Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến androstendion (AD) và 9 alpha hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa dược

BỘ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ






BÁO CÁO NHIỆM VỤ HỢP TÁC QUỐC TẾ
THEO NGHỊ ĐỊNH THƯ VIỆT NAM - LB NGA
(2007 - 2010)


Tên Nhiệm vụ:

“Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến androstendion (AD)
và 9alpha-hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa- dược”


Cơ quan chủ trì: Viện Hóa học
Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam

Chủ nhiệm: PGS.TS. Lưu Đức Huy

8176




HÀ NỘ
I – 6/ 2010


THÔNG TIN TÓM TẮT VỀ NHIỆM VỤ

1.Tên nhiệm vụ: “Nghiên cứu công nghệ vi sinh chuyển hóa phytosterol đến
androstendion (AD) và 9alpha-hydroxy AD sử dụng trong công nghiệp hóa- dược”

2.Mã số:
3.Thời gian thực hiện: 6/2007- 6/2010
4.Cơ quan thực hiện:
Phía Việt nam:
Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam
Địa chỉ: 18- Hoàng Quốc Việt- Cầu Giấy- Hà Nội
Điện thoại: 84-4-37564312, 84-4-37564333/ 1058
Fax: 84-4-38361283
Email:

Website: www.vienhoahoc.ac.vn

Phía LB Nga:
Trung tâm kỹ thuật sinh học, Viện HL KH LB Nga
Địa chỉ: Prosp. 60 let Oktyabrya 7 kor.1, Moscow, 117312 Russian Federation
Điện thoại: +007-095 135 7319
Fax: +007-095 1350571
Email:

5.Chủ nhiệm đề tài:
Phía Việt nam: PGS. TS. Lưu Đức Huy
Viện Hóa học- Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam
Phía LB Nga: TS. Andryushina V.A.
Trưởng phòng thí nghiệm công nghệ vi sinh steroid- TT kỹ thuật sinh học –
Viện HL KH LB Nga
6.Mục tiêu nhiệm vụ:
- Có được công nghệ tiên tiến chỉ một vài cường quốc KHCN có, rấ
t cần thiết cho
công nghiệp sản xuất thuốc steroid từ nguyên liệu mới phytosterol mà Việt Nam
hiện tại không thể tự nghiên cứu, đó là 02 công nghệ vi sinh chuyển hoá
phytosterol đến androstenedione (AD) và từ AD đến 9alpha- OH AD.
- Làm cho sterol dồi dào thế mạnh của Việt nam trở thành nguyên liệu số 1 tổng
hợp các loại thuốc steroid thay thế diosgenin và solasodin không có sức cạnh tranh
vì phải trồng trên đất nông nghiệp nhiều năm là mục tiêu chung.
-Đào tạo chuyên gia về khoa họ
c công nghệ hoá- dược steroid và CNSH vi sinh
steroid dược phẩm.

7. Danh sách cán bộ khoa học tham gia chủ chốt :

Phía Việt nam:

Họ và tên Học hàm, học vị
Chuyên môn
Cơ quan
1 Lưu Đức Huy PGS. TS. NCVC Viện Hóa học
2 Nguyễn Thị Diệp Ths.NCV Viện Hóa học
3 Mai H.Th. Tùng HVCH Viện Hóa học
4 Lưu Thị Kim Nhung NCV Viện Hóa học
5 Trương Nam Hải PGS TS NCVC Viện Công nghệ sinh học
6 Nguyễn Thị Quý Ths.NCV Viện Công nghệ sinh học
7 Phạm Thị Bích Hợp TS.NCVC Viện Công nghệ sinh học




Phía LB Nga:

1 Andryushina V.A. TS.NCVCC TT Kỹ thật sinh học,
VHL KH LB Nga
2 Savinova T.S. TS.GVC TT Kỹ thật sinh học,
VHL KH LB Nga
3 Rodina N.V. NCS TT Kỹ thật sinh học,
VHL KH LB Nga
4 Voyshvillo N.E. TS.NCVCC TT Kỹ thật sinh học,
VHL KH LB Nga

LỜI CẢM ƠN

Thay mặt tập thể cán bộ khoa học thực hiện đề tài, chúng tôi xin cảm ơn chân
thành Bộ Khoa học và Công nghệ, Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam, Viện Hóa
học, tất cả các cơ quan chức năng ban ngành đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và cần thiết
để đề tài được triển khai đạt kết quả tốt và hoàn thành đúng hạn.

Xin chân thành cả
m ơn Trung tâm Kỹ thuật sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học LB
Nga , đặc biệt là các cán bộ khoa học TS. Andryushina A.V., TS. Voyshvillo N.E, TS.
Savinova T.S. và TS. Rodina N.E. đã phối hợp chặt chẽ và trực tiếp với phía Việt nam
để hoàn thành tốt các nhiệm vụ đặt ra .

Xin chân thành cảm ơn Viện CNSH, Viện KHCNVN đứng đầu là PGS.TS.
Trương Nam Hải đã phối hợp chặt chẽ cùng chúng tôi để hoàn thành tốt Nhiệm vụ
đúng hạn.

Đề tài đã nhận
được tài trợ toàn bộ của Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam theo
dự án với LB Nga 2007-2010, Mã s
ố………………… Ban chủ nhiệm đề tài xin ghi nhận
và chân thành cảm ơn!

