Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế biến một số nông sản thực phẩm ĐTN nghiên cứu sản xuất đường fructooligsacarit bằng công nghệ đa enzym và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ em và bánh kẹo chức năng

Bộ khoa học và công nghệ
Viện công nghiệp thực phẩm

Báo cáo tổng kết
khoa học và kỹ thuật
Đề tài cấp nhà nớc:
Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym
trong chế biến một số nông sản thực phẩm
Mã số: KC 04-07
Chủ nhiệm đề tài cấp nhà nớc: PGS. TS Ngô Tiến Hiển


Đ
ề tài nhánh:

Nghiên cứu sản xuất đờng fructooligsacarit bằng
công nghệ đa enzim và ứng dụng trong sản xuất
thức ăn trẻ em và bánh kẹo chức năng

Chủ nhiệm đề tài nhánh: TS. Trịnh Thị Kim Vân

Hà nội,10/ 2004
Danh sách ngời thực hiện đề tài



1. TS. Trịnh Thị Kim Vân
2. PGS. TS. Ngô Tiến Hiển
3. TS. Nguyễn Thị Hoài Trâm
4. PGS. TS. Hoàng Đình Hoà
5. PGS. TS. Trơng Thị Hoà
6. KS. Lê Đình Hùng
7. CN. Nguyễn Thị Thái.

8. CN. Nguyễn Thị Thi
9. KS. Phạm Đức Toàn.
10. KS. Đỗ Thanh Huyền
11. KS. Đỗ Thị Thuỷ Lê
12. KS. Chu Thắng
13. CN. Nguyễn Thanh Hà

Mục lục



Danh sách ngời thực hiện đề tài

Mục lục

Các chữ viết tắt

Tóm tắt

Mở đầu
1

Chơng 1 : Tổng quan tài liệu


3
1.1 Giới thiệu về fructooligosacarit (FOS) 3
1.1.1 Fructôligosacarit trong tự nhiên và cấu tạo 3

1.1.2 Tính chất của FOS 5
1.1.3 Tính an toàn của FOS 10
1.2 ứng dụng của FOS
11
1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới . 12
1.3.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzim cho sản xuất FOS . 12
1.3.2 Nghiên cứu và sản xuấtFOS 50 ( FOS phổ thông ) 14
1.3.3 Nghiên cứu và sản xuất FOS cao độ 15
1.4 Giới thiệu về fructosyltransferaza (FTS) 17
1.5 Giới thiệu về enzim glucooxidaza (GOD)
18
1.5.1 Đặc tính của enzim GOD
18
1.5.2 Cơ chế xúc tác của enzim GOD
18
1.6 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam
20
Chơng 2:
Nguyên liệu, thiết bị và phơng pháp
nghiên cứu


22
2.1 Nguyên vật liệu và hoá chất . 22
2.1.1 Giống vi sinh vật 22
2.1.2 Enzim 22
2.1.3 Nguyên vật liệu chính. 22
2.1.4 Hoá chất 22
2.2 Các thiết bị chủ yếu . 23
2.3 Phơng pháp nghiên cứu . 24

2.3.1 Phơng pháp vi sinh vật 24
2.3.2 Các phơng pháp hoá sinh, hoá lý . 25
2.3.3 Phơng pháp toán học . 27
2.3.4 Phơng pháp đánh giá cảm quan . 27
2.3.5 Các công nghệ và quá trình cơ sở . 27

Chơng 3:
Kết quả và thảo luận


28
3.1 Nghiên cứu sản xuất đờng FOS cao độ bằng phơng pháp nối tiếp 28
3.1.1 ảnh hởng của pH môi trờng đến hoạt lực của FTS.
28
3.1.2 ảnh hởng của nhiệt độ đến sự ổn định của enzim . 30
3.1.3 Tối u hoá các điều kiện chuyển hoá FOS. 30
3.1.4 Tối u hoá các điều kiện chuyển hoá đờng glucoza bằng hệ
enzim GOD- CAT

35
3.2 Nghiên cứu sản xuất FOS cao độ bằng phơng pháp đồng thời 41
3.3 Sơ bộ tính toán giá thành cho sản phấm đờng FOS 42
3.3.1 Sơ bộ tính toán giá thành cho sản phẩm đờng FOS 50 42
3.3.2 Sơ bộ tính toán giá thành cho sản phẩm đờng FOS cao độ 43
3.4 Phân lập và tuyển chọn giống cho lên men sinh tổng hợpenzim FTS 44
3.5 Định tên và phân loại vi sinh vật 46
3.6 Nghiên cứu sử dụng đờng FOS trong sản xuất một số thực phẩm
chức năng
50
3.6.1 Nghiên cứu ứng dụng đờng FOS trong sản xuất bột dinh 51

dỡng trể em
3.6.2 Nghiên cứu sử dụng đờng FOS trong sản xuất bánh bích quy 57
3.6.3 Nghiên cứu sử dụng đờng FOS trong sản xuất kẹo 61
3.7 Nghiên cứu thử nghiệm trên cơ thể ngời để đánh giá trị của sản
phẩm đờng FOS
67
Kết luận
70
Tài liệu tham khảo
72
Phụ lục
81

Các chữ viết tắt




CAT
F
FOS
FOS 50 (phổ thông)
FOS cao độ
FTS
G
GF
2

GF
3
GF
4
GI
GOD
HPLC
U
U
T
U
H
Catalaza
Fructoza
Fructooligosacarit
Fructooligosacarit có độ tinh khiết từ 45% đến 60 %
Fructooligosacarit có độ tinh khiết cao hơn 75 %
Fructosyltransferaza
Glucoza
Kestoza
Nystoza
Fructosylnystoza
Glucoizomeraza
Glucooxydaza
Sắc ký lỏng cao áp
Đơn vị hoạt lực enzim quốc tế
Hoạt lực fructosyltransferaza
Hoạt lực thuỷ phân

mục lục

lời cam đoan .
I
lời cảm ơn .
II
mục lục .
III
Các chữ viết tắt .
VI
danh mục các Hình
VII
danh mục các bảng
X
Mở đầu
1

