Nghiên cứu phát triển công nghệ vector adenovirus để sản xuất vắc xin cho động vật trên mô hình gen kháng VP2 (virus protein 2) phòng bệnh gumboro

1

B KHOA HC VÀ CÔNG NGH
CHƯƠNG TRÌNH KH&CN TRỌNG ĐIỂM CẤP NHÀ NƯỚC
KC04/06-10




BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI

NGHIÊN CỨU PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ VECTOR
ADENOVIRUS ĐỂ SẢN XUẤT VẮC-XIN CHO ĐỘNG VẬT
TRÊN MÔ HÌNH GEN KHÁNG NGUYÊN VP2
(VIRUS PROTEIN 2) PHÒNG BỆNH GUMBORO
MÃ SỐ: KC04.24/06-10



Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Công nghệ sinh học
Chủ nhiệm đề tài: PGS.TS. Lê Thanh Hòa



8571

Hà Nội - 2010

ii
MỤC LỤC



Tr

MỤC LỤC
i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA

v

DANH MỤC CÁC HÌNH CÓ TRONG BÁO CÁO
vii

DANH MỤC CÁC BẢNG CÓ TRONG BÁO CÁO
x




Phần thứ nhất


ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TÓM TẮT QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN
1

Phần thứ hai


TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI
TỔ HỢPVÀ SỰ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI

7
2.1.
Đánh giá về công nghệ adenovirus tái tổ hợp
7

2.1.1. Adenovirus và nghiên cu phát trin làm vector tái t hp hin
nay

7
2.1.2. Tình hình nghiên cu công ngh adenovirus tái t hp hin nay 13

2.1.3. ánh giá công ngh thit k adenovirus làm khung vector cho
phát trin vacxin tái t hp
15
2.2.
Nguyên liệu cơ bản cho công nghệ thiết kế để tạo adenovirus tái
tổ hợp làm vacxin

17
2.2.1. Plasmid cha DNA h gen ca adenovirus vector 17
2.2.2. Plasmid con thoi (shuttle plasmid) hay plasmid trung gian 18
2.2.3. H thng t bào vi khun E. coli  ng nhim 19
2.2.4. H thng t bào ng vt tr giúp kin to adenovirus tái t hp 20
2.3.
Mô tả công nghệ adenovirus tái tổ hợp mà đề tài nghiên cứu
21
2.3.1. t vn  21
2.3.2. i vi h thng Had5 22
2.3.3. i vi h thng Fad9 25
2.4.
Tình hình nghiên cứu vacxin phòng bệnh Gumboro và ý nghĩa
của phát triển vacxin thế hệ mới trên nền adenovirus làm vector

25
2.4.1. Gii thiu virus gây bnh Gumboro 25
2.4.2. Vacxin truyn thng phòng bnh Gumboro 28
2.4.3. Vacxin th h mi phòng bnh Gumboro 30

2.4.4. Gen kháng nguyên VP2 ng dng trong chin lc to vacxin
th h mi phòng bnh Gumboro
30

2.4.5. Ý ngha ca phát trin vacxin Gumboro th h mi trên nn
adenovirus làm vector
32

Phần thứ ba


NGUYÊN LIỆU VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP ỨNG DỤNG
THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
34
3.1. NGUYÊN LIU 34
3.1.1. Nguyên liu gen VP2 34
3.1.2. H thng plasmid adenovirus FAd9 và plasmid trung gian 34
3.1.3. H thng plasmid adenovirus HAd5 và plasmid con thoi 36

3.1.4. H thng t bào vi khun E. coli BJ5183 c bit  gây ng
nhim
40

iii
3.1.5. H thng t bào vi khun E. coli thông dng khác  tách dòng 40
3.1.6. Các loi hóa cht, sinh phm, trang thit b và ph tr khác 40

3.1.7. Ging virus tái t hp nguyên gc FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-
R

41
3.1.8. Virus vacxin sn xut trên môi trng t bào gan phôi gà 42

3.1.9. Các loi hóa cht, sinh phm, dng c nuôi cy t bào thông
dng
42
3.2. PHNG PHÁP NGHIÊN CU 43
3.2.1. Phng pháp tip truyn virus Gumboro 43

3.2.2. Phng pháp tách chit và tinh sch RNA h gen ca virus
Gumboro
43

3.2.3. Phng pháp RT-PCR và tách dòng  lu gen kháng nguyên
VP2 ca Gumboro
43

3.2.4. Phng pháp gii trình t xác nh chui gen hoc kim tra kt
qu
44

3.2.5. Phng pháp thit k mi chuyên bit c hiu VP2  thu
nhn “hộp gen kháng nguyên VP2“
45

3.2.6. Phng pháp tách dòng trong E. coli và tách chit DNA
plasmid tái t hp
46

3.2.7. Phng pháp thit k và gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào

plasmid con thoi
46

3.2.8. Phng pháp lu gi DNA plasmid ca h thng HAd5 trong
E. Coli
47
3.2.9. Phng pháp gây ng nhim tái t hp trong vi khun BJ5183 48

3.2.10. Phng pháp chun b DNA ca plasmid adenovirus tái t hp
 lây nhim
48

3.2.11. Phng pháp lây nhim (transfection)  to adenovirus tái t
hp trong t bào c thù
49

3.2.12. Phng pháp kim tra hot lc và chn lc adenovirus tái t
hp
50
3.2.13. Phng pháp nuôi cy t bào gan phôi gà mt lp 54

3.2.14. Phng pháp kim tra sinh hc phân t vi ging và vacxin
FAd9-VP2 (L/R) bng phn ng PCR
56

3.2.15. Phng pháp kim tra an toàn, vô trùng, vi ging và vacxin
FAd9-VP2 (L/R) và phân b virus  các c quan
57

3.2.16. Phng pháp kim nghim min dch vi kháng th Gumboro

bng phn ng trung hòa trên t bào gan phôi gà
58
3.2.17. Phng pháp kim tra min dch ca vacxin bng ELISA 60

Phần thứ tư


KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI
TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG FAD9 GIA CÂM
63
4.1.
TÓM LC KT QU NGHIÊN CU CÔNG NGH
ADENOVIRUS FAD9 GIA CM
63
4.2. KT QU THU NHN VÀ CHUN B NGUN GEN VP2 65

4.2.1. Kt qu tip truyn ging virus Gumboro  cung cp ngun
gen VP2
65
4.2.2. Kt qu phân lp và tách dòng lu gi gen VP2 66

iv
4.3.
THIT K VÀ GÀI “HP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2” (CMV-
KOZAK-VP2-PolyA) VÀO PLASMID TRUNG GIAN pL2.4
68

4.3.1. Thit k và thu nhn “hp gen kháng nguyên VP2“ (CMV-
KOZAK-VP2-PolyA)
68

4.3.2. Gài “hp gen kháng nguyên VP2“ (CMV-KOZAK-VP2-
PolyA) vào plasmid trung gian pL2.4
70
4.3.3. Chuyn np và chn lc plasmid trung gian pL2.4-VP2 73
4.4.
KT QU TO PLASMID ADENOVIRUS TÁI T HP MANG
GEN VP2 (pPacFAdV9-VP2)
74
4.4.1. Thit k plasmid vector FAd9 làm khung 74

4.4.2. Thu nhn lu gi DNA ca plasmid FAd9 (pFTR2-EGFP) và
kim tra cht lng
75
4.4.3. Gây ng nhim to adenovirus FAd9 tái t hp mang gen VP2 77
4.5. KIM TRA KIM NGHIM GING VIRUS FAD9-VP2-L/R 78
4.5.1. Yêu cu kim tra kim nghim 78
4.5.2. ánh giá hot lc ca virus thông qua hy hoi t bào 79