Chủ nhiệm




PGS.TS. Lưu Đức Huy







MỤC LỤC

PHẦN A: BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT ĐỀ TÀI
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
LỜI MỞ ĐẦU…………………………………………………………………………….1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………………… 3
1.1.Vài nét về sản xuất, nhu cầu tiêu thụ dược phẩm gốc steroid, trên thế giới 3
1.2. Giới thiệu về sterol 4
1.3.Chuyển hóa vi sinh sterol đến 17-cetosteroid và ….:……………………………… 6
1.3.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước:……………………………………………… ….6
1.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước………………………………………………… 8
1.4.Thu hồi, tinh chế phytosterol từ phế phụ thải công nghiệp:………………………… 9

1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước:………………………………………………….9
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước liên quan đến Nhiệm
vụ:……………………… 9
1.4.2.1.Tình hình nghiên cứu, sản xuất và tiêu thụ dược phẩm steroid trong nước
…………………………………………………………………………………………….
.9
1.4.2.2.Nghiên cứu của chủ nhiệm & Cs liên quan đến Nhiệm vụ:………………… 11
CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU…………………………… 13
2. 1. Phương pháp nghiên cứu sterol ………………………………………… 13
2.1.1.Chiết suất sterol : 13
2.1.2.Các phương pháp phân tích sterol ………… …………………………………14
2.2.Phương pháp vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh hỗn hợp sterol đến 17-
cetosteroid :……………………………………………………………………………18
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ ĐẠT ĐƯỢC …………………………………………… 20


3.1.Tiếp nhận và hoàn thiện 02 công nghệ vi sinh sản xuất Androstendion (CN1) và 9α
- hydroxy Androstendion (CN2) quy mô phòng thí nghiệm từ Trung tâm Kỹ thuật sinh
học- Viện HL KH LB Nga…………………………………………………………….20
3.2.Triển khai kiểm tra CN1 và CN2 trên fermentor 5,0 lít………………………… 28
3.3. Triển khai CN2 chuyển hoá vi sinh AD đến 9α - OH AD trên fermentor pilot 80 L
do Mỹ sản xuất:…………………………………………………………………… 39
3.4. Triển khai lặp lại CN2 chuyển hoá vi sinh AD đến 9α - OH AD lên quy mô pilot 80
L………………………………………………………………………………………44
3. 5.Nghiên cứu lắp đặt và triển khai công nghệ quy mô 50 L chiết xuất tinh chế
phytosterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu t
ương………………………48
3.6. Phân tích giám định các sản phẩm bằng các phương pháp
phổ: 63

CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ KHÁC……………………………………………………….67
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ………………………………………………………….69
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………….… 72
PHẦN B:PHỤ LỤC ( Đóng thành cuốn riêng):
Không đánh số trang, được bố trí theo thứ tự
• Đề cương và Hợp đồng
• Công nghệ 1 vi sinh sản xuất Androstendion ( AD) từ hỗn hợp phytosterol
• Công nghệ 2 vi sinh sản xu
ất 9alpha- hydroxy Androstendion (9α-OH AD) từ AD
• Các tài liệu về kết quả phân tích các sản phẩm phytosterol, AD và 9α- OH AD
• Sao lục các phổ
• Các báo cáo khoa học của đơn vị phối hợp- Viện CNSH
• Các công bố khoa học liên quan
• Minh chứng các kết quả đào tạo
• Báo cáo thống kê kết quả thực hiện đề tài
• Báo cáo tóm tắt ( 02 tr.) kết quả thực hiện đề tài ( tiế
ng Việt và tiếng Anh)
• Báo cáo quyết toán tài chính đề tài


• Biên bản kiểm tra định kỳ của Bộ KH & CN
• Công văn của Bộ KH & CN cho phép điều chỉnh nội dung và kinh phí đề tài

CÁC TÀI LIỆU KÈM THEO:
-Quyết định thành lập hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở
-Biên bản cuộc họp hội đồng cấp cơ sở
-Phiếu nhận xét- GS TSKH Trần Văn Sung
-Phiếu nhận xét- PGS TS Lê Mai Hương
-Phiếu nhận xét- PGS TS Nguyễn Văn Tuyế
n

-Phiếu nhận xét- PGS TS Nguyễn Hải Nam
-Phiếu nhận xét- PGS TS Phan Minh Giang
-Phiếu nhận xét- TS Trần Văn Thanh
-Phiếu nhận xét- TS Đỗ Quốc Việt
-Giấy xác nhận đã hoàn thiện, chỉnh sửa Hồ sơ của Hội đồng nghiệm thu cấp cơ sở
-Quyết định thành lập hội đồng nghiệm thu cấp nhà nước
-Biên bản cuộc họp hội đồng cấp nhà nước
-Gi
ấy xác nhận đã hoàn thiện, chỉnh sửa Hồ sơ của Hội đồng nghiệm thu cấp nhà nước
-Giấy chứng nhận của Cục trưởng cục thông tin khoa học và công nghệ quốc gia…….
Các tài liêu sau Bộ KH & CN lưu giữ, không yêu cầu đưa vào Hồ sơ:
- Phiếu nhận xét – GS TSKH Nguyễn Thu Vân – Chủ tịch Hội đồng
- Phiếu nhận xét – GS TS Phạm Thanh Kỳ- Phó chủ tịch Hội đồng
-Phiếu nhận xét – GS TSKH Phan T
ống Sơn- Phản biện
-Phiếu nhận xét- PGS TS Nguyễn Thị Hoài Trâm- Phản biện
-Phiếu nhận xét- PGS TS Lê Mai Hương
-Phiếu nhận xét- PGS TS Vũ Đào Thắng
-Phiếu nhận xét- TS Dương Văn Hợp
-Phiếu nhận xét- DS CK2 Nguyễn Huy Văn
-Phiếu nhận xét- TS Trần Khắc Vũ



DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AD: Androstenedione: Androstendion

ADD: Androstadienedione : Androstadiendion.
9α- OH AD: 9-alpha hydroxy androstendion

Viện HL KH LB Nga: Viện Hàn lâm Khoa học Liên bang Nga
Bộ KH & CN: Bộ Khoa học và Công nghệ
TLTK: Tài liệu tham khảo
Viện KHCNVN: Viện Khoa học và Công nghệ Việt nam
TGĐ: Tổng giám đốc
Cty: Công ty
HPLC: High performance liquid chromatography: Phương pháp sắc ký lỏng cao áp

TLC: Thin layer chromatography : Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Đnc. : Điểm chảy
NMR: Phổ cộng hưởng từ hạt nhân
MS: Mass spectrometry : Phổ khối lượng
IR: Infrared spectroscopy :Phổ hồng ngoại
UV: Phổ tử ngoại