Chơng 1 : Tổng quan tài liệu

1.1 Giới thiệu về FOS

3
1.1.1 Đờng FOS trong tự nhiên và cấu tạo
3
1.1.2 Tính chất và đặc tính chức năng của FOS
5
1.1.3 Tính an toàn của FOS
12
1.1.4 ứng dụng của FOS
12
1.2 Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới
13
1.2.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzim cho sản xuất FOS .
14
1.2.2 Nghiên cứu và sản xuất FOS 50
21
1.2.3 Nghiên cứu và sản xuất FOS cao độ
22
1.3 Tiềm năng cho sản xuất FOS tại Việt Nam .
30

Chơng 2:
Nguyên liệu, thiết bị và phơng pháp
nghiên cứu

2.1 Nguyên vật liệu và hoá chất .
32
2.1.1 Giống vi sinh vật
32
2.1.2 Enzim
32
2.1.3 Nguyên vật liệu ..
32
2.1.4 Hoá chất
33
2.2 Các thiết bị chủ yếu .
33
2.3 Phơng pháp nghiên cứu .
34
2.3.1 Phơng pháp vi sinh vật
34
2.3.2 Các phơng pháp hoá sinh, hoá lý .
36
2.3.3 Phơng pháp toán học . .
44
2.3.4 Quy trình công nghệ và quá trình
44

Chơng 3:
Kết quả và bàn luận

3.1 Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc và tối u hoá quá trình lên men
sinh tổng hợp enzim

46
3.1.1 Phân lập và tuyển chọn
46
3.1.2 Phân loại và định tên cho chủng nấm mốc VVTP 84
46
3.1.3 Nghiên cứu các điều kiện lên men sinh tổng hợp FTS của chủng
Asp. flavipes VVTP84.

51
3.1.4 Nghiên cứu các điều kiện lên men tổng hợp FTS trong thùng lên
men 25 lít

60
3.2 Thu nhận chế phẩm và xác định đặc tính của FTS
66
3.2.1 Chiết tách enzim
66
3.2.2 Tinh chế enzim
67
3.2.3 Xác định cấu tạo và tính chất của FTS .
70
3.2.4 Một số đặc tính của FTS
72
3.2.5 Xác định hệ số động học K

m
và hệ số ức chế K
i
của FTS .
76
3.3 Nghiên cứu công nghệ sản xuất FOS bằng phơng pháp đơn giản 78
3.3.1 ảnh hởng của pH đến hoạt động của FTS trong tế bào 79
3.3.2 ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt động của FTS trong tế bào 80
3.3.3 Xác định hệ số động học của FTS trong tế bào 81
3.3.4 Tối u hoá các điều kiện chuyển hoá FOS 82
3.4 Nghiên cứu nâng cao độ tinh khiết của FOS 50 bằng hệ enzim
glucooxydaza- catalaza (GOD- CAT)
88

3.4.1 ảnh hởng của nhiệt độ đến hoạt động của GOD . 89
3.4.2 ảnh hởng của pH đến hoạt động của GOD . 92
3.4.3 Xác định các thông số công nghệ để nâng cao độ tinh khiết
của FOS

94
3.5 Tinh chế, phân tích kết cấu và một số tính chất FOS 103
3.5.1 Phân ly hỗn hợp FOS 104
3.5.2 Thuỷ phân bằng axit 104
3.5.3 Thuỷ phân bằng enzim 105
3.5.4 Tính khử của đờng S
1
, S
2
. 106
3.5.5 Xác định cấu tạo hai đờng S

1
và S
2
bằng phơng pháp cộng
hởng từ hạt nhân
13
CNMR .
106
3.5.6 Đánh giá chất lợng và một số tính chất sản phẩm FOS . 112
3.5.7 Tính chịu nhiệt, chịu axit của FOS 114
3.6 Định hớng cho sản xuất và sơ bộ tính toán giá thành ``
3.6.1 Định hớng sản xuất cho sản phẩm FOS 116
3.6.2 Sơ bộ tính toán giá thành 120
Kết luận

124
TàI liệu tham khảo

125
Các bàI báo đã công bố có liên quan đến luận án 140





Mở đầu

Ngày nay, do sự phát triển của khoa học kỹ thuật, sản lợng nông sản thực
phẩm trên toàn thế giới đạt đợc ngày càng nhiều, đặc biệt ở các nớc phát triển,
lơng thực, thực phẩm và hàng hoá đang có xu hớng d thừa. Yêu cầu của con

ngời về thực phẩm vì thế cũng có nhiều thay đổi. Nếu nh trớc kia chúng ta đặt
vấn đề hàm lợng dinh dỡng cao, khả năng cung cấp nhiều năng lợng của thực
phẩm là hàng đầu thì bây giờ không hẳn là nh vậy. Đã có nhiều ngời chuyển
hớng tìm cho mình các loại thức ăn không có hoặc có ít dinh dỡng, thức ăn thấp
năng lợng. Một số khác lại có nhu cầu sử dụng thực phẩm để phòng và chữa bệnh
v.v Và thế là có sự ra đời của thực phẩm chức năng (functional food). Thực tế từ
bao đời nay loài ngời đã biết đến chức năng của thực phẩm trong việc phòng và
chữa bệnh tật, ví nh dùng các loại thảo dợc để chữa bệnh, ăn các loại cây quả
đặc hiệu để dài tóc, trắng da vv Nhng chỉ khi khoa học phát triển đến độ cao,
con ngời có thể khám phá cấu trúc từng phân tử, phân tích đợc mối liên quan
giữa cấu trúc sinh hoá với chức năng của hàng loạt các thành phần hoá học cấu tạo
nên một thực phẩm nhất định và ảnh hởng của nó đến sức khoẻ con ngời; Khi
mà con ngời đã nhận rõ rằng trong một số loại thực phẩm, vì nó mang các thành
phần sinh hoá đặc biệt nên có tác dụng đặc biệt đối với sự phát triển của cơ thể
sống nh điều khiển sự tăng trởng, cân bằng trạng thái tinh thần hoặc kích thích
sự hoạt động của các cơ quan chức năng vv thì khái niệm thực phẩm chức
năng mới chính thức ra đời. Và nh vậy thực phẩm chức năng đợc định nghĩa
nh là một loại thực phẩm chứa các thành phần có hoạt tính sinh học, có khả năng
phòng chống một số bệnh tật, tăng cờng sức khoẻ dựa trên cơ sở của các quá trình
dinh dỡng.
Đờng chức năng là một bộ phận quan trọng trong nhóm thực phẩm chức
năng, đợc tập trung nghiên cứu nhiều trong những năm gần đây do phát hiện thấy
có nhiều đặc tính sinh học có lợi cho sức khoẻ nh chống sâu răng, chống bệnh
tiểu đờng, không gây béo phì, có khả năng kích thích hoạt động của hệ tiêu hoá