4.5.3. Kt qu xác nh PFU ca ging FAd9-VP2 (FAd9-VP2-L và
FAd9-VP2-R)
80

4.5.4. Kim nghim min dch vi kháng th Gumboro bng phn
ng trung hòa
82

4.5.5. Kt qu kim tra ging FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R bng
sinh hc phân t
86

4.5.6. Kt qu kim tra bng phn ng HA phát hin virus Newcastle 87
4.6.
NGHIÊN CU CÔNG NGH T BÀO GAN PHÔI GÀ SN
XUT VÀ KIM TRA GING VÀ VACXIN FAd9-VP2-L VÀ
FAd9-VP2-R
88

4.6.1. Kt qu thc hin công ngh t bào  sn xut virus làm
vacxin
88

4.6.2. Kt qu kim tra kh nng nuôi cy virus ging FAd9-VP2 trên
t bào gan phôi gà
90

4.6.3. Kt qu sn xut ~5.000 liu adenovirus tái t hp trên t bào
gan phôi gà
93

4.6.4. Kt qu kim tra an toàn vô trùng, hiu lc và phân b virus
trong các c quan  gà c a vacxin
98
4.7.
KIM TRA MIN DCH CA VACXIN FAD9-VP2-L VÀ FAD9-
VP2-R BNG ELISA
102
4.7.1. B trí thí nghim 102

4.7.2. Kt qu th nghim adenovirus vacxin vào c th gà bng
ng tiêu hóa (ung), hô hp (nh mi) và tiêm (di da)

104

4.7.3. Tng hp ánh giá kt qu kim tra ELISA ca hai loi vacxin
FAd9-VP2-R (vacxin R) và FAd9-VP2-L (vacxin L) th nghim
109

Phần thứ năm


KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI
TỔ HỢP ĐỐI VỚI HỆ THỐNG HAD5 NGƯỜI
111
5.1.
B TRÍ CÁC NI DUNG THC HIN NGHIÊN CU VI H
THNG ADENOVIRUS HAD5 NGI
111
5.2. KT QU SN XUT LU GI DNA PLASMID CHA H 113

v
GEN ADENOVIRUS (HAD5) VÀ PLASMID CON THOI
5.3
THIT K VÀ GÀI “HP GEN KHÁNG NGUYÊN VP2”
(KOZAK-VP2) VÀO PLASMID CON THOI PSHUTTLE-CMV
115
5.3.1. Thiêt k và thu nhn “hộp gen VP2“ (KOZAK-VP2) 115
5.3.2. Gài „hp gen kháng nguyên VP2“ vào plasmid pShuttle-CMV 119
5.3.3. Kim tra DNA plasmid tái t hp pShuttle-CMV-VP2 121
5.4
KT QU TO PLASMID ADENOVIRUS TÁI T HP MANG
GEN VP2 (pAd-Shuttle-VP2)

124
5.4.1. t vn  v công on gây ng nhim 124
5.4.2. Kt qu thc hin “ng nhim trc tip“ trong E. coli BJ5183 127

5.4.3. Kt qu xây dng phng pháp “ng nhim k tip” vào t
bào BJ5183 ã cha sn pAdEasy1
130

5.4.4. Kt qu thc hin “ng nhim k tip“ DNA pShuttle-CMV-
VP2 vào t bào kh bin BJ5183 mang sn vector pAdEasy1
133

5.4.5. Kim tra plasmid ng nhim tái t hp pAd-Shuttle-VP2 bng
các phng pháp ct enzyme gii hn (EcoRI; PmeI và EcoRI; PacI)
138

5.4.6. Kt qu kim tra pAd-Shuttle-VP2 bng phng pháp sinh hc
phân t và gii trình t
142
5.4.7. Kt lun chung v kt qu to plasmid adenovirus HAd5-VP2 145

Phần thứ sáu


KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
146

Kết luận
146

Đánh giá chung về đề tài
147

Đề nghị
148

TÀI LIỆU THAM KHẢO
150


vi

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT VÀ GIẢI NGHĨA

Ký hiệu Tiếng Anh
Thuật từ/Cách dùng hoặc nghĩa
tiếng Việt

AGP Agar Gel Precipitation Phn ng kt ta khuch tán trong thch
ATCC American Type Culture Collection T chc t bào quc t (tm dch s
dng)
bp base pair Cp baz
CAR coxsackie/adenovirus receptor Th th ca adenovirus cùng vi
coxsackie virus
CED Chicken embryo dermal cells T bào biu bì phôi gà
CEF Chicken Embryo Fibroblast Cells T bào x phôi gà
CEK Chicken Embryo Kidney Cells T bào thn phôi gà
CEL Chicken Embryo Liver Cells T bào gan phôi gà
cDNA complementary DNA DNA b sung
CMV Cytomegalovirus Virus cytomegalo

CPE Cytopathic Effect Bnh tích t bào
Da/kDa Dalton /Kilodalton n v
tính trng lng phân t protein
DMEM Dulbecco's Modified Eagle's
Medium
Môi trng nuôi cy t bào
DNA Deoxyribonucleic acid Axit Deoxyribonucleic
EGFP Enhanced Green Fluorescent Protein Protein phát hunh quang xanh lá cây
ELISA Enzym Linked Immunosorbent
Assay
Phn ng hp ph min dch liên kt vi
enzyme
FAd9 Fowl adenovirus type 9 Adenovirus type 9 loài chim
FBS fetal bovine serum Huyt thanh bê
HAd5 Human adenovirus type 5 Adenovirus type 5 ngi
HEK293 Human embryonic kidney cell T bào thn bào thai ngi
IBD Infectious Bursal Disease Bnh viêm túi Fabricius truyn nhim
IBDV Infectious Bursal Disease Virus Virus gây viêm túi Fabricius truyn
nhim
kb Kilobase 1000 cp baz (1 kb = 1000 bp)
LB Luria-Bertani medium Môi trng LB
L-ITR Light inverted tandem repeat Cu trúc lp ngn phía bên trái
LMH Leghorn male hepatoma
(avian hepatocellular carcinoma cell
line)
Dòng t bào u gan gà phát trin t gan gà
trng Lgo (Kawaguchi et al., 1987)
MTA Material Transfer Agreement Th
a thun chuyn giao vt t sinh hc

OIE Office International des
Epizooties (since 25 Jan, 1924);
World Organisation for Animal
Health (from May, 2003)
T chc Thú y quc t (hình thành
25/01/1924) ; t ngày nay vn gi tên
lch s ó.
ORF Open Reading Frame Khung c m
PCR Polymerase chain reaction Phn ng nhân gen/DNA
PFU plaque forming unit n v khun lc hình thành do áp dng

vii
phng pháp ‘úp mặt thạch”
R-ITR Right inverted tandem repeat Cu trúc lp ngn phía bên phi
RNA Ribonucleic Acid Axit ribonucleic
RT-PCR Reverse transcription-PCR Phn ng PCR ngc
SPF Special Pathogen Free Siêu sch mm bnh
TCID50
tissue culture infectious dose
Liu gây nhim 50% t bào
TR2 Tandem repeats Cu trúc lp s 2 ( h gen FAd9)
VN Virus Neutralization Phn ng trung hòa virus
VP Viral protein Protein virus
vvIBDV Very virulent Infectious Bursal
Disease Virus
Virus gây viêm túi Fabricius truyn
nhim th c lc cao

VP Viral protein Protein ca virus



viii
DANH MỤC CÁC HÌNH CÓ TRONG BÁO CÁO

Hình Nội dung

Tr
Hình 1.1. S  tóm tt các giai on chính thc hin  tài nghiên cu công
ngh adenovirus vector tái t hp mô hình gen kháng nguyên VP2
trên h thng adenovirus FAd9 gia cm và trên h thng adenovirus
HAd5 ngi


4
Hình 2.1.
Hình thái và cu to ca adenovirus. A. nh kính hin vi in t mô
t các ht adenovirus có dng hình khi sp xp vi nhau to thành
tp hp. B. Mô hình cu trúc không gian ca h
t virion adenovirus


10
Hình 2.2.
Mô hình cu to ht virion adenovirus (ct phng) vi DNA h gen và
13 loi protein c bit hin nay

10

Hình 2.3.
Xâm nhim ca adenovirus vào t bào thông qua th th CAR và α-
integrin (mi tên ch dn), dn vào endosome và chuyn vn n nhân
 thc hin chu trình tái to virus


11
Hình 2.4.
Công ngh to vector adenovirus tái t hp cha gen kháng nguyên
VP2, s dng h thng AdEasy™ Adenoviral Vector System
(Stratagene Inc.)

