Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi khuẩn có đặc tính đối kháng vibrio spp nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú

BỘ NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NƠNG THƠN
CHƯƠNG TRÌNH CƠNG NGHỆ SINH HỌC NÔNG NGHIỆP, THỦY SẢN

BÁO CÁO TỔNG HỢP
KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ ĐỀ TÀI
Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dòng vi
khuẩn có đặc tính đối kháng Vibrio spp. nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu
trùng cá biển và tôm sú

Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Nghiên cứu Ni trồng Thủy sản II
Chủ nhiệm đề tài: TS. Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

8938

TP. Hồ Chí Minh, tháng 6/2011


VIỆN NGHIÊN CỨU NI
TRỒNG THỦY SẢN II
__________________

CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
TP.HCM, ngày 21 tháng 06 năm 2011

BÁO CÁO THỐNG KÊ
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
I. THÔNG TIN CHUNG
1. Tên đề tài: Nghiên cứu sản xuất thử nghiệm chế phẩm vi sinh từ các dịng vi khuẩn
có đặc tính đối kháng Vibrio spp. nhằm nâng cao tỉ lệ sống ấu trùng cá biển và tôm sú.
Mã số đề tài, dự án:

Thuộc: Chương trình Cơng nghệ sinh học nơng nghiệp, thủy sản.
2. Chủ nhiệm đề tài:
Họ và tên: Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh
Ngày, tháng, năm sinh: 06/03/1967

Nam/ Nữ: Nữ

Học hàm, học vị: Tiến sĩ
Chức danh khoa học: ............................................Chức vụ: Trưởng Phòng
Điện thoại: Tổ chức: (08)39372964; Nhà riêng: (08)38384217;
Mobile: 0908.264202
Fax: (08)38226807

E-mail:

Tên tổ chức đang công tác: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
Địa chỉ tổ chức: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh
Địa chỉ nhà riêng: 18/7/5 Phan Văn Trị, Phường 2, Quận 5, thành phố Hồ Chí
Minh
3. Tổ chức chủ trì đề tài:
Tên tổ chức chủ trì đề tài: Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản II
Điện thoại: (08)38299592
E-mail:
Website: />
Fax: (08)38226807


Địa chỉ: 116 Nguyễn Đình Chiểu, Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh
Họ và tên thủ trưởng tổ chức: Nguyễn Văn Hảo
Số tài khoản: 060.19.00.00047

Ngân hàng: Kho bạc Nhà nước Quận 1, thành phố Hồ Chí Minh
Tên cơ quan chủ quản đề tài: Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thơn
II. TÌNH HÌNH THỰC HIỆN
1. Thời gian thực hiện đề tài:
- Theo Hợp đồng đã ký kết: từ tháng 01/ năm 2008 đến tháng 12/ năm 2010
- Thực tế thực hiện: từ tháng 01/năm 2008 đến tháng 12/năm 2010
- Được gia hạn (nếu có):
- Lần 1 từ tháng…. năm…. đến tháng…. năm….
- Lần 2 ….
2. Kinh phí và sử dụng kinh phí:
a) Tổng số kinh phí thực hiện: 1.096 tr.đ, trong đó:
+ Kính phí hỗ trợ từ SNKH: 1.096 tr.đ.
+ Kinh phí từ các nguồn khác: ……………….tr.đ.
+ Tỷ lệ và kinh phí thu hồi đối với dự án (nếu có): ………….
…………………………………….
b) Tình hình cấp và sử dụng kinh phí từ nguồn SNKH:
Số
TT
1
2
3

Theo kế hoạch
Thời gian
Kinh phí
(Tháng, năm)
(Tr.đ)
2008
396
2009

401
2010
299

Thực tế đạt được
Thời gian
Kinh phí
(Tháng, năm)
(Tr.đ)
2008
362,708
2009
399,568
2010
270,386

Ghi chú
(Số đề nghị
quyết tốn)
362,708
399,568
270,386

- Lý do thay đổi:
+ Năm thứ nhất: thực hiện tiết kiệm 8% kinh phí theo quy định của Nhà nước (kinh phí
tiết kiệm là 33 triệu đồng).
+ Năm thứ ba: kinh phí tiết kiệm là 29 triệu đồng.


c) Kết quả sử dụng kinh phí theo các khoản chi:

Đơn vị tính: Triệu đồng
Số
TT

Nội dung
các khoản chi

1

Trả cơng lao động
(khoa học, phổ
thơng)
Ngun, vật liệu,
năng lượng
Thiết bị, máy móc
Xây dựng, sửa chữa
nhỏ
Chi khác
Tổng cộng

2
3
4
5

Theo kế hoạch
Tổng

SNKH

458

Nguồn
khác

Thực tế đạt được
Tổng

SNKH

458

459,28

459,28

352

352

362,79

362,79

45
10

45
10

41,15
11,38

41,15
11,38

231
1.096

231
1.096

Nguồn
khác

158,06 158,06
1.032,7 1.032,7

3. Các văn bản hành chính trong q trình thực hiện đề tài:
(Liệt kê các quyết định, văn bản của cơ quan quản lý từ công đoạn xác định nhiệm vụ, xét
chọn, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực hiện... nếu
có); văn bản của tổ chức chủ trì đề tài, dự án (đơn, kiến nghị điều chỉnh ... nếu có)
Số Số, thời gian ban hành
Tên văn bản
văn bản
TT
1 209/KHCN, 20/5/2008 Hợp đồng nghiên cứu khoa học
và phát triển công nghệ
2 1128/QĐ-BNN-TC,
Quyết định giao chỉ tiêu tiết kiệm