CN:
Công nghệ
Ph- VN: Mẫu phytosterol Việt nam, sản phẩm của Phòng thí nghiệm Hoá học Steroid và
Alkaloid- Viện Hoá học - Viện KHCNVN

Ph-N
o
1: Mẫu phytosterol nước ngoài 1
Ph-N
o
2: Mẫu phytosterol nước ngoài 2
L : Lít

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU

Bảng 1- Môi trường nhân giống và chuyển hoá của chủng Mycobacterium neoaurum.
……………………………………………………………………………………………………21
Bảng 2- Môi trường nhân giống và chuyển hoá của chủng vi sinh Rhodococcus…-
erythropolis………………………………………………………………………………………22
Bảng 3- Kết quả định lượng sản phẩm AD sau khi lên men quy mô 5 L 31
Bảng 4- Kết quả định lượng sản phẩm 9α-OH AD sau khi lên men quy mô 5 L 36
Bảng 5- Kết quả định lượng sản phẩm 9α- OH AD sau khi lên men quy mô 80 L 41
Bảng 6- Kết quả định lượng sả
n phẩm 9α-OH AD quy mô 80 L 46
Bảng 7- Mô tả các chi tiết, các bộ phận và xuất xứ c
ủa reactor…………………………49
Bảng 8- Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân lên hiệu suất thu hồi phytosterol…….……51
Bảng 9- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên hiệu suất thu hồi phytosterol………52
Bảng 10- Ảnh hưởng của độ kiềm lên hiệu suất thu hồi phytosterol……………………53
Bảng 11-
Ảnh hưởng nhiệt độ, dung môi kết tinh lên hiệu suất kết tinh thu hồi
phytosterol quy mô phòng thí nghiệm………………………………………………………54
Bảng 12- Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân quy mô pilot lên hiệu suất thu hồi
phytosterol…………………………………………………………………………………… 55
Bảng 13- Ảnh hưởng của thời gian thủy phân lên hiệu suất thu hồi phytosterol quy mô
50 lít……………………………………………………………………………………………56
Bảng 14- Ảnh hưởng của độ kiềm lên hiệu suất thu hồi phytosterol quy mô 50
L……….57
Bảng 15- Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ, dung môi k
ết tinh lên hiệu suất tinh chế kết
tinh hỗn hợp phytosterol quy m

ô 50 L…………………………………………………….…59









DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ ĐỒ THỊ

Hình 1- Cấu trúc một số sterol điển hình……………………………………………………5
Hình 2- Sắc đồ HPLC của một hỗn hợp phytosterol điển hình 15
Hình 3- Phổ HPLC của sản phẩm AD độ tinh sạch ~ 100% 27
Hình 4- Phổ HPLC của sản phẩm 9α - OH AD độ tinh sạch ~ 100% 27
Hình 5- Kết quả định tính sản phẩm AD ở nồi 5 L và bình tam giác 500 ml……… 30
Hình 6- Sắc ký đồ HPLC của chất chuẩn AD 32
Hình 7- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm AD thô mẻ 5 lít……………………………… 33
Hình 8- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm AD tinh chế mẻ 5 lít………………………… 33
Hình 9- Định tính sản phẩm 9α -OH AD ở fermentor 5 L và bình tam giác 500 ml 35
Hình 10- Sắc ký đồ HPLC của ch
ất chuẩn 9α -OH AD 37
Hình 11- Sắc ký đồ HPLC của sản phẩm thô 9α -OH AD 38
Hình 12- Sắc ký đồ của sản phẩm tinh chế 9α -OH AD 38
Hình 13- Kết quả định tính sản phẩm 9α -OH AD ở nồi 80 L 41
Hình 14- Sắc ký đồ của chất chuẩn 9α -OH AD 42
Hình 15- Sắc ký đồ của sản phẩm thô 9α -OH AD quy mô 80 lít- lần 1 43
Hình 16- Sắc ký đồ HPLC của sản ph
ẩm 9α -OH AD quy mô 80 lít-1 43

Hình 17- Kết quả định tính dịch lên men ở nồi 80 L-2 bằng sắc ký bản mỏng 45
Hình 18A-
HPLC 9α -OH AD ( 128 g) sau tinh chế 99,24% 47
Hình 18B- HPLC 9α -OH AD ( 20g) sau tinh chế 96,12% 47
Hình 19- Sơ đồ thiết kế & hình ảnh nồi phản ứng 50 lít……………………………… 50
Hình 20- Phổ IR của hỗn hợp phytosterol 64
Hình 21- Phổ HPLC của hỗn hợp phytosterol…………………………………….65
Hình 22- Phổ MS của thành phần
β
- Sitosterol 65
Hình23- Phổ MS của thành phần Stigmasterol 66
Hình 24- Phổ MS của thành phần Campesterol 66




DANH MUC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1- Chuyển hoá hỗn hợp sterol đến các loại thuốc gốc steroid……………………… .8b
Sơ đồ 2- Sơ đồ thiết kế nồi phản ứng 50 L thu hồi chiết tách phytosterol……………….….50

Sơ đồ 3- Sơ đồ tóm tắt quy trình công nghệ quy mô 50 L chiết tách phytosterol
từ phụ thải CN dầu đậu tương………………………………………………………………… 62

Chương I

TỔNG QUAN

I.1. Vài nét về sản xuất, nhu cầu tiêu thụ dược phẩm gốc steroid, đặc biệt là
hocmon cocticoid trên thế giới:
-Trên thế giới các dược phẩm gốc steroid, nhất là hocmôn cocticoid bắt đầu được
sản xuất từ những năm 1950 thế kỉ trước. Qui mô lớn nhất sản xuất hocmôn steroid
tổng hợp là ở Mỹ. Tại Mỹ, năm 1990 tiêu thụ các dược phẩm cocticoid là 400 triệu
đ
ô la chiếm hơn 7% so với các dược phẩm nói chung. Trung bình hàng năm mức
độ tăng trưởng sản xuất hocmôn steroid khoảng 20%. Sự tăng nhanh tốc độ tiêu
thụ sản xuất các thuốc hocmôn steroid có liên quan đến các thành tựu của y học
cho phép mở rộng đáng kể sử dụng chúng trong thực tiễn chữa bệnh. Năm 1991
trên thế giới sản xuất hơn 150 tấn cocticosteroid. Việc sản xuất các dược phẩm
hocmôn steroid ở Nh
ật, ví dụ chỉ sau 2 năm 1984-1986 đã tăng lên 3 lần và đạt 619
triệu đô la.
-Nói riêng, theo thống kê nhu cầu tiêu thụ trên thế giới về các dược phẩm
cocticosteroid (tính theo đơn vị tỉ đô la) như sau:

1980 1990 2000 (2010)
1,5 4,5 10,8 (15)

-Như vậy, tiêu thụ dược phẩm cocticoid trên thế giới là rất lớn và có khuynh hướng
ngày càng tăng. Người ta dự đoán rằng nhu cầu thế giới tiêu thụ các d
ược phẩm
cocticoid đến 2010 tăng ít nhất tới 14-15 tỷ đô la.
-Trước đây, các dược phẩm có gốc steroid được sản xuất từ diosgenin, solasodin,
một số nước sử dụng axit mật và hecogenin nhưng xu hướng chung đang chuyển
sang dùng phytosterol vì giá thành rẻ do thu hồi từ phế phụ thải công nghiệp chế

biến nông lâm sản như phế thải CN bột giấy, phụ thải CN mía đường, CN tinh
luyện dầu đậu tương.
I.2. Giới thiệu về sterol:
I.2.1. Nguồn tự nhiên của sterol:
-Sterol là một trong những hợp chất rất phong phú, nó có trong động vật có xương
sống, động vật không xương sống và thực vật.
I.2.1.1.Sterol động vật biển không xương sống:
-Sterol dạng thấp của đời sống thực,
động vật là đáng chú ý vì chúng gợi ý cho ta
về sự liên quan giữa giai đoạn tiến hóa với kiểu mẫu của sterol được hình thành.
Trong nhiều sterol động vật không xương sống, chuỗi mạch bên 8 cacbon của
cholesterol được thay bằng một đơn vị có 9 cacbon với các nhóm metyl ở C
20
hoặc
bằng một đơn vị 10 cacbon với nhóm etyl. Những sterol của động vật biển, một số
kiểu mẫu điển hình là: spongesterol, clionasterol, 24- metylencholesterol,
fucosterol.
I.2.1.2.Sterol nấm men.
-Những sterol thuộc kiểu mẫu này là ergosterol và zymosterol. Sterol nấm men thứ
yếu là acosterol và fecosterol.
I.2.1.3.Sterol thực vật ( phytosterol):
-Có mặt trong tất cả các bộ phận của cây nhưng có nhiều nhất ở các hạt có dầu
dưới dạng tự do hoặc các este. Một số ít
ở dạng glycozit.
-Sitosterol, stigmasterol,
α
- spinasterol và brassicasterol là sterol thực vật, rất
phong phú và tồn tại ở dạng phức hợp. Chúng cũng có mạch bên C
9

và C
10
.
-Người ta chứng minh rằng sinh tổng hợp cholesterol được tiến hành theo các bước
chính như chuyển hóa acetat thành squalen, đồng thời phối hợp đóng vòng squalen
thành lanosterol và đề metyl hóa lanosterol thành cholesterol.
-Sterol là những ancol ở thể rắn có cấu trúc 27- 29 nguyên tử C, thuộc nguồn gốc
động vật (cholesterol) hoặc thực vật (phytosterol, ví dụ
β
-sitosterol, ergosterol,


stigmasterol) nhưng đều có chung một khung cơ bản perhydrocyclopentano
phenanthren và một chuỗi ngang với các nhóm metyl (loại ergostan) hoặc ete
(stigmastan) đặc biệt là ở C
21
.
-Một số sterol có nhóm metyl ở C
4
hoặc C
14
. Các chất này được gọi là metylsterol.
Tất cả các sterol đều có nhóm OH ở C
3
. Sterol có nối đôi ở mạch nhánh gọi là
stenol. Các sterol không có nối đôi gọi là stanol.
-Công thức một số sterol điển hình được dẫn ra dưới đây:


OH

OH

Cholesterol
β
-sitosterol
(sterol động vật)
Stigmasterol Campesterol




HO


I.3.Chuyển hóa vi sinh sterol đến 17-cetosteroid và tổng hợp thuốc gốc steroid
từ sterol:
I.3.1.Tình hình nghiên cứu ngoài nước:
-Phát minh ra một số chủng vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh các sterol đến
17- cetosteroid như Androstendion (AD), Androstađiendion (ADD) và 9α- OH AD
là một trong số các thành tựu nổi bật và quan trọng nhất trong lĩnh vực công nghệ
sinh học dược phẩm thế giới trong thời gian cuối thế kỷ XX. Thành tựu này mở ra
khả năng sử dụng “ rác công nghiệp- sterol” làm nguyên liệ
u đầu tổng hợp các
loại thuốc steroid thiết yếu giá rẻ thay thế nguồn nguyên liệu truyền thống
diosgenin & solasodin phải trồng trên đất nông nghiệp nhiều năm do vậy giá
thành cao. Cũng cần nhấn mạnh là thành công nhất trong ứng dụng công nghệ vi
sinh trong sản xuất dược phẩm ở quy mô công nghiệp chính là trong lĩnh vực sản
xuất các dược phẩm steroid.

