Nghiên cứu chiết tác limonene và một số dẫn xuất từ nguồn thực vật việt nam sử dụng phòng trừ côn trùng trong y tế

BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM







BÁO CÁO TỔNG KẾT


ĐỀ TÀI CẤP BỘ:
Nghiên cứu chiết tách limonene và một số dẫn xuất từ nguồn
thực vật Việt Nam sử dụng trong lĩnh vực sát trùng gia dụng
(phòng trừ côn trùng y tế)







Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Ngọc Thanh

8343


Hà Nội 12/2010


BỘ CÔNG THƯƠNG
VIỆN HÓA HỌC CÔNG NGHIỆP VIỆT NAM







BÁO CÁO TỔNG KẾT


ĐỀ TÀI CẤP BỘ:
Nghiên cứu chiết tách limonene và một số dẫn xuất từ nguồn
thực vật Việt Nam sử dụng trong lĩnh vực sát trùng gia dụng
(phòng trừ côn trùng y tế)

Chủ nhiệm đề tài: ThS. Nguyễn Ngọc Thanh

Cán bộ tham gia: TS. Phan Thanh Bình
ThS. Nguyễn Thị Thu Hương
CN. Lê Ngọc Thức
KS. Đoàn Thị Xuân Liễu












Hà Nội 12/2010
MỤC LỤC
LỜI MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN 2
1. Các biện pháp phòng trừ côn trùng y tế 2
1.1.Tác hại của côn trùng y tế tới sức khỏe cộng đồng 2
1.2. Các biện pháp phòng trừ ruồi muỗi 5
1.2.1.Biện pháp diệt ruồi, muỗi 3
1.2.2. Các biện pháp phòng ngừa ruồi, muỗi 5
1.3. Limonen và ứng dụng trong phòng ngừa côn trùng y tế 6
1.3.1. Nguồn tinh dầu chứa Limonene 6

1.3.2. Thành phần hóa học của một số tinh dầu vỏ quả có múi thuộc
chi Citrus 7
1.4. Đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của Limonene (D- Limonene) 9
1.4.1. Đặc tính hóa lý 9
1.4.2. Hoạt tính sinh học của Limonene 10
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Limonene (D-Limonene) 11
1.6. Các phương pháp chiết tinh dầu và Limonene 13
1.6.1. Cất lôi cuốn hơi nước 13
1.6.2. Chiết SCO
2
(CO
2
ở trạng thái siêu tới hạn) 13
1.6.3. Các phương pháp khác 15
1.6.4. Lựa chọn phương pháp án công nghệ 15
CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM 18
2.1. Đối tượng nghiên cứu 16
2.2. Phương pháp nghiên cứu 16
2.2.1. Cất lôi cuốn hơi nước 16
2.2.1.1. Thiết kế nghiên cứu 16
2.2.1.2. Cách tiến hành 17
2.2.2. Chiết bằng SCO
2
18
2.2.2.1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 18
2.2.2.2. Quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện chiết tối ưu 18
2.3. Thiết bị, hóa chất 20
2.3.1. Thiết bị 20
2.3.2. Hóa chất 20
2.4. Phân tích sản phẩm 21

2.5. Thử hoạt tính phòng ngừa ruồi, muỗi trong y tế của Limonene và chế
phẩm từ Limonene 21
2.5.1. Quy trình khảo nghiệm đối với ruồi (quy trình diệt) 22
2.5.2. Quy trình khảo nghiệm đối với muỗi (quy trình diệt) 23
CH
ƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24
3.1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu 24
3.1.1. Khảo sát hàm lượng Limonene bằng phương pháp chưng cất lôi cuối
và cất phân đoạn 24
3.2.1. Khảo sát hàm lượng D- Limonene trong tinh dầu vỏ quả theo phương
pháp (SCO
2
) 25
3.2. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quy trình tách Limonene 26
3.2.1. Ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất chưng cất tinh dầu 26
3.2.2. Ảnh hưởng của lượng nước 27
3.3. Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất chiết dầu cam bằng
phương pháp SCO
2
29
3.3.1. Mô hình hóa thực nghiệm xác định điều kiện chiết tối ưu 29
3.3.2. Khảo nghiệm về kích thước nguyên liệu ảnh hưởng đến hiệu suất
thu dầu cam bằng SCO
2
30
3.4. Kết quả thực nghiệm tách D-Limonene và gia công chế phẩm 31
3.4.1. Tách D- Limonene bằng phương pháp cất phân đoạn 31
3.4.2. Chiết D- Limonene bằng phương pháp SCO
2
31