1

v.v Các đờng chức năng mới xuất hiện có: đờng panatinozamaltitol, sorbitol,
lactitol, fructooligosacarit xylooligosacarit, galactooligosacarit ,
izomaltooligosacarit, soybeanoligosacarit v.v [12] [74], Trong số đó đờng
fructooligosacarit (FOS) đợc nhiều nhà nghiên cứu chú ý hơn cả bởi công nghệ
sản xuất đơn giản, sản phẩm có hơng vị thơm ngon, lại có nhiều hoạt tính sinh
học có lợi cho cơ thể của ngời.
Công nghiệp sản xuất thực phẩm chức năng nói chung và đờng chức năng
nói riêng đang đợc phát triển mạnh trên thế giới, song ở Việt Nam lĩnh vực này
còn đang rất mới mẻ. Để hoà đồng cùng xu thế phát triển khoa học của thế giới, để
đáp ứng nhu cầu mới của ngời tiêu dùng, đề tài nghiên cứu sản xuất đờng
fructooligosacarit bằng công nghệ đa enzim và ứng dụng trong sản xuất thức ăn trẻ
em và bánh kẹo chức năng đợc tiến hành với các nội dung chính nh sau:
- Nghiên cứu quy trinh công nghệ sản xuất đờng FOS có độ tinh khiết cao
bằng phơng pháp đa enzim.
- Nghiên cứu sử dụng đờng FOS trong sản xuất bột dinh dỡng trẻ em
- Nghiên cứu sử dụng đờng FOS trong sản xuất bánh kẹo chống sâu răng,
chống béo phì và cho ngời mắc bệnh tiểu đờng.
- Nghiên cứu sử dụng đờng FOS trong sản xuất bánh bích quy chống sâu
răng, chống béo phì và cho ngời mắc bệnh tiểu đờng.

2




Chơng 1
Tổng quan tài liệu
1.1 Giới thiệu về fructooligosacarit (FOS)
1.1. 1 Fructooligosacarit trong tự nhiên và cấu tạo
Fructooligosacarit là những oligoza mà trong phân tử của chúng có một gốc
glucoza gắn kết với một vài gốc fructoza. Loại đờng này có nhiều trong thiên
nhiên, tồn tại trong các loại rau quả nh chuối, mận, đào , quýt, cây atiso, cà chua,
hành, tỏi v.v Hàm lợng FOS trong một số loại rau quả có thể tham khảo ở bảng
1.1[38].
Bảng 1.1: Hàm lợng FOS của một số loại cây quả (mg/g chất khô)
Loại cây quả Kestoza
(GF
2
)
Nystoza
(GF
3
)
Fructosyl-
nystoza (GF
4
)
Tổng FOS
(GF
n

)
Chuối
Quýt
Đào
Lê
Mận
Da hấu
Măng
Rau dền đỏ
Rau cần tây
Hành ta
Dứa Nhật Bản
Cà chua
Tỏi
Cây atiso
Hành tây
5,9
1,7
3,5
0,8
1,8
2,8
0,3
0,1
0,2
0,4
0,5
0,2
8,7
93,9

15,5
0,1
0,0
0,0
0,0
0,2
0,0
0,0
0,0
0,0
0,3
0,0
0,0
1,2
94,3
6,7
0,0
1,1
0,0
0,0
0,0
0,1
0,0
0,0
0,4
0,4
0,0
0,4
0,4
98,1

4,2
6,0
2,8
3,5
0,8
2,0
3,0
0,3
0,1
0,6
1,1
0,5
0,6
10,3
286,2
26,4
Trong tự nhiên FOS đợc hình thành dới tác dụng của enzim chuyển hoá
fructoza. Do các nguồn gốc của enzim chuyển hoá fructoza khác nhau mà các sản
phẩm chuyển hoá thu đợc không giống nhau về cấu tạo hoá học. Ví dụ enzim
chuyển hoá fructoza thu từ các loại nấm mốc nh Aureobasidium pululans [35] và
Aspergillus niger [8],[30] chỉ xúc tác tạo FOS dạng 1
F
, trong khi đó enzim thu


3

4
đợc từ chủng Claviceps purpurea[15] và từ củ măng tây [50], [51], [52], [53] lại
xúc tác tạo đồng thời cả hai loại FOS dạng 1
F
và 6
G
.
Vì đều là - D-fructan nên nhiều ngời thờng gọi tất cả các loại đờng
fructan, glucofructan và innunin là FOS [28], [39]. Nhng thực tế, FOS đợc gọi
chỉ đối với 1- gluco- (2- - fructofuranosyl)
n-1
oligofructoza, trong đó giá trị n= 2,3
hoặc 4 và đợc viết tắt dới dạng hỗn hợp của 3 loại đờng GF
2
(Kestoza), GF
3

(Nystoza) và GF
4
(Fructosylnystoza). Nh vậy FOS là hỗn hợp các dẫn xuất của
sacaroza mà trong cấu tạo phân tử có chứa 1 gốc sacaroza nối thêm 1, 2 hoặc 3
gốc fructoza thông qua mối liên kết (2-1) glucosit [9]. Công thức cấu tạo phân tử
của FOS đợc viết một cách tổng quát nh ở hình 1.1. Chỉ có cấu tạo nh trên FOS
mới mang hoạt tính sinh học có lợi cho sức khoẻ con ngời và động vật.
O
HOCH
2
O

CH
2
O
CH
2
OH
O
O
HOCH
2
CH
2
O
HOCH
2
CH
2
OH
O
CH
2
OH
O
O
HOCH
2
CH
2
O
HOCH

2
CH
2
OH
O
HOCH
2
O
CH
2
O
CH
2
OH
O
O
HOCH
2
CH
2
O
HOCH
2
CH
2
OH
O
HOCH
2
O

CH
2













0






Kestoza

o





Nystoza

o


Fructosylnystoza



Hình 1.1: Công thức cấu tạo của FOS [9]