Xin thuyết minh :

-Trên thế giới, từ lâu diosgenin và solasodin là nguyên liệu số
1 cho bán tổng hợp
các loại thuốc có gốc steroid. Tuy nhiên, giá cả trên thị trường quốc tế của chúng
ngày càng tăng do phải trồng nhiều năm (khoảng 5 năm) trên đất nông nghiệp. Do
vậy người ta đã ra sức tìm kiếm những nguồn nguyên liệu mới rẻ tiền hơn. Các
sterol thực vật đã được chú ý đến nhiều nhất vì chúng có trữ lượng rất lớn và có thể
thu hồi từ phế phụ
thải một số ngành công nghiệp ( CN sản xuất bột giấy, CN tinh
luyện dầu đậu tương, CN mía đường). Điều này đã trở thành hiện thực sau khi phát
minh ra một số chủng vi sinh phân cắt chọn lọc mạch nhánh các sterol đến 17-
cetosteroid. (Fujimoto K. et al. J. Amer. Chem.Soc. 1982.Vol 104. N-17pp.4718;
Westmejze H. et al. Tetr.Lett 1980.Vol 21. N 27.pp 2665). Các nghiên cứu chuyển
hoá vi sinh sterol đã phát triển mạnh mẽ trong những năm gần đây và đặc biệt chỉ


một số ít cường quốc khoa học công nghệ mới có như là Mỹ, Tây Đức cũ, Nhật,
Nga.
-Trên thực tế, một số hãng dược phẩm quốc tế như Apdzon & Serdz của Mỹ,
Sering của Tây Đức, Mitsubisi của Nhật đã bắt đầu sử dụng các sterol thông qua
17-cetosteroid trung gian để bán tổng hợp một số thuốc có gốc steroid; Nga đã có
đề cương quốc gia thu hồi, chuyển hoá phytosterol từ 1993 / Riakhovskaya M.I.,
Luậ
n án TS. VHLKH LB Nga 1990; L. Đ. Huy, Luận án TS. VHLKH LB Nga,
1992 /.
-Công bố khoa học liên quan ( xem phần TLTK)
-Trung tâm kỹ thuật sinh học Viện HL KH LB Nga đã có nhiều thành tựu trong
lĩnh vực chuyển hóa phytosterol đến 17-cetosteroid như AD, 9α- OH AD. Chúng
tôi đã trực tiếp đến thăm làm việc, đã ký kết thỏa thuận hợp tác và trên cơ sở đó Bộ
KH & CN đã phê duyệt Nhiệm vụ Nghị định thư này để chúng ta có thể có được
công nghệ sản xuất AD và 9

α- OH AD từ phytosterol Việt Nam. Theo thỏa thuận
phía Nga sẽ chuyển giao công nghệ cùng với các chủng vi sinh đột biến tương ứng
quy mô phòng thí nghiệm chuyển hóa phytosterol đến AD và từ AD đến 9α- OH
AD, hiệu suất chuyển hóa đạt ≥ 70 +/- 5% với độ tinh sạch các sản phẩm đạt ≥
97%. Các công nghệ bền vững và họ sẵn sàng giúp ta giai đoạn tiếp theo chuyển
lên quy mô sản xuất công nghiệp.
-Công bố khoa học của phía đố
i tác Nga (xem phần TLTK).

I.3.2. Tình hình nghiên cứu trong nước:
- Trước khi đề tài này được phê duyệt, chúng tôi chưa được biết có nơi nào ở trong
nước và trong khu vực có những công bố về chuyển hóa vi sinh sterol đến 17-
cetosteroid, cũng như các nghiên cứu khác liên quan.
-Công bố khoa học liên quan ( xem phần công bố của tác giả trong Mục TLTK):
-Từ sterol đến các thuốc gốc steroid có thể tóm tắt minh họa trong sơ đồ 1 sau:



CH
3
CH
3
CH
3
H
H
H
H
R
CH

3
CH
3
OH




Phytosterol (R=C
2
H
5
)
Cholesterol (R=H)



CH
3
CH
3
H
H
H
O
O


CH
3

CH
3
H
H
H
O
O


CH
3
CH
3
H
H
OH
O
O

Androstadiendion (ADD) Androstenedion ( AD)
9 α- hydroxy-AD


(Sery I ) (Sery II ) (Sery III )
1.Estrogens
(
ethynylestradiol,
estriol, ethers of
estradiol)
1.Mineralo- and gluco-

corticoids( Hydrocortisone,
prednisolone ,
methyl- prednisolone ,
cortinef )
1.Fluorinated at 9-position
2.Corticosteroids:
( Dexamethasone, fluocinar,
triamcinolone, beta-methasone )
2. Anabolics
(Phenobolin ,
Sylabolil )
2.Androgens
( Methyltestosterone,
ethers of testosterone )
2.Mineralo-and gluco-
corticoids( Hydrocortisone,
prednisolone ,
methyl- prednisolone, cortinef )
3.Progestagens
(Norethysterone acetate )
3.Progestagens
(Acetomepregenole,
megestrolacetate,
esters of
17 alpha-hydroxyprogesterone
)

4. Diuretics
(Spironolactone, canrenone )

5. Anabolics
(Methandrostenolone)


Sơ đồ1
Chuyển hoá hỗn hợp sterol đến các loại thuốc gốc steroid



I.4.Thu hồi, tinh chế phytosterol từ phế phụ thải công nghiệp:
I.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước:
-Cholesterol cũng như phytosterol được phân lập từ rất lâu, nhưng nó chỉ được
xem như “rác” trong các nghiên cứu, tức là khi gặp người ta bỏ qua không quan
tâm.
-Sau những phát minh đầu tiên phân cắt vi sinh chọn lọc mạch nhánh sterol ( cả
cholesterol và hỗn hợp phytosterol) đến 17-cetosteroid như Androstendion, các nhà
khoa học bắt đầu tập trung đến việc thu hồi chúng từ các nguồn phế phụ thả
i công
nghiệp chế biến nông lâm sản như từ phế thải CN bột giấy, từ phụ thải CN mía
đường, CN tinh luyện dầu đậu tương. Hiệu quả nhất là thu hồi phytosterol từ
nguồn phụ thải CN tinh luyện dầu đậu tương, hàm lượng có thể đạt từ 3-5-10%,
thậm trí cao hơn tùy nguồn nguyên liệu.
-Mỹ, Nhật và Tây Đức có những công bố khoa học và bằng phát minh đầu tiên
trong lĩnh vự
c thu hồi sterol từ phế phụ thải công nghiệp, đặc biệt là từ phụ thải CN
tinh luyện dầu đậu tương.
-Nga có đề tài quốc gia thu hồi tinh chế phytosterol từ phế thải CN bột giấy từ
1993.
-Cu Ba đã có những nghiên cứu chiết xuất phytosterol từ rỉ đường, phụ thải CN
mía đường. Tuy nhiên phương pháp không hiệu quả, không có ý nghĩa thực tiễn.