3.4.3. Phân tích cấu trúc D- Limonene 32
3.5. Gia công thử nghiệm chế phẩm phòng trừ côn trùng y tế 33
3.6. Khảo nghiệm hoạt tính sinh học Limonene ( D-Limonene) trên ruồi,
muỗi 33
3.6.1. Thử nghiệm hoạt tính trên ruồi (quy trình diệt) 33
3.6.2. Thử nghiệm hoạt tính trên muỗi (quy trình diệt) 37
3.6.3. Thử nghiệm hoạt tính của chế phẩm đối với ruồi và muỗi 39
3.7. Đề xuất quy trình sản xuất chế phẩm Limonene 40
KẾT LUẬN 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO 42
PHỤ LỤC I
PHỤ L
ỤC II



1

LỜI MỞ ĐẦU

Với mục tiêu vì một môi trường an toàn nên ngày nay rất nhiều sản phẩm về
lĩnh vực bảo vệ thực vật và diệt trừ côn trùng gây hại đã sử dụng nguồn nguyên liệu
tự nhiên, thân thiện với môi trường.
Tinh dầu là một sản phẩm được sử dụng rộng rãi trong các ngành thực phẩm
mỹ phẩm, dược phẩm. Một trong những tác dụng chung của tinh dầu là có tính chất
diệ
t khuẩn, có độ sát trùng cao.
Việt Nam có một thảm thực vật vô cùng phong phú phát triển trong điều kiện
khí hậu nhiệt đới nên các loại cây cho tinh dầu được khẳng định là dồi dào và độc
đáo. Trong đó, giống Citrus họ Rustaceae tuy có tiềm năng lớn nhưng chưa được

khai thác và tận dụng triệt để. Tinh dầu trong vỏ quả của giống Citrus có chứa thành
phần chính là Limonene có đặc tính xua đuổi và di
ệt trừ côn trùng gây bệnh ở người
và động vật.
Tuy nhiên ở nước ta vẫn chưa có nghiên cứu nào theo hướng sử dụng
Limonene trong phòng trừ côn trùng y tế. Vì vậy, kết hợp với mục tiêu tận dụng
phụ phẩm của các nghành chế biến rau quả tạo ra các sản phẩm hữu ích thân thiện
với môi trường chúng tôi đã tiến hành đề tài nghiên cứu ứng dụng Limonene trong
vỏ quả của một số
loại cây có múi làm thuốc diệt trừ côn trùng trong nghành y tế:
Nghiên cứu chiết tách Limonene và một số dẫn xuất từ nguồn thực vật Việt Nam
sử dụng trong lĩnh vực sát trùng gia dụng (phòng trừ côn trùng y tế).
Nội dung đề tài cần thực hiện:
- Khảo sát hàm lượng Limonene trong một số vỏ quả có múi.
- Tiến hành tách Limonene bằng hai phương pháp: cất lôi cuốn hơi nước kết
hợp cất phân đoạn dưới áp su
ất giảm và chiết Limonene bằng SCO
2
(Supercritical
Carbondioxide).
- Phân tích và so sánh chất lượng sản phẩm chiết bằng hai phương pháp trên.
- Gia công thử nghiệm chế phẩm.
- Thử hoạt tính sinh học về tác dụng phòng ngừa ruồi, muỗi.
2

