Nghiên cứu quy trình chiết tách ent kauran dipecpenoit có tác dụng chống ung thư và chống viêm từ cây khổ sâm bắc bộ (croton tonkinensis gagnep , euphorbiaceae (giai đoạn 2 phụ lục)

Bộ khoa học và công nghệ
ĐạI học quốc gia hà nội
Trờng đại học
Khoa học tự nhiên


Đề tài độc lập cấp nhà nớc

báo cáo tổng hợp
kết quả khoa học công nghệ đề tài
nghiên cứu quy trình chiết tách
ent-kauran Ditecpenoit có tác dụng
chống ung th Và chống viêm từ cây
khổ sâm Bắc Bộ (croton tonkinensis
gagnep., euphorbiaceae) - Giai đoạn 2
Mã số: ĐTĐL.2009G/03



Phụ lục


Cơ quan chủ trì: Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc gia Hà Nội
Chủ nhiệm : GS TSKH Phan Tống Sơn


9072-1

Hà Nội 6/2011

§Ò tµi §T§L.2009G/03

1
ĐỀ TÀI NHÁNH CỦA ĐỀ TÀI ĐTĐL.2009G/03
NGHIÊN CỨU ĐỘNG THÁI TÍCH LŨY
CỦA HOẠT CHẤT ENT-KAURAN DITECPENOIT
TRONG CÂY KHỔ SÂM BẮC BỘ
(CROTON TONKINENSIS GAGNEP., EUPHORBIACEAE)

Chủ nhiệm Đề tài nhánh: PGS TS Phan Minh Giang
Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
Nội dung nghiên cứu của Đề tài nhánh này là nghiên cứu động thái tích lũy
của hoạt chất ent- kauran ditecpenoit trong cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton
tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) theo thời gian ở một số vùng nguyên
liệu.
1 Khảo sát các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ và Thu thập
các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ cho nghiên cứu
1.1 Lựa chọn các vùng trồng cây nguyên liệu kh
ổ sâm Bắc Bộ
Trong số các địa phương đã lâu năm trồng cây nguyên liệu khổ sâm
Bắc Bộ để dùng làm thuốc có thể kể đến Mỹ Đức, Quốc Oai (Hà Tây cũ),
Ngọc Trục thuộc Từ Liêm, Gia Lâm và Hòa Bình.
1.2 Khảo sát các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ
Đã tổ chức khảo sát thực địa các vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm
Bắc Bộ bao gồm Mỹ Đức, Quốc Oai (Hà Tây cũ), Ng
ọc Trục , Gia Lâm và
Hòa Bình (vùng Kỳ Sơn).
Bảo quản các cây cung cấp nguyên liệu để có thể thu thập mẫu cho 3 thời

điểm trong năm (xem Bảng 1: Danh sách mẫu cây khổ sâm Bắc Bộ cho
nghiên cứu). Các thời điểm thu thập mẫu và bộ phận cây cần thu hái được lựa

§Ò tµi §T§L.2009G/03

2
chọn dựa trên kinh nghiệm của nhân dân địa phương và các tài liệu tham khảo
về thời gian thu thập nguyên liệu của các cây thuốc cổ truyền [1,2].












Hình 1: Lá và hoa một cây khổ sâm Bắc Bộ (Ngọc Trục)
1.3 Thu thập các mẫu thực vật
Các mẫu thực vật bao gồm các bộ phận có khả năng chứa hàm lượng
cao các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit là lá và cành con được thu thập tại
các thời điểm trong năm. Các thời điểm được lựa chọn là tháng 4, tháng 9 và
tháng 1 dương lịch.
Bảng 1: Danh sách các mẫu cây khổ sâm Bắc Bộ cho nghiên cứu
STT Địa phương thu mẫu Ký hiệu mẫu
1
HB-L1

2
HB-T1
3 HB-L2
4
HB-T2
5
HB-L3
6
Hòa Bình
HB-T3

§Ò tµi §T§L.2009G/03

3
7
GL-L1
8
GL-T1
9
GL-L2
10
GL-T2
11
GL-L3
12
Gia Lâm
GL-T3
13
QO-L1
14

QO-T1
15
QO-L2
16 QO-T2
17
QO-L3
18
Quốc Oai
QO-T3
19
NT-L1
20
NT-T1
21
NT-L2
22
NT-T2
23
NT-L3
24
Ngọc Trục
NT-T3
25
MD-L1
26 MD-T1
27
MD-L2
28
MD-T2
29

MD-L3
30
Mỹ Đức
MD-T3
Hai chữ đầu là ký hiệu của vùng nguyên liệu (ví dụ, NT = Ngọc
Trục); L hoặc T là bộ phận nguyên liệu (L = lá và T = cành con);
các ký hiệu 1, 2 hoặc 3 được dùng để chỉ các thời điểm thu thập mẫu
tương ứng với tháng 4, tháng 9 và tháng 1 dương lịch.
Tài liệu tham khảo
1) Võ Văn Chi, Từ điển cây thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Y học, Thành phố
Hồ Chí Minh, 2007.