23
Hình 2.5.
S  minh ha các phân on A và B ca h gen virus Gumboro 26
Hình 3.1.
H thng gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid
pPacFAdV-9, nhim t bào Hepatoma (CH-SAH)  to nên virus
FAdV-9 (virus t nhiên, hoang dã, wildtype)


35
Hình 3.2
H thng gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid
pPacFAdV-9, cài “hộp gen EGFP” vào v trí TR2  to thành
plasmid pFTR2-EGFP làm “vector m” (open vector). Kim tra
bng cách lây nhim vào t bào Hepatoma  to virus FAdV-9 ch
th hunh quang, rt d phát hin

36
Hình 3.3.
S  cu trúc ca plasmid khung pAdEasy-1 mua ca hãng
Stratagene (Stratagene Inc.)
37
Hình 3.4.
S  cu trúc ca plasmid con thoi pShuttle-CMV và vùng a ni
MCS tip nhn DNA ngoi lai (Stratagene)
38
Hình 3.5.
T bào HEK293. (A): Nuôi cy thành mt lp sau 72 h (t >90% ph
áy); (B): nhum hunh quang (Ngun: />); (C): Nuôi
cy mc thành mt lp sau 48 h, do chúng tôi ( tài KC04.24/06-10),
thc hin


39
Hình 4.1.
S  minh ha 8 giai on thc hin  tài (I - VIII), ca ni dung
nghiên cu công ngh adenovirus FAd9 gia cm

64
Hình 4.2
Bnh tích in hình ca túi Fabricius (sng to) và c (xut huyt)  gà
tip truyn

66
Hình 4.3.
Kt qu in di sn phm RT-PCR nhân gen kháng nguyên VP2 ca

mt ch
ng i din (A) và kim tra kt qu ct DNA plasmid tái t
hp bng enzyme EcoRI (B)


67
Hình 4.4.
Trình bày chui nucleotide và amino acid suy din ca gen VP2 thu
nhn t chng GKN-T1ST

67
Hình 4.5.
S  minh ha quá trình lp ghép gen VP2 và các thành phn ph tr
khác (hp gen CMV-Kozak-VP2-PolyA) vào plasmid trung gian
pL2.4 ca h thng FAd9 adenovirus gia cm


71
Hình 4.6.
S  b trí v trí cài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào vùng cu trúc
lp TR2, mà trc ó TR2 ã c thit k thay th bng EGFP
(Enhanced Green Fluorecence Protein) bt màu hunh quang


72
Hình 4.7.
Kt qu sàng lc các DNA VP2 cài vào plasmid pL2.4 (A) và kim

ix
tra các clone tái t hp bng phn ng PCR vi cp mi CMV-up

Primer và PolyA-dn Primer (B)

73
Hình 4.8.
H gen ca FAdV-9 (FAd9) c thit k to thành plasmid
pPacFAdV-9, cài “hộp gen VP2” vào v trí TR2 to thành plasmid
pFTR2-VP2 (quay trái) hoc pFTR2-VP2inv (quay phi), lây
nhim t bào Hepatoma to giống nguyên gốc FAd9-VP2-L và FAd9-
VP2-R (thc hin ti Canada); chuyn giao ging nguyên gc cho
Vin Công ngh sinh hc, lây nhim t bào gan phôi gà (CEL) tip
truyn giống g
ốc và tạo giống cấp 1  sn xut vacxin FAd9-VP2-L
và FAd9-VP2-R (thc hin ti Vit Nam)






76
Hình 4.9.
T bào mt lp (monolayer): A. Không gây nhim (i chng); B.
Gây nhim virus FAd9-VP2 (nng  10
-3
) có CPE sau 72 gi

79
Hình 4.10
T bào Hepatoma nhim  nng  virus gây nhim là 10
-6

ca FAd9-
VP2-L có s lng plaque nhiu (xem ti, không nhum bng 
trung tính)

80
Hình 4.11.
S  b trí thí nghim trung hòa  các chai t bào nuôi cy gan phôi
gà mt lp

83
Hình 4.12.
Hình nh t bào gan phôi gà mt lp quan sát  thí nghim trung hòa
virus FAd9-VP2-L vi kháng th kháng VP2 ca virus Gumboro

84
Hình
4.13:
Kt qu in di gen VP2 s dng cp mi E1F-E1R (~ 1,35kb) 86
Hình
4.14:
Kt qu ki
m tra hiu giá HA 88
Hình 4.15
ánh giá kt qu nuôi cy t bào gan phôi gà sau 24 h và 48 h; t bào
mc thành mt lp u mn trong môi trng DMEM/FBS

90
Hình 4.16.
ánh giá CPE kt qu nuôi cy ging FAd9-VP2-L (FADVAC-L) và
FAd9-VP2-R (FADVAC-R) trên t bào gan phôi gà sau 72 h  chn

ging

93
Hình 4.17.
ánh giá CPE  xác nh thi im thu hoch virus FAd9-VP2-L
(FADVAC-L) trên t bào gan phôi gà sau 48 h, 72 h, 96 h và 144 h;
có b trí i chng


93
Hình 4.18.
T bào gan phôi gà (CEL) lúc 48 h mt lp (u, mn, trong môi
tr
ng DMEM/FBS)  chun b cy ging virus vacxin FAd9-VP2-
L/R; t bào i chng theo dõi lúc 72h và t bào i chng lúc 144h
 so sánh vi t bào cy ging sn xut vacxin



94
Hình 4.19.
Kim tra thng xuyên hàng ngày các chai t bào gan phôi gà trc
khi cy ging virus và các chai nuôi cy virus và i chng
95
Hình 4.20.
S hy hoi t bào (CPE) ca 3 chai (1, 2, 3) nuôi cy ging virus
vacxin FAd9-VP2-L trên t bào gan phôi gà ti thi im 72h sau gây
nhim,  thu hoch vacxin

96
Hình 4.21.
Kt qu in di kim tra vùng “siêu biến đổi” ca gen VP2 (474 bp)
thu nhn t các mu

101
Hình 4.22.
Kt qu gii trình t kim tra chui gen vùng “siêu biến đổi” (474 bp)
ca gen VP2 thu nhn t mu lách c tách dòng trong plasmid
pCR2.1

101
Hình 5.1.
S  minh ha 4 giai on ã thc hin ca  tài (I - IV), thuc các
ni dung nghiên cu công ngh adenovirus HAd5 ng
i

112
Hình 5.2
Kim tra trên thch agarose 1%, DNA ca plasmid vector con thoi
pShuttle-CMV sau khi ct m vòng bng EcoRI ca các clone 1, 2, 3,
u có kích thc 7,5 kb


115
Hình 5.3.
in di sn phm PCR thu nhn “hộp gen kháng nguyên VP2” ( dài
khong 1,38 kb) bng cp mi GKPKZR-GV2R

117

x
Hình 5.4.
in di kim tra DNA vector tái t hp pShuttle-CMV-VP2 ct bng
EcoRI. C+: DNA ca pShuttle-CMV ( dài 7,5 kb) làm i chng