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.Các biện pháp phòng trừ côn trùng y tế
1.1.Tác hại của côn trùng y tế tới sức khỏe cộng đồng
Ruồi, muỗi, kiến, gián…là những loại côn trùng mang theo các vi trùng, vi
khuẩn từ những nơi kém vệ sinh nhất tới nguồn thức ăn của con người thông qua

đặc điểm sống của chúng.
Loài ruồi nhà thường gặp có tên khoa học là Musca domestica, sống rất gần
gũi với loài người trên toàn thế giới. Chúng thường đượ
c tìm thấy ở những khu dân
cư hoặc súc vật sinh sống, nơi có nhiều thực phẩm và chất thải vì thế chúng có thể
mang và phát tán nhiều loại mầm bệnh khác nhau

Đa số mầm bệnh do ruồi truyền đều nhiễm trực tiếp qua đường thức ăn, nước
uống. Những bệnh do ruồi truyền như kiết lỵ, ỉa chảy, thương hàn, tả và một số
bệnh giun sán, nhiễm trùng mắt và một số bệnh ngoài da như mụn cóc, nấm, phong.
Riêng đối với loài gián, chúng còn thải ra nhiều mùi hôi tại những khu vực bị chúng
tấn công.
Đối với loài muỗ
i, muỗi Ae. aegypti được coi là véc tơ chính trong các vụ
dịch sốt xuất huyết ở nhiều nước như: Singapo, Philippin, Thái Lan (1958 và các
năm tiếp theo), Malaysia, Lào, Việt Nam (vào tháng 6 đến tháng 8 /1963 vụ dịch sốt
xuất huyết ở Sài Gòn đã phân lập được vi rút Dengue từ muỗi Ae. Aegypti; tháng 6–
8/2009 dịch sốt xuất huyết ở một số huyện của tỉnh Phú Yên muỗi Ae. Eagypti cũng
là véc tơ chính).
Những năm gần đây b
ệnh sốt xuất huyết bùng phát thành dịch ở nhiều nơi
làm hàng ngàn người mắc và hàng trăm người tử vong, việc phòng chống bệnh sốt
xuất huyết cũng đang là vấn đề quan tâm của cộng đồng.
Muỗi truyền bệnh sốt rét thuộc giống Anopheles, có chân dài mảnh như tơ
và cánh lốm đốm. Muỗi gây bệnh là giống cái, vì muỗi cái cần nhiều huyết cầu tố
để
nuôi trứng. Các ký sinh trùng sốt rét phá hủy nhiều tế bào hồng cầu tới mức gần
như không đủ duy trì các chức năng tồn tại.
Trong năm 2006, trùng sốt rét tấn công hơn 1/2 tỷ người, trong số này tối
thiểu một triệu người chết. Phần lớn các nạn nhân này là trẻ dưới năm tuổi và ở

Châu Phi. Năm 2009, Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đã phải dùng 23 triệu USD từ
quỹ từ thiện của Bill và Melinda Gates để ngăn chặn dòng sốt rét kháng Artemisinin
lan rộng đến châu Phi, nơi có đến 90 % ca bệnh sốt rét trên thế giới. Vì vậy, việc
3