§Ò tµi §T§L.2009G/03

4
2) Đỗ Tất Lợi, Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa
học và Kỹ thuật, Hà Nội, 1997.
2 Nghiên cứu quy trình xử lý các mẫu thực vật (bao gồm lá và cành con
của cây khổ sâm Bắc Bộ)
Đã nghiên cứu xây dựng quy trình xử lý mẫu thực vật để có bột nguyên
liệu thực vật khô cho nghiên cứu phân tích.
2.1 Mẫu thực vật
Mẫu thực vật là cành lá (nhánh cây) tươi của cây khổ
sâm Bắc Bộ
(Croton tonkinensis Gagnep.) thuộc họ Thầu dầu (Euphorbiaceae) được thu
thập thực địa tại một số thời điểm theo vụ thu hoạch trong năm tại một số
vùng trồng cây nguyên liệu khổ sâm Bắc Bộ quan trọng, như đã nêu ở Bảng
1.
2.2 Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật
Các khảo sát của nhóm nghiên cứu chúng tôi đã cho thấy các nguyên

liệu thực vật khô từ lá cây khổ
sâm Bắc Bộ có thể chứa một hàm lượng khá
cao các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit. Một điều thuận lợi cho các quá trình
xử lý mẫu trong trường hợp nghiên cứu các hoạt chất từ cây khổ sâm Bắc Bộ
là các hoạt chất ditecpenoit này thường có độ ổn định hóa học khá cao và
được thu nhận ở trạng thái rắn không dễ bị bay hơi. Tuy nhiên để giảm các
ảnh hưởng đến các hoạt chất việc xử
lý mẫu đòi hỏi một quá trình làm khô
mẫu chậm và tránh các tác động mạnh của nhiệt độ và độ ẩm. Do đó trước khi
tiến hành các nghiên cứu chiết xuất các mẫu thực vật đã được xử lý để ổn
định mẫu theo một quy trình chung gồm năm bước sau (xem Sơ đồ 1).




§Ò tµi §T§L.2009G/03

5
Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật từ cây khổ sâm Bắc Bộ:
1. Các mẫu thực vật (cành lá tươi) của cây khổ sâm Bắc Bộ được lưu giữ
trong các túi lưới có kích thước 60 cm x 80 cm (rộng x dài) trong bóng râm ở
điều kiện nhiệt độ phòng thoáng, mát cho bước xử lý tiếp theo ngay sau đó.
Các túi nguyên liệu này đều được gắn nhãn có ghi tên mẫu, địa điểm thu thập
mẫu, thời gian thu thập mẫu và người trực tiếp thu th
ập mẫu.
2. Sau đó các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ được hong khô trong
bóng râm trong điều kiện có quạt thông gió trong khoảng thời gian năm ngày.
Các mẫu thực vật này sau khi đã được lấy ra một phần để dùng cho các
nghiên cứu chiết tách đều đuợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong điều kiện
thoáng, mát nhằm hạn chế các ảnh hưởng đến các hoạt chất

ent-kauran
ditecpenoit có ở trong các mẫu.
3. Các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ, sau khi đã được hong khô trong
bóng râm, được xử lý tách riêng phần lá và phần cành con (được xác định là
phần gắn liền với lá có đường kính khoảng từ 1-1,5 mm) cho bước nghiên cứu
chiết xuất. Đây là các bộ phận của cây được sử dụng theo kinh nghiệm trong
Y học cổ truyền và có hàm lượng hoạt chất ent-kauran ditecpenoit cao.
4. Mẫu thực vật (lá ho
ặc cành con, để riêng) của cây khổ sâm Bắc Bộ sau đó
được sấy trong tủ sấy ở điều kiện nhiệt độ 40
o
C trong 48 giờ.
Các mẫu nguyên liệu thực vật (tức lá khô hoặc cành con khô, để riêng) của
cây khổ sâm Bắc Bộ bây giờ đã được ổn định cho các nghiên cứu chiết xuất.
5. Để cho dung môi hữu cơ có thể thẩm thấu vào các cấu trúc tế bào của các
mô thực vật trong quá trình chiết xuất, các nguyên liệu thực vật (lá khô hoặc
cành con khô) của cây khổ sâm Bắc Bộ cần được xay thành bột mịn. Cho các
nghiên cứu chiết xu
ất ở quy mô phân tích, các nguyên liệu thực vật này được
xay thành bột trong máy xay cỡ nhỏ (Philips, Hà Lan). Để giảm nhiệt sinh ra

Đề tài ĐTĐL.2009G/03

6
trong quỏ trỡnh xay mu, mỏy xay c t ch hot ng cho khong thi
gian 30 giõy.

Sơ đồ 1: Quy trình chung xử lý các mẫu thực vật của cây khổ sâm Bắc Bộ
Phõn tớch sc ký lp mng (TLC) nh tớnh kim tra s cú mt ca cỏc
hot cht ent-kauran ditecpenoit trong cỏc mu sau x lý:
Quy trỡnh phõn tớch TLC chung
1) Ngõm chit 1 g mu sau x lý vi MeOH khan trong bỡnh Erlenmeyer (1
ngy).
2) Ct loi kit dung mụi MeOH di ỏp sut gim.
3) Chun b mu dung dch phõn tớch TLC (10 mg phn chit MeOH/1 ml
MeOH).
4) Phõn tớch TLC nh tớnh : s
dng bỡnh trin khai TLC Sigma-Aldrich, bn
mng TLC Aluminium precoated sheets silica gel 60 F
254
(Merck, Germany),
Mẫu thực vật thô
1. Hong khô trong bóng râm
Mẫu thô khô
2. Sấy ở 40
o
C
3. Tách mẫu
Mẫu lá
4. Xay nguyên liệu khô

Mẫu cành con
Bột mịn
Bột mịn

§Ò tµi §T§L.2009G/03

7
chất chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (1 mg/1 ml
CH
2
Cl
2
), đưa mẫu lên bản mỏng: 20 µl cho mẫu phần chiết MeOH (10 mg/1
ml MeOH) và 5 µl cho mẫu chuẩn, hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 (v/v),
nhiệt độ triển khai TLC: nhiệt độ phòng, thuốc thử hiện màu: Dragendorff-
Munier (hiện màu da cam) và vanilin/H
2
SO
4
đặc 1% (hiện màu tím), phương
pháp phân tích TLC định tính: so sánh và co-TLC.
2.3 Áp dụng quy trình xử lý mẫu chung
Quy trình xử lý mẫu chung nêu trên đã được áp dụng để xử lý 30 mẫu
nguyên liệu tươi của cây khổ sâm Bắc Bộ bao gồm 15 mẫu lá và 15 mẫu cành
con. Các nguyên liệu sau khi xử lý đều đạt yêu cầu sử dụng; phân tích TLC đã
cho thấy sự có mặt các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit mục tiêu trong các
nguyên liệu này.
2.4 Kết luận
1) Đối với các mẫu th
ực vật (lá và cành con) từ cây khổ sâm Bắc Bộ đã khảo