Theo số liệu tính toán, ngời phơng Tây với mức ăn tiêu chuẩn một ngày
hấp thụ trung bình 2g- 4g FOS [46]. Tuy nhiên thành phần dinh dỡng của thực
phẩm phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh chủng loại cây trồng, điều kiện thổ nhỡng,
canh tác, thời gian thu hoạch, thời gian bảo quản v.v [11][57], do đó mức hấp
thụ FOS của con ngời tại các địa phơng khác nhau không giống nhau. Để tăng
cờng sự hấp thụ FOS nhằm lợi dụng đợc nhiều đặc tính sinh học u việt của
chúng, nhiều nơi ngời ta lựa chọn ăn những loại thực phẩm có hàm lợng FOS
cao.
1.1.2 Tính chất của FOS
1.1.2.1 Tính chất hoá lý
Mặc dù đã có nhiều bài báo công bố về FOS, song cho tới nay thông tin về
tính chất hoá lý của đờng này vẫn còn rất ít. Theo ý kiến của Gross [22], thì
kestoza là loại đờng kết tinh màu trắng có góc quay cực []
D
20
là +28

0
và nhiệt độ
nóng chảy là 199
0
C 200
0
C. Độ ngọt của kestoza, nystoza và fructosylnystoza
so với sacaroza tơng ứng là 31%, 32% và 16%. Còn độ ngọt tổng của hỗn hợp ba
đờng này (FOS) chỉ bằng 30% độ ngọt của sacaroza. Đờng FOS hút ẩm mạnh,
nên khó bảo quản ở trạng thái tinh thể trong thời gian dài. ở cùng một nồng độ,
FOS có độ nhớt tơng đơng với độ nhớt của sacaroza. Độ bền nhiệt của FOS cao
hơn sacaroza [43]. Đờng FOS bền trong dải pH 4.0- 7.0 và nhiệt độ cao tới 140
0
C.
Một số tác giả khác khi nghiên cứu về tính chất hoá lý của FOS đều đa ra một kết
luận chung là có nhiều tính chất hóa lý tơng tự sacaroza nh độ hoà tan, độ đông
đặc, nhiệt độ sôi và các thông số về quá trình kết tinh [68]. Khác với đờng
sacaroza FOS mang nhiều đặc tính sinh học u việt hơn. Đây chính là đặc điểm
khiến các nhà thực phẩm chú ý và tập chung khai thác loại đờng oligoza này.
1.1.2.2 ảnh hởng của FOS đến sự chuyển hóa hydratcabon.
Fructooligosacarit không hoặc rất ít bị thuỷ phân bởi hệ enzyme đờng ruột,
nên khi ăn lợng đờng trong máu không bị biến động [43],[61]. Thí nghiệm về sự
thay đổi hàm lợng đờng và insulin trong máu theo thời gian sau khi ăn FOS đã


5

cho kết quả nh hình 1.2; 1.3 và 1.4. Kết quả cho thấy trái với sacaroza khi ăn 25 g
FOS, trong khoảng thời gian 120 phút, lợng đờng trong máu không hề thay đổi.
0
50
100
150
200
250
0 25 50 75 100 125 150
Thời gian (phút)
Nồng độ insulin trong máu
(pmol/l)
Dùng sacaroza Dùng FOS

Hình 1.2: Sự thay đổi nồng độ insulin trong máu [43]



2
2.5
3
3.5
4
4.5
5
5.5
0 25 50 75 100 125
Thời gian (phút)
Nồng độ glucoza trong máu
(mmol/l)

Dùng sacaroza Dùng FOS

Hình 1.3: Sự thay đổi nồng độ glucoza trong máu[43]


6





Từ kết quả của một số nghiên cứu khác cho thấy, đối với những ngời bị
mắc bệnh tiểu đờng nếu mỗi ngày ăn 8g FOS, lợng đờng trong máu sẽ giảm
nhanh trong vòng 14 ngày [70].
Những biến đổi có tính tích cực phát sinh khi chuyển hoá glucoza và chất béo
trong quá trình trao đổi chất với sự hiện diện của FOS đợc Wang. X và các cộng
sự của ông nghiên cứu [67]. Các tác giả đã kết luận rằng nguyên nhân của các hiệu
ứng này là do FOS không bị tiêu hoá ở ruột non bởi tác dụng của hệ enzim đờng
ruột, mà bị lên men trong ruột già dới tác dụng của vi khuẩn Bifidobacterium (là
một chi trong họ Lactobacteraceae, tế bào hình que, phân nhánh, thẳng hoặc cong,
bất động, gram +, sống kỵ khí, a ấm, không sinh bào tử, thờng gặp trong ruột
già). Kết quả của quá trình là sinh ra các axit béo đoản mạch (SCFA) nh axit
acetic, axit propionic và axit butyric. Các chất này sauđó đợc thấm vào thành ruột
già hoặc chuyển lên gan và ức chế sự gia tăng của glucoza và chất béo trong máu.
0
30
60
90
120
150

180
210
0 25 50 75 100 125
Thời gian (phút)
Nồng độ fructoza trong máu
(mmol/l)
Dùng sacaroza Dùng FOS
Hình 1.4: Sự thay đổi nồng độ fructoza trong máu[43]



7




Thí nghiệm trên cơ thể chuột của Tokunaga [61] cũng chứng tỏ kết luận
trên. Tác giả này đã chỉ ra rằng hàm lợng axit béo đoản mạch trong 1g phân của
nhóm chuột ăn FOS cao hơn rất nhiều so với nhóm chuột đối chứng ăn sacaroza.
Đối với bệnh nhân mắc bệnh tiểu đờng (có hoặc không rối loạn tiết
insulin) ngoài sự bất bình thờng về hàm lợng đờng trong máu, chất béo trong
máu cũng luôn bị rối loạn. Cả hai nhân tố trên đều có ảnh hởng nh nhau đối với
bệnh lý [5]. Vì thế việc hạn chế sự gia tăng hàm lợng chất béo trong máu cũng là
một biện pháp để chữa bệnh tiểu đờng. Với ý tởng trên, Agheli và các cộng sự
gần đây đã nghiên cứu và chỉ ra rằng nhóm chuột mắc bệnh tiểu đờng có kháng
tiết isulin khi ăn thức ăn có chứa 10% FOS đã giảm đáng kể hàm lợng chất béo tự
do và triglycerit trong máu. Kết quả này đã khẳng định lại báo cáo trớc đó của
Delzenne [14], ngời đã chỉ ra rằng FOS có khả năng làm giảm lợng chất béo
trong máu của chuột. Cũng theo Agheli FOS không chỉ làm thay đổi hàm lợng
chất béo trong máu mà còn có thể điều chỉnh sự tạo ra các enzim tổng hợp axít