ngăn ngừa các nguồn bệnh từ ruồi, muỗi và các côn trùng gây bệnh trung gian là
một vấn đề rất quan trọng và bức thiết trên toàn cầu.
1.2. Các biện pháp phòng trừ ruồi, muỗi.
1.2.1. Biện pháp diệt ruồi, muỗi.
* Diệt ruồi:
Để diệt ruồi người ta thường dùng hai phương pháp:
- Phương pháp vật lý: đập ruồi, bẫy ruồi bằng bẫy đèn, bẫy dính, bẫy nước,
lướ
i điện
- Phương pháp hóa học: dùng bả ruồi, phun thuốc diệt ruồi trưởng thành hay
diệt dòi.
a. Một số phương pháp vật lý:
- Dùng cóng bẫy trứng ruồi.
Quét dọn vệ sinh sạch sẽ để ruồi không có chỗ đẻ trứng. Đặt cóng bẫy trứng
ở những nơi mật độ ruồi cao (chợ, các nhà hàng ăn uống) để thu hút ruồi cái vào
cóng đẻ trứng, rồi thu hồi trứng
đem đốt hoặc giội nước sôi. Cóng bẫy trứng là các
chai lọ, hộp có miệng hình tròn, đặt phễu lên miệng cóng. Trong cóng đặt 1 thìa cà
phê sữa bò hoặc nước cháo cám để hấp dẫn ruồi cái đẻ.
Đặt cóng khoảng 8-9h, thu hồi khoảng 17h, hàng ngày mỗi cóng có thể thu
được hàng vạn trứng (1ml=6.000 trứng).
- Nhựa dính bẫy ruồi.
Có thể pha chế theo thành phần: Nhựa thông (2gr), dầu thực vật (2gr), đường
hoặc mật (7gr), nước (10gr). Đun nhỏ
lửa cho nhựa thông chảy ra rồi đổ dầu, đường

mật và nước vào quấy đều lên. Phết nhựa dính lên mảnh bìa cứng, đem đặt ở những
nơi ruồi tập trung để bẫy ruồi.
Một cách khác: Nhựa thông 12gr, dầu thực vật 6gr, mỡ tra máy 2gr. Đun nhỏ
lửa cho nhựa thông chảy ra, đổ dầu vào mỡ và quấy đều. Phết nhựa dính vào mảnh
bìa cứng, những băng giấ
y (5 x 40cm) hoặc lấy sợi dây gai (40cm) tẩm vào nhựa
dính. Đem đặt hoặc treo ở những nơi ruồi tập trung đậu nghỉ ban đêm để bẫy chúng.
Cứ 5-10cm
2
treo 1 sợi dây gai hoặc 1 băng giấy.
Khi mật độ ruồi dày đặc trên nhựa thì đem đốt huỷ.
b. Phương pháp hóa học.
Dùng
hộp bốc hơi hóa chất diệt, đặt hóa chất diệt vào nơi trú đậu của ruồi,
mồi thu hút ruồi có bả để diệt.
Sử dụng hóa chất chuyên dùng để tiêu diệt và phòng ruồi bằng hai cách:
4

- Phun không gian:
- Phun hóa chất dạng sương: được áp dụng trong các không gian bên trong
nhà nhằm tiêu diệt ngay các loài ruồi đang có mặt.
- Phun hóa chất dạng khói mù nóng: phun chủ yếu ở khu vực khuôn viên bên
ngoài nhằm tiêu diệt ngay lập tức các loài ruồi đang có mặt.
- Phun tồn lưu:
Phun trực tiếp hóa chất lên bề mặt vách tường trong tòa nhà, các khu vực
cống thoát nước, bãi rác, chu vi bao ngoài tòa nhà, sân vườn nhằm tiêu diệt ngay
các loại côn trùng, ấu trùng đồng thời thiết lập một hàng rào hóa chất ngă
n chăn sự
sinh sản và thâm nhập của côn trùng.
* Diệt muỗi:

a. Phương pháp sinh học:
- Nuôi cá nhỏ trong bể nước để tiêu diệt bọ gậy.

- Có thể tạo ra chủng muỗi đực mất khả năng sinh sản bằng cách
chiếu phóng xạ rồi thả chúng vào tự nhiên. Các con muỗi đực vô sinh sẽ cạnh
tranh giao phối với muỗi đực thường, giảm tỷ lệ sinh của muỗi.