22/5/2008
10% chi thường xuyên năm 2008
3 6693/BNN-KHCN,
Công văn của Vụ KHCN&MT
3/12/2009
gửi Viện NCNTTS II về việc thay
đổi địa điểm bố trí thí nghiệm của
đề tài

4. Tổ chức phối hợp thực hiện đề tài: Khơng có

Ghi chú

Đồng ý cho chủ
nhiệm đề tài thực
hiện thí nghiệm trên
tơm sú của ND4 tại
Trại Thực nghiệm
thủy sản Bạc Liêu


5. Cá nhân tham gia thực hiện đề tài:
(Người tham gia thực hiện đề tài thuộc tổ chức chủ trì và cơ quan phối hợp, không quá 10
người kể cả chủ nhiệm)
Tên cá nhân đăng
ký theo Thuyết
minh
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh
GSTS Nguyễn Văn

Thanh
Trần Nguyễn Ái
Hằng

Tên cá nhân đã
tham gia thực hiện

Nội dung tham
gia chính

Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh
GSTS Nguyễn Văn
Thanh
Trần Nguyễn Ái
Hằng

4

Đặng Tố Vân Cầm

Đặng Tố Vân Cầm

5

Vũ Hồng Như Yến

Vũ Hồng Như Yến

Chủ nhiệm đề

tài
Cố vấn khoa
học
Phân lập các
chủng probiotic,
đánh giá in vitro
Phụ trách các
thí nghiệm qui
mơ pilot trên cá
chẽm
Phụ trách các
thí nghiệm qui
mô pilot trên
tôm sú

Số
TT
1
2
3

Sản phẩm
chủ yếu
đạt được

Ghi
chú*

- Lý do thay đổi ( nếu có):
6. Tình hình hợp tác quốc tế:

Số
TT
1

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm, tên tổ chức hợp tác,
số đoàn, số lượng người tham
gia...)
Tên người và tổ chức hợp tác:
GSTS. Peter Bossier,
Laboratory of Aquaculture &
Artemia Reference Center,
Ghent University, Belgium
Nội dung hợp tác: Trao đổi và
học tập các phương pháp phân
lập và tạo chế phẩm vi sinh
ứng dụng trong thủy sản

Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm, tên tổ chức hợp tác,
số đồn, số lượng người tham
gia...)
Đã thực hiện việc hợp tác với tổ
chức nói trên vào tháng 9/2009

Ghi
chú*

7. Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị:
Số
TT

Theo kế hoạch
(Nội dung, thời gian, kinh phí,
địa điểm )

Thực tế đạt được
(Nội dung, thời gian,
kinh phí, địa điểm )

Ghi chú*

1
2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
8. Tóm tắt các nội dung, công việc chủ yếu:
(Nêu tại mục 16 của thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát
trong nước và nước ngồi)
Số
TT
1
1.1
2

2.1

2.2

3

Các nội dung, cơng việc
chủ yếu
(Các mốc đánh giá chủ yếu)
Khảo sát phân lập tác nhân gây
bệnh Vibrio spp. trên ấu trùng tôm
sú và cá chẽm
Thu mẫu ấu trùng tôm sú và cá
chẽm bệnh, xác định và phân lập
tác nhân gây bệnh
Phân lập các dòng vi khuẩn có khả
năng phân hủy phân tử quorum
sensing của vi khuẩn Gram âm
(AHL)
Thu mẫu ấu trùng tôm sú và cá
chẽm, nghiền mẫu, ly tâm và bảo
quản ở -800C

Thời gian
(Bắt đầu, kết thúc
- tháng … năm)
Theo kế
Thực tế
hoạch
đạt được

1/2008 –

5/2008

1/2008 –
9/2008

Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng

4/2008 –
6/2008

4/2008 –
6/2008;
1/2010 –
3/2010
6/2008 –
9/2008;
4/2010 –
6/2010
10/2008 –
3/2009;
4/2010 –
6/2010

Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng

Phân lập các dòng vi khuẩn có khả 6/2008 –

năng phân hủy phân tử AHL
9/2008
Khảo sát các đặc tính probiotic
của các chủng vi khuẩn đã phân
lập ở điều kiện in vitro

Người,
cơ quan
thực hiện

10/2008 –
3/2009

Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng


4

4.1

Khảo sát các đặc tính probiotic
của các chủng vi khuẩn đã phân
lập ở điều kiện in vivo (trên ấu
trùng cá chẽm và tơm sú)
Khảo sát các đặc tính probiotic

của các chủng vi khuẩn ở điều
kiện phịng thí nghiệm

4.2

Khảo sát các đặc tính probiotic
của các chủng vi khuẩn riêng lẻ và
hỗn hợp vi khuẩn ở qui mô pilot

4/2009 –
3/2010

4/2009 –
6/2009;
4/2010 –
6/2010
4/2009 –
8/2010

5

Định danh các chủng vi khuẩn đã
được tuyển chọn làm chế phẩm vi
sinh sử dụng phương pháp sinh
học phân tử và phương pháp
truyền thống
Nghiên cứu nhân sinh khối và
phối chế tạo chế phẩm vi sinh từ
các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn,
khảo sát thời gian bảo quản

1/2010 –
9/2010

5/2009 –
9/2009

1/2010 –
9/2010

7/2010 –
12/2010

6

4/2009 –
3/2010

Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Đặng Tố Vân
Cầm, Vũ Hồng Như
Yến
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, Trần Nguyễn
Ái Hằng
Nguyễn Thị Ngọc
Tĩnh, GSTS.