120
Hình 5.5.
in di kim tra sn phm vector pShuttle-CMV-VP2 ca 3 chng
GKN-T1ST, GKN-G202 và GQG-52-70

122
Hình 5.6. Trình t nucleotide ti u 5’ và 3’ ca chromatogram gii trình t
mt clone i din ca plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2

123
Hình 5.7.
Minh ha quá trình gây ng nhim trong E. coli 5183 gia DNA ca
plasmid con thoi pShuttle-CMV-VP2 (ct bng PmeI) (1) vi DNA
c
a plasmid adenovirus vector pAdEasy-1 (2),  to nên plasmid
adenovirus tái t hp pAd-Shuttle-VP2 (3), cha các thành phn:
vùng mm ori ca plasmid con thoi và gen kháng kháng sinh
kanamycin (mi tên); hp gen kháng nguyên VP2; và khung
adenovirus HAd5. Vùng mm ori và gen kháng kháng sinh ampicillin
ca plasmid pAdEasy-1 b loi b trong quá trình ng nhim

126
Hình 5.8.
Kim tra on DNA ca pShuttle-CMV-VP2 sau khi ct m vòng
bng enzyme PmeI

128
Hình 5.9.
in di kim tra kh nng hiu qu ng nhim to vector adenovirus
tái t hp

130
Hình 5.10.
in di kim tra sn phm DNA ca các clone BJ5183 chuyn np
DNA plasmid pAdEasy-1

132
Hình 5.11.
in di kim tra DNA tách t t bào kh bin BJ5183 mang vector
pAdEasy1 sau khi gây ”ng nhim k tip” vi DNA pShuttle-
CMV-VP2 và xác nh clone dng tính


136
Hình 5.12.
in di kim tra chuyn np chn lc các khun lc cha plasmid tái
t hp pAd-Shuttle-VP2 sàng lc phân lp vi các khun lc khác

137
Hình 5.13.
K
t qu in di kim tra DNA plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2 ct
bng enzyme EcoRI

139
Hình 5.14.
Kt qu in di kim tra DNA plasmid tái t hp pAd-Shuttle-VP2
(clone 1/1; 4/2 và 5/1) ct bng hai enzyme EcoRI và PmeI

140
Hình 5.15.
in di kim tra kt qu DNA ca pAd-Shuttle-VP2(1/1) và pAd-
Shuttle-VP2(5/1) ct bng PacI

141
Hình 5.16.
Kt qu in di sn phm PCR thc hin  kim tra adenovirus tái t
h
p pAd-Shuttle-VP2(1/1); pAd-Shuttle-VP2(4/2) và pAd-Shuttle-
VP2(5/1), vi các cp mi c hiu SHUTF-ADER (~2,6 kb) và
GKPKZF-GV2R (~1,35 kb)



143
Hình 5.17.
Kt qu gii trình t kim tra sn phm PCR thu nhn vùng giao nhau
gia pShuttle-CMV và pAdEasy1 ca pAd-Shuttle-VP2(1/1) cha

hp gen VP2

144



xi
DANH MỤC CÁC BẢNG CÓ TRONG BÁO CÁO

Bảng Nội dung

Tr
Bảng 2.1. V trí cu trúc và chc nng hot ng ca 13 loi protein kin
to adenovirus ngi

9
Bảng 4.1.
Theo dõi PFU hình thành sau khi gây nhim virus và ph thch 81
Bảng 4.2.
B trí các ging kim tra bng phn ng ngng kt hng cu
(HA)

87
Bảng 4.3.
Nng  ging c pha và b trí cy ging vào t bào gan phôi
gà

91
Bảng 4.4.

Kt qu kim tra vô trùng vi khun và nm 99
Bảng 4.5.
Kt qu kim tra an toàn (100 liu) vi 2 loi vacxin, 3 ng
a vacxin, theo dõi 10 ngày

100
Bảng 4.6.
S liu chi tit ELISA kt qu kim tra ánh giá áp ng min
dch ca gà i vi vacxin FAd9-VP2-R (gi tt là vacxin R) vi
các ng s dng khác nhau


105
Bảng 4.7.
S liu chi tit ELISA kt qu
kim tra ánh giá áp ng min
dch ca gà i vi vacxin FAd9-VP2-L (gi tt là vacxin L) vi
các ng s dng khác nhau


107
Bảng 4.8.
Kt qu ELISA kim tra các mu huyt thanh ca các lô i
chng i vi thí nghim

109
Bảng 4.9.
Tng hp kt qu kim tra ánh giá áp ng min dch ca gà
ca các loi vacxin FAd9-VP2-R (gi t
t là R) và FAd9-VP2-L

(gi tt là L) vi các ng dùng khác nhau bng phn ng huyt
thanh hc ELISA



10
Bảng 5.1.
Thành phn và s lng c cung cp trong b kit AdEasy™
Adenoviral Vector System

113



2
Phần thứ nhất
ĐẶT VẤN ĐỀ VÀ TÓM TẮT QUÁ TRÌNH THỰC HIỆN

Nhng tin b v công ngh DNA tái t hp, v genomics, v virus hc và
min dch hc phân t ã m hng ng dng cho quá trình thit k và phát
trin các loi vacxin th h mi. Nhu cu vacxin và ch phm chn oán th h
mi là rt ln trong vic ng d
ng phòng chng bnh truyn nhim. Trong s
vacxin thit k da trên h thng vector virus tái t hp (recombinant virus-
based vectoral vaccine), h thng adenovirus là loi hình công ngh có hiu qu
ni bt, óng vai trò quan trng trong phát trin vacxin th h mi hin nay.
 tài KC04.24/06-10: “Nghiên cứu phát triển công nghệ vector
adenovirus để sản xuất vắc-xin cho động vật trên mô hình gen kháng nguyên
VP2 (virus protein 2) phòng bệnh Gumboro”, ã c B Khoa hc và Công
ngh phê duyt, cho thc hi

n trong giai on 2009 - 2010, vi mt s ch ích
nh sau:
Mục tiêu tổng thể của đề tài: Nghiên cu ng dng công ngh vector
adenovirus tái t hp ln u tiên c thc hin ti Vit Nam, vi mc ích
nhm thit k c h thng adenovirus  làm vacxin cho ng vt, trc ht
là xây dng mô hình gen kháng nguyên VP2 ca virus Gumboro  gia cm, t
ó, có 
c s tip cn công ngh mi cho nghiên cu sn xut vacxin th h
mi và các ch phm hot tính sinh hc th h mi sau này.
Mục tiêu cụ thể của đề tài:
- Có c qui trình công ngh và h thng adenovirus làm vector vacxin.
- Có c ging vacxin sn xut bng công ngh vector adenovirus,  có th
s dng qua ng tiêu hoá (ung/n), hô hp (khí dung), ng tiêm cho gia
cm và có giá tr kinh t
.
- Sn xut th nghim c vacxin phòng chng bnh Gumboro bng công
ngh vector adenovirus làm c s (tin ) cho nhng vacxin virus khác ca gia
súc, gia cm và thu sn, theo công ngh này.