b. Phương pháp vật lý:
- Đèn bẫy muỗi: Được chế tạo với một đèn phát ánh sáng hấp dẫn muỗi và côn
trùng tụ tập đến, bao quanh bởi lưới kim loại có hiệu điện thế thấp. Khi muỗi và côn
trùng sa vào lưới, dòng điện nhỏ sẽ phóng qua và tiêu diệt chúng. Phương pháp này
sử dụng được trong nhà và ngoài trời.
- Vợt điện: Thiết kế như vợt bắt muỗi cầm tay, chỉ gồm lưới kim loại có điện thế,
chạy pin. Vợt này đòi hỏi kỹ thuật sử dụng của người bắt muỗi, có thể có ích trong
nhà, nhưng không có tính hiệu quả cao.
c. Phương pháp hóa học:
Sử dụng Hương xua muỗi (còn gọi là nhang muỗi), được đốt trong nhà. Nó
có thể tiêu diệt muỗi trong phạm vi nhà ở và không duy trì được tác dụng lâu dài.
Hương xua muỗi có thể gây độc cho người, và tạo nguy cơ hỏa hoạn.
Thông dụng nhất là dùng hóa chất đặc trị, áp dụng quy trình kỹ thuật phun
thuốc sát trùng cho cả hai phương pháp phun không gian và phun tồn lưu. Hai
phương pháp này thường được sử dụng để diệt cả
ruồi và muỗi.
5

1.2.2. Các biện pháp phòng ngừa ruồi, muỗi
- Vệ sinh môi trường: Làm giảm hoặc loại trừ nơi đẻ trứng của ruồi bằng cách vệ
sinh chuồng trại gia súc, gia cầm, quản lý phân và chất thải con người, xử lý rác thải
tốt.
- Làm giảm nguồn thu hút ruồi từ nơi khác đến như mùi của thức ăn, mùi của các ổ

đẻ của ruồi.
- Đề phòng sự tiếp xúc của ru
ồi và mầm bệnh như hố xí, người ốm và chất thải của
họ, lò mổ, động vật chết
- Bảo vệ không cho ruồi tiếp xúc với thức ăn, vệ sinh nhà ăn.
- Ruồi thích ánh sáng thường ban ngày, như do ruồi có mắt kép phản xạ nhanh với
ánh sáng phản chiếu bởi loại gương cầu. Vì vậy người ta cho nước sạch vào túi
nylon, treo trong nhà, ruồi bay qua bay lại gặp phải ánh sáng phản quang từ các túi
nylon đựng nước, ruồi sợ và bay xa. Đây là biện pháp mà các quán hàng ăn uống
thường sử dụng rất có hiệu quả.
- Màn ngủ: là phương pháp hiệu quả để phòng chống muỗi đốt khi ngủ.
- Lưới cửa: là các lưới kim loại (hay nhựa) có lỗ nhỏ, không cho muỗi hay các loại
côn trùng vượt qua và xâm nhập vào nhà ở, nhưng vẫn đảm bảo thoáng khí và ánh
sáng.
Sử dụng thuốc bôi lên da để xua muỗi khỏi da, tiện dụng khi đi du lịch đến
vùng đất nhiều muỗi. Chúng thường chứa các hóa chất sau:
DEET(Diethyltoluamide), D.E.P (Diethylphtalat) tinh dầu bạc hà
mèo, nepetalactone, tinh dầu sả hay tinh dầu bạch đàn (dầu khuynh diệp).
Tác dụng xua đuổi côn trùng của Diethyltoluamide được I.H. Gilbert và cộng
sự công bố từ năm 1955, sau đó đươc Hãng Hercules Agrochemicals Inc đăng ký và
sản xuất với tên thương mại là metadelphin.[1]
Dietyltoluamide, chất lỏng màu hổ phách, sôi ở 111
o
C/ mmHg, là chất xua
đuổi côn trùng gây hại, đặc biệt là muỗi. LD50 2000 mg/kg. Trong số các đồng
phân thì đồng phân meta hiệu quả hơn so với orto và para.
Trong các biện pháp phòng ngừa ruồi, muỗi nêu trên thì phương pháp sử
dụng hóa chất để diệt vẫn được dùng nhiều nhất. Ngoài tác dụng diệt côn trùng, các
thuốc này với hàm lượng nhất định sẽ có tác dụng lên con người, vật nuôi và môi
trường. Thuốc có thể gây ô nhiễm nguồn nướ