Nguyễn Văn Thanh

- Lý do thay đổi (nếu có):
III. SẢN PHẨM KH&CN CỦA ĐỀ TÀI
1. Sản phẩm KH&CN đã tạo ra
a) Sản phẩm Dạng I:
Số
TT
1
2

Tên sản phẩm và
chỉ tiêu chất lượng
chủ yếu
Chế phẩm vi sinh sử
dụng cho trại giống
cá biển
Chế phẩm vi sinh sử
dụng cho trại giống
tôm sú

- Lý do thay đổi (nếu có):

Đơn
vị đo

Theo kế
hoạch

Thực tế

đạt được

kg

5,0

10,5

kg

5,0

15,6

Số lượng


b) Sản phẩm Dạng II:
Số
TT
1

Tên sản phẩm
Qui trình cơng nghệ phân
lập và sản xuất sinh khối
chế phẩm vi sinh

Yêu cầu khoa học
cần đạt
Theo kế hoạch

Thực tế
đạt được
Qui trình dễ áp Qui trình tạo ra
dụng, tạo ra
chế phẩm vi
chế phẩm vi
sinh với công
sinh ở qui mô
suất 2,5kg / 24
1kg / 3 giờ
giờ

Ghi chú

2
...
- Lý do thay đổi (nếu có): Máy sấy đơng khơ hiện có khơng đạt được cơng suất lớn.
c) Sản phẩm Dạng III:
Số
TT
1

2

Tên sản phẩm
Bài báo “Phân lập các
chủng vi khuẩn phân hủy
quorum sensing ở nhóm vi
khuẩn gây bệnh Gram âm
trên động vật thủy sản”

Báo cáo thuyết trình “Kết
quả phân lập các chủng vi
khuẩn probiotic đối kháng
Vibrio spp. và bước đầu
ứng dụng trong ương nuôi
ấu trùng cá chẽm và tơm
sú”

...
- Lý do thay đổi (nếu có):

u cầu khoa học
cần đạt
Theo
Thực tế
kế hoạch đạt được
01
01

Số lượng, nơi cơng bố
(Tạp chí, nhà xuất bản)
Tạp chí Khoa học và
Cơng nghệ - Viện Khoa
học Công nghệ Việt Nam
(chấp nhận đăng)
Kỷ yếu Hội nghị Cơng
nghệ sinh học tồn quốc
khu vực phía Nam năm
2009

d) Kết quả đào tạo:
Số
TT

Cấp đào tạo, Chuyên
ngành đào tạo

1
2

Thạc sỹ
Tiến sỹ

Số lượng
Theo kế hoạch
Thực tế đạt
được
01
01

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)
9/2010

- Lý do thay đổi (nếu có):
đ) Tình hình đăng ký bảo hộ quyền sở hữu công nghiệp, quyền đối với giống cây trồng:
Số
TT

1

Tên sản phẩm
đăng ký

Kết quả
Theo
kế hoạch

Thực tế
đạt được

01

Ghi chú
(Thời gian kết
thúc)

01

Qui trình phân lập chế
phẩm vi sinh có đặc tính
ức chế quorum sensing
của vi khuẩn gây bệnh

2
...
- Lý do thay đổi (nếu có):
e) Thống kê danh mục sản phẩm KHCN đã được ứng dụng vào thực tế

Số
TT

Tên kết quả
đã được ứng dụng

Thời gian

Địa điểm
(Ghi rõ tên, địa
chỉ nơi ứng
dụng)

Kết quả
sơ bộ

1
2
2. Đánh giá về hiệu quả do đề tài mang lại
a) Hiệu quả về khoa học và công nghệ:
(Nêu rõ danh mục công nghệ và mức độ nắm vững, làm chủ, so sánh với trình độ cơng
nghệ so với khu vực và thế giới…)
Với các kết quả nghiên cứu đạt được, đề tài sẽ đóng góp vào lĩnh vực KH&CN
có liên quan đến việc nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phân lập và
tạo chế phẩm vi sinh có đặc tính ức chế quorum sensing và đối kháng nhóm vi khuẩn


gây bệnh và ứng dụng trong sản xuất giống tôm sú và cá biển, đồng thời xây dựng qui
trình cho các đối tượng thủy sản khác.
b) Hiệu quả về kinh tế xã hội:

(Nêu rõ hiệu quả làm lợi tính bằng tiền dự kiến do đề tài, dự án tạo ra so với các sản
phẩm cùng loại trên thị trường…)
Các sản phẩm của đề tài có hiệu quả cao trong việc nâng cao tỉ lệ sống của ấu
trùng tôm sú và cá biển. Nếu có thể hạ giá thành so với các sản phẩm khác cùng loại
sản xuất trong nước thì sẽ có sức cạnh tranh cao, đồng thời tạo ra giá trị thặng dư thông
qua việc ứng dụng sản phẩm vào sản xuất và đời sống.
3. Tình hình thực hiện chế độ báo cáo, kiểm tra của đề tài
Số
TT
I