2
Mục tiêu dài hạn sau khi thực hiện xong đề tài:
Trên c s thc hin thành công  tài KC04.24/06-10 vi mô hình gen
kháng nguyên VP2 ca virus Gumboro  gia cm, công ngh vector adenovirus
s c trin khai và a ra c mt loi hình công ngh mi làm c s (làm
tin ) cho nhng vacxin virus khác ca gia súc, gia cm và thu sn, ng dng
thích hp cho mi loi bnh truyn nhim cn phòng chng.
* * *
Có nhiu lo
i adenovirus ngi và ng vt ã c thit k làm h
thng vector dn truyn gen kháng nguyên, trong ó  tài KC04.24/06-10 ã

la chn và thc hin cùng lúc trên hai h thng sau ây:
i) Thc hin trên hệ thống adenovirus type 9 ca gia cm (FAdV9 hay
FAd9, Fowl adenovirus type 9), trên c s hp tác cht ch vi Trng i hc
Guelph, Canada,  nghiên cu thit k và ã to ra c ging vacxin
adenovirus gia cm tái t h
p FAd9-VP2 mang gen VP2 (t virus Gumboro
Vit Nam)  sn xut vacxin;
ii) Thc hin trên hệ thống adenovirus type 5 của người (HAd5, human
adenovirus type 5), mà h thng này ã c thng mi hóa, do ó, chúng tôi
ã mua ca hãng Stratagene ( />resources/7-commercial products/14-stratagene.html),  thc hin thao tác và
to sn phm tái t hp.
S d cùng lúc thc hin trên c hai h thng nh vy, là vì:
i) Thực hiện trên hệ thống FAd9 gia cầm, s cho kt qu là to c
ging vacxin adenovirus tái t hp FAd9-VP2 ca gia cm, ó là loi virus
sng nhc c làm vacxin, có kh nng nhân lên c trong gà khi a vacxin
này vào, cung cp ngun protein VP2 kháng nguyên tng hp do
FAd9-VP2
nhân lên được trong c th gà. Loi vacxin này thuc dng vacxin sống nhược
độc có nguồn kháng nguyên nhân lên khi s dng (ây là chủ định chính ca
 tài ã ng ký,  t c sn phm cui cùng là sn xut và s dng
vacxin phòng bnh Gumboro cho gà và xây dng qui trình công ngh thit k

3
adenovirus vector tái t hp);
ii) Thực hiện trên hệ thống HAd5, s cho kt qu là to c ging
adenovirus tái t hp HAd5-VP2 làm vacxin cho gia cm, ó cng là virus sng
nhc c làm vacxin cho gà, nhng s không nhân lên được trong c th gà,
mà ch cung cp ngun protein VP2 kháng nguyên c nh có sn ti mi liu
vacxin a vào. Loi vacxin này (nu s dng) thuc dng vacxin sống nhược
độc có ngu

ồn kháng nguyên không nhân lên (chủ định phụ ca  tài, làm mô
hình   tài nghiên cu các thao tác adenovirus vector tái t hp và to
vacxin, nu cn).
V nguyên liệu thiết kế,  có mt h thng adenovirus cho s dng, cn
có 5 loi nguyên liu chính: i) Plasmid vector adenovirus cha DNA h gen ã
c thit k an toàn, úng ch nh s dng; ii) Plasmid vector con thoi (hay
còn gi là plasmid trung gian)  tip nhn “hộp gen kháng nguyên
” ích, sau
ó, s dng  gây ng nhim vi DNA plasmid vector, to nên mt loi
plasmid tái t hp mang “hộp gen kháng nguyên” ích, chun b cho s kin to
adenovirus tái t hp trong (các) t bào chuyên bit; iii) “Hộp gen kháng
nguyên” ích là on DNA thu nhn có cha toàn b gen kháng nguyên và các
thành phn iu hòa ph tr  hai u ca hp gen (do chúng ta ch ng thit
k); iv)
Hệ thống tế bào vi khuẩn  thc hin ng nhim (c s dng tt
nht hin nay là t bào E. coli dòng BJ5183), hòa nhp DNA plasmid con thoi
tái t hp (on cha cha hp gen kháng nguyên) vi DNA plasmid
adenovirus vector to plasmid adenovirus tái t hp mang gen kháng nguyên
ích; v) Hệ thống tế bào động vật chuyên biệt, là (các) dòng t bào ng vt
c thù khác nhau c s dng  thc hin lây nhi
m (transfection),  trong
t bào ó, các ht adenovirus tái t hp mang hp gen ích s c kin to, 
chn lc làm ging.

V các giai đoạn chính thực hiện vic kin to adenovirus tái t hp mang
gen ích kháng nguyên VP2 (ca virus Gumboro) trên c hai h thng là FAd9
và HAd5  s dng làm vacxin, ã tri qua các giai on sau (Hình 1.1):

4

Hình 1.1. S  tóm tt các giai on chính thc hin  tài nghiên cu công
ngh adenovirus vector tái t hp mô hình gen kháng nguyên VP2 trên h thng
adenovirus FAd9 gia cm và trên h thng adenovirus HAd5 ngi. Ghi chú:
Phn óng khung vch ôi lin là ã thc hin theo ng ký ca  tài; phn
khung vch n ri là cha thc hin vì là công vic ph
cha cn tp trung gii

quyt.
Phân lậpvàlưugiữ gen đích kháng nguyên
VP2 củaGumboroViệtNam
Hệ thống adenovirus
FAd9 gia cầm
Hệ thống adenovirus
HAd5 người
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(CMV-Kozak-VP2-PolyA)
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(Kozak-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid trung gian
(p∆L2.4-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid con thoi
(pShuttle-CMV-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pPacFAdV9-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pAd-Shuttle-VP2)
Tạoadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L/R)
Tạo adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2

(HAd5-VP2)
Sảnxuấtadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L và R)
Sảnxuất adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Công nghệ tế bào CEL
sảnxuấtvàkiểmtra
giống và vacxin
(FAd9-VP2-L và R)
Kiểm tra miễndịch của vacxin
FAd9-VP2-L và R
(Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
Phân lậpvàlưugiữ gen đích kháng nguyên
VP2 củaGumboroViệtNam
Hệ thống adenovirus
FAd9 gia cầm
Hệ thống adenovirus
HAd5 người
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”

(CMV-Kozak-VP2-PolyA)
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(Kozak-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid trung gian
(p∆L2.4-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid con thoi
(pShuttle-CMV-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pPacFAdV9-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pAd-Shuttle-VP2)
Tạoadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L/R)
Tạo adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Sảnxuấtadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L và R)
Sảnxuất adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Công nghệ tế bào CEL
sảnxuấtvàkiểmtra

giống và vacxin
(FAd9-VP2-L và R)
Kiểm tra miễndịch của vacxin
FAd9-VP2-L và R
(Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)
Phân lậpvàlưugiữ gen đích kháng nguyên
VP2 củaGumboroViệtNam
Hệ thống adenovirus
FAd9 gia cầm
Hệ thống adenovirus
HAd5 người
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(CMV-Kozak-VP2-PolyA)
Thiếtkế
“Hộp gen kháng nguyên VP2”
(Kozak-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid trung gian
(p∆L2.4-VP2)
Cài “Hộp gen kháng nguyên
VP2” vào plasmid con thoi
(pShuttle-CMV-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pPacFAdV9-VP2)
Tạo plasmid adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(pAd-Shuttle-VP2)
Tạoadenovirus

tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L/R)
Tạo adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Sảnxuấtadenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(FAd9-VP2-L và R)
Sảnxuất adenovirus
tái tổ hợpmanggenVP2
(HAd5-VP2)
Công nghệ tế bào CEL
sảnxuấtvàkiểmtra
giống và vacxin
(FAd9-VP2-L và R)
Kiểm tra miễndịch của vacxin
FAd9-VP2-L và R
(Tiêu hóa; Hô hấp; Tiêm)
II
IIII
III
IV
V
VI
VII
VIII

5
i) Phân lập và lưu giữ gen đích kháng nguyên VP2: Cung cp ngun nguyên
liu gen VP2  thit k “hộp gen kháng nguyên VP2” t virus Gumboro ca