sát và xác định các điều kiện thích hợp để xử lý ổn định mẫu thực vật tươi mà
không làm ảnh hưởng đến các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit: thời gian
hong khô ngoài không khí, nhiệt độ sấy (40
o
C) và thời gian sấy mẫu, để
thu được các mẫu nguyên liệu thực vật khô ổn định.
2) Đã áp dụng phương pháp TLC để kiểm tra định tính các thành phần, kết
quả cho thấy sự có mặt của các thành phần hoạt chất ent-kauran ditecpenoit
cần thu nhận ở tất cả các mẫu sau xử lý.
3) Quy trình chung đã được áp dụng để xử lý 30 mẫu nguyên liệu tươi của cây
khổ sâm Bắc Bộ
được thu thập tại các vùng trồng cây khổ sâm Bắc Bộ khác
nhau tại ba thời điểm trong năm.


§Ò tµi §T§L.2009G/03

8
3 Điều chế phần chiết metanol toàn phần của các mẫu thực vật
Theo quy trình của chúng tôi, các nghiên cứu phân tích được thực hiện
trên các phần chiết MeOH. Theo sự đánh giá của chúng tôi metanol có một số
giá trị ưu việt: metanol là dung môi được sử dụng phổ biến trong sản xuất do
có giá thành thấp, độ chiết các ent-kauran ditecpenoit có hoạt tính sinh học
đạt cao, có tính phù hợp với các quy trình cần loại bỏ các chất màu gây cản
trở trong quá trình sả
n xuất.
Quy trình điều chế phần chiết metanol toàn phần cho phân tích từ lá và
từ cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ
3.1 Nguyên liệu thực vật
Nguyên liệu thực vật (lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ, Croton

tonkinensis Gagnep., Euphorbiaceae) được xử lý ổn định theo một quy trình
chung (xem Mục 2, Phần 2.2). Các mẫu nguyên liệu khô đều được xay thành
bột mịn để dùng cho các nghiên cứu chiết xuất các hoạt chất ent-kauran
ditecpenoit.
3.2 Quy trình chung điề
u chế các phần chiết metanol toàn phần. Chiết
xuất các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ cây khổ sâm Bắc Bộ
Trong bước chuẩn bị chiết xuất, các tế bào thực vật đã được chuẩn bị
cho sự tiếp xúc với dung môi hữu cơ sau khi nguyên liệu khô (lá hoặc cành
con) đã được chuyển thành dạng bột mịn. Do độ phân cực của các hoạt chất
ent-kauran ditecpenoit cũng như để hạn ch
ế sự giải phóng các chất màu, chất
dễ bay hơi và sáp (dễ tan trong các dung môi ít phân cực) vào dịch chiết, và
do tính chất hóa học tương đối trơ của MeOH đối với các hoạt chất ent-kauran
ditecpenoit mục tiêu ở điều kiện chiết xuất được lựa chọn (ngâm chiết ở nhiệt
độ phòng) và giá thành phù hợp cho các mục đích sản xuất lượng lớn, MeOH
đã được lựa chọn làm dung môi chiết. Quá trình chiết r
ắn - lỏng các hoạt chất

§Ò tµi §T§L.2009G/03

9
ent-kauran ditecpenoit từ nguyên liệu thực vật cây khổ sâm Bắc Bộ đã được
thực hiện theo Sơ đồ 2 qua các bước sau.
Quy trình chung chiết các mẫu thực vật từ cây khổ sâm Bắc Bộ
1. Ngâm chiết bột nguyên liệu khô (lá hoặc cành con của cây khổ sâm Bắc
Bộ) trong MeOH khan trong các bình Erlenmeyer 250 ml ở nhiệt độ phòng.
Khối lượng nguyên liệu được sử dụng cho mỗi lần ngâm chiết mẫu phân tích
là 50 g lá hoặc 10 g cành con.
2. Sau khi ngâm chiết ba ngày, các dị

ch chiết MeOH được lọc hút chân không
bằng phễu lọc Büchner.
Lặp lại quy trình ngâm chiết và gộp các dịch chiết MeOH lại.
Dùng MeOH tráng kỹ bã nguyên liệu sau mỗi lần ngâm chiết.
3. Cất loại kiệt nhanh MeOH bằng thiết bị quay cô chân không dưới áp suất
giảm ở nhiệt độ < 50
o
C, thu được các phần chiết MeOH.
4. Tiếp tục loại hết dung môi ở các phần chiết MeOH này bằng áp suất giảm
trong 30 phút.









Sơ đồ 2: Quy trình điều chế các phần chiết MeOH từ cây khổ sâm Bắc Bộ
bét nguyªn liÖu
l¸ (cµnh con)
MeOH
dÞch chiÕt MeOH
2 lÇn
(x 3 ngµy)
cÊt lo¹i MeOH
phÇn chiÕt MeOH