Nội dung

Thời gian
thực hiện
6/2008

Lần 2

12/2008

Lần 3

6/2009

Lần 4

12/2009

Lần 5

6/2010

Lần 6
II

Báo cáo định kỳ
Lần 1

10/2010

Kiểm tra định kỳ
Lần 1

12/2008

Lần 2

11/2009

Ghi chú
(Tóm tắt kết quả, kết luận chính, người chủ
trì…)
Đề tài đã hồn thành những nội dung công
việc của 6 tháng đầu năm 2008.
Đề tài thực hiện đúng tiến độ, đã hoàn thành
nội dung 1 và 2 và đang thực hiện nội dung 3
Đã hoàn thành nội dung 3 và đang thực hiện
thử nghiệm quy mơ pilot.
Đã xác định 2 hỗn hợp vi khuẩn có thể sử

dụng làm chế phẩm vi sinh cho ấu trùng cá
biển và 1 hỗn hợp có thể sử dụng làm chế
phẩm vi sinh cho ấu trùng tơm sú.
Đã hồn thành nội dung 4 nhưng chậm 3
tháng so với tiến độ. Đang thực hiện nội
dung 5 và 6.
Đang tiếp tục định danh và thử nghiệm ở
điều kiện trại giống. Đề tài thực hiện đúng
tiến độ so với thuyết minh và hợp đồng.
Chủ nhiệm đề tài bám sát đề cương, triển
khai tốt.
CNĐT đã bám sát đề cương. Chú ý định
hướng phát triển của sản phẩm là kháng
bệnh. Cần chú ý sự tương thích khi phát triển
hỗn hợp sản phẩm.


Lần 3
III
IV

8/2010

Nghiệm thu cơ
sở
Nghiệm thu cấp
Nhà nước

12/2010
3/2011

Chủ nhiệm đề tài
(Họ tên, chữ ký)

Nguyễn Thị Ngọc Tĩnh

Đề nghị CNĐT khẩn trương hoàn thiện và
làm báo cáo tổng kết. Chuẩn bị đầy đủ hồ sơ
để nghiệm thu đề tài đúng thời hạn.
Đề tài được xếp loại “Đạt”, đủ điều kiện
đánh giá kết quả đề tài ở cấp Nhà nước.
Đề tài được xếp loại “Khá”

Thủ trưởng tổ chức chủ trì
(Họ tên, chữ ký và đóng dấu)


MỤC LỤC
Chương 1 - MỞ ĐẦU .........................................................................................1
1.1.

Giới thiệu về sự hình thành đề tài ..................................................................... 1

1.2.

Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu....................................................................... 1

1.3.

Tính cấp thiết .................................................................................................... 1

1.4.

Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài .......................................................... 2

1.5.

Tổng quan về tình hình nghiên cứu .................................................................. 2

1.5.1. Tình hình nghiên cứu bệnh do Vibrio gây ra trên động vật thủy sản................ 2
1.5.2. Probiotic – giải pháp thay thế kháng sinh......................................................... 5
1.5.3. Bẻ gãy hệ thống quorum sensing ở vi khuẩn gây bệnh – phương pháp tiếp
cận mới trong việc kiểm soát bệnh .............................................................................. 7
1.5.4. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chế phẩm vi sinh trong nuôi trồng thủy sản
trong và ngoài nước...................................................................................................... 13

Chương 2 – KHẢO SÁT PHÂN LẬP TÁC NHÂN GÂY BỆNH Vibrio spp.
TRÊN ẤU TRÙNG TÔM SÚ VÀ CÁ CHẼM...................................................17
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 17
2.1.1. Tôm, cá thí nghiệm ............................................................................................ 17
2.1.2. Chủng vi khuẩn .................................................................................................. 17
2.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 17
2.3. Kết quả nghiên cứu ............................................................................................... 19
2.3.1. Thí nghiệm gây nhiễm trên ấu trùng tơm sú ...................................................... 19
2.3.1.1. Thí nghiệm 1 ................................................................................................... 20
2.3.1.2. Thí nghiệm 2 ................................................................................................... 20
2.3.1.3. Thí nghiệm 3 ................................................................................................... 20
2.3.1.4. Thí nghiệm 4 ................................................................................................... 21
2.3.1.5. Thí nghiệm 5 ................................................................................................... 21
2.3.1.6. Thí nghiệm 6 ................................................................................................... 22

i


2.3.2. Thí nghiệm gây nhiễm trên cá chẽm hương....................................................... 23
2.3.2.1. Thí nghiệm 1 ................................................................................................... 23
2.3.2.2. Thí nghiệm 2 ................................................................................................... 23
2.3.2.3. Thí nghiệm 3 ................................................................................................... 23
2.3.2.4. Thí nghiệm 4 ................................................................................................... 24
2.3.2.5. Thí nghiệm 5 ................................................................................................... 24
2.3.2.6. Thí nghiệm 6 ................................................................................................... 25