c, làm chết các động vật thủy sinh.
6

Bên cạnh đó, việc hóa chất vẫn còn tác dụng với côn trùng một thời gian dài
sau khi phun chứng tỏ thuốc vẫn tồn lưu trong môi trường và con người hằng ngày
vẫn chịu sự phơi nhiễm đối với những hóa chất này.
Ngay đối với những hoá chất diệt côn trùng đã được Bộ Y tế đảm bảo về độ
an toàn thì việc thường xuyên tiếp nhận chúng qua đường hô hấp cũng hoàn toàn
không có lợ
i cho sức khỏe.
Hiện nay, các loại thuốc sử dụng phòng trừ côn trùng gây hại tại Việt Nam
hầu hết được nhập khẩu. Chúng được sản xuất bởi các hãng hóa chất nổi tiếng của
các nước có nền khoa học kỹ thuật phát triển như Anh, Pháp, Bỉ, Mỹ, Đức, Italia,
Nhật Bản,…Những loại hóa chất này hầu hết được chiết xuất từ thực vật như hoạt
chất permethrin (chiếm 50% trong thuốc Map Permethrin 50EC của Hockley
International Ltd. – Anh quốc) thuộc nhóm pyrethroid tổng hợp được chiết xuất từ
hoa cây Cúc trừ sâu (Chrysanthemum cinerariaefolium Vis.) hoặc hoạt chất rotenon
trong một số hóa chất khác được chiết xuất từ hạt cây Củ đậu (Pachyrhizus erosus
(L.) Urb.),…Tuy nhiên những loại hóa chất này cũng chỉ an toàn cho người sử dụng
trong một liều lượng nhất định nào đó. [19]
Chính vì vậy việc nghiên cứu, phát triển và đưa ra thị trường những sản
phẩm có chứa hoạt chất diệt côn trùng thân thiện với môi trường, không gây độc với
con người như Limonene đang là một trong những vấn đề được quan tâm hàng đầu
của các cơ quan chức năng ở Việt Nam và trên nhiều quốc gia khác.
1.3. Limonen và ứng dụng trong phòng ngừa côn trùng y tế
1.3.1. Nguồn tinh dầu chứa Limonene
Limonene là một monoterpen chiếm hàm lượng lớ
n trong tinh dầu vỏ các
loại quả có múi: cam, chanh, quýt, bưởi thuộc chi Citrus họ Rutaceae. Đây là loài
thực vật được coi là một trong những chi có tiềm năng lớn về mặt thương mại trong

các lĩnh vực mỹ phẩm, thực phẩm, hóa chất và y tế.
Chi Citrus phân bố nhiều ở một số nước như Việt Nam, Trung Quốc, Nepal, Nhật
Bản. Tại Việt Nam chi Citrus có khoảng 24 loài thông dụng, phân bố dải d
ọc suốt
từ miền Bắc đến Nam. Những năm gần đây, các loại cây ăn quả trong cả nước đang
phát triển khá mạnh với diện tích trên 750.000 ha. Trong đó, riêng cây có múi phát
triển mạnh nhất với diện tích gần 80.000 ha, sản lượng khoảng 532.000 tấn/năm và
là một trong những loại cây trồng, mang lại hiệu quả kinh tế cao cho nhà vườn.