Vit Nam.
ii) Thiết kế “hộp gen kháng nguyên VP2” (VP2 antigenic expression
cassette): “Hộp gen kháng nguyên VP2” c hiu là on DNA c thit k
t nguyên liu gen kháng nguyên VP2 ã lu gi, có b sung thêm các thành
phn iu hòa gen (chui Kozak) [43], giúp gen kháng nguyên này biu hin
protein, ng vi mi h
 thng FAd9 hay HAd5.
iii) Gài “hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi: a toàn b
“hộp gen kháng nguyên VP2” vào plasmid con thoi ã c tái thit k,  to
c plasmid con thoi tái t hp mang gen VP2, ng vi mi h thng FAd9
hay HAd5.
iv) Tạo plasmid adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2: ó là vic chuyn
np toàn b “hộp gen kháng nguyên VP2” t plasmid con thoi tái t hp mang
gen VP2 vào plasmid adenovirus tng ng (ng vi mi h thng FAd9 hay
HAd5), thông qua thao tác ng nhim trong E. coli (homologous
recombination in E. coli
),  to nên plasmid adenovirus tái t hp cha hp
gen VP2. Sau ó, chun b lây nhim vào t bào ng vt c thù (i vi h
thng FAd9 gia cm là t bào gan dòng thun Hepatoma ca gà, ví d dòng
CH-SAH hay LMH; và i vi h thng HAd5 ngi là t bào thn bào thai
ngi dòng HEK293).
v) Tạo adenovirus tái tổ hợp mang gen VP2: DNA ca plasmid
adenovirus tái t hp cha hp gen VP2 nht thit phi 
c ct bng enzyme
PacI, ri tip tc thc hin lây nhim (transfection) vào t bào c thù cho mi
h thng (Hepatoma cho h thng FAd9  to adenovirus FAd9-VP2; HEK293
cho h thng HAd5  to adenovirus HAd5-VP2).
vi) Sản xuất adenovirus tái tổ hợp mang hộp gen VP2: Ging virus
FAd9-VP2 gia cm c thc hin trên t bào Hepatoma  gi giống nguyên
gốc, sau ó, có th chuyn sang t bào gan phôi gà s

 cp CEL (chicken embryo

6
liver cell)  tip truyn to giống gốc/giống cấp 1 và sn xut vacxin; Ging
virus HAd5-VP2 c thc hin trên t bào HEK293  to và gi giống
nguyên gốc, nhng cng s dng dòng t bào này  sn xut virus làm vacxin.
vii) Các công nghệ tế bào sản xuất và kiểm tra giống và vacxin:  tài
KC04.24/06-10 ã thc hin công ngh chế tạo tế bào gan phôi gà s
 cp
(CEL)  sn xut và bc u kim tra kim nghim vacxin FAd9-VP2 (tên
gi: FADVAC) ca gia cm.
viii) Kiểm tra kiểm nghiệm vacxin thử nghiệm: Thc hin th nghim
min dch vi vi vacxin FAd9-VP2-L và FAd9-VP2-R a vào gà bng
ng tiêu hóa (ung), hô hp (nh mi) và tiêm (di da).
n khi kt thúc (tháng 12/2010),  tài KC04.24/06-10 ã hoàn thành mt
khi lng công vic (lit kê 
Hình 1.1), nh sau:
i) Đối với hệ thống FAd9 gia cầm: ã hoàn thành y  tt c các giai
on (bao gm i - viii), ã to c giống virus FAd9-VP2, ã xây dng c
các qui trình gm: a) Qui trình công ngh thit k và lp ghép gen kháng
nguyên c trng ca virus gây bnh Gumboro vào h thng vector adenovirus
nhc c (Qui trình thiết kế); b) Qui trình công ngh thu nhn adenovirus
nhc c tái t hp cha kháng nguyên làm công c d
n gen gây min dch
cho gia cm (Qui trình sản xuất); c) Qui trình a adenovirus cha gen kháng
nguyên VP2 vào ng vt thông qua ng tiêu hoá (ung/n), hô hp (khí
dung) và tiêm (Qui trình sử dụng); d) ng thi  tài ã sn xut c trên
5000 liều vacxin, ã kiểm tra kiểm nghiệm miễn dịch; và các sn phm hot
ng khác ca  tài và các ch tiêu liên quan khác (Hình 1.1).
ii) Đối với hệ thống HAd5 người:

ã hoàn thành n giai on (iv) tc là
ã to c plasmid adenovirus tái t hp HAd5-VP2 (i - iv), ã nuôi cy thành
công t bào HEK293 chun b lây nhim; nhng n giai on này thì tm dng
li, cha thc hin tip các giai on (v - viii), vì  dn thi gian tp trung gii
quyt các giai on (i - viii) ca h thng FAd9-VP2 hoàn chnh làm vacxin gia
cm, hn na, i vi HAd5, 
ây là công vic ph không ng ký trong  tài.

8
Phần thứ hai

TỔNG QUAN TÀI LIỆU VỀ CÔNG NGHỆ ADENOVIRUS TÁI TỔ HỢP
VÀ SỰ CẦN THIẾT NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI KC04.24/06-10

2.1. Đánh giá về công nghệ adenovirus tái tổ hợp
2.1.1. Adenovirus và nghiên cứu phát triển làm vector tái tổ hợp hiện nay
Rất nhiều loại vector virus đã được nghiên cứu thiết kế làm vector vacxin
và khám phá khả năng biểu hiện protein kháng nguyên từ nguồn gen của vi sinh
vật độc hại ngoại lai, vacxin do virus làm vector chỉ có ch
ứa duy nhất gen kháng
nguyên của chúng, loại trừ được khả năng có mặt của toàn bộ đối tượng vi sinh
vật gây bệnh. Trong cơ thể (in vivo), vacxin trên nền virus tái tổ hợp đã kích
thích tốt đáp ứng miễn dịch đặc hiệu với các loại kháng nguyên ngoại lai, có
khả năng tận dụng được cả 3 loại hình đáp ứng miễn dịch: miễn dịch dịch thể
(humoral immune response), mi
ễn dịch trung gian tế bào (cell-mediated
immune response) và miễn dịch niêm mạc (mucosal immune response). Phương
thức đưa vacxin là tiện lợi, bằng tất cả mọi đường, trong đó lợi thế lớn nhất là
tính đơn giản và hiệu quả của việc đưa vacxin vào quần thể qua đường tiêu hoá
(ăn/uống) và đường hô hấp (nhỏ mũi, khí dung), hạn chế đường tiêm vì tốn

công sức. Vacxin trên nền virus vector là loại virus sống nhược độ
c, dễ sản
xuất, khả năng sản sinh và giới thiệu kháng nguyên trong cơ thể đối tượng thích
ứng được coi là hoàn thiện. Hệ thống vector để làm vacxin đảm bảo tiêu chí qui
định là có khả năng cho phép sản xuất được một khối lượng lớn sử dụng công
nghệ tế bào, có hiệu giá cao, do vậy giá thành vacxin thấp, có hiệu quả kinh tế
(Bangari, Mittal, 2006)[15].
Adenovirus trong tự nhiên (loại hoang dã, wild type) là loại virus có kích
thước bé, hình thái đơn giản, có cấu trúc hình khố
i đối xứng, đường kính 80 -
110 nm, không có lớp vỏ ngoài cùng (envelop), capsid bao gồm 252 capsomer
phân chia thành 12 penton, 240 hexon và có 6 sợi protein (fiber) còn gọi là

9
angten (một số adenovirus loài chim có 12 angten). Capsid có cấu trúc 1 lớp,
trọng lượng phân tử khoảng 150 - 180 triệu Dalton (Da); cả hexon, penton và
angten đều là kháng nguyên bề mặt nổi, trong đó angten (fiber) mọc ra từ
penton có điểm mút (knob) làm vị trí tiếp xúc với thụ thể tế bào trong quá trình
gây nhiễm (Bunchen-Osmond, 2003; Benko et al., 2005) [17; 19] (Hình 2.1).
Adenovirus động vật bậc cao có hệ gen không phân đoạn, chứa một phân
tử DNA 2 sợi, kích thước 35.800 - 36.200 nucleotide (hệ gen adenovirus của
loài chim khoảng 42.000 - 43.000 nucleotide), mà tại hai đầu cuối của hệ gen
có b
ố trí hai chuỗi lặp ngược ITR (inverted terminal repetitions), mỗi chuỗi có
độ dài 103 bp đối với adenovirus của người, 50 - 200 bp đối với adenovirus
động vật khác, có vai trò quan trọng trong quá trình khép vòng hệ gen DNA
của virus. Hệ gen bao gồm 2 sợi: 1 sợi DNA hướng trái L (left), 1 sợi DNA
hướng phải R (right), chứa các tổ hợp gen sớm (E, early region) đó là các gen
E1A, E1B, E2A-B, E4; và một khung gen chung cho sao chép muộn (L, late
region), mã hoá cho 5 protein hợp nhất (L1 - 5) [3,4,36].