§Ò tµi §T§L.2009G/03

10
5. Phân tích sắc ký lớp mỏng (TLC) định tính để kiểm tra quá trình chiết các
hoạt chất ent-kauran ditecpenoit từ các nguyên liệu thực vật khô.
Quy trình phân tích TLC chung
1) Chuẩn bị dung dịch mẫu phân tích TLC (10 mg phần chiết MeOH /1 ml
MeOH).
2) Phân tích TLC định tính: sử dụng bình triển khai TLC Sigma-Aldrich, bản
mỏng TLC Aluminium precoated sheets silica gel 60 F
254
(Merck, Germany),
chất chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) (1 mg/1 ml
CH
2
Cl
2
), đưa mẫu lên bản mỏng: 20 µl cho mẫu phần chiết MeOH (10 mg/1
ml MeOH) và 5 µl cho mẫu chuẩn, hệ dung môi n-hexan-axeton 3:1 (v/v),
nhiệt độ triển khai TLC: nhiệt độ phòng, thuốc thử hiện màu: Dragendorff-
Munier và vanilin/H
2
SO
4
đặc 1%, phương pháp phân tích TLC định tính: so
sánh và co-TLC.
3.3 Áp dụng quy trình ngâm chiết mẫu chung
Quy trình ngâm chiết mẫu chung nêu ở trên đã được áp dụng để chiết
30 mẫu nguyên liệu khô của cây khổ sâm Bắc Bộ bao gồm 15 mẫu lá và 15
mẫu cành con. Các phần chiết đạt yêu cầu sử dụng cho phân tích; phân tích
TLC cho thấy các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit mục tiêu được chiết ra tốt

từ các nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ.
3.4 Kết luận
1) Đã xây dựng được quy trình chiết thích hợp ở quy mô chiết mẫu phân tích
với lượng mẫu thực vật thích hợp được lựa chọn là 50 g bột lá khô hoặc 10 g
bột cành con khô của cây khổ sâm Bắc Bộ.
2) Theo quy trình, mẫu thực vật được ngâm chiết 2 lần với metanol khan ở
nhiệt độ phòng, mỗi lần trong ba ngày. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
trên silica gel với hệ dung môi n-hexan-axeton (3:1, v/v) đã được áp dụng để

§Ò tµi §T§L.2009G/03

11
xác định hiệu quả chiết tốt các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit vào trong các
phần chiết.
3) Đã áp dụng quy trình chung chiết mẫu phân tích này để chiết 30 mẫu
nguyên liệu thực vật (15 mẫu lá và 15 mẫu cành con) của cây khổ sâm Bắc
Bộ (xem Bảng 1). Phương pháp chiết mẫu này tỏ ra thích hợp, cho phép chiết
các mẫu khổ sâm Bắc Bộ đạt yêu cầu phân tích của đề tài.
4 Chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-
en-18-yl axetat và các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác từ lá
cây khổ sâm Bắc Bộ
Mục 4 có nhiệm vụ xây dựng quy trình thực nghiệm áp dụng cho lượng
nhỏ chất để chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-
16-en-18-yl axetat (1) và các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác ent-
1
α
,14
α
-diaxetoxy-7
β

-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-1
α
,7
β
-diaxetoxy-
14
α
-hydroxykaur-16-en-15-on (3) từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ.
Các quy trình điều chế các mẫu chuẩn ent-kauran ditecpenoit đều bao
gồm các bước cơ bản sau:
1) Chuẩn bị nguyên liệu (phần chiết MeOH) cho sự phân bố hai pha lỏng;
2) Phân bố hai pha lỏng lần lượt giữa nước với các dung môi hữu cơ n-hexan
và diclometan: điều chế các phần chiết hữu cơ giàu các ent-kauran
ditecpenoit;
3) Sắc ký điều chế lượ
ng nhỏ các ent-kauran ditecpenoit thô;
4) Sắc ký tinh chế các mẫu chuẩn ent-kauran ditecpenoit;
5) Kiểm tra các sản phẩm nhận được (TLC phân tích, HPLC phân tích, phổ
1
H- NMR và phổ
13
C-NMR).



§Ò tµi §T§L.2009G/03

12
4.1 Nguyên liệu thực vật
Nguyên liệu thực vật là lá cây khổ sâm Bắc Bộ (Croton tonkinensis

Gagnep., Euphorbiaceae). Lá cây được hong khô trong bóng râm rồi sấy ở
40
o
C, sau đó được xay thành bột mịn.
4.2 Các quy trình chiết tách và tinh chế các mẫu chuẩn ent-kauran
ditecpenoit từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ
Yêu cầu đặt ra cho nhiệm vụ này là nghiên cứu quy trình phân lập các
hợp chất chuẩn cho phân tích bao gồm ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-
yl axetat (1), ent-1
α
,14
α
-diaxetoxy-7
β
-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-
1
α
,7
β
-diaxetoxy-14
α
-hydroxykaur-16-en-15-on (3).
Các quy trình này đều bao gồm các bước chung sau:
1. Ngâm chiết nguyên liệu bột lá khô của cây khổ sâm Bắc Bộ trong MeOH
khan ở nhiệt độ phòng (2 lần, mỗi lần trong ba ngày).
2. Sau mỗi lần ngâm chiết lọc tách lấy các dịch chiết MeOH. Gộp các dịch
chiết MeOH lại và cất loại kiệt nhanh MeOH bằng thiết bị quay cô chân
không dưới áp suất giảm ở nhiệt độ < 50
o
C để thu phần chiết MeOH.

3. Phần chiết MeOH được hoà với nước cất rồi lần lượt chiết với các dung
môi có độ phân cực tăng dần (n-hexan và diclometan). Cất loại kiệt dung môi
của các dịch chiết tương ứng dưới áp suất giảm bằng thiết bị quay cô chân
không, thu được các phần chiết n-hexan và diclometan.
4. Gộp chung các phần chiết n-hexan và diclometan. Tiến hành sắc ký cột
phầ
n chiết gộp này trên silica gel (0,063-0,200 mm, Merck, Germany), rửa
giải gradient với n-hexan và các hệ dung môi n-hexan-EtOAc hoặc n-hexan-
axeton. Kiểm soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica
gel, n-hexan-EtOAc 3:1 hoặc n-hexan-axeton 3:1, v/v; thuốc hiện:
vanilin/H
2
SO
4
đặc 1% hoặc Dragendorff-Munier). Các phân đoạn rửa giải

