Nghiên cứu công nghệ sản xuất chế phẩm nấm sợi ứng dụng trong sản xuất rượu cao độ

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM








BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI CẤP BỘ

NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
NẤM SỢI ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT
RƯỢU CAO ĐỘ


Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THU VÂN











7848

07/4/2010



HÀ NỘI – 2010




1
TÓM TẮT NHIỆM VỤ

Trong quy trình sản xuất rượu cao độ giai đoạn ủ mốc tạo enzim là
quan trọng nhất (giai đoạn nuôi koji). Chúng tôi đã nghiên cứu sản xuất
và sử dụng chế phẩm mốc bào tử thuần chủng để làm giống cho giai đoạn
nuôi Koji. Các yếu tố ảnh hưởng trong quá trình nuôi mốc đến sự hình
thành bào tử hay tạo hệ enzim thủy phân đã được khảo sát.
Điều kiện
thích hợp cho quá trình nuôi tạo bào tử: độ ẩm cơ chất là 40-42%, độ ẩm
không khí là 80-90%, nhiệt độ nuôi 34
o
C trong 5 ngày, tỷ lệ bào tử mốc
giống 0,35g/kg nguyên liệu khô, độ dày khối ủ là 4cm, đảo trộn định kỳ 8
giờ/lần. Chế độ sấy chế phẩm là 45
o
C trong thời gian 36 giờ, khi đó độ
ẩm đạt khoảng 10%. Chế phẩm được bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 12
tháng, lúc đó hoạt độ enzim α-amylaza và glucoamylaza của chế phẩm
đạt khoảng 140 và 200 (UI/g Koji). Các điều kiện thích hợp cho quá trình
nuôi tạo Koji có hoạt lực enzim cao tương tự như điều kiện nuôi mốc tạo

bào tử chỉ khác: nhiệt độ nuôi 37
o
C trong 24 giờ và 32
o
C trong 24 giờ
sau, tỷ lệ bào tử mốc giống 1g/kg nguyên liệu khô. Chúng tôi đã sản xuất
05 mẻ chế phẩm bào tử mốc ở qui mô thực nghiệm, mỗi mẻ 50kg gạo và
thu được 200kg chế phẩm bào tử nấm mốc. Chúng tôi đã ứng dụng chế
phẩm thu được vào giai đoạn nuôi Koji sản xuất rượu cao độ (20 mẻ, mỗi
mẻ 750kg gạo) tại nhà máy rượu Việt Xưa - Công ty Cổ
phần thực phẩm
Delta .














2


CHƯƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Tình hình nghiên cứu trong nước

Tại Việt Nam công nghệ sản xuất rượu cao độ cổ truyền đã có từ
lâu đời. Một hình thức chế phẩm mốc và men giống phổ biến nhất dùng
cho sản xuất rượu chính là bánh men cổ truyền, đây là một phức hệ các
loại vi sinh vật dùng để làm giống gốc trong quá trình ủ cơm và lên men.
Bánh men thường
được sản xuất ở quy mô nhỏ theo kinh nghiệm và các
chủng giống sử dụng làm bánh men thường là các chủng tự nhiên hoạt
lực không cao, quy trình làm thủ công nên rất dễ nhiễm tạp các vi sinh vật
không có lợi. Do vậy chất lượng bánh men thường không đồng đều nên
dẫn tới chất lượng rượu cổ truyền thường không ổn định. Mặc dù đã có
nhiều nghiên cứu được thực hiện để nâng cao chất lượ
ng bánh men, tuy
nhiên tính ổn định của chế phẩm vi sinh vật này cũng chưa được thực sự
cải thiện đáng kể.

Men rượu đóng vai trò quan trọng ảnh hưởng đến chất lượng và
sản lượng rượu. Do vậy trước kia hầu hết các gia đình đều tự làm lấy
bánh men để nấu rượu. Mỗi làng nghề, mỗi gia đình đều có bí quyết làm
bánh men riêng, tạo nên chất lượng, hươ
ng vị rượu khác nhau. Tuy nhiên
trong những năm gần đây, do sự phát triển mạnh mẽ của nhiều dòng rượu
Vodka, rượu pha chế, rượu ngoại nhập khẩu chính thức và không chính
thức, làm giảm nhu cầu tiêu thụ rượu tự nấu, hơn nữa các đại lí chuyên
làm bánh men bán rất rẻ nên các gia đình có xu hướng không tự làm men
rượu mà mua của các đại lí, cơ sở bên ngoài. Theo khảo sát điều tra của
Cục An toàn vệ sinh thực ph
ẩm thì chỉ có 33,7% cơ sở tự làm bánh men,

66,3% mua tại chợ và các đại lí. Đáng lưu ý là các cơ sở bán men rượu
hầu như cũng không tự làm bánh men từ nguyên liệu và bí quyết của địa
phương mà chủ yếu nhập bánh men có nguồn gốc từ các tỉnh phía Bắc
Việt Nam hoặc không rõ nguồn gốc từ Trung Quốc, sau đó sang bao,
đóng gói, gắn nhãn mác để bán. Điều này ảnh hưởng nghiêm trọng đến
chất l
ượng rượu và mất tính đặc trưng “quốc hồn, quốc túy” của mỗi
vùng miền, quốc gia.

Hiện nay ở Việt Nam cũng xuất hiện một số loại sản phẩm giống
dạng bột dùng cho sản xuất rượu có nguồn gốc từ Trung Quốc, tuy nhiên
đây là các sản phẩm nguồn gốc không rõ ràng và chất lượng rượu sản
xuất ra không cao thường gây đau đầu cho người uống.

3

1.1.1. Hệ vi sinh vật trong bánh men
Trong bánh men chứa một phức hệ các vi sinh vật bao gồm: nấm
mốc, giả nấm men, nấm men.
Các loại nấm mốc chủ yếu trong bánh men là Aspergillus, Mucor,
Rhizopus, đó là các loại nấm mốc phổ biến có trong không khí. Các loại
nấm mốc này thường có thành phần và tỷ lệ rất khác nhau tùy thuộc vào
từng loại bánh, từng vùng sản xuất, từng hộ. Các loại nấm mốc
Aspergillus, Mucor, Rhizopus khi phát triể
n trên môi trường với cơ chất
là tinh bột có khả năng sinh tổng hợp enzim amylaza để thủy phân tinh
bột thành đường. Trong đó đáng chú ý nhất là các chủng thuộc giống
Aspergillus, các chủng này có khả năng sinh tổng hợp enzim amylaza
cao, đặc biệt là glucoamylaza.
Các chủng giả nấm men thuộc loài Endomycopsis có vai trò quan

trọng trong bánh men, đặc biệt là các chủng Endomycopsis fibulliger. Khi
phát triển trên môi trường cơ chất là tinh bột Endomycopsis fibulliger có
khả năng sinh tổng hợ
p enzim glucoamylaza cao để thủy phân tinh bột
thành đường glucoza.
Các loại nấm men để giúp quá trình lên men đường thành rượu.
Trong đó đáng chú ý nhất là các loại nấm men thuộc chủng
Saccharomyces cerevisiae, chủng này thường có hoạt lực lên men mạnh.