Tổng số, adenovirus có tất cả 13 loại protein, được chia làm 3 nhóm chính:
i) Nhóm protein vỏ capsid (Capsid protein); ii) Nhóm protein nhỏ (Minor
protein); iii) Nhóm protein lõi (Core protein) (Hình 2.2). Trong số 13 protein
của adenovirus, ngoài các protein cấ
u trúc còn có các protein không cấu trúc
mang hoạt tính enzyme là DNA - polymerase, replicase và protease (Bảng 2.1).
Protein cấu trúc chính của adenovirus bao gồm: II (hexon); III (penton nền);
IIIa; IV (fiber); V (protein lõi); VI; VII (protein lõi); VIII và IX. Polypeptide
Hexon (II) là thành phần vỏ virus; Penton nền (III) là protein capsid gốc, với trợ
giúp của protein IIIa làm trụ cho protein fiber (IV) là cần angten cắm vào; đi sâu
vào bên trong virus là các protein đệm bao bọc DNA của hệ gen, gồm protein V
(đệm nhỏ) và protein VII (đệm lớn). Ngoài ra, còn có 3 loại protein chèn màng
được liên kết chặt chẽ với hexon là protein VI, VIII và IX; cũng như một số loại
protein phụ trợ khác, đó là TP (protein kết thúc hệ gen, terminal protein),
protein Mu và protein X protease [25] (Hình 2.2; Bả
ng 2.1).

10
Bảng 2.1. Vị trí cấu trúc và chức năng hoạt động của 13 loại protein kiến tạo
adenovirus người
TT
Tên
protein
Vị trí cấu trúc trong virus Chức năng hoạt động
1 II
Hexon đơn nguyên (monomer)
Protein cấu trúc bề mặt
(Surface structural protein)
2 III
Penton nền (base)

Protein giúp virus xuyên màng
(Penetration)
3 IIIa
Liên kết với Penton nền (Associated with
penton base)
Protein giúp virus xuyên màng
(Penetration) và Lắp ráp
(Assembly)
4 IV
Sợi angten (Fibre) và nút bám (knob)
Tiếp xúc thụ thể tế bào (Receptor
binding); Có khả năng liên kết
hồng cầu thực hiện ngưng kết hồng
cầu (Hemagglutination)
5 V
Protein đệm nhỏ liên kết với DNA và
Penton nền (Core: associated with DNA &
penton base)
Giống histon, bao gói DNA hệ gen
(Histone-like; packaging)
6 VI
Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon
(Hexon minor polypeptide)
Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus
(Stabilization/assembly of particle)
7 VII
Protein đệm lớn liên kết với DNA và
Penton nền (Core: associated with DNA &
penton base)
Giống histon, bao gói DNA hệ gen

(Histone-like; packaging)
8 VIII
Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon
(Hexon minor polypeptide)
Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus
(Stabilization/assembly of particle)
9 IX
Tiểu protein chèn màng liên kết Hexon
(Hexon minor polypeptide)
Ổn định cấu trúc/ Lắp ráp virus
(Stabilization/assembly of particle)
10 X
Protein protease liên kết với Penton
(Associated with pentons?)
Hoàn thiện giải phóng virus
(Maturation)
11 TP
Protein kết thúc hệ gen (Genome -
T
erminal Protein)
Tham gia và trợ giúp quá trình
nhân lên hệ gen của virus (Genome
replication)
12 Mu
Nucleoprotein
Trợ giúp sự nhân lên hệ gen của
virus (Genome replication)
13 IV2a
Nucleoprotein
Trợ giúp lắp ráp và bao gói của

virus (Genome packaging)


11









Hình 2.1. Hình thái và cấu tạo của adenovirus. A. Ảnh kính hiển vi điện tử mô
tả các hạt adenovirus có dạng hình khối sắp xếp với nhau tạo thành tập hợp. B.
Mô hình cấu trúc không gian của hạt virion adenovirus. Nguồn: Fields et al.,
Fundamental Virology (1996).

Hình 2.2. Mô hình cấu tạo hạt virion adenovirus (cắt phẳng) với DNA hệ gen
và 13 loại protein được biết hiện nay. Tất cả các protein của adenovirus
được ký
hiệu đánh số, trừ protein TP (protein kết thúc hệ gen) và Mu (nucleoprotein).
Nguồn: />.
II
III
IV
X
TP
III
II
IV
IX
V
VI
VII
VIII
IIIa
X
Mu
TP
IVa2
II
III
IV
X
TP

III
II
IV
IX
V
VI
VII
VIII
IIIa
X
Mu
TP
IVa2
A
knob
B
A
knobknobknob
B

12

Hình 2.3. Xâm nhiễm của adenovirus vào tế bào thông qua thụ thể CAR và α-
integrin (mũi tên chỉ dẫn), dẫn vào endosome và chuyển vận đến nhân để thực
hiện chu trình tái tạo virus. Mô hình cấu tạo hạt virion adenovirus (cắt phẳng)
với DNA hệ gen và 13 loại protein được biết hiện nay. Tất cả các protein của
adenovirus được ký hiệu đánh số, trừ protein TP (protein kết thúc hệ gen) và
Mu (nucleoprotein).
Nguồn: />.

Adenovirus hấp phụ lên tế bào thích ứng bằng cách dùng nút angten (fiber
knob) bám dính vào thụ thể tế bào đích (Hình 2.3). Thụ thể tế bào đích có tên
gọi là CAR (coxsackie/adenovirus receptor), xuất phát từ bản chất của thụ thể
adenovirus giống hoàn toàn thụ thể của virus Coxsackie B, do vậy, thụ thể này
được sử dụng chung cho cả hai loại virus [48,59,69]. Sau khi bám dính, penton
của adenovirus cần có sự tương tác với α-integrin của bề mặt tế bào để kết dính
và xuyên màng thông qua quá trình ẩm bào (endocytosis) [49]. Bên trong nhân
tế bào, adenovirus thực hiện quá trình sao chép sớm (early transcription) để có
vật liệu hệ gen và tiếp tục thực hiện quá trình sao chép muộn (late transcription)
để có protein cấu trúc, tạo nên capsid của các hạt virion mới [28]. Sao chép,
Hấpphụ
Xuyên màng
Nguyên sinh chất
Ống dẫn vào nhân
Hấpphụ
Xuyên màng
Nguyên sinh chất