béo. Trong gan, hoạt lực của enzim trên tăng lên nếu chỉ ăn sacaroza nhng sẽ
đợc bình thờng hoá bởi sự cung ứng FOS. Nh vậy FOS có vai trò khá tích cực
trong việc phòng và chữa bệnh tiểu đờng xét ở góc độ bệnh lý liên quan đến sự
gia tăng của lipoprotein trong máu. Vì thế FOS hiện nay đợc dùng nhiều nh là
một chất ngọt thấp năng lợng đặc biệt dành cho các đối tợng mắc bệnh tiểu
đờng.
1.1.2.3 ảnh hởng của FOS đến hệ vi sinh vật đại tràng
Tác động của FOS đến hệ vi sinh vật đờng ruột đã đợc nhiều tác giả
nghiên cứu. Bằng thí nghiệm ngoại thể Gross. D khi nghiên cứu hệ vi sinh vật trực
tràng cho thấy các nòi Bifidobacterium spp. và Bacteroides spp có thể phát triển
mạnh trong môi trờng dinh dỡng có chứa FOS, ngợc lại Escherichia coli và
Clostridium perfringens lại bị tiêu diệt trong môi trờng này [18],[22]. Còn kết
quả thí nghiệm trên cơ thể cho thấy cả hai đối tợng ngời và động vật ở các lứa
tuổi khác nhau sau khi ăn FOS cho thấy số lợng vi sinh vật Bifidobacterium và
Lactobacilli trong đại tràng tăng lên, trong khi đó số lợng vi sinh vật Clostridium


8




perfringens lại giảm xuống [21][28]. Thí nghiệm còn chỉ rõ rằng do FOS có cấu
tạo mạch thẳng ngắn nên đã tác động đến khả năng lên men của các vi sinh vật nói
trên. Còn các loại fructooligoza mạch nhánh hoặc innulin mạch thẳng nhng dài
thì ảnh hởng trên rất hạn chế.
Hiện nay Bifidobacterium đợc đặc biệt quan tâm trong lĩnh vực sinh học
bởi nó mang nhiều lợi ích cho cơ thể sống. Vi khuẩn Bifidobacterium tồn tại và
phát huy tác dụng ngay trong cơ thể chủ, điều này rất có ý nghĩa vì nó có thể
phòng chống các bệnh tật về đờng ruột, do Bifidobacterium có khả năng sản sinh

các axit mạch ngắn nh axit axetic, axit lactic trong quá trình lên men đờng. Sự
gia tăng hàm lợng axit sẽ có tác dụng giảm pH trong đờng ruột, giữ gìn hoạt
động trao đổi chất của các vi sinh vật đờng ruột khác ổn định, đúng quy luật, hạn
chế hoặc ngăn ngừa sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh và các vi sinh vật
gây thối rữa. ở mức độ cao hơn nghiên cứu còn chỉ ra rằng quá trình giảm pH
trong đờng ruột có tác dụng trực tiếp phòng và trị bệnh ung th ruột thông qua
việc ngăn trừ sự phát triển của bacterium hoại sinh và ức chế hoạt lực của các
enzim nh nitroreductaza, - glucoronidaza và decarboxylaza [37]. Đây là những
enzim tham gia quá trình chuyển hoá nitơ tạo các sản phẩm trung gian có khả năng
gây ung th (những dẫn xuất phenol của tyrosin và tryprophan) [9]. Ngoài ra vi
khuẩn Bifidobacterium còn có khả năng tạo vitamin, nhất là vitamin nhóm B, giảm
cholesterol trong máu và tái sinh hệ vi sinh vật đờng ruột cho các bệnh nhân sau
khi dùng nhiều kháng sinh điều trị bệnh.
1.1.2.4 ảnh hởng của FOS đến bệnh sâu răng
Bệnh sâu răng chủ yếu là do vi khuẩn Streptococci đột biến và các liên cầu
khuẩn gây nên. Các vi sinh vật trên có rất nhiều trong khoang miệng của ngời và
động vật. Khi thức ăn đa vào, chúng sẽ lựa chọn các thành phần dinh dỡng phù
hợp để lên men, phát triển và gây bệnh. Vì vậy nếu trong thành phần thức ăn của ta
không chứa hoặc chứa ít chất thích hợp cho quá trình dinh dỡng của loại vi sinh
vật trên sẽ có thể ngăn ngừa đợc bệnh. Để xét ảnh hởng của FOS đến bệnh sâu
răng ngời ta đã thí nghiệm trên cơ thể chuột. Kết quả cho thấy nhóm chuột thí


9




nghiệm (ăn FOS) bị sâu răng ít hơn nhiều so với nhóm chuột đối chứng (ăn
sacaroza). Các thí nghiệm nuôi cấy vi sinh vật phân lập từ khoang miệng lên môi