-Trong khu vực chúng tôi không thấy có công bố khoa học nào liên quan cho đến
thời điểm này.
-Các công bố khoa học liên quan ( xem phần TLTK )

I.4.2. Tình nghiên cứu trong nước liên quan đến Nhiệm vụ:
I.4.2.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất, tiêu thụ dược phẩm steroid trong nước
-Cho đến nay, Việt Nam phải nhập khẩu toàn bộ các loại thuốc có gốc steroid với
những khoản ngoại tệ rất lớn, do chưa có nguyên liệu đầu và công nghệ tổng hợp.


Nhận thức được tầm quan trọng của vấn đề nguyên liệu cho công nghiệp sản xuất
các dược phẩm steroid, ngay từ những năm bảy - tám mươi thế kỷ trước Viện Hoá
học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (KHCNVN) và Bộ Y tế đã ra sức tìm
kiếm nguồn nguyên liệu diosgenin và solasodin từ cây cỏ Việt Nam. Kết quả là sau
nhiều năm điều tra sàng lọc không chỉ ra được cây nào có thể làm nguyên li
ệu vì
hàm lượng hoạt chất quá thấp. Cây Solanum (cà) di thực từ Liên Xô cũ vào Việt
Nam trồng thử ở Lâm Đồng nhưng dần bị thoái hoá. Một vài cây Dioscorea (củ
mài) lấy giống từ Mehico cho hàm lượng diosgenin khá, vì vậy Bộ Y tế đã có
chương trình quốc gia 3 kế hoạch 5 năm “Di thực, gieo trồng Dioscorea, chiết xuất
và chuyển hoá diosgenin đến các loại thuốc steroid”. Tuy nhiên từ năm 1990 đến
nay không thấy tiếp tụ
c đề tài này và chưa đưa vào sản xuất được loại thuốc nào,
có lẽ chính vì xu hướng chung trên thế giới đang chuyển sang nguyên liệu mới tiên
tiến phytosterol (?) hay là vì lý do nào khác (?).
-Tại Hội thảo Đức-Việt về Hoá học các hợp chất thiên nhiên được tổ chức tại Viện
KHCNVN từ 15-20/4/1998, Tiến sĩ người Đức H.Ripperger, một chuyên gia lớn
về Solanum đã trả lời chúng tôi rằng: “Hai mươi năm trước
đây chúng ta đã tuyên
bố: diosgenin và solasodin là nguyên liệu số một cho tổng hợp các loại thuốc

steroid mà không ngờ rằng sterol sẽ chiếm vị trí độc tôn này trong một ngày gần
đây !”
-Lần đầu tiên, chính phủ đã phê duyệt Chương trình hóa- dược quốc gia 2007-
2020, trong đó đã phê duyệt nội dung “ chiết xuất phytosterol từ phụ thải công
nghiệp tinh luyện dầu đậu tương và nghiên cứu tổng hợp một số thuốc g
ốc steroid
từ phytosterol”.
-Không còn nghi ngờ gì nữa, phytosterol là cơ hội, là nguyên liệu đầu tiên tiến
tiềm năng, là thế mạnh của Việt Nam trong công nghiệp sản xuất dược phẩm
steroid trong thời gian tới.


-Như trên đã nói, phytosterol có thể được thu hồi từ phế phụ thải CN sản xuất bột
giấy, CN mía đường và CN tinh luyện dầu đậu tương- 3 ngành sản xuất lớn của
Việt Nam. Đậu tương là ngũ cốc quan trọng số 3 của Việt Nam, sản lượng hàng
trăm ngàn tấn/ năm và tăng nhiều chục phần trăm/ năm. Năm 2007, ông Nguyễn
Hữu Ninh Phó TGĐ Tổng Cty dầu th
ực vật đã trả lời chúng tôi trực tiếp rằng:
Tổng sản lượng dầu đậu tương tiêu thụ của Tổng Cty dầu thực vật Việt Nam chiếm
75 % thị phần cả nước là ~ 100.000 tấn /năm. Chỉ riêng Công ty dầu Cái Lân -
Quảng Ninh, theo ông Phạm Văn Dũng trưởng phòng kỹ thuật cho biết, tổng dầu
thô nguyên liệu tiêu thụ khoảng 48.000 tấn/ năm. 3-5% con số đó là cặn- phụ
thải-
nguyên liệu mà ta có thể dùng để chiết xuất phytosterol, hiện nay đang được bán
cho các cơ sở chế biến thức ăn gia súc và xuất khẩu rất không kinh tế. Hàm lượng
phytosterol trong nguồn phụ thải này khoảng 3-5% tuỳ đầu nguyên liệu.
-Cho đến nay chúng tôi chưa được biết có nơi nào khác ngoài Viện Hoá học – Viện
KHCNVN có nghiên cứu liên quan đến đề tài phytosterol cả về chiết xuất tinh chế,
chuyển hóa vi sinh và hóa học.