Chương 3 – PHÂN LẬP CÁC CHỦNG VI KHUẨN CÓ KHẢ NĂNG PHÂN
HỦY PHÂN TỬ QUORUM SENSING CỦA VI KHUẨN GRAM ÂM ..........26
3.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 26
3.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 26
3.2.1. Thu nhận hệ vi sinh vật đường ruột ................................................................... 26
3.2.2. Phân lập vi khuẩn có đặc tính phân hủy phân tử AHL ...................................... 27
3.2.3. Định danh bằng phương pháp sinh hóa.............................................................. 27
a) Nhuộm Gram............................................................................................................ 27
b) Định danh................................................................................................................. 27
3.3. Kết quả nghiên cứu ............................................................................................... 28
3.3.1. Biến động giá trị pH của môi trường phân lập................................................... 28
3.3.2. Mật độ vi sinh vật qua các đợt phân lập ............................................................ 30
3.3.3. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của vi khuẩn phân hủy AHL qua các chu kỳ
phân lập ........................................................................................................................ 31
3.3.4. Kết quả định danh bằng phương pháp sinh hóa................................................. 31

Chương 4 – KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN PHÂN HỦY QUORUM SENSING Ở ĐIỀU KIỆN IN VITRO ....33

4.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................... 33
4.2. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................... 33
4.2.1. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL ....................................................... 33

ii


4.2.2. Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh ................................................. 35
4.3. Kết quả nghiên cứu ............................................................................................... 36
4.3.1. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL ....................................................... 36
4.3.1.1. Khả năng phân hủy HHL của nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm hương .... 36
4.3.1.2. Khả năng phân hủy HHL của nhóm vi khuẩn phân lập từ tơm sú thương
phẩm ............................................................................................................................. 37
4.3.1.3. Khả năng phân hủy HHL của nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú post .......... 38
4.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio gây bệnh .................................................. 39

Chương 5 – KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC CỦA CÁC CHỦNG
VI KHUẨN PHÂN HỦY QUORUM SENSING Ở ĐIỀU KIỆN IN VIVO ......42
5.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................... 42
5.1.1. Đánh giá tính an tồn đối với vật chủ (tôm sú post và cá chẽm hương)............ 42
5.1.2. Đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp. ......................... 42
5.1.3. Khảo sát đặc tính tương thích ........................................................................... 43
5.1.4. Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mơ pilot ................................................. 44
5.1.4.1. Thí nghiệm trên cá chẽm hương ..................................................................... 44
5.1.4.2. Thí nghiệm trên ấu trùng tơm sú..................................................................... 46
5.1.5. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................................. 49
5.2. Kết quả nghiên cứu ............................................................................................... 49
5.2.1. Đánh giá tính an tồn đối với vật chủ ................................................................ 49
5.2.1.1. Đánh giá tính an tịan đối với ấu trùng cá chẽm ............................................. 49
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm........................................................................ 49

b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tơm sú .......................................................................... 50
5.2.1.2. Đánh giá tính an tịan đối với ấu trùng tơm sú................................................ 51
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm........................................................................ 51
b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú .......................................................................... 52
5.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp. .......................... 53

iii


5.2.2.1. Khả năng bảo vệ ấu trùng cá chẽm gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus 53
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm........................................................................ 53
b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú .......................................................................... 54
5.2.2.2. Khả năng bảo vệ ấu trùng tơm sú gây nhiễm với Vibrio alginolyticus........... 54
a. Nhóm vi khuẩn phân lập từ cá chẽm........................................................................ 54
b. Nhóm vi khuẩn phân lập từ tôm sú .......................................................................... 55
5.2.3. Khảo sát đặc tính tương thích giữa các chủng vi khuẩn .................................... 56
5.2.4. Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mơ pilot ................................................. 57
5.2.4.1. Thí nghiệm trên cá chẽm hương ..................................................................... 57
a. Thí nghiệm 1 ............................................................................................................ 57
b. Thí nghiệm 2 ............................................................................................................ 60
c. Thí nghiệm 3 ............................................................................................................ 63
d. Thí nghiệm 4 ............................................................................................................ 66
5.2.4.2. Thí nghiệm trên ấu trùng tơm sú..................................................................... 71
a. Thí nghiệm 1 ............................................................................................................ 71
b. Thí nghiệm 2 ............................................................................................................ 72
c. Thí nghiệm 3 ............................................................................................................ 75
d. Thí nghiệm 4 ............................................................................................................ 78

Chương 6 – ĐỊNH DANH VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH PROBIOTIC
KHÁC CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐÃ ĐƯỢC TUYỂN CHỌN ............83