trờng FOS đã chứng tỏ cơ chế về khả năng phòng bệnh sâu răng của nó. Đó là do
FOS không phải là môi trờng thích hợp cho các vi sinh vật gây bệnh trên phát
triển [31]. Ngoài ra Ikeda. T còn nghiên cứu cho thấy FOS không những chỉ có khả
năng phòng mà còn có khả năng chữa bệnh bệnh sâu răng [32]. Vì thế ngày nay
nhiều nơi trên thế giới ngời ta đã dùng FOS thay thế cho đờng kính trong thành
phần ăn hoặc trong chế biến bánh kẹo, đặc biệt là bánh kẹo cho trẻ em để phòng
bệnh sâu răng.
1.1.2.5 Vai trò thúc đẩy quá trình hấp thụ caxi của FOS
Nhiều nghiên cứu cho thấy, sử dụng FOS có thể tăng cờng sự hấp thụ canxi
của tế bào [39], [40]. Nhờ đặc tính này, FOS có thể giúp cho con ngời phòng và
chống các bệnh về chuyển hoá và bệnh loãng xơng. Quá trình thúc đẩy hấp thụ
canxi của FOS xảy ra trong ruột già [41]. Cơ chế thúc đẩy trên cha đợc xác
định một cách rõ ràng nhng các tác giả đều có một kết luận chung là do ba yếu
tố sau [42] :
Đờng FOS trong ruột già bị các vi sinh vật sinh axit lên men, làm giảm pH
của môi trờng, dẫn đến sự tái hoà tan của các muối canxi.
Trong ruột già vi khuẩn Bifidobacterium lên men mạnh khi môi trờng có
chứa FOS sinh ra các axit mạch ngắn, các axit này khuyếch tán vào tế bào biểu bì
thành ruột, từ đó thúc đẩy sự hấp thụ canxi.
Sự dịch chuyển FOS trong ruột già sẽ kéo theo sự dịch chuyển của hợp chất
canxi-protein, nhờ đó canxi đợc tiếp xúc nhiều hơn với các tế bào thành ruột, tạo
điều kiện tốt cho sự hấp thụ vào máu. Ngoài canxi, FOS đồng thời còn thúc đẩy sự
hấp thụ cả magiê[40], [41]. Điều này thúc đẩy quá trình phát triển xơng, tăng
cờng hàm lợng canxi trong xơng.
1.1.3 Tính an toàn của FOS
Để khẳng định tính an toàn của FOS đối với cơ thể sống, đã có nhiều nghiên
cứu về tế bào và gen của động vật ăn FOS. Các nghiên cứu này chủ yếu tập trung


10

để trả lời các câu hỏi là khi động vật sử dụng FOS có ảnh hởng đến khả năng
kháng khuẩn của tế bào hay không? Có gây ra đột biến về gen dẫn đến sự tổng hợp
ADN bất qui tắc hay không? Tất cả các nghiên cứu đã đi đến kết luận là FOS
không gây độc hại đến tế bào của chủ thể [61]. Tác giả Clevenger M.A. còn làm
thí nghiệm trên chuột để kiểm tra về độc tố cấp tính và mãn tính cũng nh khả
năng gây ung th của FOS . Kết quả cho thấy FOS không có biểu hiện của các độc
tố khi cho chuột ăn hơn 2,17mg/kg/ngày [11].
1.2 ứng dụng của FOS
Phụ thuộc vào độ tinh khiết, FOS thơng phẩm chủ yếu có hai loại là FOS phổ
thông (độ tinh khiết từ 45% đến 60%) và FOS cao độ (độ tinh khiết cao hơn 75 %).
Đờng FOS phổ thông thờng đợc dùng trực tiếp nh một loại thực phẩm hoặc
nh một chất ngọt bổ sung trong chế biến các loại thực phẩm khác. Còn FOS cao
độ thờng để chuyên dùng cho các đối tợng mắc bệnh, ăn kiêng. Ngoài ra còn có
loại tinh khiết 100 % dùng cho công việc phân tích hoá học. Loại có độ tinh khiết
thấp có thể dùng làm chất bổ sung trong môi trờng nuôi cấy vi khuẩn
Bifidobacterium.
Theo tài liệu công bố thì cơ thể ngời một ngày chỉ có thể hấp thụ 2-12g FOS,
nên việc dùng FOS bổ sung vào thực phẩm khác nh một chất phụ gia để tăng
cờng hoạt tính sinh học của thực phẩm là ứng dụng đầu tiên và quan trọng của
FOS trong lĩnh vực chế biến thực phẩm. Do FOS có đặc tính là có vị ngọt, thấp
năng lợng và có hoạt tính sinh học nên thờng đợc bổ sung vào các loại bánh,
kẹo, bánh quy và các sản phẩm của sữa hoặc kết hợp trộn lẫn vào trong các chất
ngọt khác.
ở Nhật Bản FOS đợc dùng để bổ sung vào hơn 500 loại thực phẩm [65].
Năm 1984 ở nớc này đã có một thị trờng rộng lớn cho FOS. Đến năm 1990
lợng FOS tiêu thụ trong cả nớc lên đến 4000 tấn. Đờng FOS bán trên thị trờng

Nhật Bản rất đa dạng, từ loại có hàm l
ợng rất thấp đến loại có độ tinh khiết cao
đến 98%, phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, loại hàm lợng thấp dùng làm
chất kích thích trong môi trờng lên men cho vi khuẩn Bifidobacterium, chất có


11




hàm lợng trung bình dùng cho ngời ăn trực tiếp hoặc bổ sung vào thực phẩm còn
loại tinh khiết dùng trong kỹ thuật phân tích [75].
ở Mỹ và Nhật Bản ngời ta còn sử dụng FOS để làm chất bổ sung trong thức
ăn cho gia súc. Nhờ đặc tính của FOS là có thể tăng cờng hoạt động của hệ tiêu
hoá nên giúp cho gia súc ăn nhiều, tăng cân nhanh .
Tại Trung Quốc đến tận năm 1992 công nghiệp sản xuất FOS mới bắt đầu,
nhng trong vòng mời năm ngành công nghiệp này đã có bớc phát triển vợt
bậc. Nếu nh năm 1999 toàn Trung Quốc mới chỉ có 2 nhà máy sản xuất FOS tại
Vân Nam và Giang Tô với công suất 2000 tấn/năm thì đến đầu năm 2002 số nhà
máy sản xuất FOS trong toàn quốc đã lên đến mời cơ sở với công suất từ 2000 tấn
đến 4000 tấn/năm. Sản phẩm FOS ở nớc này đợc dùng nhiều cho các đối tợng
già, trẻ em và những ngời bệnh trong thời kỳ phục hồi sức khoẻ để tăng cờng
hoạt động tiêu hoá, giúp cho các đối tợng trên nhuận tràng, ăn tốt.
ở Mỹ và Châu Âu, nhiều công ty đã và đang xin chứng chỉ của GRAS
(Generally Recognized As Safe) cho việc sử dụng sản phẩm FOS của mình [75], và
nh thế FOS đã đợc công nhận chính thức bằng văn bản về độ an toàn thực phẩm
[54], [63]. Nhờ đó số lợng ngời tiêu dùng FOS ngày càng tăng cao.
1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất FOS trên thế giới
Fructooligosacarit có thể thu nhận đợc bằng cách chiết suất chúng từ các loại

cây quả, hoặc bằng các phơng pháp hoá học, hoá lý, hoá sinh v.v Nhng cho tới
nay phơng pháp đợc coi là hiệu quả và có khả năng công nghiệp hoá nhất là
phơng pháp công nghệ sinh học. Bắt đầu bằng sự phát hiện một số chủng nấm
men và nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzim xúc tác quá trình chuyển hoá
sacaroza thành FOS, cho tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về lĩnh vực sản xuất
đờng này theo công nghệ sinh hóa. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc
phân lập tuyển chọn giống để sinh tổng hợp enzim , ứng dụng enzim trong sản xuất
FOS và nghiên cứu tinh chế FOS v.v
1.3.1 Nghiên cứu sinh tổng hợp enzim cho sản xuất FOS


