thymidine
RPMI RPMI medium

FBS Fetal Bovine serum
PSF Penicillin Steptomycine Fugizone
HPV human papiloma virus
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

vi

FAO Food and Agriculture Organization
ADN Acid deoxyribonucleic
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

vii

MỤC LỤC BẢNG

Tên bảng Trang
Bảng 1.1. Thông số kỹ thuật của màng do hãng Milipore sản xuất 30

Bảng 1.2. Thông số kỹ thuật của màng do hãng Whatman sản xuất 31
Bảng 1.3. Thông số kỹ thuật của màng Whatman FF 31
Bảng 1.4. Thông số kỹ thuật của màng Prima
TM
32
Bảng 1.5. Thông số kỹ thuật của màng Whatman Immunopore 33
Bảng 2.1. Các thông số và trình tự cặp mồi 47
Bảng 2.2. Thành phần của phản ứng PCR 48
Bảng 3.1. Xác định hàm lượng VP28 tái tổ hợp tinh sạch 58
Bảng 3.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng
kháng VP28 trên 2 dòng tế bào myeloma
65
Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh
kháng thể đơn dòng kháng VP28 tự nhiên
67
Bảng 3.4. Thu dịch báng chuột 70
Bảng 3.5. Kiểm tra hiệu gía kháng thể đơn dòng thu được 72
Bảng 3.6. Định lượng hàm lượng protein polyhedrin có trong mẫu tinh
chế
79
Bảng 3.7. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng
kháng polyhedrin trên 2 dòng tế bào myeloma
84
Bảng 3.8. Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh
kháng thể đơn dòng kháng VP28 tự nhiên
87
Bảng 3.9. Kết quả thu dịch báng của chuột 89
Bảng 3.10. Tỷ lệ tế bào lai sống sau các lần cấy chuyển 92
Bảng 3.11. Khả năng sống sót của tế bào sau khi đánh thức 93
Bảng 3.12. Thông số kỹ thuật của màng hút mẫu có bản chất sợi thủy

tinh
96
Bảng 3.13. Thông số kỹ thuật của màng hút mẫu có bản chất cellulose 96
Bảng 3.14. Thời gian giải phóng kháng thể cộng hợp 101
Bảng 3.15. Kết quả xác định giới hạn phát hiện của test 114
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

viii

Bảng 3.16. Kết quả xác định mức độ dương tính giả và âm tính giả 115
Bảng 3.17. Phản ứng chéo của que thử đối với một số virus khác 116

Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

ix

MỤC LỤC HÌNH
Tên hình Trang
Hinh 1.1. Tôm nhiễm MBV (nhuộm xanh malachit) 11
Hình 1.2. Protein polyhedrin sau tinh chế và chụp ảnh dưới kính hiển

vi điện tử. (theo C.Boosangnongchokying 2006)
12
Hình 1.3. Sơ đồ cấu tạo và bố trí các loại màng 25
Hình 1.4. Sự bố trí các thànhphần trên 1 que thử nhanh 28
Hinh 2.1. Máy trải kháng thể lên màng 54
Hinh 2.2. Đường trải kháng thể trên màng 54
Hình 2.3. Tủ chân không sấy màng 54
Hình 2.4. Màng sau khi trải kháng thể 54
Hình 3.1. Điện di sản phẩm PCR bằng cặp mồi VP28NdeI và
VP28XhoI
56
Hình 3.2. Ảnh điện di trên gel agarose sản phẩm cắt các plasmid bằng
Nde I và Xho I
56
Hình 3.3. Biểu hiện của gen vp28 trong E.coli BL21 DE3 57
Hình 3.4. Protein VP 28 tái tổ hợp tinh sạch trên gel polyacrylamid 58
Hinh 3.5. Kiểm tra tính đặc hiệu kháng nguyênVP28 – kháng thể
kháng VP28
60
Hình 3.6. Hoạt độ kháng thể kháng VP28 của các kháng huyết thanh
thu từ các chuột được gây miễn dịch
62
Hình 3.7. Tế bào Myeloma dòng Sp2/0 (A) và P3X-Ag14 (B) sau 5
ngày nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS
63
Hình 3.8. Tế bào lai giữa tế bào lympho B tách từ lách chuột sau miễn
dịch và tế bào myeloma (A) dòng Sp2/0 (B) dòng P3X sau 7 ngày
nuôi trong môi trường chọn lọc HAT
64
Hình 3.9. Khẳng định khả năng sản sinh kháng thể kháng VP28 của 66

Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

x

30 giếng có giá trị OD cao nhất từ quá trình sàng lọc ban đầu
Hình 3.10. (A) Clone tế bào ở giếng D8C1; (B) Clone tế bào ở giếng
E4C2 sau quá trình tách dòng
68
Hình 3.11. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng do
05 dòng tế bào tạo ra trên các kháng nguyên khác nhau
69
Hình 3.12. Kiểm tra hiệu giá kháng thể đơn dòng ở các độ pha loãng
khác nhau của (A): dịch báng sau li tâm; (B): Dịch kháng thể tinh
sạch
73
Hình 3.13. Đánh giá phản ứng đặc hiệu của kháng thể đơn dòng
kháng VP28 tái tổ hợp với kháng nguyên tự nhiên ở tôm mắc bệnh
đốm trắng
74
Hình 3.14. Kiểm tra kết quả gắn kháng thể đơn dòng với chất nhũ
vàng bằng Dot-blot
75
Hình 3.15. Mẫu tôm nhiễm MBV xuất hiện thể ẩn 76
Hình 3.16. Mẫu tôm nhiễm MBV xuất hiện thể ẩn bằng kỹ thuật
nhuộm mẫu cắt mô tế bào
76
Hình 3.17. Điện di sản phẩm PCR kiểm tra với cặp mồi MBV,
WSSV, YHV, IHHNV, TSV
77
Hình 3.18. Protein thu dược từ fraction urografin 50% 78

Hình 3.19. Kiểm tra virion của MBV trên kính hiển vi điện tử. 78
Hình 3.20. Protein polyhedrin sau tinh chế được kiểm tra trên gel
acrylamid 12%
78
Hình 3.21. Hoạt độ kháng thể kháng polyhedrin của các kháng huyết
thanh thu từ các chuột được gây miễn dịch
81
Hình 3.22. Tế bào Myeloma dòng Sp2/0 (A) và P3X-Ag14 (B) sau 5
ngày nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 bổ sung 10% FBS
82
Hình 3.23. Tế bào lai giữa tế bào lympho B tách từ lách chuột sau 84
Báo cáo Tổng kết đề tài KC06-16/06-10

xi

miễn dịch và tế bào myeloma (A) dòng Sp2/0 (B) dòng P3X sau 7
ngày nuôi trong môi trường chọn lọc HAT
Hình 3.24. Kiểm tra giếng có tế bào lai cao nhất 85
Hình 3.25. (A) Clone tế bào ở giếng D8C1; (B) Clone tế bào ở giếng
E4C2 sau quá trình tách dòng
87
Hình 3.26. Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của kháng thể đơn dòng do
05 dòng tế bào tạo ra trên các kháng nguyên khác nhau
88
Hình 3.27. Hàm lượng kháng thể tinh sạch từ dịch báng đo Pierce
®

BCA Protein Assay kit và dựng đường chuẩn cũng như phương trình
tính hàm lượng mẫu kiểm tra
91

Hình 3.28. Tế bào WSSV (A) Tế bào lai WSSV khi mới đánh thức;
(B) Tế bào lai WSSV sau 3 ngày nuôi cấy
94
Hình 3.29. Khả năng sinh kháng thể đơn dòng kháng VP28 và
polyhedrin của 2 dòng tế bào lai WSSV và MBV sau khi cất trong
nito lỏng 3 tháng và 6 tháng
95
Hình 3.30. Màng của Ahlstrom 95
Hình 3.31. Màng của hãng Satorius 95
Hình 3.32. Tủ sấy chân không 98
Hình 3.33. Màng chứa kháng thể cộng hơp dạng cuộn trước và sau khi
rải kháng thể
98
Hình 3.34. Một số mẫu màng chứa kháng thể cộng hợp 98
Hình 3.35. Kết quả thí nghiệm lựa chọn hệ đệm 100
Hình 3.36. Thử nghiệm thời gian hút mẫu lên màng 102
Hình 3.37. Kết quả thử nghiệm tốc độ dẫn mẫu lên 103
Hình 3.38. Ảnh hưởng của đệm trong quá trình xử lý màng 106
Hình 3.39. Sơ đồ bố trí kháng thể trên que thử 109
Hình 3.40. Sơ đồ hoạt động và hiển thị kết quả trên que thử 110