§Ò tµi §T§L.2009G/03

13
được thu theo hệ dung môi rửa giải và phân tích TLC. Các phân đoạn gộp
được cất loại dung môi dưới áp suất giảm bằng thiết bị quay cô chân không ở
nhiệt độ < 50
o
C.
Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô nhận được từ phân
đoạn được rửa giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 3:1 hoặc n-hexan-axeton
3:1, v/v.
Các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác (ent-1
α
,14

α
-diaxetoxy-7
β
-
hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-1
α
,7
β
-diaxetoxy-14
α
-hydroxykaur-16-
en-15-on (3)) nhận được dưới dạng thô từ phân đoạn được rửa giải với hệ
dung môi n-hexan-EtOAc 1:1 hoặc n-hexan-axeton 1:1, v/v.
Tiếp theo bước này các giai đoạn tinh chế sản phẩm có thể được thực
hiện theo các quy trình A, B và C sau đây. Điểm khác biệt giữa các quy trình
tinh chế này là ở việc sử dụng các chất hấp phụ (silica gel, silica gel pha đảo
(silica gel RP) và Sephadex LH-20) và do đó có các điều kiện sắc ký khác
nhau.
Qui trình A: Tinh chế trên chất hấp phụ silica gel
5. Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô được tinh chế tiếp
bằng sắc ký cột trên silica gel (0,063-0,200 mm, Merck, Germany), rửa giải
với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 3:1 (v/v), sau đó được kết tinh chậm trong
cùng hệ dung môi cho ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) tinh
khiết ở dạng tinh thể hình kim không màu (phân tích TLC, HPLC và phổ
1
H-
NMR). Kiểm soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica
gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v/v).
6. Các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác ở dạng thô được tinh chế
tiếp bằng sắc ký cột trên silica gel (0,063-0,200 mm, Merck, Germany), rửa

giải với hệ dung môi n-hexan-EtOAc 4:1 và 2:1 (v/v), sau đó được kết tinh

§Ò tµi §T§L.2009G/03

14
chậm trong cùng hệ dung môi rửa giải cho hai hoạt chất ent-kauran
ditecpenoit phụ chuẩn khác (ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-
15-on (2) và ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3)) ở dạng
bột vô định hình màu trắng (phân tích TLC, HPLC và phổ
1
H-NMR). Kiểm
soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica gel, n-hexan-
EtOAc 3:1, v/v).
Do trong các yêu cầu phân tích hai hợp chất ent-kauran ditecpenoit 2 và
3 thường cần được phát hiện đồng thời nên cũng có thể sử dụng hỗn hợp của
hai chất này làm chất chuẩn mà không cần phải phân lập tinh khiết từng hợp
chất riêng biệt.
Quy trình B: Tinh chế trên chất hấp phụ Sephadex
®
LH-20
5. Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô được tinh chế tiếp
bằng sắc ký cột trên Sephadex
®
LH-20 (Pharmacia, Sweden), rửa giải với
dung môi MeOH khan, sau đó được kết tinh chậm trong cùng hệ dung môi
cho ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat tinh khiết (phân tích TLC,
HPLC và phổ
1
H-NMR). Kiểm soát quá trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng
(TLC) (silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v/v).

Quy trình C: Tinh chế trên chất hấp phụ đảo pha silica gel RP-18 (ODS)
5. Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat thô được tinh chế tiếp
bằng sắc ký cột pha đảo trên ODS (octadecyl silica gel, YMC, Japan) hoặc
silica gel RP-18 (Merck, Germany), rửa giải với hệ dung môi gradient
MeOH-H
2
O 3:1 và 4:1, v/v, sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm
bằng thiết bị quay cô chân không cho ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-
yl axetat tinh khiết (phân tích TLC, HPLC và phổ
1
H-NMR). Kiểm soát quá
trình phân tách bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) (silica gel, n-hexan-EtOAc 3:1,
v/v).

§Ò tµi §T§L.2009G/03

15
Nhận dạng và kiểm tra độ tinh khiết của các mẫu chuẩn:
Sử dụng các phương pháp TLC, HPLC và
1
H-NMR.
1) Phân tích TLC (với dãy 5 nồng độ áp dụng khác nhau, ví dụ 5 µl, 10 µl,
15 µl, 20 µl và 25 µl - nồng độ hoà tan mẫu đầu 1 mg/ml), dùng các hệ dung
môi triển khai khác nhau như n-hexan-EtOAc 3:1 và n-hexan-axeton 3:1, v/v,
hiện màu với các thuốc hiện Dragendorff-Munier và vanilin/H
2
SO
4
đặc 1%,
và soi đèn UV λ 254 nm.

Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1): R
f
0,36 (TLC, silica
gel, n-hexan-EtOAc 3:1, v/v) và (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v),
hiện màu da cam với thuốc thử Dragendorff-Munier và màu tím hồng với
thuốc thử vanilin/H
2
SO
4
đặc 1%.
Các chất ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-
1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3): R
f
0,36 (TLC, n-hexan-
EtOAc 3:1, v/v) và (TLC, silica gel, n-hexan-axeton 3:1, v/v), hiện màu trắng
với thuốc thử Dragendorff-Munier và màu xám với thuốc thử vanilin/H
2
SO
4

đặc 1%. (Chú ý: các chất 2 và 3 không phân giải được trên TLC và xuất hiện
ở dạng một vệt có chung giá trị R
f
).
2) Phân tích HPLC với detectơ PDA (cột phân tích ODS 250 × 4.6 i.d. mm,
cỡ hạt 5 µm, gradient, 20%-100% MeOH-H
2
O v/v (25 phút), MeOH (5 phút),
UV ở
λ

210 nm, tốc độ dòng 1 ml/phút, nồng độ mẫu 10 mg/ml, thể tích bơm
mẫu 10 µl). Các chất chuẩn 1, 2 và 3 đều có các chromophore giống nhau của
nhóm cacbonyl và do đó có thể được phát hiện bằng detectơ UV được đặt ở
các bước sóng λ 210 nm, 240 nm và 254 nm.
Chất ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1) có thời gian lưu
khoảng 23,907 phút, HPLC-UV: 240 nm.