Ống dẫn vào nhân

13
tổng hợp protein, tổng hợp DNA và bao gói virus đều xảy ra trong nhân tế bào
nhiễm.
Tất cả adenovirus đều có hệ gen là DNA hai sợi (double-stranded
DNA), đều thuộc họ Adenoviridae, hầu hết adenovirus đều vô hại, một số chỉ
gây nhiễm nhẹ trên các loài thích ứng mà không gây chết. Adenovirus được
phân làm 4 nhóm chính nằm trong họ Adenoviridae [19], đó là
Mastadenovirus, Aviadenovirus, Atadenovirus và Siadenovirus [17]. Phần lớn
adenovirus của động vật có vú đều thuộc về nhóm Mastadenovirus, kể cả các
serotype của adenovirus của ng
ười (human adenovirus, HAd). Tất cả mọi loại
adenovirus phân lập từ chim được phân loại thuộc về nhóm Aviadenovirus.
Nhóm Atadenovirus bao gồm những virus đơn nhất, phân lập từ cừu, bò, hươu,
thú có túi và một vài loài chim. Nhóm thứ tư mới được phân loại gần đây là
Siadenovirus được tạm quy định bao gồm tất cả các adenovirus phân lập từ
ếch, cá, một số loài không xương sống và loại virus gây bệnh viêm ruột xuất
huyết ở
gà tây [17,25].
Adenovirus tái tổ hợp làm vacxin có khả năng sản sinh đáp ứng miễn
dịch dịch thể, miễn dịch trung gian tế bào và thích ứng hấp phụ lên tế bào niêm
mạc hệ hô hấp và hệ tiêu hóa để sản sinh miễn dịch niêm mạc [14]. Adenovirus
đã được làm vector vacxin đối với nhiều bệnh ở người và gia súc, gia cầm,
trước hết phải kể đến dịch hạch Yersinia pestis, nhiệt thán Bacillus anthracis, vi
khuẩn lao, số
t xuất huyết Dengue, sốt xuất huyết Ebola, sốt xuất huyết Dengue
đa type, hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải HIV/AIDS ở người và khỉ, hội
chứng hô hấp virus cấp ở người SARS, cũng như nhiều tác nhân gây bệnh khác
ở người. Đối với động vật, nhiều loại vacxin trên nền adenovirus đã được

nghiên cứu và đưa vào sử dụng như viêm não tuỷ truyền nhiễm ngựa, cúm
A/H5N1 [33,64], viêm phế quản truyền nhiễm IBV, Gumboro virus [31,62], hội
chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (tai xanh) ở lợn và nhiều ứng dụng vacxin
khác cho gia súc, gia cầm [30]. Hệ thống dẫn truyền adenovirus cũng được định
hướng sử dụng liệu pháp gen phòng chống ung thư, điều trị ung thư từ tế bào

14
gốc, điều trị bệnh ty thể, định hướng kích ứng miễn dịch, sản xuất kháng thể
đơn chuỗi scFv (single chain fragment variable) và biểu hiện kháng thể đơn
chuỗi trong tế bào cơ thể, cũng như định hướng phá bỏ gen thông qua cơ chế
can thiệp của RNAi (Xem bài tổng hợp tại [4]).
2.1.2. Tình hình nghiên cứu công nghệ adenovirus tái tổ hợp hiện nay
Công nghệ vector tái tổ hợp adenovirus là công nghệ mới, linh ho
ạt, thuận
lợi và dễ ứng dụng. Tổng toàn bộ thời gian thao tác để có được adenovirus tái tổ
hợp chứa gen kháng nguyên làm vacxin là rất ngắn, chỉ vài tháng khi đã thiết
lập xong công nghệ cơ sở, đáp ứng nhu cầu cần có vacxin trong điều kiện cấp
bách (dịch bệnh cấp, bệnh mới phát sinh/phát hiện, khủng bố sinh học ).
Vacxin trên nền adenovirus tái tổ hợp có tính bền nhiệt, liều lượng sử d
ụng ít,
miễn dịch lâu, hiệu lực đảm bảo. Việc sản xuất cũng hết sức thuận lợi đó là sử
dụng công nghệ tế bào nền với hàm lượng virus tạo ra rất cao.
Cho đến khi đề tài KC04.24/06-10 bắt đầu, công nghệ vector tái tổ hợp
adenovirus làm vacxin, hoàn toàn chưa được nghiên cứu tại Việt Nam, do vậy,
đề tài thực hiện với mục đích khám phá loại hình công nghệ mới, cho ra sản
ph
ẩm mới, sản phẩm mang tính kỹ thuật cao và thực dụng (Xem Thuyết minh
đề tài KC04.24/06-10; và [4]).
Có thể kể đến một số ứng dụng adenovirus làm vector cho vacxin như sau:
Đối với hệ thống HAd5 (Human adenovirus type 5):

- Vacxin HAd5 vector đối với virus Ebola kích thích sinh miễn dịch bảo hộ
tốt khi công cường độc bằng virus Ebola và loài động vật thí nghiệm gần người
(primates).
- Vacxin HAd5 vector đối với virus HIV-1 chứa gen kháng nguyên env có
khả năng kích thích miễn dịch bảo hộ ch
ống lại virus HIV khi thử nghiệm trên
khỉ rhesus và khỉ baboon.
- Vacxin HAd5 vector mang gen kháng nguyên của vi khuẩn nhiệt thán
(Bacillus anthracis) cho khả năng bảo hộ hiệu quả đối với vi khuẩn nhiệt thán
cường độc phòng bệnh tahn ở người và động vật.

15
- Vacxin HAd5 vector mang gen virus hội chứng hô hấp cấp tính (SARS)
thuộc loại Coronavirus cho đáp ứng miễn dịch đặc hiệu tốt khi thử nghiệm trên
chuột BALB/c và khỉ Rhesus macaque (Macaca mulatta).
- Vacxin HAd5 vector đối với virus cúm A/H5N1 mang gen H5 đã cho miễn
dịch và bảo hộ tốt trên gà và chuột/chồn Ferret khi công cường độc bằng chủng
A/Vietnam/1203(04)(H5N1).
- Hệ thống HAd5 vector cũng có thể còn được sử dụng như là một công cụ
liệu pháp miễn dịch, ch
ống ung thư, điều trị bệnh ty thể, sản xuất kháng thể đơn
chuỗi scFv (single chain fragment variable) và biểu hiện kháng thể đơn chuỗi
trong tế bào cơ thể, định hướng phá bỏ gen thông qua cơ chế can thiệp của
RNAi.
Đối với adenovirus loài chim (FAd, Fowl adenovirus):
- Nuôi ở mật độ đông, gia cầm cần có nhiều loại vacxin sử dụng thuận lợi
qua đường tiếu hóa, hô hấp, nên một loạt các type adenovirus loài chim, FAd1,
FAd8, FAd9 và FAd10 là các h
ệ thống được nghiên cứu nhiều nhất làm vacxin
ở gia cầm.

- Vector tái tổ hợp FAd1 (CELO virus) mang gen VP2 của virus Gumboro đã
cung cấp được miễn dịch bảo hộ hoàn toàn khi công cường độc với chủng
Gumboro cường độc [31]. Vector FAd1 cũng được kiểm nghiệm đối với liệu
pháp gen chống ung thư trên mô hình chuột chống lại khối u melanoma dưới da
chuột.
- Vector FAd8 tái tổ hợp có hiệu quả nhất hiện nay là vacxin vector chứa gen
S1 củ
a virus viêm phế quản truyền nhiễm (IBV) [39]. FAd8 vector chứa gen
kích ứng miễn dịch (cytokine), mang gen interferon γ (IFN- γ) của gà đã được
sử dụng để dẫn truyền cytokine có khả năng tăng cường miễn dịch rất cao chống
lại cầu trùng [40].
- Vector FAd9 (đối tượng nghiên cứu chính của Đề tài KC04.24/06-10), là
loại đã được nghiên cứu thiết kế thành công tạo thành khung plasmid vector
pPacFAdV9 để tiến hành lắp ráp các gen kháng nguyên có chủ định [20; 21; 22;