1.1.2. Công nghệ làm bánh men
Sản xuất bánh men chính là sản xuất hỗn hợp các hệ vi sinh vật cần
thiết cho quá trình sản xuất rượu. Bản chất của bánh men là nuôi cấy và
bảo quản vi sinh vật trên môi trường tinh bột sống
ở trạng thái khô. Sau
quá trình tạo bánh, ủ và sấy tới độ ẩm bảo quản, các vi sinh vật được
chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ. Chúng sẽ hoạt động
nhanh chóng trở lại trong điều kiện môi trường thích hợp (độ ẩm, chất
dinh dưỡng, nhiệt độ), sinh sản, phát triển đồng thời sinh tổng hợp phức
hệ enzim đường hóa.
Nguyên liệu chính để sản xuấ
t bánh men là gạo và các vị thuốc
bắc, nam hoặc các loại lá, củ, quả. Gạo để sản xuất bánh men thuốc bắc
thì được ngâm và nghiền ướt thành bột mịn. Đối với bánh men lá gạo
được nghiền khô thành bột. Gạo để sản xuất bánh men được lựa chọn rất
kỹ, thường là các loại gạo cũ không bị mốc, mọt.
Thuốc bắc hoặc các loại lá, củ, quả được sử dụng với thành phần
và tỷ lệ khác nhau, tùy thuộc vào kinh nghiệm gia truyền của từng làng
nghề. Mỗi bài thuốc khác nhau ảnh hưởng đến hương vị của từng lọa
rượu. Các vị thuốc để sản xuất bánh men thường được nghiền nhỏ để
dùng dần.

4
Người ta thường sử dụng men giống gốc làm giống để gây men.
Men giống gốc là bánh men có chất lượng tốt của mẻ trước để lại, được
nghiền nhỏ trước khi phối trộn làm men.
Để sản xuất bánh men người ta phối trộn tỷ lệ hỗn hợp thuốc bắc
(bánh men thuốc bắc) hoặc các loại lá, củ, quả (bánh men lá), gạo và men
giống theo kinh nghiệm. Sau đó bổ
sung nước để nhào bột tới độ ẩm
khoảng 50-55%, tạo bánh, xếp vào các khay đã đựng sẵn trấu, ủ men đến
khi các bánh men xốp phồng đều, bề mặt có hệ sợi mốc trắng, có mùi
rượu thơm. Sau đó lấy ra hong khô tự nhiên hoặc sấy khô thu được bánh
men cho sản xuất rượu.

1.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Ở Trung Quốc, rượu được chế biến bằng gạo tẻ, gạ
o nếp với các
loại men phối hợp. Rượu mạnh Trung Quốc nổi tiếng về độ trong, thuần,
thơm dễ chịu. Ngày nay nhiều loại rượu truyền thống của Trung Quốc đã
được sản xuất ở qui mô công nghiệp. Việc sản xuất men để làm rượu đã
có từ hàng ngàn năm nay. Từ khi thành lập nước Cộng hòa nhân dân
Trung Hoa, các nhà khoa học đã tập trung nghiên cứu hệ vi sinh vật trong
bánh men, từ
những năm 1950 đã công bố những kết quả về vi sinh vật và
kỹ thuật làm men. Kết quả là nhiều nhà máy đã sử dụng qui trình sản xuất
men công nghiệp.

Hiện nay tại Nhật có khoảng 6 nhà máy chuyên sản xuất chế phẩm
bào tử mốc giống (Tane Koji) và cung cấp cho toàn bộ các nhà máy rượu

trên toàn nước Nhật. Không chỉ rượu mà nhiều sản phẩm khác như nước
chấm, tương… là những sả
n phẩm mà có trải qua giai đoạn nuôi Koji
cũng sử dụng các chế phẩm bào tử dạng bột như vậy (mỗi một sản phẩm
khác nhau sử dụng một loại bào tử của chủng giống riêng biệt). Tại các
công ty sản xuất mốc giống các chủng nấm mốc thuần chủng như
Aspergillus oryzae, Aspergillus niger, Aspergillus kawachii… được nuôi
trên những môi trường đặc hiệu để thu nhận lượng bào tử
lớn và sau đó
được hoàn thiện thành dạng sản phẩm bào tử dạng bột và nhà sản xuất
rượu mua dạng chế phẩm này dùng trực tiếp cho quá trình nuôi Koji trong
sản xuất rượu. Điều này giúp chất lượng rượu sản xuất ra luôn ổn định do
sử dụng các chủng giống công nghiệp, thuần chủng, hoạt lực cao và giúp
cho quy trình công nghệ làm Koji tại các cơ sở sản xuất rượu trở nên đơn
giản, dễ thao tác hơn.



5
Tane Koji theo tiếng Nhật có nghĩa là hạt mốc giống. Nuôi cấy
mốc để sản xuất tương hoặc xì dầu ở các nước phương Đông có từ thời cổ
xưa. Trước đây bào tử nấm mốc có từ thiên nhiên rơi vào trong xôi gạo
và mọc lên mốc làm tương hay làm rượu. Theo phương pháp truyền
thống có từ thời Muromachi (XIII-XV) thì mốc được sản xuất trên gạo
hấp chín theo tỷ lệ
96% gạo, 4% tro của một số lá cây như camellia,
zelkova nuôi cấy ở nhiệt độ 34-36
o
C trong 7 ngày. Loại sản phẩm này
được gọi là Tane Koji.

Năm 1884 J. Takamine (Nhật Bản) đã nuôi cấy Asp. oryzae trên
gạo, sau đó thay gạo bằng cám mì và thu được chế phẩm enzim bằng cách
chiết qua nước rồi kết tủa bằng cồn. Năm 1914 mốc này được dùng rộng
rãi trong sản xuất rượu ở Mỹ theo qui trình công nghệ của Takamine và
được dùng phổ biến trên thế giới để đường hóa các nguồn nguyên liệu
tinh bột trướ
c khi lên men rượu cho đến nay.

1.2.1. Các sản phẩm Tane Koji được sử dụng trong sản xuất rượu
Shochu

Hiện nay ở Nhật có 3 loại Tane Koji được sử dụng rộng rãi trong
công nghiệp sản xuất rượu cao độ Shochu đó là: Tane Koji đen, Tane
Koji trắng và Tane Koji vàng. Các tên gọi này xuất phát từ màu của các
bào tử nấm mốc.

Tane Koji đen được sản xuất từ chủng Aspergillus awamorii,
chủng mốc đen thường được dùng ch
ủ yếu trong sản xuất Shochu truyền
thống ở Nhật Bản do tạo nhiều axit xitric. Tane Koji trắng được sản xuất
từ chủng Aspergillus kawachii, chủng đột biến từ Aspergillus awamorii.
Hiện nay loại mốc trắng này đang rất được ưa chuộng ở Nhật bởi vì
chủng này tạo hương thơm rất đặc trưng. Tane Koji vàng được sản xuất
từ chủng Aspergillus oryzae. Ch
ủng này không sản sinh nhiều axit xitric
trong quá trình nuôi Koji nên thường chỉ dùng khi phối trộn với chủng
mốc đen.

6
1.2.2. Công nghệ sản xuất bào tử nấm mốc (Tane Koji)

Qui trình công nghệ
Gạo

Vo sạch

Nước Ngâm

Để ráo nước

Hấp chín

Làm nguội

Bào tử giống gốc Trộn đều

Đưa vào khay

Vào phòng nuôi

Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

Chế phẩm Tane Koji
Hình 1.1. Sơ đồ nuôi mốc tạo chế
phẩm bào tử
Thuyết minh qui trình công nghệ
A. Xử lý nguyên liệu gạo
Vo gạo: với số lượng gạo nhiều thì sử dụng thiết bị chuyên dụng. Sau khi
vo lượng nước hấp thụ vào gạo khoảng 10%.
Ngâm gạo: mục đích của quá trình ngâm là cho gạo hấp thụ nước để dễ
chín khi hấp. Gạo được ngâm trong nước có nhiệt độ 15-16
o
C, thời gian
từ 12-15 giờ. Sau khi ngâm gạo lượng nước hấp thụ vào gạo khoảng 30%.