6.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................... 83
6.1.1. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử ................................................ 83
6.1.2. Khảo sát các đặc tính probiotic khác ................................................................. 83
6.1.2.1. Khả năng sinh bacteriocin............................................................................... 83
6.1.2.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ................................................................... 85
a) Gelatinase ................................................................................................................ 85
b) Caseinase ................................................................................................................. 85

iv


c) Amylase ................................................................................................................... 85
d) Cellulase................................................................................................................... 86
e) Lipase ....................................................................................................................... 86
6.1.2.3. Khả năng tương tác với vi tảo ......................................................................... 86
6.1.3. Khảo sát khả năng sinh hemolysin..................................................................... 87
6.2. Kết quả nghiên cứu ............................................................................................... 87
6.2.1. Định danh bằng phương pháp sinh học phân tử................................................. 87
6.2.2. Khảo sát các đặc tính probiotic khác ................................................................. 89
6.2.2.1. Xác định bản chất của hợp chất đối kháng ..................................................... 89
a. Khảo sát khả năng đối kháng với các chủng vi khuẩn kiểm định theo thời gian
nuôi cấy ........................................................................................................................ 89
b. Khảo sát sự thay đổi pH của môi trường ................................................................. 92
6.2.2.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào ................................................................... 93
6.2.2.3. Khảo sát sự tương tác với vi tảo...................................................................... 93
a. Thí nghiệm 1 ............................................................................................................ 93
b. Thí nghiệm 2 ............................................................................................................ 94
6.2.3. Khả năng sinh hemolysin ................................................................................... 95

Chương 7 – NGHIÊN CỨU NHÂN SINH KHỐI VÀ PHỐI CHẾ TẠO

CHẾ PHẨM VI SINH.........................................................................................96
7.1. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................... 96
7.1.1. Khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ở các điều kiện nuôi
cấy khác nhau ............................................................................................................... 96
7.1.2. Tạo chế phẩm vi sinh từ các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn, khảo sát thời
gian bảo quản ............................................................................................................... 96
7.1.2.1. Thiết bị và chất mang sử dụng ........................................................................ 96
7.1.2.2. Thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu .................... 97
7.1.3. Thử nghiệm sản phẩm ở điều kiện trại giống .................................................... 98

v


7.2. Kết quả nghiên cứu ............................................................................................... 98
7.2.1. Khảo sát sự tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn............................ 98
a. Khảo sát sự tăng trưởng trong các môi trường khác nhau ....................................... 98
b. Khảo sát sự tăng trưởng ở các giá trị pH khác nhau ................................................ 99
c. Khảo sát sự tăng trưởng ở các giá trị nhiệt độ khác nhau ........................................ 99
d. Khảo sát đường cong tăng trưởng theo thời gian................................................... 100
7.2.2. Xác định chất mang, tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu ..................... 101
a. Xác định chất mang thích hợp................................................................................ 101
b. Xác định tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản tối ưu.............................................. 101
7.2.3. Kết quả thử nghiệm sản phẩm ở điều kiện sản xuất ........................................ 103
a. Kết quả thử nghiệm ở trại giống cá chẽm .............................................................. 103
b. Kết quả thử nghiệm ở trại giống tôm sú................................................................. 104

Chương 8 – CÁC KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC VÀ THẢO LUẬN ....................... 105
8.1. Các kết quả khoa học công nghệ......................................................................... 105
8.1.1. Khảo sát tác nhân gây bệnh Vibrio spp. trên ấu trùng tôm sú và cá chẽm ...... 105
8.1.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phân hủy phân tử quorum sensing

(phân tử AHL) của vi khuẩn Gram âm ...................................................................... 105
8.1.3. Khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn đã sàng lọc ở điều kiện
in vitro ........................................................................................................................ 106
8.1.3.1. Khảo sát khả năng phân hủy phân tử HHL .................................................. 106
8.1.3.2. Khảo sát khả năng đối kháng Vibrio spp. ..................................................... 106
8.1.4. Khảo sát các đặc tính probiotic của các chủng vi khuẩn đã sàng lọc ở điều kiện
in vivo ......................................................................................................................... 106
8.1.4.1. Khảo sát khả năng bảo vệ vật chủ gây nhiễm với Vibrio spp. ở điều kiện
phịng thí nghiệm........................................................................................................ 106
8.1.4.2. Khảo sát các đặc tính probiotic ở quy mơ pilot ............................................ 108
8.1.5. Xác định thành phần loài và định danh các hỗn hợp vi khuẩn đã tuyển chọn. 109

vi


8.1.6. Nghiên cứu nhân sinh khối và phối chế tạo chế phẩm vi sinh từ các hỗn hợp
vi khuẩn đã tuyển chọn, thử nghiệm lại ở điều kiện trại giống.................................. 109
8.2. Các sản phẩm khoa học và công nghệ ................................................................ 111
8.3. Tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường.................................................. 112
8.3.1. Hiệu quả kinh tế trực tiếp................................................................................. 112
8.3.2. Mức độ tác động đối với kinh tế, xã hội và môi trường .................................. 112
8.3.3. Mức độ sẵn sàng thương mại hóa kết quả nghiên cứu..................................... 112

Chương 9 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 113
9.1. Kết luận ............................................................................................................... 113
9.2. Kiến nghị............................................................................................................. 114