§Ò tµi §T§L.2009G/03

16
Chất ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2) có thời gian lưu
khoảng 20,112 phút, HPLC-UV: 240 nm.
Chất ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3) có thời gian lưu
khoảng 20,692 phút, HPLC-UV: 240 nm.
Như vậy HPLC với chương trình gradient trên cho sự phân giải tốt của cả ba
hợp chất 1, 2 và 3, các pic đều có sự đối xứng. Độ tinh khiết của các chất này
cũng có thể được kiểm tra bằng detectơ PDA.
3) Phân tích phổ

1
H-NMR (500 MHz) và
13
C-NMR (125 MHz)
Các dữ kiện phổ
1
H-NMR được ghi ở tần số 500 MHz trong dung môi
CDCl
3
với thang δ (ppm) được sử dụng để xác định các hợp chất chuẩn. Các
dữ kiện phổ được đưa ra dưới đây cho các độ chuyển dịch hóa học đặc trưng

nhất cho phép phân biệt và nhận dạng tốt các hợp chất này trong các hỗn hợp
chất từ cây khổ sâm Bắc Bộ.
ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1):







1
H-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 0,84 (3H, s, H
3
-19), 1,14 (3H, d, J = 1,19 Hz,
H
3
-20), 3,10 (1H, m, H-13), 2,10 (3H, s, 18-OAc), 3,66 (1H, d, J = 10,8 Hz,
H-18a), 3,87 (1H, d, J = 10,8 Hz, H-18b), 4,05 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 4,4 Hz,
H-7), 5,29 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17a), 5,97 (1H, t, J = 1,1 Hz, H-17b).
O
OH
AcO
H
H
1
2
3
4

5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18 19
20
1

§Ò tµi §T§L.2009G/03

17
13
C-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 17,5 (t, C-2), 17,5 (q, C-19), 18,0 (t, C-11), 18,2
(q, C-20), 27,7 (t, C-6), 27,9 (t, C-14), 32,8 (t, C-12), 35,4 (t, C-3), 36,4 (s,
C-4), 37,6 (d, C-13), 38,9 (t, C-1), 39,6 (s, C-10), 46,3 (d, C-5), 51,8 (d, C-9),
58,3 (s, C-8), 70,8 (d, C-7), 72,3 (t, C-18), 115,0 (t, C-17), 149,2 (s, C-16),
171,2 (s)/21,1 (q) (18-OAc), 209,7 (s, C-15).
ent-1α,14α-diaxetoxy-7β-hydroxykaur-16-en-15-on (2):

1
H-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 0,90 (3H, s, H
3
-19), 0,95 (3H, s, H
3
-18), 1,27
(3H, s, H
3
-20), 1,97 (3H, s, 14-OAc), 1,99 (3H, s, 1-OAc), 3,08 (1H, br s, H-
13), 4,19 (1H, dt, J = 11,9 Hz, 4,6 Hz, H-7), 4,86 (1H, br s, H-1), 5,41 (1H, s,
H-17a), 6,01 (1H, s, H-14), 6,18 (1H, s, H-17b).
13
C-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 16,6 (t, C-11), 18,6 (q, C-20), 21,4 (q, C-19),
22,7 (t, C-2), 27,3 (t, C-6), 32,3 (t, C-12), 32,9 (s, C-4), 33,2 (q, C-18), 35,0
(t, C-3), 44,2 (d, C-13), 43,0 (s, C-10), 47,6 (d, C-5), 48,1 (d, C-9), 61,6 (s, C-
8), 72,7 (t, C-1), 72,9 (d, C-7), 76,1 (d, C-14), 117,7 (t, C-17), 146,0 (s, C-16),
170,1 (s)/21,2 (q) (1-OAc), 170,6 (s)/21,4 (q) (14-OAc), 206,5 (s, C-15).
ent-1α,7β-diaxetoxy-14α-hydroxykaur-16-en-15-on (3):




O

OH
H
H
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18 19
20
2
OAc
OAc
O
OAc
H
H
1

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18 19
20
3
OAc
OH

§Ò tµi §T§L.2009G/03

18
1
H-NMR (CDCl
3
): δ (ppm) 0,87 (3H, s, H
3

-19), 0,97 (3H, s, H
3
-18), 1,16
(3H, s, H
3
-20), 2,01 (3H, s, 1-OAc), 2,02 (3H, s, 7-OAc), 3,12 (1H, br s, H-
13), 4,86 (1H, br s, H-1), 4,89 (1H, s, H-14), 5,42 (1H, s, H-17a), 5,45 (1H,
dd, J = 12,4 Hz, 3,9 Hz, H-7β), 6,17 (1H, s, H-17b).
13
C-NMR (CDCl
3
):
δ
(ppm) 16,6 (t, C-11), 18,5 (q, C-20), 21,2 (q, C-19),
22,6 (t, C-2), 25,0 (t, C-6), 31,0 (t, C-12), 32,9 (q, C-18), 33,0 (s, C-4), 34,9
(t, C-3), 42,3 (s, C-10), 45,7 (d, C-13), 46,9 (d, C-5), 46,99 (d, C-9), 60,9 (s,
C-8), 72,7 (d, C-1), 74,3 (d, C-14), 75,9 (d, C-7), 118,3 (t, C-17), 146,7 (s, C-
16), 170,1(s)/21,2 (q) (1-OAc), 168,1 (s)/21,2 (q) (7-OAc), 205,0 (s, C-15).
4.3 Kết luận
1) Qua các thí nghiệm đã xây dựng được quy trình chiết tách và tinh chế thích
hợp các mẫu chuẩn ent-kauran ditecpenoit từ lá cây khổ sâm Bắc Bộ. Các
điều kiện thí nghiệm để phân lập lượng nhỏ các mẫu chuẩn ent-kauran
ditecpenoit từ nguyên liệu lá cây khổ sâm Bắc Bộ đã được xác định.
2) Các điều kiện phân tích để xác định các hợp chất này nh
ư TLC phân tích,
HPLC phân tích trên pha đảo và phổ NMR đã được đưa ra. Độ sạch của chất
chuẩn 1 đạt > 98% (HPLC, NMR). Hỗn hợp của 2 và 3 nhận được với tỷ lệ
1:1 đạt độ sạch theo 2 và 3 là 100% (NMR).
5 Phân tích định tính và định lượng ent-7β-hydroxy-15-oxokaur-16-en-
18-yl axetat và xác định các hoạt chất ent-kauran ditecpenoit phụ khác