I.4.2.2.Nghiên cứu c
ủa chủ nhiệm & Cs liên quan đến Nhiệm vụ:
a)Nghiên cứu “Hoàn thiện một số phương pháp mới tổng hợp cocticoid từ 17-
cetosteroid ”: Từ 1988 đến nay chúng tôi liên tục nghiên cứu trong lĩnh vực này
và xin tóm tắt như sau:
+)L.Đ.Huy: Luận án TS, Viện Hoá hữu cơ N.D. Zelinsky -Viện HL KH LB Nga
(1992) với đề tài “Hoàn thiện một số phương pháp mới tổng hợp cocticoid từ 17-
cetosteroid.”. Tác giả đã được trao Giải nhất Giải thưởng KHKTTN về
thành tựu
khoa học cơ bản năm 1998 cùng Huy chương Tuổi trẻ sáng tạo KHKT do TT
KHTN & CNQG kết hợp Đoàn TNCS Hồ Chí Minh tổ chức và trao giải.
+)Chúng tôi đã tiếp tục nghiên cứu đề tài chuyển hoá phytosterol bằng tài trợ của
Quỹ khoa học Quốc tế IFS ( Inter. Found. for Science ), (1996- 1999)


+) Chúng tôi đã nhận được tài trợ lần thứ 2 từ tổ chức IFS, (2001- 2003)
+) … ……………………………………3………… IFS, (2004-2006)
+) Đã được Tổ chức IFS tài trợ bổ sung kinh phí để tham dự và đọc báo cáo khoa
học tại Hội nghị Quốc tế 14, Havana, Cu Ba, tháng 6, năm 2005.
+) Đã nhận được tài trợ của Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu á Hàn Quốc,
ĐHQG Hà Nội (2004 - 2005)
-Xem Mục “Các công bố khoa học của tác giả”.

b)Nghiên cứu “Chiết xuất phytosterol từ phụ th
ải CN tinh luyện dầu đậu
tương”:
+) Năm 2003: Bằng nguồn kinh phí cấp cơ sở chọn lọc của Viện Hóa học, lần đầu
tiên chúng tôi đã nghiên cứu thành công phương pháp phòng thí nghiệm rất hiệu
quả khả thi thu hồi tinh chế phytosterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu
tương, đã nhận được 500g phytosterol mẫu với độ tinh sạch ≥ 90%.

-Xem phụ lục các công bố khoa họ
c của tác giả.

c)Nghiên cứu “Chuyển hóa vi sinh phytosterol đến AD và 9α- OH AD”:
+) Năm 2005: Chúng tôi đã cộng tác với TT KH Quốc gia Cu Ba chuyển hoá thử
nghiệm thành công phytosterol do phòng thí nghiệm của chúng tôi chiết xuất tinh
chế từ phụ thải CN dầu đậu tương đến AD & ADD với hiệu suất tốt ( ≥ 65%).
+) Năm 2006: Mẫu phytosterol của Việt Nam cũng đã được Trung tâm kỹ thuật
sinh học – Viện HL KH LB Nga thử nghiệm chuyển hóa bằ
ng chủng vi sinh đột
biến công nghiệp của Nga đến AD hiệu suất ≥ 70%, độ tinh sạch sản phẩm ≥ 97%.
-Xem công bố khoa học của tác giả.

Chương II
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

II. 1. Phương pháp nghiên cứu sterol.
II.1.1. Chiết suất sterol :
-Đặc tính của sterol là chất không phân cực, rất ít tan trong nước, tan trong dầu
béo, caroten, lexitin nhưng tan tốt trong các dung môi không phân cực như dầu,
ete, benzen, CHCl
3
. Do vậy các dung môi này được dùng làm dung môi để chiết
sterol. Ngoài ra còn có thể chiết sterol bằng cồn (dạng glycozit).
-Sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp của các este sterol kết
hợp với lipit, caroten, lexitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóa để tách các chất này
ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế sterol bằng
phương pháp kết tinh phân đoạn. Trong nghiên cứu, để định lượng sterol có thể kết
tủa sterol bằng digitonin.
-Chiết sterol từ phụ thải công nghiệp tinh luyện dầu đậu tương được thực hiện dựa
trên cơ sở phương pháp chiết phytosterol từ dầu đậu tương. Phương pháp được
thực hiện mô phỏng thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm như sau / Raphael Ikan.
Natural Products. 2-nd Ed. Academic Press INC. San Diego ,California. 1991/ :
82g dầu đậu tương thêm 400 ml MeOH và 75g NaOH/KOH, đun hồi lưu 3 giờ.
Sau đó thêm 200 ml nước và chiết hỗn hợp này 3 lần, mỗi lần 300 ml ete isopropyl.
Dịch chiế
t ete isopropyl được rửa với muối, cất thu hồi dung môi. Cặn không xà
phòng hóa được hòa tan trong 100ml ete dầu, lọc. Để yên 12 giờ. Hỗn hợp
phytosterol sẽ tủa. Lọc lấy tủa, sấy khô, đun hồi lưu với anhydic acetic (10 ml)
trong 3 giờ. Để lạnh qua đêm, được tủa acetat sterol. Lọc, rửa tủa và kết tinh lại từ
hỗn hợp dung môi chọn lọc.
-Phương pháp chung chiết xuất tinh chế phytosterol từ phụ thả
i CN dầu đậu

tương: Thuỷ phân kiềm nguyên liệu “Phụ thải CN dầu đậu tương“ → Trung hòa
dich thủy phân bằng axít sunfuric → Trích ly →Sterol thô →Kết tinh lại nhiều lần
bằng hỗn hợp dung môi chọn lọc → Sterol tinh khiết.
II.1.2.Các phương pháp phân tích sterol


II.1.2.1.Phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).
-Phương pháp HPLC đã phát triển rất nhanh sau khi ra đời các bơm cao áp, các
detector phân tích và lớp phủ cột nhồi silicagel. HPLC không chỉ ứng dụng cho sắc
ký lỏng pha thường mà còn ứng dụng cho cả sắc ký lỏng pha ngược với lớp phủ
cột nhồi silicagel- O- Si (CH
2
)
17
CH
3
. Sau ứng dụng thành công đầu tiên của HPLC
để phân tích sterol, nó đã được trực tiếp ứng dụng rộng hơn cho các mục đích phân
tích trong đối tượng sterol, hiện nay đã trở thành một phương pháp phổ biến và chủ
đạo để phân tích sterol.
-HPLC là kỹ thuật phân tách vật lý hai hay nhiều cấu tử trong một hỗn hợp, có thể
dùng để phân tích các phân tử hoặc ion hữu cơ. Như vậy, độ tinh khiết của nhiều
h
ợp chất hữu cơ có thể được đánh giá bằng phương pháp HPLC. Kỹ thuật này bao
gồm một pha rắn (pha tĩnh) được nhồi vào một cột thép không rỉ và một pha lỏng
di động (pha động) chạy qua. Việc phân tách các cấu tử trong dung dịch được thực
hiện nhờ sự khác nhau về tỷ số phân bố của các chất tan giữa hai pha. Phương pháp
HPLC, dựa trên cơ chế của hấp phụ, phân bố
, trao đổi ion hoặc kích cỡ tùy thuộc
vào kiểu pha tĩnh được sử dụng.