12




Vì enzim chuyển hoá fructoza trong thực vật có hoạt tính thấp và thờng là
hỗn hợp của một vài loại và lại bị hạn chế khai thác do có tính thời vụ, nên việc
chiết tách enzim từ thực vật để phục vụ cho công nghiệp sản xuất FOS không có
tính khả thi.
Cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học, việc ứng dụng vi sinh vật
trong sản xuất enzim ngày càng nhiều. Cũng nh các loại enzim khác, nguồn cung
cấp enzim chuyển hoá fructoza cho công nghiệp chế biến FOS chủ yếu là từ vi sinh
vật. Hidaka và các cộng sự [29], [30], [31] là những ngời đầu tiên nghiên cứu khả
năng công nghiệp hoá sản xuất FOS từ đờng kính. Ông cũng là ngời đã đa ra
phơng pháp xác định hoạt lực FTS và đại lợng biểu thị mối liên quan giữa hoạt
lực FTS và hiệu suất chuyển hoá sacaroza thành FOS (tỷ lệ hoạt tính chuyển hoá
với hoạt tính thuỷ phân U
T
/U

H
) mà cho tới nay vẫn đợc coi nh là phơng pháp cơ
sở cho hầu hết các nghiên cứu liên quan tới FOS. Bằng nghiên cứu của mình
Hidaka đã tìm ra nhiều chủng vi sinh vật thuộc các loài nh Aspegillus awamori,
Saccharomices cerivisiae, Aspegillus niger có khả năng tổng hợp FTS. Thông
qua quá trình phân lập, tuyển chọn theo hoạt lực chuyển hoá và tỷ lệ hoạt tính
chuyển hoá với hoạt tính thuỷ phân (U
T
/U
H
), tác giả đã khẳng định nấm mốc Asp.
niger là nguồn vi sinh vật tốt nhất cho lên men tổng hợp FTS.
Khả năng sinh tổng hợp FTS của A.pullulans cũng đợc Jung K.H và các
cộng sự nghiên cứu [34]. Tác giả này đã kết luận rằng sacaroza là nguồn cacbon lý
tởng cho lên men sinh tổng hợp FTS và hiệu suất tổng hợp FTS của chủng vi sinh
vật trên tăng tỷ lệ thuận với nồng độ sacaroza trong môi trờng lên men Khi
nghiên cứu thu nhận FTS từ F. oxysporum, tác giả ngời Anh Patel V. và các cộng
sự [44] còn đi đến kết luận rằng quá trình lên men của vi sinh vật trong môi trờng
chứa sacaroza có sự tổng hợp FTS mang hoạt tính invectaza và hoạt tính chuyển
hoá. Năm 1992 Bo Jiang [8] đã phân lập đợc một chủng Asp. niger AS0023 có
khả năng tổng hợp FTS với hoạt lực cao. Ngoài ra còn rất nhiều tác giả khác nh
Hayashi [27] đã nghiên cứu chọn ra chủng Aureobasidium sp dùng để sinh tổng
hợp FTS cho sản xuất FOS. Jung[34] và Smith [52] cũng có các công bố về khả


13

năng sinh FTS của loài Aureobasidium pullulans. Van Balken [66] đã nghiên cứu
thành công quá trình tổng hợp FTS từ Aspegillus phoenicis và đã ứng dụng để sản
xuất FOS đạt độ tinh khiết 60%. Fujita [20] đã phát hiện giống A. bacterium cũng
có khả năng tổng hợp FTS. Gần đây Takeda còn tìm ra loại mốc Scopulariosis
brevicaulis có khả năng tổng hợp FTS chỉ xúc tác tạo đờng 1-kestoza. Ngoài ra
các vi sinh vật khác nh A.japonicus [10] Penicillium rigolosum [7], Acetobacter
diazo-trokicus SRT4 [59] cũng có khả năng tổng hợp FTS, các vi sinh vật này đã
đợc nghiên cứu và ứng dụng trong công nghiệp sản xuất FOS.
Một đặc điểm chung cho tất cả các kết quả nghiên cứu trên cho thấy, hầu
hết FTS trong các vi sinh vật tìm đợc chủ yếu là enzim nội bào và luôn chứa đồng
thời cả hai hoạt tính là thuỷ phân và chuyển hoá. Tỷ lệ hoạt lực của hai hoạt tính
trên thay đổi phụ thuộc vào chủng loại giống và điều kiện lên men, điều kiện phản
ứng vv
1.3.2 Nghiên cứu và sản xuất FOS 50 (FOS phổ thông)
Hiện nay ở Nhật, Trung Quốc, Hàn Quốc, Mỹ và các nớc khác, FOS đã
đợc sản xuất ở qui mô công nghiệp và hàng năm cho ra thị trờng hàng ngàn tấn
sản phẩm [64]. Thông thờng FOS phổ thông đợc sản xuất theo phơng thức liên
tục và không liên tục. Trong phơng thức sản xuất liên tục công nghệ cố định
enzim hoặc cố định tế bào đợc sử dụng, còn đối với phơng thức sản xuất không
liên tục thì sử dụng enzim đã chiết tách [8], [26], [69], [73]. Giải pháp cố định
enzim và cố đinh tế bào trong sản xuất FOS cho hiệu quả cao hơn vì sản xuất đợc
liên tục, tiêu hao năng lợng ít, nhà xởng nhỏ v.v nhng tính ổn định kém và
cần máy móc thiết bị hiện đại, nhà xởng tiêu chuẩn. Mặc dù vậy, đây lại là
phơng pháp có khả năng công nghiệp hoá cao và đợc tập trung nghiên cứu nhiều
ở các nớc có nền công nghiệp phát triển nh Nhật Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc
v.v
Các công bố kết quả nghiên cứu về cố định enzim để sản xuất FOS rất
nhiều. Điển hình có Hayashi S. [26]. Tác giả này đã cố định FTS tổng hợp từ
A.
pullulans sp để sản xuất FOS. Ngoài ra Yun J.W., một tác giả ngời Hàn Quốc