trong các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm Bắc Bộ bằng các phương pháp
phân tích
Yêu cầu củ
a phần này là nghiên cứu các phương pháp phân tích các
hoạt chất ent-kauran ditecpenoit có trong các mẫu nguyên liệu cây khổ sâm
Bắc Bộ. Ngoài hoạt chất ent-7
β
-hydroxy-15-oxokaur-16-en-18-yl axetat (1)
ra các ent-kauran ditecpenoit khác từ cây khổ sâm Bắc Bộ cần được phân tích

§Ò tµi §T§L.2009G/03

19
là ent-1
α
,14
α
-diaxetoxy-7
β
-hydroxykaur-16-en-15-on (2) và ent-1
α
,7
β
-
diaxetoxy-14
α
-hydroxykaur-16-en-15-on (3). Sự có mặt của các ent-kauran
ditecpenoit này trong các hỗn hợp với chất 1 có thể được phân tích thuận lợi
bằng phổ
1

H-NMR và bằng phương pháp HPLC; bên cạnh đó phương pháp
TLC dễ thực hiện và cũng cho những thông tin hữu ích.
5.1 Nghiên cứu phân tích định tính phần chiết metanol toàn phần bằng
phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC)
Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) cho phép phân tích định tính
nhanh các thành phần đặc trưng của một thuốc hoặc của một chế phẩm. Các
thông tin đảm bảo cho độ lặp lại của việc phân tích này là nguồn gốc thuốc,
điều kiện chiết, điều kiện phân tích TLC, hệ dung môi sắc ký, nồng độ chất,
và phương pháp phát hiện [1, 2]. Chất chuẩn được triển khai đồng thời với
mẫu phân tích để nhận dạng hợp chất này trong mẫu phân tích.
5.1.1 Dụng cụ phân tích TLC
1) Bình triển khai sắc ký lớp mỏng (Sigma-Aldrich).
2) Bản mỏng TLC Aluminium precoated sheets silica gel 60 F
254
(Merck,
Germany), 20 × 20 cm, 25 sheets, layer thickness: 200 µm.
3) Bản mỏng phân giải cao HPTLC Fertigplatten Kieselgel 60 F
254
(Merck,
Germany), 10 × 10 cm, 25 plates, layer thickness: 200 µm.
4) Syringe Hamilton và plastic capillary để đưa mẫu lên bản mỏng.
5) Dung môi phân tích khan: n-hexan, axeton, etyl axetat.
6) Đèn UV (
λ
= 254 nm) (phương pháp hiện màu không phá hủy mẫu).
7) Bình phun thuốc hiện (CHLB Đức) và các thuốc hiện màu hoá học
Dragendorff-Munier hoặc vanilin/H
2
SO
4

đặc 1% (phương pháp hiện màu phá
huỷ mẫu).
5.1.2 Quy trình phân tích TLC định tính

§Ò tµi §T§L.2009G/03

20
1) Phân tích song song các mẫu phân tích và mẫu chất chuẩn.
2) Kích thước bản mỏng hoạt động là 10 cm × 10 cm. Vạch xuất phát cách
mép dưới 1 cm và tuyến dung môi cách mép trên 0,3 cm. Các vệt chất xuất
phát cách nhau 1 cm.
3) Chuẩn bị mẫu phân tích: Ngâm chiết 1 g bột mẫu khô (lá hoặc cành con
của cây khổ sâm Bắc Bộ) trong ba ngày trong MeOH ở nhiệt độ phòng. Lọc
dịch chiết nhận được và cất loại kiệt MeOH dưới áp suất giảm. Hoà tan phần
chiết MeOH (1 mg) trong MeOH khan (1 ml). Mẫu ch
ất chuẩn được sử dụng
ở nồng độ 0,5 mg/ml.
4) Tối ưu hoá hệ dung môi triển khai TLC (các hệ dung môi và tỷ lệ).
Dùng hệ dung môi triển khai: n-hexan-axeton 3:1 (hoặc n-hexan-EtOAc
3:1), v/v.
5) Bão hoà dung môi ở nhiệt độ phòng (dung môi sắc ký được để trong bình
30 phút trước khi bắt đầu tiến hành sắc ký), và không bão hoà dung môi (dung
môi sắc ký được đưa vào bình triển khai, xoáy mạnh đều xung quanh trong
vài giây, sau đó để yên bình để cho sắc ký bắt đầu).
6) Đưa mẫu lên bản TLC: 5, 10 và 20
µl dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn (5
µl) được đưa lên bản TLC cách nhau từng khoảng 1 cm và cách mép dưới bản
TLC 1 cm.
7) Điều kiện triển khai:
nhiệt độ phòng.