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 116

vii

DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các yếu tố độc lực liên quan đến quá trình phát sinh bệnh của Vibrio
harveyi ......................................................................................................................... 4
Bảng 1.2. Các yếu tố cấu thành trong chiến lược kiểm sóat hệ vi sinh trong ương
ni ấu trùng thủy sản ................................................................................................. 6
Bảng 1.3. Một số phân tử tín hiệu của các loài vi khuẩn gây bệnh trên động vật
thủy sản ....................................................................................................................... 8
Bảng 2.1. Tỉ lệ sống của ấu trùng tơm sú (%) sau 24 giờ gây nhiễm (thí nghiệm 2) .. 20
Bảng 2.2. Tỉ lệ sống của ấu trùng tơm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 3) ............................................................................................................... 21
Bảng 2.3. Tỉ lệ sống của ấu trùng tơm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 4) ............................................................................................................... 21
Bảng 2.4. Tỉ lệ sống của ấu trùng tơm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 5) ............................................................................................................... 22
Bảng 2.5. Tỉ lệ sống của ấu trùng tơm sú (%) sau 24 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 6) ............................................................................................................... 22
Bảng 2.6. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 2) ............................................................................................................... 23
Bảng 2.7. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 3) ............................................................................................................... 24
Bảng 2.8. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 4) ............................................................................................................... 24
Bảng 2.9. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 5) ............................................................................................................... 25
Bảng 2.10. Tỉ lệ sống của cá chẽm hương (%) sau 48 giờ gây cảm nhiễm
(thí nghiệm 6) ............................................................................................................... 25

viii

Bảng 3.1. Khoảng biến thiên giá trị pH ở các nghiệm thức qua các đợt phân lập....... 28
Bảng 4.1. Kết quả tổng hợp các đặc tính probiotic in vitro của các chủng vi khuẩn
khảo sát......................................................................................................................... 40
Bảng 5.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên cá chẽm hương (quy mơ pilot). ...................... 46
Bảng 5.2. Chế độ thay nước và cho ăn đối với ấu trùng tơm sú thí nghiệm................ 47
Bảng 5.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm trên ấu trùng tơm sú (quy mô pilot)....................... 48
Bảng 5.4. Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi
khuẩn phân lập từ cá chẽm và gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus. ................... 53
Bảng 5.5. Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi
khuẩn phân lập từ tôm sú và gây nhiễm với Vibrio parahaemolyticus. ..................... 54
Bảng 5.6. Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi
khuẩn phân lập từ cá chẽm và gây nhiễm với Vibrio alginolyticus. ............................ 55
Bảng 5.7. Tỉ lệ RPS (%) trên ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi
khuẩn phân lập từ tôm sú và gây nhiễm với Vibrio alginolyticus ............................... 55
Bảng 5.8. Đặc tính tương thích của 13 chủng vi khuẩn tuyển chọn ............................ 56
Bảng 6.1. Đặc điểm hình thái và kết quả định danh của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn ................................................................................................................... 88
Bảng 6.2. Hoạt tính đối kháng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn theo thời gian
nuôi cấy ........................................................................................................................ 90
Bảng 6.3. Giá trị pH của môi trường sau thời gian ni cấy ....................................... 92
Bảng 6.4. Hoạt tính các enzyme ngoại bào của các chủng vi khuẩn tuyển chọn ........ 93
Bảng 7.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát tăng trưởng của các chủng vi khuẩn
tuyển chọn .................................................................................................................... 96
Bảng 7.2. Bố trí thí nghiệm khảo sát tỉ lệ phối trộn và nhiệt độ bảo quản đối với các chế
phẩm vi sinh. ................................................................................................................ 97
Bảng 7.3. Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy trong các môi trường
khác nhau...................................................................................................................... 98
Bảng 7.4. Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy ở các giá trị pH

ix


khác nhau...................................................................................................................... 99
Bảng 7.5. Mật độ vi khuẩn (log CFU/ml) sau 48 giờ nuôi cấy ở các giá trị nhiệt độ
khác nhau.................................................................................................................... 100
Bảng 7.6. Độ ẩm của sản phẩm ở các tỉ lệ phối trộn khác nhau . .............................. 102
Bảng 7.7. Mật độ vi khuẩn tổng số trong sản phẩm ở các nhiệt độ bảo quản và ở các
thời điểm khác nhau. .................................................................................................. 103
Bảng 7.8. Kết quả thử nghiệm sản phẩm BioFish-RIA2 ........................................... 104
Bảng 7.9. Kết quả thử nghiệm sản phẩm BioShrimp-RIA2 ...................................... 104
Bảng 8.1. Các chủng vi khuẩn đạt giá trị RPS cao nhất ở các thí nghiệm gây nhiễm trên
ấu trùng tôm sú và cá chẽm........................................................................................ 107
Bảng 8.2. Kết quả định danh của bốn chủng được tuyển chọn.................................. 109
Bảng 8.3. Các sản phẩm khoa học và công nghệ của đề tài ...................................... 111

x


DANH SÁCH HÌNH VÀ ĐỒ THỊ
Hình 1.1. Hệ thống quorum sensing ở Vibrio harveyi . ............................................... 10
Hình 1.2. Sơ đồ các phương pháp bẻ gãy quá trình quorum sensing ở vi khuẩn. ....... 11
Hình 1.3. Quá trình phân hủy phân tử AHL bằng enzyme. ......................................... 12
Hình 2.1. Tồn cảnh bố trí thí nghiệm gây nhiễm để khảo sát tác nhân gây bệnh
Vibrio spp. .................................................................................................................... 19
Hình 3.1. Sơ đồ qui trình phân lập vi khuẩn phân hủy phân tử AHL. ......................... 29
Hình 3.2. Mật độ vi sinh vật trung bình (log CFU/ml) qua các chu kỳ và qua các đợt
phân lập ........................................................................................................................ 30
Hình 4.1. Mức độ phân hủy khác nhau đối với phân tử HHL bởi các chủng vi khuẩn