14




cũng đã nghiên cứu thành công công nghệ sản xuất FOS liên tục bằng phơng
pháp cố định FTS trên các hạt nhựa trao đổi ion.
Đối với công nghệ cố định tế bào, Jiang Bo đã tìm ra chất mang thích hợp
cho cố định tế bào phát triển Asp. niger AS0023 để sản xuất FOS là canxi alginat.
Tác giả sau đó cũng đã xác định đợc các thông số kỹ thuật thích ứng cho quá
trình chuyển hoá FOS từ sacaroza trên cột phản ứng.
Phơng thức không liên tục trong sản xuất FOS đòi hỏi phải trang bị thêm
một công đoạn trích ly enzim và làm sạch tạp chất sau quá trình chuyển hoá. Bù lại
kỹ thuật sản xuất lại đơn giản và thiết bị cũng rẻ tiền hơn. Phơng pháp này đợc
sử dụng nhiều ở các qui mô nhỏ, đầu t thấp. Nghiên cứu công nghệ này có Yun, J.
W., [33], theo phơng pháp này tác giả đã kết hợp FTS với các enzim khác sản
xuất ra FOS có độ tinh khiết cao tới 98%. Ngoài hai giải pháp trên hiện nay ngời
ta còn dùng phơng pháp đơn giản, với phơng pháp này tế bào vi sinh vật đợc sử
dụng nh một nguồn enzim. Phơng pháp đơn giản này đang đợc dùng trong một
số nhà máy ở Trung Quốc.
1.3.3 Nghiên cứu và sản xuất FOS cao độ
Quá trình chuyển hóa sacaroza thành FOS phổ thông dới tác dụng của FTS
có thể biểu diễn một cách tổng quát nh sau:
GF + GF > G + GF +
GF
2
+ GF
3

+ GF
4

Sacaroza Sacaroza Glucoza Sacaroza FOS

Qua phơng trình phản ứng ta thấy, ngoài FOS ra, sản phẩm thu đợc còn
chứa một lợng glucoza nhất định. Đờng glucoza xuất hiện trong phản ứng không
những làm giảm độ tinh khiết của FOS mà còn ức chế hoạt tính của enzim. Vì chất
ức chế này mà ta chỉ thu đợc dịch đờng phổ thông có nồng độ FOS không quá
55 % còn lại hơn 45 % là sacaroza và glucoza. Vì thế muốn thu đợc FOS có độ
tinh khiết cao (FOS cao độ) hoặc FOS tinh khiết, cần thiết phải tách bỏ hoặc
chuyển hoá lợng glucoza và sacaroza còn sót lại. Cho tới nay các phơng pháp
loại bỏ đợc áp dụng chủ yếu bao gồm:


15




+ Lọc gel [35], [60]: ở Nhật gần đây phơng pháp này đã đợc đa vào áp
dụng ở qui mô công nghiệp. Dựa trên nguyên lí của sự khác nhau về kích cỡ phân
tử của các cấu tử phân tán trong dịch mà ngời ta phân li đợc riêng rẽ từng loại
đờng, nhờ đó có thể tách, loại bỏ glucoza ra. Phơng pháp này cần có hệ thống
thiết bị tinh lọc đồng bộ đắt tiền do đó hiệu quả kinh tế không cao.
+ Lọc Nano: Đây là một phơng pháp mới, sử dụng kỹ thuật thẩm thấu
ngợc, có nhiều tính u việt rất phù hợp với qui mô công nghiệp.
+ Dùng công nghệ lên men: Phơng pháp này đợc thực hiện thông qua việc
sử dụng vi sinh vật để lên men glucoza có trong dung dịch, loại vi sinh vật hay
đợc dùng là nấm men [4][47]. Phơng pháp này đợc sử dụng rất nhiều bởi nó

cho hiệu quả kinh tế cao, tuy thế nó cũng còn tồn tại là sản phẩm FOS bị nhiễm
bẩn và gây mùi vị lạ.
+ Dùng công nghệ enzim: Có hai loại enzim đợc sử dụng để phân giải
glucoza là glucoizomeraza (GI) và glucooxidaza (GOD) [69].
- Sử dụng enzim GI [8], [71]: Trong phơng pháp này enzim GI có vai trò
trong chuyển hoá glucoza có trong dịch thành fructoza. Về lí thuyết fructoza mới
sinh ra lại gắn kết với sacaroza để tạo thành FOS. Nhng trong thực tế thí nghiệm
cho thấy fructoza mới tạo ra không có khả năng gắn kết với sacaroza, kestoza hoặc
nystoza. Vì thế trong phơng pháp này chỉ có thể làm giảm glucoza trong dịch
thủy phân chứ không nâng cao độ tinh khiết của dịch FOS đợc.
- Sử dụng enzim GOD [72]: Bằng cách này enzim GOD có nhiệm vụ phân
giải glucoza thành axit gluconic. Đây là loại enzim đợc coi là có hiệu quả nhất
trong việc chuyển hoá glucoza trong sản xuất FOS [36].
Cũng nh trong sản xuất FOS phổ thông, công nghệ sản xuất FOS tinh khiết
có thể thực hiện bằng hai phơng pháp là cố định và không cố định enzim (tế bào).
Đại đa số các nghiên cứu đã chọn hệ enzim FTS, GOD và catalaza (CAT), cố định
trên chất mang nh canxi alginat và hạt trao đổi ion rồi đợc nhồi vào cột phản
ứng. Với công nghệ này Yun, J. W. [73] đã liên tục sản xuất đợc FOS có độ tinh
khiết cao hơn 90 %. Jiang Bo còn kết hợp cố định tế bào nấm mốc AS0023 với


16