Sau đó để bản mỏng ngoài không khí cho bay hơi hết dung môi và hiện màu
với các thuốc hiện khác nhau.
8) Hiện màu bản mỏng:
a) Phun thuốc hiện vanilin/H
2
SO
4
đặc 1%
Điều chế thuốc hiện: pha 1 g vanilin trong 100 ml H
2
SO
4
đặc (98%), phun
thuốc hiện rồi hơ nóng bản mỏng ở nhiệt độ 120
o
C cho đến khi hiện màu các

§Ò tµi §T§L.2009G/03

21
vệt chất (ghi màu sắc các vệt hiện trên sắc ký đồ TLC);
b) Phun thuốc hiện Dragendorff-Munier
Điều chế thuốc hiện: pha chế dung dịch gốc từ các dung dịch sau:
- dung dịch A: 17 g Bi(NO
3
)
2
và 200 g axit tactric trong 800 ml nước cất.
- dung dịch B: 160 g KI trong 400 ml nước cất.
Trộn hai dung dịch A và B với nhau, thu được dung dịch gốc có màu da cam.

Dung dịch gốc này cần được bảo quản trong chai màu nâu, tránh ánh sáng và
để lạnh. Pha dung dịch gốc thành dung dịch thuốc thử để sử dụng như sau: 50
ml dung dịch gốc và 200 g axit tactric trong 400 ml nước cất (ghi màu sắc
của vệt hiện trên sắc ký đồ TLC);
c) Soi đèn tử ngoại ở bước sóng λ 254 nm.
9) Mô tả sắ
c ký đồ TLC:
Mô tả các giá trị R
f
, màu sắc của các vệt chất và của chất chuẩn (TLC phân
tích).
5.1.3 Các ví dụ phân tích TLC định tính các ent-kauran ditecpenoit từ lá
và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ
1) Phân tích TLC phần chiết MeOH từ lá và cành con
Thực hiện quy trình phân tích TLC nêu trên với 30 mẫu phân tích (15
mẫu phần chiết MeOH từ lá và 15 mẫu từ cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ
được thu thập ở năm địa phương vào ba thời điểm trong năm, xem Bảng 1).
Phân tích TLC (xem Bảng 2) dễ dàng phát hiện sự
có mặt của hoạt chất 1
trong các phần chiết MeOH do 1 cho màu đặc trưng với các thuốc hiện
Dragendorff-Munier (da cam) và vanilin/H
2
SO
4
đặc 1% (tím hồng). Các hoạt
chất 2 và 3 có R
f
trùng với của 1 và không có các màu đặc trưng với các thuốc
hiện Dragendorff-Munier (trắng) và vanilin/H
2

SO
4
đặc 1% (xám), do đó khó
phát hiện trực tiếp trong các mẫu phần chiết MeOH bằng các phân tích TLC.

§Ò tµi §T§L.2009G/03

22
Bảng 2: Xác định các hoạt chất 1, 2 và 3 trong các mẫu khổ sâm Bắc Bộ
STT Ký hiệu mẫu Phát hiện các hoạt chất
1
HB-L1 1
2
HB-L2 1
3
HB-L3 1
4
HB-T1 1
5 HB-T2 1
6
HB-T3 1
7
GL-L1 1
8
GL-L2 1
9
GL-L3 1
10
GL-T1 1
11

GL-T2 1
12
GL-T3 1
13
QO-L1 1
14
QO-L2 1
15 QO-L3 1
16
QO-T1 1
17
QO-T2 1
18
QO-T3 1
19
NT-L1 1
20
NT-L2 1
21
NT-L3 1
22
NT-T1 1
23
NT-T2 1
24
NT-T3 1
25 MD-L1 1
26
MD-L2 1
27

MD-L3 1

§Ò tµi §T§L.2009G/03

23
28
MD-T1 1
29
MD-T2 1
30
MD-T3 1

Dưới đây là các sắc ký đồ được hiện màu với các thuốc hiện
Dragendorff-Munier (Hình 2) và vanilin/H
2
SO
4
đặc 1% (Hình 3) của một số
mẫu phần chiết MeOH từ lá và cành con của cây khổ sâm Bắc Bộ. Như đã
nêu ở trên, do có màu đặc trưng với các thuốc hiện này nên sự có mặt của hợp
chất 1 trong các phần chiết MeOH dễ được phát hiện bằng phân tích TLC,
trong khi các chất 2 và 3 trong các phần chiết này khó có thể được nhận biết
bằng TLC. Các vệt chất 1 được phát hiện tạ
i R
f
× 100 = 36. Cần lưu ý đến sự
khác biệt giữa TLC profile của các mẫu phần chiết MeOH từ lá với của các
mẫu phần chiết từ cành con.

Hình 2: Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn
(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,
U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn
S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện Dragendorff-Munier,
chuẩn S1 hiện màu da cam, các chuẩn S2 và S3 hiện màu trắng)

§Ò tµi §T§L.2009G/03

24








Hình 3: Phân tích TLC các phần chiết MeOH và các chất chuẩn
(các mẫu lần lượt từ trái sang phải : GL-L, HB-L, NT-L, MD-L, QO-L,
U-L, GL-T, HB-T, NT-T, MD-T, QO-T, U-T, và các mẫu chất chuẩn
S1 (1), S2 (2) và S3 (3), hiện màu bằng thuốc hiện vanilin/H
2
SO
4

đặc
1%, chuẩn S1 hiện màu tím, các chuẩn S2 và S3 hiện màu xám)
Sự so sánh các sắc ký đồ TLC ở Hình 2 với Hình 3 cho thấy thuốc hiện
Dragendorff-Munier là sự lựa chọn thích hợp để nhận biết hợp chất 1 trong
các phần chiết metanol từ các nguyên liệu thực vật. Các tecpenoit nói chung
nhạy với thuốc hiện vanilin/H
2
SO
4
đặc 1%, do đó sắc ký đồ trở nên khó nhận
dạng hơn; tuy nhiên sự vắng mặt các dải màu tím ở phía trên và phía dưới của
vệt chất 1 cũng đã cho phép ta nhận dạng hợp chất này.
Các chất 1, 2 và 3 không hiện đèn UV ở bước sóng λ 254 nm (Hình 4).
Các sắc ký đồ TLC chuẩn của phần chiết MeOH từ lá và cành con của
cây khổ sâm Bắc Bộ được nêu tổng quát trong Bảng 3.