7
Đồ gạo: gạo sau khi ngâm nước được làm ráo rồi đưa vào thiết bị hấp,
thường thời gian đồ gạo kéo dài từ 30 đến 50 phút tùy từng loại gạo.
Trong quá trình đồ gạo, gạo hấp thụ thêm 10% nước. Sau khi đồ gạo, tiến
hành cân xác định lại khối lượng gạo đồ. Nếu tỉ lệ khối lượng gạo đồ/khối
lượng gạo ban đầu đạt khoảng 140 -150% là
đạt yêu cầu.
Làm nguội: sau khi đồ gạo được tãi ra làm nguội đến nhiệt độ 37
o
C rồi
trộn bào tử mốc giống.
B. Quá trình nuôi Tane Koji
Sau khi được cấy giống mốc, gạo đồ được chuyển vào các khay
nuôi bằng gỗ, rồi đưa vào phòng nuôi, nhiệt độ phòng giữ khoảng 32
o
C,

độ ẩm không khí trong phòng là 80-90%, thời gian nuôi khoảng 5-6 ngày.
Các khay nuôi được xếp chồng lên nhau cứ 5 khay một và được đặt trên
các giá đỡ. Hàng ngày tiến hành đảo trộn khối ủ và đảo vị trí các khay
nuôi sao cho nhiệt độ giữa các khay đồng đều và đạt nhiệt độ yêu cầu
trong quá trình nuôi.
Điều kiện phòng nuôi: diện tích phòng khoảng 15m
2
/100 kg gạo.
Trong phòng nuôi có hệ thống điều khiển nhiệt độ, độ ẩm và thiết bị
thông khí. Tường bao quanh, trần và mái của phòng nuôi được làm bằng
vật liệu giữ ấm.
1.3. NẤM MỐC
Nấm mốc là tên chung để chỉ các nấm hiển vi có cấu tạo dạng sợi.
Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí
hậu nóng ẩm. Màu sắc của nấ
m mốc được xác định bởi màu các bào tử do
nó sinh ra như: xanh, vàng, trắng, đen, nâu
1.3.1. Đặc điểm cấu tạo [3,4]
Tế bào nấm mốc có các thành phần cơ bản như tế bào nấm nói
chung cũng như tế bào của các vi sinh vật nhân chuẩn khác bao gồm các
phần: thành tế bào, màng tế bào, nhân, không bào, ty thể, mạng lưới nội
chất. Thành tế bào dày khoảng 0,2µm, có cấu tạo khá vững chắc do vừa
có cấu trúc bản mỏ
ng vừa có cấu trúc dạng sợi. Màng tế bào thường tách
khỏi thành tế bào ở một vài chỗ, dày khoảng 7x10
-3
µm, được cấu tạo chủ
yếu bởi lipit và protein.
Chất nguyên sinh là dịch keo trong suốt, không màu, luôn chuyển
động từ phần sợi nấm già sang phần sợi nấm non hoặc từ các sợi nấm

sinh dưỡng đến các sợi nấm làm nhiệm vụ sinh sản.
Nhân tế bào thường có kích thước rất nhỏ, đường kính 2-3 µm,
hình cầu hoặc hình trứng. Số lượng nhân trong tế bào không ổn định.
1.3.2. Đặc điểm sinh học c
ủa nấm mốc [8]
Nấm mốc có dạng hình sợi phân nhánh hoặc không phân nhánh,
cấu tạo đơn bào hoặc đa bào. Sợi nấm có kích thước bề dày đường kính
từ 1-10 µm hoặc 20 µm, chiều dài có khi lên tới vài chục cm. Khi nấm

8
mốc phát triển sẽ tạo thành hệ sợi nấm hay còn gọi là khuẩn ty. Có hai
loại khuẩn ty: khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt môi trường và
khuẩn ti dinh dưỡng ăn sâu vào môi trường đặc (còn gọi là khuẩn ty cơ
chất). Đến giai đoạn trưởng thành từ các khuẩn ty khí sinh sẽ hình thành
các cơ quan sinh sản gọi là bào tử. Một số loại nấm mốc đơn bào bậc thấp
như lớp Phycomycetes
, trong đó điển hình là Mucor, Rizopus, khuẩn ty
thường không có vách ngăn, toàn bộ khuẩn ty được coi là một tế bào
phân nhánh, đa nhân. Các khuẩn ty có vách ngăn thì tạo nên cơ thể đa bào
như Penicillium, Aspergillus.
Nấm mốc không có diệp lục tố, do đó không có khả năng tiến hành
quang hợp như các loại cây xanh. Chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các
thức ăn hữu cơ có sẵn qua bề mặt của khu
ẩn ty, đó là các cơ thể kí sinh
hoặc hoại sinh.
1.3.3. Nấm mốc dùng trong sản xuất các loại thực phẩm cổ truyền [7]
Nấm mốc dùng để đường hóa các nguồn nguyên liệu tinh bột trong
sản xuất rượu là Asp. oryzae, Asp. flavus, Asp. usami, Asp. awamorii
Mốc Aspergillus đã được dùng phổ biến trong sản xuất tương, nước
chấm ở các nước phương Đông từ lâu đời. Giống mốc này có hệ khuẩn ty

(hệ sợi) không màu hoặc vàng nhạt. Khuẩn ty phân nhánh có nhiều vách
ngăn tế bào. Tế bào có hạch nhân. Cuống đính bào tử không phân nhánh
dài và thẳng, đầu phình to thành chóp, nang hình cầu, hình bán cầu hoặc
hình chùy xung quanh đầu có nhiều cuống nhỏ. Tùy loài có cuống nhỏ
1 tầng hoặc 2 tầng. Tất cả cuống nhỏ có hình chai và gọi là tế bào hình
chai, khi trưởng thành sinh ra các đính bào tử ở đầu cuống. Các đính bào
tử xếp thành chuỗi dài và càng tận cùng càng lớn dần. Những chu
ỗi đính
bào tử xếp đối xứng tỏa tròn trên chóp nang. Đính bào tử điển hình
thường hình cầu, đơn bào, đa hạch, bề mặt xù xì. Do cuống sinh bào tử và
đính bào tử có màu sắc, nên màu của chúng trở thành màu của khuẩn lạc
mốc. Các khuẩn lạc của mốc Aspergillus thường là: vàng, vàng lục, đen,
tro, nâu vv
Aspergillus oryzae còn gọi là mốc vàng. Đầu tiên có màu vàng lục
sau có mầu nâu thẫm. Chiều cao của cuống sinh bào tử 1-2 mm. M
ốc này
sinh ra các enzim amylaza, invectaza, maltaza, proteaza và catalaza. Mốc
phát triển trong khoảng nhiệt độ 15-40
o
C, tối thích 30-32
o
C. Trong giống
này có nhiều chủng được dùng trong sản xuất rượu, sản xuất nước chấm.
Aspergillus flavus cũng gọi là mốc vàng rất giống Aspergillus
oryzae, chỉ khác là kích thước nhỏ hơn, các tầng cuống hình trùy mang
đính bào tử và khuẩn lạc có màu trội về xanh lục hơn. Lúc đầu khuẩn lạc
mốc có màu vàng sáng, sau chuyển thành màu nâu ôliu. Chiều cao của
cuống sinh bào tử là 0,4-1 mm. Mốc này sinh ra các hệ enzim giống
Aspergillus oryzae, đặc biệt là proteaza rất ho
ạt động và chế phẩm tinh