khảo sát......................................................................................................................... 34
Hình 4.2. Thí nghiệm khảo sát đặc tính đối kháng Vibrio spp. ở điều kiện in vitro.... 36
Hình 4.3. Biến động nồng độ HHL theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các
chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm hương................................................................. 36
Hình 4.4. Biến động nồng độ HHL theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các
chủng vi khuẩn phân lập từ tôm sú thương phẩm ........................................................ 38
Hình 4.5. Biến động nồng độ HHL theo thời gian ở các nghiệm thức có bổ sung các
chủng vi khuẩn phân lập từ tơm sú post....................................................................... 39
Hình 5.1. Bố trí thí nghiệm khảo sát đặc tính probiotic ở điều kiện in vivo (phịng thí
nghiệm)......................................................................................................................... 43
Hình 5.2. Tồn cảnh bố trí thí nghiệm trên cá chẽm hương tại Trung tâm quốc gia
giống hải sản Nam Bộ. ................................................................................................. 45
Hình 5.3. Tồn cảnh bố trí thí nghiệm trên ấu trùng tơm sú tại Trại Thực nghiệm Thủy
sản Bạc Liêu. ................................................................................................................ 47
Hình 5.4. Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập từ cá chẽm...................................................................................................... 50

xi


Hình 5.5. Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm 48 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập từ tôm sú thương phẩm và tôm sú post. ........................................................ 50
Hình 5.6. Tỉ lệ sống của ấu trùng tơm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập từ cá chẽm. .................................................................................................... 51
Hình 5.7. Tỉ lệ sống của ấu trùng tôm sú 24 giờ sau khi bổ sung các chủng vi khuẩn
phân lập từ tôm sú thương phẩm và tơm sú post. ....................................................... 52
Hình 5.8. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm (Thí
nghiệm 1). .................................................................................................................... 58
Hình 5.9. Tỉ lệ sống của ấu trùng cá chẽm tại thời điểm 14 ngày (Thí nghiệm 1) ...... 59
Hình 5.10. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm

(Thí nghiệm 2).............................................................................................................. 60
Hình 5.11. Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 2)............... 62
Hình 5.12. Chiều dài trung bình cá chẽm hương 30 ngày tuổi (Thí nghiệm 2)........... 63
Hình 5.13. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm (Thí
nghiệm 3) ..................................................................................................................... 64
Hình 5.14. Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 3)............... 65
Hình 5.15. Chiều dài cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 3) ............... 66
Hình 5.16. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương cá chẽm
(Thí nghiệm 4).............................................................................................................. 68
Hình 5.17. Tỉ lệ sống cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí nghiệm 4)............... 69
Hình 5.18. Trọng lượng khơ cá thể cá chẽm hương vào ngày tuổi thứ 30 (Thí
nghiệm 4) ..................................................................................................................... 70
Hình 5.19. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tơm sú (Thí
nghiệm 1) ..................................................................................................................... 72
Hình 5.20. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tơm sú (Thí
nghiệm 2) ..................................................................................................................... 73
Hình 5.21. Tỉ lệ sống ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 2).................... 74
Hình 5.22. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tơm sú (Thí

xii


nghiệm 3) ..................................................................................................................... 76
Hình 5.23. Tỉ lệ sống ấu trùng tơm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 3).................... 77
Hình 5.24. Chiều dài thân ấu trùng tôm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 3) ............ 78
Hình 5.25. Mật độ Vibrio tổng số trung bình trong nước bể ương tơm sú (Thí
nghiệm 4) ..................................................................................................................... 80
Hình 5.26. Tỉ lệ sống ấu trùng tơm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 4).................... 81
Hình 5.27. Chiều dài thân ấu trùng tơm sú ở giai đọan PL13 (Thí nghiệm 4) ............ 82
Hình 6.1. Kết quả nhộm Gram các chủng vi khuẩn tuyển chọn .................................. 89

Hình 6.2. Diễn biến mật độ tảo Chlorella sp. trong bình ni cấy khơng có và có bổ
sung các chủng vi khuẩn phân lập từ cá chẽm ............................................................. 94
Hình 6.3. Diễn biến mật độ tảo Chlorella sp. trong bình ni cấy khơng có và có bổ
sung các chủng vi khuẩn phân lập từ tơm sú thương phẩm ......................................... 95
Hình 7.1. Đường cong tăng trưởng của các chủng vi khuẩn tuyển chọn theo
thời gian...................................................................................................................... 100

xiii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AHL

Acyl homoserine lactone

AI-2

Autoinducer 2

ANOVA

Analysis of variance

BHL

Butyryl homoserine lactone

CAI-1

Cholerae autoinducer 1

EM

Effective microorganisms

HAI-1

Harveyi autoinducer 1

HHL

Hexanoyl homoserine lactone

LB

Luria-Bertani

MA

Marine Agar

MBV

Monodon baculovirus

ODHL

Oxo-decanoyl homoserine lactone

PL

Postlarvae

QS

Quorum sensing

TCBS

Thiosulphate citrate bile salt

TSA

Tryptic Soy Agar

TSB

Tryptic Soy Broth

VEM

Vietnamese effective microorganisms

YHV

Yellow-head virus

WSSV

White spot syndrome virus

xiv