-Cấu hình thiết bị của HPLC bao gồm: hệ thống bơm, van bơm mẫu, cột sắc ký,
đầu dò (detector) và hệ thống xử lý, ghi sắc ký đồ (máy tính).
-Cột sắc ký dùng trong HPLC để phân tích sterol có thể thuộc một trong các kiểu
phân tách dưới đây:
-Cột pha thường: Gồm các chất phân tích tương tác với bề mặt của chất rắn phân
c
ực (pha tĩnh) như trường hợp của cột nhồi và lớp màng mỏng sắc ký. Dung môi
của phương pháp này là hỗn hợp 2 hoặc 3 dung môi có độ phân cực khác nhau.
-Cột pha ngược: Sợi silica có đường kính rất nhỏ (đường kính trong 3-10
µ
m) và
độ xốp cao cho hiệu suất tương tác cao giữa chất phân tích và pha tĩnh. Trong hệ
thống này, chất sterol phân cực hơn, tuơng tác kém hơn với pha tĩnh không phân
cực và do đó tách rửa từ các cột nhanh hơn. Hệ pha ngược nhạy hơn đối với sự có
mặt của liên kết đôi và kích thước phân tử so với hệ pha thường. Số liên kết đôi
trong sterol tăng lên hoặc kích thước của chất phân tích giảm, t
ương tác kém với


pha tĩnh và bởi vậy tách rửa từ các cột nhanh hơn. Một vài pha phân cực di động
được sử dụng trong hệ pha ngược HPLC, thường chứa acetonitrile và methanol và
thường thêm nước.
-Trong cột tách luôn luôn xảy ra sự cạnh tranh giữa độ tan của chất tan trong pha
động và tương tác vật lý của nó với bề mặt của pha tĩnh. Nếu như mẫu tan tốt trong
pha động thì nó sẽ rửa giải sớm. “Độ mạnh” của pha độ
ng có thể được điều chỉnh
bằng cách thay thế tỉ lệ dung môi đem sử dụng.
-Detector thích hợp nhất cho phân tích sterol là detector UV và RI. Đối với các
sterol, detector UV thường hoạt động ở bước sóng 200-210 nm. Đáng tiếc là
detector UV không thể sử dụng cho toàn bộ detector để định lượng các sterol. Hình

3 dưới đây chỉ ra khả năng tách và xác định các sterol campesterol, stigmasterol và
β
- sitosterol trong một hỗn hợp phức tạp.

Hình1.
Sắc đồ HPLC của một hỗn hợp phytosterol điển hình
(1) Chất chuẩn Cholesterol, (2) Campesterol, (3) Stigmasterol, (4)
β
-Sitosterol
II.1.2.2.Các phương pháp hoá lý và vật lý khác phân tích sterol.
II.1.2.2.1. Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC):
-Sắc ký lớp mỏng cho kết quả tốt trong phân tích sterol. Chất hấp phụ thường dùng
silicagel G. Để tăng khả năng tách dùng chất hấp phụ có thêm AgNO
3
. Kính được


tráng với dung dịch AgNO
3
5% trong MeOH + H
2
O (thay nước) sau đó hoạt hóa ở
120
0
C

trong khoảng thời gian 30 phút.
-Các hệ dung môi là: benzen-etyl acetat (4:1), benzen-clorofoc (9:1).
-Một số sterol khó tách rời như cholesterol và stigmasterol, có thể chuyển chúng
thành dẫn xuất acetyl trước khi tiến hành phân tích.

-Để hiện màu trên lớp mỏng dùng dung dịch SbCl
3
trong CHCl
3
, H
2
SO
4
20%
trong cồn hoặc H
2
SO
4
- H
2
O (1:1) và hơ nóng kính. Một số sterol có thể phát hiện
vết bằng soi UV.
II.1.2.2.2. Phương pháp xác định điểm chảy (Đnc.) :
-Barton có nhận xét về điểm chảy của sterol như sau:
-Tất cả sterol dãy 3
β
- ol có điểm chảy cao hơn điểm chảy của các acetat tương
ứng, trừ các sterol có nối đôi
87−
∆
(các sterol này điểm chảy của acetat cao hơn).
-Điểm chảy của các 5
α
- sanol (sterol no) thấp hơn điểm chảy của các sterol có
dây nối đôi trong vòng (sterol).

-Các 3-ceto-
4
∆ - sterol (thu được do oxy hóa
3
∆
- sterol) có điểm chảy thấp, thấp
hơn điểm chảy của sterol tương ứng.
II.1.2.2.3. Phổ tử ngoại (UV):
-Sự có mặt các nhóm liên hợp (chromophor) trong sterol cho phép ta áp dụng quy
tắc Woodward để dự đoán phổ hấp thụ của sterol. Ví dụ đối với ergosterol; vòng
đơn thuần đien (253), 4 nhóm ankyl (+20), 2 dây nối đôi ngoại vòng (+10) có
λ

max ở 283 nm.
-Cường độ hấp thụ tăng tỷ lệ với số nhóm thế, đặc biệt là nhóm thế của sterol có
dây nối
∆
8
.
II.1.2.2.4. Phổ hồng ngoại (IR):
-Các nhóm OH ancol bậc 2 hấp thụ ở vùng 3650 - 3590 cm
-1
và 1055 cm
-1
. Vùng
2960 - 2850 và 1485 - 1445 cm
-1
tương ứng với dao động giãn C-H và uốn cong
CH
2

. Tín hiệu ở 1385 - 1380 cm
-1
và 1370 - 1365 cm
-1
tương ứng với sự hấp thụ