9
khiết của enzim này được dùng làm tác nhân ổn định bia. ở một số môi
trường có chất béo (trên lạc) mốc này có thể sinh ra độc tố aflatoxin.
Aspergillus niger thường gọi là mốc đen. Sợi mốc màu trắng nhưng
đính bào tử màu đen. Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2-4 nhánh cuống nhỏ
rồi mới tiếp đến các đính bào tử. Mốc sinh ra enzim amylaza, invectaza,
maltaza, proteaza, pectinaza, glucozooxydaza. Mốc này được dùng trong
sản xuất rượu, sả
n xuất axit xitric, axit fumaric. Proteaza do mốc này hoạt
động ở pH 2,5-3,5, còn proteaza của Aspergillus oryzae không hoạt động
ở vùng pH này.
Aspergillus niger có hoạt tính amylaza đường hóa khác nhau ở những
chủng khác nhau. Một số chủng được sử dụng để đường hóa tinh bột
trong sản xuất rượu hoặc xiro glucoza. Mốc này có thể chịu được pH
thấp, nhiệt độ thích hợp là 30-35
o
C và dễ phát triển trên môi trường tinh
bột.
Aspergillus awamorii và Aspergillus usami gần với Aspergillus
niger có khả năng sinh ra nhiều dextrinaza và glucoamylaza, còn amylaza
sinh ra ít hoặc trung bình. Mốc này được dùng nhiều trong công nghiệp
rượu để đường hóa tinh bột.
Aspergillus kawachii là loại nấm mốc trắng được sử dụng rộng rãi
để nuôi Koji trong sản xuất rượu Shochu của Nhật Bản. Mốc này tạo ra
axit xitric và các enzim thủy phân như α-amylaza và glucoamylaza rất
cần thiết cho quá trình đường hóa.
1.3.4. Dinh dưỡng của nấm mốc [3,4]
Nấm là những sinh vật dinh dưỡng hóa năng hữu cơ, chúng chỉ có
khả năng thu nhận năng lượng từ môi trường bên ngoài nhờ quá trình oxy

hóa hiếu khí hoặc quá trình lên men kị khí các chất hữu cơ ngoại bào.
Kiểu dinh dưỡng cacbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng cacbon
dị dưỡng. Nấm mốc là những loài hiếu khí hoàn toàn và có kiểu cacbon dị
dưỡng thuộc loại hoại sinh, có ngh
ĩa là có khả năng phân giải xác sinh
vật, sử dụng các chất hữu cơ để làm chất dinh dưỡng.
1.3.4.1. Nguồn thức ăn cacbon
Nấm mốc có thể sử dụng nguồn thức ăn cacbon khác nhau và
không có những đòi hỏi nghiêm ngặt đối với một loại thức ăn cacbon.
Nhiều loài nấm mốc còn có khả năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất
bền vữ
ng hoặc rất độc đối với nhiều sinh vật khác (các hợp chất n-alcal,
ancaloid, phenol, nhiều chất kháng sinh ). Đối với nguồn thức ăn hữu cơ
phức tạp như: xilan, tinh bột, xenlulo, kitin trước hết nấm mốc phải sinh
ra các enzim để phân huỷ các hợp chất này thành các hợp chất đơn phân
tử sau đó mới đồng hoá được chúng.



10
1.3.4.2. Nguồn thức ăn Nitơ
Các loài nấm mốc khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với
nguồn thức ăn nitơ. Nấm mốc thường có khả năng sử dụng cả nguồn nitơ
vô cơ và hữu cơ.
Nhiều loài nấm mốc có khả năng đồng hoá cả muối amôn và
nitơrat. Nhiều loài thuộc chi Fusarium có khả năng đồng hoá nitơ trong
khí NH
3
. Nhiều loài nấm mốc thuộc chi Aspergillus flavus, Trichoderma
nignorum, có khả năng đồng hoá trực tiếp nitơ phân tử.

Ngoài các nguồn nitơ vô cơ, nhiều loài nấm mốc có thể sử dụng
nguồn nitơ hữu cơ (protein, pepton, peptit, axit amin vv ).

1.3.4.3. Các nguyên tố khoáng
Bằng các phương pháp phân tích quang phổ, người ta đã xác định
được tất cả các chất khoáng có trong tế bào nấm mốc. Về các nguyên tố
đại lượng, có thể kể đến: S, P, K, Ca, Mg, Fe, chúng thườ
ng chiếm từ vài
phần nghìn đến vài phần trăm trọng lượng khô. Các nguyên tố vi lượng
có Mn, Mo, Zn, Cu, Co, Ni, B.
Hàm lượng các nguyên tố khoáng trong tế bào nấm mốc không
những thay đổi tuỳ thuộc và điều kiện nuôi cấy, thành phần môi trường,
thời gian nuôi cấy.

1.3.5. Độc tố nấm [14]
Trong số hơn 10.000 loài nấm được biết đến, có khoảng 50 loài
nấm mốc gây hại cho người và vật nuôi vì chúng sản sinh ra độc tố, ng
ười
ta thường gọi tên chúng là độc tố nấm (mycotoxin). Độc tố nấm là những
sản phẩm trao đổi thứ cấp của nấm mốc như Aspergillus, Furasium,
Penicillium. Những loài nấm mốc này có thể phát triển trong lúc canh tác,
lúc thu hoạch, lúc dự trữ, lúc sản xuất chế biến thức ăn khi gặp điều kiện
thuận lợi. Theo số liệu của Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO) thì
khoảng 25% tổng số lượng ngũ cốc nhiễm mycotoxin.
Độc tố nấm mốc ở mỗi nơi là khác nhau do điều kiện khí hậu của
từng khu vực. Chẳng hạn Aflatoxin thì thường được tìm thấy ở khu vực
nhiệt đới, trong khi Zearalenon thường được tìm thấy ở xứ ôn đới.
Mycotoxin không những hiện diện trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt mà
còn chuyển qua thịt, sữa, trứ
ng và các sản phẩm từ nuôi trồng thuỷ sản

như tôm, cá. Thiệt hại kinh tế do mycotoxin gây ra có thể lên đến hàng
triệu USD mỗi năm và ảnh hưởng nhiều nhất cho các nhà chăn nuôi, sản
xuất thực phẩm và thức ăn gia súc.




11
Bảng 1.1. Các dấu hiệu do nhiễm độc tố nấm
Mycotoxin Triệu chứng
- T-2 và Diacetoxycripenol - Lở loét miệng, mất tính ngon
miệng, da và ruột bị bong tróc,
sưng tấy
- Zearaleuone - Rối loạn sinh sản
- Vomitoxin - Chán ăn, da bị nhiễm nấm
- Fumoni và Momlifosumin - Rối loạn thần kinh, gan bị hư nát
- Aflatoxin - Gan bị nhiễm độc, suy yếu hệ
thống miễn nhiễm
- Dehratoxin và Citrinin - Thận nhiễm độc, bệnh Gout

Aflatoxin là độc tố nấm đáng sợ nhất. Có nhiều chủng nấm tiết ra
độc tố này, nhưng Aspergillus flavus là loài nấm mốc sản sinh ra lượng
aflatoxin lớn nhất, nguy hiểm nhất. Hiện có 4 loại aflatoxin đã được xác
định là B1, B2, G1, G2 (phân biệt ký tự “B” và “G” theo màu huỳnh
quang xanh da trời và xanh lá cây khi chiếu tia cực tím lên bản tách các
vết sắc ký lớp mỏng aflatoxin). Trong đó aflatoxin B1, G1 là hai chất có
tính độc nhất và được nghiên cứu khá kỹ.
Ngoài việc gây ngộ
độc cấp tính (liều gây chết người khoảng
10mg), độc tố aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung

thư. Người ta đã biết aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan
mạnh nhất, tác động qua đường miệng. Nếu hấp thu một tổng lượng
2,5mg aflatoxin trong thời gian 89 ngày có thể dẫn đến ung gan hơn 1
năm sau. Vụ dịch năm 1960 ở miền Nam và Đông nước Anh khi 10 vạn
gà tây từ 4-6 tuần tuổi ăn phải lạ
c mốc bị chết đã làm mọi người sửng sốt.
Các con vật bị chết sau 1 tuần khi thấy xuất hiện triệu chứng đầu tiên:
biếng ăn, sã cánh, lù dù rõ rệt. Mổ gà chết đều thấy mô gan bị phá hủy và
có sự tăng tế bào biểu mô của ống dẫn mật. Độc tố aflatoxin rất bền với
nhiệt, khi đem lạc mốc rang lên, mặc dù nhiệt độ rất cao, các bào t
ử của
nấm mốc bị tiêu diệt, nhưng độc tố của chúng vẫn không bị phá huỷ hoàn
toàn.
Người ta đã phân lập được nhiều loài mốc khác nhau trên gạo,
nhưng có 2 chủng hay gặp nhất là Aspergillus và Penicillium. Rất nhiều
loài mốc được phát hiện trên gạo có tính độc, thuộc các chủng
Penicillium khác nhau và tạo nên các màu nâu, vàng Nguy hiểm hơn cả
là chủng nấm mốc Penicillium islandicum tạo nên màu “gạo vàng Thái
Lan”. Đ
ây là chủng mốc được xem là nguyên nhân chủ yếu gây mốc gạo
trong kho.
Để phát triển, nấm mốc cần phải có môi trường phù hợp, đó là độ
ẩm cao và nhiệt độ nóng ấm thích hợp. Aspergillus flavus chủ yếu xâm

12
nhập được khi hạt lạc chứa 15-20% hàm lượng nước, nếu hàm lượng
nước dưới 9% thì nó không thể phát triển được. Vì vậy cách chống mốc
tốt nhất là phơi khô, loại hết những hạt giập vµ, nhăn nheo hoặc nghi mốc
để tránh bào tử mốc nhanh chóng lan sang các hạt lạc bình thường khác.
1.3.6. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi mốc [3, 4, 5, 8]

1.3.6.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Nhiệt độ đóng vai trò chủ yếu trong quá trình sinh trưởng của sợi
nấm, nó cũng tác động đến việc sản sinh bào tử và sự nảy mầm của
chúng. Mỗi loài nấm mốc có khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển
nhất định. Phần lớn nấm mốc phát triển trong khoảng 15-32
o
C và sinh
trưởng tốt nhất ở khoảng 25-30
o
C. Một số ít loài nấm mốc có thể sinh
trưởng ở cả các kho lạnh đến -6
o
C, thậm chí -20
o
C như Cladosporium
herbarum, một số loài thuộc chi Penicilium. Ngược lại, loài Asp. flavus
vẫn phát triển tốt ở 35
o
C. Một số ít loài khác có nhiệt độ tăng trưởng đến
50
o
C. Căn cứ vào nhiệt độ tăng trưởng, các loài nấm mốc được chia thành
5 nhóm: nhóm ưa nóng, nhóm chịu nóng, nhóm ưa nhiệt trung bình,
nhóm chịu lạnh, nhóm ưa lạnh. Nhiệt độ tối thích cho đa số các chủng
nấm mốc là 28-32
o
C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 24
o
C hay trên 45
o

C nấm
mốc sẽ phát triển chậm.
1.3.6.2. Ảnh hưởng của độ ẩm
Mọi quá trình trao đổi chất của tế bào vi sinh vật đều xảy ra trong
môi trường nước. Tuy nhiên nhu cầu về nước đối với từng loài, từng
chủng và thời kỳ phát triển khác nhau có khác nhau. Trong những nhân tố
tác động vào sự phát triển của nấm mốc, độ ẩm có vai trò rất lớn. Độ ẩm
của môi trườ
ng cũng như độ ẩm tương đối của không khí là yếu tố quan
trọng quyết định sự sinh trưởng của hệ sợi nấm và sự sản sinh bào tử.
1.3.6.3. Ảnh hưởng của độ thoáng khí
Nấm mốc hoàn toàn hiếu khí và chỉ phát triển được trong điều kiện
thoáng khí. Các loài như Mucor và Trichoderma là những loài cần nhiều
oxy. Một lượng nhỏ khí cacbon là cần thiết cho bào tử Aspergillus nả
y
mầm nhưng nếu nồng độ này quá cao lại ức chế sự phát triển của chúng.
Khi nuôi cấy nấm mốc bằng phương pháp bề mặt cần chú ý tới độ dày
khối môi trường để đảm bảo độ thoáng khí cần thiết cho sự phát triển của
nấm mốc.
1.3.6.4. Ảnh hưởng của pH môi trường
pH của môi trường cũng ảnh hưởng đến sự phát triển của n
ấm mốc.
Phần nhiều nấm mốc phát triển trong phạm vi pH từ 4-8 nhưng một số
nấm mốc có khả năng chịu được những cơ chất có pH axit hơn hoặc kiềm
hơn. Tuy nhiên khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi trường ít
làm ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm mốc vì
môi trường rắn có tính đệm cao.

13
1.4. Phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu chế phẩm enzim

Để thu chế phẩm enzim từ nấm mốc, ta có thể dùng một trong hai
phương pháp nuôi cấy: nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy chìm.
1.4.1. Phương pháp nuôi cấy bề mặt
Nuôi cấy nấm mốc theo phương pháp bề mặt để sản xuất enzim
thường dùng môi trường rắn. Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự
nhiên: gạo, ngô mảnh, đậu tương Nấm mố
c phát triển và bao phủ trên
bề mặt các hạt chất dinh dưỡng rắn đã được làm ẩm. Nấm mốc sử dụng
những chất dinh dưỡng trong môi trường và oxy phân tử của không khí
để hô hấp, tạo hệ sợi nấm nhanh chóng và đồng bộ, sự tổng hợp enzim sẽ
được hoàn thành sau khoảng 36 đến 48 giờ, có khi lâu hơn tùy thuộc vào
chủng giống.
Trước khi gieo vi sinh vật, môi trường rắn cần được làm ẩm t
ới 58-
60%. Độ ẩm 58-60% là độ ẩm tương đối thích hợp với nhiều mốc nuôi bề
mặt với khay hở. Trong quá trình nuôi cấy nên giữ môi trường ở độ ẩm
khoảng 50-60%. Muốn vậy, độ ẩm không khí trong phòng nuôi cần
khoảng 95-100%.
Nhiệt độ thích hợp với đa số các chủng mốc là 30-32
o
C. Nếu nhiệt
độ xuống dưới 24
o
C và trên 45
o
C, nấm mốc phát triển chậm, sinh bào tử
yếu, thời gian nuôi cấy dài và đưa đến làm giảm khả năng sinh tổng hợp
enzim. Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36-60 giờ. Nhiều chủng
Aspergillus tạo thành enzim cao nhất ở giai đoạn nấm mốc bắt đầu sinh
bào tử. Một số trường hợp khác enzim được tích tụ vào lúc mốc sinh

nhiều bào tử.
1.4.2. Phương pháp nuôi cấy chìm
Môi trường nuôi cấy vi sinh v
ật theo phương pháp này thường là
môi trường lỏng. Thành phần dinh dưỡng của môi trường lỏng sẽ khác
nhau với mỗi loại vi sinh vật khác nhau và thường chứa tinh bột, các dạng
tinh bột và một số vật liệu khác làm nguồn carbon. Nguồn nitơ được cung
cấp bởi nước chiết ngô, nước chiết malt, dịch nấm men tự phân. Thành
phần khoáng của môi trường có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo ra các
enzim mong muốn.
Dịch dinh dưỡng
được cho vào thùng lên men. Sau đó đưa trực tiếp
hơi nước nóng vào thanh trùng ở nhiệt độ 118-125
o
C trong 45-60 phút.
Hạ nhiệt độ và bổ sung vi sinh vật, nuôi 2-4 ngày. Quá trình nuôi được
thực hiện trong điều kiện sục khí liên tục và vô trùng tuyệt đối. Nuôi cấy
chìm thường tạo nhiều bọt, nên có thể sử dụng một số chất hoạt động bề
mặt để phá bọt như tween 20, axit oleic
Ở phương pháp nuôi chìm, sự tiết các enzim vào môi trường xảy ra
trong suốt quá trình phát triển.

14
Đa số enzim thủy phân của nấm mốc là những enzim ngoại bào,
tuy được tổng hợp nên ở trong tế bào, sau đó mới tiết ra ngoài môi
trường. Do đó khi kết thúc quá trình nuôi có thể lọc, loại bỏ sinh khối, thu
lấy dịch enzim. Tuy nhiên có một số enzim nội bào (enzim liên kết với
các bào quan bên trong tế bào). Muốn thu được enzim cần phải phá vỡ tế
bào để tách enzim ra khỏi phần sinh khối tế bào.
1.4.3. So sánh hai phương pháp nuôi cấy bề mặ

t và nuôi cấy chìm
Trong sản xuất rượu, phương pháp nuôi cấy bề mặt để thu nhận
enzim có nhiều ưu điểm hơn phương pháp nuôi cấy chìm vì những lý do
sau:
- Nồng độ enzim tạo thành trong canh trường khi nuôi cấy bằng phương
pháp bề mặt lớn hơn rất nhiều so với phương pháp nuôi cấy chìm.
- Phương pháp nuôi cấy chìm tốn nhiều điện năng do phải sục khí liên
tục.
- Đối với ph
ương pháp nuôi cấy chìm, khi không đảm bảo được vô trùng
nghiêm ngặt thì dễ xảy ra sự nhiễm toàn bộ khối môi trường. Ở phương
pháp nuôi cấy bề mặt, canh trường sau khi sấy khô vận chuyển dễ dàng,
tránh được nhiễm trùng toàn bộ khối canh trường và ít tốn điện năng.
Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy bề mặt có tính gián đoạn và
chiếm nhiều diện tích nuôi cấy.
1.5. Giới thiệu công nghệ sản xuất Koji
Koji là h
ệ chế phẩm enzim đường hoá được tạo thành khi nuôi nấm
mốc trên môi trường nguyên liệu đã hấp chín. Tuỳ vào nguồn nguyên liệu
nuôi mốc mà sẽ có tên gọi khác nhau: Koji- đại mạch, Koji-gạo, Koji-
khoai lang…
1.5.1. Biến đổi sinh hoá, sinh lí trong quá trình nuôi nấm mốc tạo
Koji
Ban đầu nấm mốc sẽ hấp thụ các thành phần dinh dưỡng dễ hấp thụ
có sẵn trong môi trường như: đường glucoza, saccharoza, axitamin và
khoáng để sinh trưởng. Trong quá trình trao đổi chất nấm m
ốc sinh tổng
hợp tạo nên các enzim thuỷ phân và axit xitric. Axit xitric được tích tụ
bên trong cơ thể nấm và sau đó được chuyển ra ngoài môi trường. Các
enzim thuỷ phân glucoamylaza, α-amylaza, proteaza tạo ra sẽ được hoạt

động, chúng phân cắt các mối liên kết glucozit và peptit trong chuỗi mạch
amyloza, amylopectin, polypeptit của tinh bột và protein để tạo thành các
chất có phân tử lượng thấp. Một phần chúng được nấm mốc sử dụng,
phần còn lại sẽ được làm nguyên liệu cho nấm men sử
dụng và cơ chất
của quá trình lên men sau này. Quá trình cứ lập đi lặp lại cho đến khi
dừng quá trình nuôi, sản phẩm thu được gọi là Koji.


15



















1.5.2.Qui trình nuôi Koji

Qui trình công nghệ

Gạo

Vo sạch

Nước Ngâm

Để ráo nước

Hấp chín

Làm nguội

Chế phẩm bào tử mốc Trộn đều

16

Đưa vào khay

Vào phòng nuôi

Nuôi cấy ở điều kiện thích hợp

Chế phẩm Koji

Hình 1.2. Sơ đồ nuôi Koji theo công nghệ Nhật Bản [8]

1.5.3. Thuyết minh qui trình công nghệ

A. Xử lí nguyên liệu gạo

- Vo gạo: với số lượng gạo lớn phải sử dụng thiết bị chuyên dụng. Sau khi
vo, lượng nước hấp thụ vào gạo khoảng 10%.

- Ngâm gạ
o: quá trình ngâm gạo sẽ cung cấp một lượng nước cần thiết
cho quá trình hồ hoá của tinh bột diễn ra khi hấp gạo. Gạo được ngâm
trong nước sạch qua đêm. Sau khi ngâm, lượng nước hấp thụ vào gạo
khoảng 30%.

- Hấp gạo: gạo sau khi ngâm được làm ráo rồi đưa vào thiết bị hấp,
thường thời gian hấp kéo dài từ 30 đến 50 phút. Trong quá trình hấp gạo,
gạo hấp thụ thêm 10% nướ
c. Nếu tỉ lệ khối lượng cơm/khối lượng gạo
ban đầu đạt 140% là đạt yêu cầu.

- Làm nguội: cơm được tãi ra làm nguội đến nhiệt độ 40
0
C rồi trộn chế
phẩm bào tử mốc.


17
B. Quá trình nuôi Koji

Mục đích của quá trình nuôi Koji là thu được chế phẩm Koji có hoạt
độ enzim glucoamylaza, α-amylaza ở mức độ cực đại.
Sau khi gạo được ngâm và hấp chín, khống chế nhiệt độ và độ ẩm
của cơm đồng đều, rải đều mốc giống lên khối gạo đồ đảm bảo mật độ
bào tử mốc đồng đều trong toàn khối. Độ dày của lớp nuôi là 6cm, nuôi
ở
nhiệt độ 36
o
C. Khi nhiệt độ tăng thêm 4-5
o
C, đảo trộn đều để giúp nhiệt
độ của khối ủ được đồng đều. Sau 20 giờ nuôi cấy, nhiệt độ khối ủ tăng
và đạt tới 41-42
o
C, hệ sợi nấm màu trắng xuất hiện trên bề mặt của gạo.
Sau 8 giờ tiếp theo, nhiệt độ duy trì ở 40-42
o
C, hệ sợi nấm phát triển
nhiều hơn, đây cũng là giai đoạn tạo axít. Ở giai đoạn này phải dàn mỏng
lớp Koji (dày khoảng 2cm). Giảm dần nhiệt độ của khối Koji xuống
33
o
C. Sau 40 giờ nuôi cấy, Koji phát triển rất tốt, có vị axít rất rõ. Đây là
thời điểm kết thúc giai đoạn nuôi Koji.


1.6. Nguyên liệu sử dụng cho sản xuất chế phẩm bào tử mốc và Koji
Gạo là nguyên liệu chính để sản xuất chế phẩm bào tử mốc và
Koji, có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng của sợi nấm cũng như việc sản
sinh bào tử. Gạo là loại nông s

ản sẵn có ở Việt Nam. Các số liệu thống kê
về sản lượng lúa trong cả nước được trình bày ở bảng 1.2
Bảng 1.2. Sản lượng lúa cả nước (nghìn tấn) [6]

Sản lượng

Năm
Lúa đông
xuân
Lúa hè thu Lúa mùa Tổng số
2000 15571,2 8625,4 8333,3 32529,5
2001 15474,4 8328,4 8305,6 32108,4
2002 16719,6 9199,7 8538,9 34447,2
2003 16822,7 9400,8 8345,3 34568,8
2004 17078,0 10430,9 8640,0 36148,9
2005 17331,7 10415,1 8044,0 35790,8

Thành phần của gạo
Thành phần chính của gạo gồm: tinh bột, protein, chất béo, các
vitamin, các chất khoáng Tỷ lệ các thành phần đó phụ thuộc vào rất

18
nhiều yếu tố như: thổ nhưỡng, khí hậu, giống lúa, kỹ thuật canh tác, mùa
vụ, ngoài ra còn phụ thuộc vào kỹ thuật chế biến và bảo quản.
Tinh bột
Đánh giá chất lượng gạo người ta chú trọng đến tỷ lệ giữa amyloza
và amylopectin có trong tinh bột, tỷ lệ này ở mỗi loại gạo rất khác nhau.
Trong tinh bột gạo tẻ hàm lượng amyloza vào khoảng 18-26%, trong tinh
bột gạo nếp h
ầu như chỉ có amylopectin

Bảng 1.3. Hàm lượng amyloza của một số loại gạo [13]

Hàm lượng amyloza
TT Loại gạo Protein
(% chất
khô)
(% chất
khô)
Phân loại
Mức độ
gelatin
hóa
1 Nếp cái hoa
vàng
9,03 3,55 Thấp Trung
bình
2 Nàng Hương 8,12 20,82 Trung bình Trung
bình
3 CR-203 8,34 26,15 Cao Trung
bình
4 C-70 7,62 27,38 Cao Trung
bình
5 C-71 7,68 25,41 Hơi cao Thấp
6 X-21 7,62 20,62 Trung bình Thấp
7 Bao Thai Hồng 8,19 24,36 Trung bình Thấp
8 Mộc Tuyền 8,37 28,26 Cao Thấp
9 DT-10 10,12 25,74 Hơi cao Thấp
10 Q-5 7,5 26,96 Cao Thấp
11 Khang Dân 6,93 26,66 Cao Thấp
12 Tạp Giao 1 8,92 19,9 Thấp Trung

bình
13 Tạp Giao 4 10,23 18,9 Thấp Trung
bình
14 IR-64 11,17 21,57 Trung bình Cao
15 IR-62030 8,04 24,15 Trung bình Thấp
16 OM-269 8,7 24,9 Trung bình Thấp

Protein

Mỗi một loại gạo, hay cùng một loại gạo ở các vùng khí hậu, thổ
nhưỡng khác nhau, có tỷ lệ và thành phần protein khác nhau. Nhưng chủ
yếu là orezinin thuộc nhóm glutelin, ngoài ra còn có globulin, locozin và

19
prolamin. So với một số loại ngũ cốc khác như lúa mỳ, lúa mạch thì
thành phần protein trong gạo thấp, nhưng trong cấu trúc protein lại chứa
đủ các loại axit amin không thay thế.




Bảng 1.4. Hàm lượng các axit amin không thay thế của gạo [13]

TT Axít amin Gạo nếp
(g/100g)
Gạo tẻ (g/100g)
1 Treonin 0,22 0,27
2 Arginin 0,57 0,55
3 Lyzin 0,34 0,29
4 Metionin 0,15 0,11

5 Tryptophan 0,08 0,08
6 Phenylalanin 0,51 0,39
7 Lơxin 0,53 0,62
8 Valin 0,44 0,47
9 Izolơxin 0,34 0,38
10 Histidin 0,19 0,11

Chất béo
Các chất béo trong hạt gạo chỉ tập trung ở lớp ngoài (vỏ cám) và
phôi hạt. Chủ yếu là các axit béo chưa no như: axit oleic chiếm tới 42,4%,
axit linoleic chiếm tới 30%, axit panmatic chiếm tới 15,5% thành phần
chất béo của hạt gạo.

Vitamin
Gạo chứa nhiều loại vitamin: B1, B2, PP, E, D trong đó vitamin
B1 chiếm một hàm lượng lớn. Gạo lật B1 chiếm 0,5 mg%, gạo xát B1
chiếm 0,2 mg%. Các vitamin chủ yếu tập trung ở lớp vỏ al
ơron và ở phôi
của hạt.

Các chất khoáng
Gạo chứa một hàm lượng đáng kể các chất khoáng: Ca, Mg, Fe,
Zn Tùy từng loại gạo, thời vụ, vùng địa lý mà tỷ lệ, thành phần các chất
khoáng trong gạo khác nhau.




20

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM

2.1. PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH NGHIÊN CỨU

2.1.1. Phương pháp phân tích hóa lý và hóa sinh
- Xác định độ ẩm theo phương pháp sấy đến 105
o
C trong 3 giờ đến
trọng lượng không đổi.

- Xác định hoạt độ enzim glucoamylaza theo TCVN-7289
Nguyên tắc: phương pháp dựa trên cơ sở thủy phân tinh bột bởi enzim
glucoamylaza có trong mẫu cần phân tích, sản phẩm tạo thành là đường
glucoza. Xác định cường độ màu tạo thành giữa glucoza và dung dịch
DNS.
Hoạt độ glucoamylaza là số micromol glucoza tạo thành khi dùng
1g chế phẩm enzim tác dụng lên tinh bột tan ở điều kiện pH=4,7; nhiệt độ
55
o
C trong thời gian 30 phút.
Công thức tính:
A
1
: cường độ màu của mẫu thí nghiệm

A
2
: cường độ màu của mẫu đối chứng
Dựa vào ∆A=A
1
-A
2
và đường chuẩn xác định được lượng đường glucoza
do glucoamylaza thủy phân tinh bột tạo ra là a (mg).
HđG =
xb
xa
x
V
V
180
1000
2
1
(UI/g Koji)
a: lượng glucoza tạo thành (mg)
b: lượng chế phẩm có trong 1ml dịch enzim phân tích (g)
180: phân tử lượng của đường glucoza (g)
V1: số ml dịch enzim sử dụng
V2: tổng số ml dịch đem đo
1000: hệ số chuyển đổi mg → µg

- Xác định hoạt độ enzim α-amylaza theo AOK-25
Nguyên tắc: đo cường độ màu tạo thành giữa phản ứng của tinh bột và
enzim α-amylaza có trong mẫu cần phân tích với Iod là chất hiện màu.

21
Hoạt độ enzim α-amylaza là số gam tinh bột tan được chuyển hóa
thành các dextrin có phân tử lượng khác nhau khi sử dụng 1g chế phẩm
enzim ở 40
o
C trong thời gian 30 phút.
Chuẩn bị hoá chất và cách thu dịch chiết enzim:
Dung dịch đệm axetat pH 5 :
Dung dịch A (CH
3
COOH 0,2M): cân 11,55 g axetic axit hoà tan trong 1
lít nước cất.
Dung dịch B (CH
3
COONa 0,2M): cân 27,21 g CH
3
COONa.3H
2
O hoà tan
trong nước cất rồi định mức đến 1000 ml.
Sau khi chuẩn bị xong dung dịch A và B, lấy 5,9 ml dung dịch A
trộn với 14,1 ml dung dịch B rồi điều chỉnh pH 5 bằng dung dịch A hoặc
dung dịch B.
Dung dịch tinh bột 1% : cân 1g tinh bột tan, hoà tan bằng một ít nước cất
(đun nóng trên bếp đến khi dung dịch trong suốt), thêm 20 ml dung dịch
đệm pH 5 đã chuẩn bị ở trên rồi định mức đến 100 ml bằng nước cất.
Dung dịch Iod phân tích: cân 0,0317g I
2
+ 0,1g KI, thêm 50ml HCl 10%.

Hoà tan rồi định mức đến 1000 ml bằng nước cất.
Dung dịch NaCl 0,5%: cân 5g NaCl hoà tan với nước cất rồi định mức tới
1000 ml bằng nước cất.
Thu dịch chiết enzim: cân 10g chế phẩm Koji và cho vào 100 ml dung
dịch NaCl 0,5% . Đưa hỗn hợp vào máy lắc trong thời gian 3 giờ, sau đó
lọc và thu được dịch chiết enzim.
Cách tiến hành:
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 2ml tinh bột 1%. Bổ sung vào ống
nghiệm 1 – mẫu đối ch
ứng 0,1 ml nước cất. Bổ sung vào ống nghiệm 2 –
mẫu thí nghiệm 0,1 ml dịch chiết enzim. Tiến hành lắc đều hai ống và để
ổn định trong máy ổn nhiệt ở 40
0
C trong 30 phút.
Lấy từ 2 ống nghiệm trên mỗi ống 0,05 ml hỗn hợp và cho vào 2
ống nghiệm đã có sẵn 5 ml dung dịch Iod phân tích, đem lắc đều và đi đo
màu. Cường độ màu được đo ở bước sóng λ = 670 nm so với mẫu nước
cất.
Công thức tính:
HđA =
10
100
75,12 xx
t
TT
to
−
(UI/g Koji)

t

T : mật độ đo quang của mẫu thí nghiệm
o
T : mật độ đo quang của mẫu đối chứng

22
t: thời gian phản ứng (phút)
12,75: hệ số thực nghiệm

10
100
hệ số pha loãng (tỷ lệ trích ly enzim)

- Xác định nồng độ cồn nhờ máy đo cồn Dujadin – Salleror


2.1.2. Phương pháp vi sinh
- Xác định số lượng bào tử sống trên môi trường PDA
- Xác định số lượng bào tử nảy chồi trên môi trường thạch có 1% tinh bột

2.2. THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ HOÁ CHẤT SỬ DỤNG
CHO NGHIÊN CỨU

2.2.1. Nguyên liệu
- Gạo: Nếp Thái Bình mua tại Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam
- Chủng nấm mốc:
Aspergillus awamorii do chuyên gia JICA cung cấp

2.2.2. Các loại hoá chất
Các loại hóa chất tinh khiết của hãng Merck (Đức), BDH (Anh)

2.2.3. Thiết bị nghiên cứu
- Tủ cấy vô trùng Biolock Scientific – Pháp
- Cân phân tích độ chính xác 0,0001g Presisa 62A – Thụy Điển
- Cân điện tử độ chính xác 0,1g Ohaus CT1200 – Mỹ
- Máy ly tâm Universal 12A - Đức
- Máy khuấy Kika RW16 - Đức
- Máy đo quang Cecil CE 1021 – Anh
- Tủ nuôi vi sinh vật Sanyo – Nhật Bản
- Kính hiển vi Ceti - Đức
- Máy điều nhiệt Vision VS 1205SW1 – Hàn Quốc
- Tủ sấy Sanyo – Nhật Bản
- Máy đo pH









23







CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BÌNH LUẬN

3.1. Hoàn thiện qui trình sản xuất chế phẩm nấm sợi.

Ở giai đoạn 1 của đề tài (đề tài 2 năm) chúng tôi đã xác định được
môi trường và điều kiện nuôi mốc phù hợp để thu nhận bào tử mốc cụ thể
như sau:
-
Thời gian ngâm gạo là 12 giờ
-
Thời gian hấp gạo là 30 phút (lúc đó độ ẩm của cơm là 40-42%)
- Hàm lượng các chất khoáng bổ sung vào môi trường gạo hấp
(KH
2
PO
4
: 0,3g/kg nguyên liệu khô; KCl: 0,3g/kg nguyên liệu khô;
MgSO
4
.7H
2
O: 0,07g/kg nguyên liệu khô; chất tro: 3g/kg nguyên
liệu khô)
-
Tỉ lệ giống mốc/nguyên liệu ban đầu là 0,35g/kg nguyên liệu
-
Nhiệt độ tối ưu cho quá trình nuôi mốc tạo bào tử là 34
o
C
-
Độ ẩm cơ chất là 40%, độ ẩm tương đối của không khí là 80 - 90%.

-
Độ dày khối ủ là 4 cm
-
Chế độ đảo trộn là 8giờ/lần
-
Thời gian nuôi 5 ngày

Ở giai đoạn 2 của đề tài chúng tôi tiếp tục hoàn thiện qui trình sản xuất
chế phẩm nấm sợi

3.1.1. Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm
Bảo quản thực phẩm bằng cách sấy khô là phương pháp thông
dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm. Sấy khô làm giảm hoạt độ
của nước trong chế phẩm do vậy ngăn ngừa sự phát triển của các vi sinh
vật.
Sau khi kết thúc quá trình nuôi, chế phẩm bào tử mốc được đem
sấy ở các nhiệt độ 40, 45 và 50
o
C trong 02 ngày. Lấy mẫu định kì
4giờ/lần để phân tích độ ẩm, đếm số lượng bào tử sống. Kết quả được thể
hiện ở hình 3.1

24
8,75
8,8
8,85
8,9
8,95
9
9,05

9,1
9,15
9,2
9,25
4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48
Thời gian sấy (giờ)
Lg cfu/g
0
5
10
15
20
25
30
35
Độ ẩm (%)
40oC
45oC
50oC
M1
M2
M3

Hình 3.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian sấy đến số lượng bào
tử sống

Nhìn vào đồ thị ta thấy trong khoảng 16 giờ đầu tiên của quá trình
sấy độ ẩm của chế phẩm mốc giảm đáng kể. Tốc độ bay hơi nước phụ
thuộc vào độ ẩm khuếch tán trên bề mặt của hạt chế phẩm. Trong giai
đoạn đầu của quá trình sấy, lượng nước bốc hơi chủ yếu là lượng nước tự

do và một phần l
ượng nước liên kết. Do vậy độ ẩm của chế phẩm giảm
nhanh trong giai đoạn đầu của quá trình sấy. Nhiệt độ sấy càng cao thì
lượng nước bay hơi càng nhiều do đó độ ẩm của các mẫu giảm nhiều theo
chiều tăng của nhiệt độ sấy.
Giai đoạn cuối của quá trình sấy độ ẩm của chế phẩm giảm chậm.
Điề
u này có thể là do lượng nước trong chế phẩm ở giai đoạn này là nước
liên kết do vậy khó khuếch tán lên phía trên bề mặt làm giảm tốc độ bay
hơi của nước.
Đồ thị chỉ ra rằng cuối quá trình sấy số lượng bào tử sống giảm
tương đối nhiều, đặc biệt khi độ ẩm dưới 10%. Do vậy chúng tôi chọn độ
ẩm cuối cùng sau khi sấy là 10%.
Nếu sấy ở 40
o
C thời gian sấy sẽ là 48 giờ và khi đó số lượng tế bào
sống là 9,07 Lg cfu/g. Nếu sấy ở 45
o
C thời gian sấy sẽ là 36 giờ và khi đó
số lượng tế bào sống là 9,1 Lg cfu/g. Nếu sấy ở 50
o
C thời gian sấy sẽ là
28 giờ và khi đó số lượng tế bào sống là 9,07 Lg cfu/g. Như vậy nếu nhìn
vào số lượng bào tử sống ta có thể chọn chế độ sấy là 45
o
C trong thời
gian 36 giờ.