7

1.3.2.Thành phần hóa học của một số tinh dầu vỏ quả có múi thuộc chi Citrus[5]
Các loài thuộc họ Rutaceae ngoài việc sử dụng quả trong thực phẩm, tinh dầu
chiết từ hoa và vỏ còn được ứng dụng trong mỹ phẩm. Hiện nay trên thế giới có rất
nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng các thành phần hóa học trong vỏ quả còn có tác dụng
chống oxy hóa, kháng nấm, phòng và diệt trừ các côn trùng gây hại cho người và
động v
ật.
Dưới đây là một số hợp chất tiêu biểu trong thành phần hóa học của các loại
quả có múi:

Z- Citral
O
OH
Linalool
β-Myrcene
Limonene
Sabinene
Geranyl acetate
O
O
O H
O
Geranyl formate
β-Farnesene
O
Hexanal
O
Methyl Heptenone
4-methyl Hexene-1
β-pinene
α-pinene
8

Bảng 1.1: Thành phần hóa học trong vỏ Bưởi (Citrus maxima)
STT Thành phần Hàm lượng (%)
1 α-Pinene 0.40
2 Sabinene 0.93
3 β-Pinene 3.71
4 Methyl heptenone 1.25
5 β-Myrcene 0.90
6 Hexanal 0.12
7 Sabinine 0.42
8 DL-Limonene 31.83
9 t-Ocimine 1.19
10 Linalool 0.16
11 1-Hexene,4-methyl 15.22
12 1-Hexene,3,3-dimethyl 0.67
13 Geranyl formate 1.83
14 Z-Citral 13.38
15 E-Citral 17.75
16 Geranylacetate 0.82
17 β-Farnesene 0.45
Bảng 1.2: Thành phần hóa học trong vỏ Cam (Citrus sinensis)
STT Thành phần Hàm lượng (%)
1 α-Pinene 0.36
2 Sabinene 0.37
3 β-Pinene 0.03
4 Methyl heptenone 0.01
5 β-Myrcene 1.71
6 Octanal 0.43
7 α-Phellandrene 0.04
8 (E)-b-ocimene 0.21

9 α-Terpinene 0.02
10 DL-Limonene 90.66
11 cis-Ocimine 0.02
12 β-Ocimine 0.04
13 Caprylic alcohol 0.05
14 Terpinolene 0.18
15 α-Terpinoline 0.06
16 Linalylacetate 2.80
9

17 Nonanal 0.05
18 2,6-Dimethyl-1,3,5,7- octatetraene 0.03
19 Myrtenylacetate 0.06
20 Artemiseole 0.18
21 Isopulegol 0.26
22 t-Sabinine hydrate 0.42
23 3-Cyclohexene-1-methanol 0.02
24 Decanal 0.02
25 b-Citronellol 0.17
26 Laevo-beta-pinene 0.46
27 Z-Citral 0.09

Theo nghiên cứu của Priyanka Singh, Ravindra Shukla và các cộng sự , tinh
dầu từ vỏ Bưởi và vỏ Cam có hoạt tính đạt chỉ số IC
50
từ 8,84 µl/ml đến 9,45 µl/ml
và đồng thời có LD
50
cao đối với động vật có vú (Thí nghiệm trên chuột bằng
đường miệng và thính giác). Nghiên cứu này cũng chỉ ra rằng trong tinh dầu của vỏ

cam, bưởi còn có tác dụng chống oxy hóa, kháng nấm và khả năng chống bệnh tốt,
trong đó D-Limonene đóng vai trò chính thể hiện hoạt tính của tinh dầu.[39]
1.4. Đặc tính hóa lý và hoạt tính sinh học của Limonene(D-limonene)
1.4.1.Đặc tính hóa lý [39]
Limonene bao gồm 2 cấu hình D-Limonene và L-Limonene, trong đó D-
Limonene được biết đến là cấu tử hữu ích chính của vai trò thể hiện hoạt tính sinh
học và chiếm hàm lượng từ 80%-95% của hỗn hợp limonene trong tinh dầu vỏ quả
có múi. Vì vậy có thể hiểu rằng D-Limonene là cấu tử thể hiện tính chất và các ứng
dụng hữu ích của Limonene.
D-Limonene là chất lỏng, không màu, có mùi thơm nhẹ, dễ cháy và không
tan trong nước.
- Công thức phân tử : C
10
H
16

- Khối lượng phân tử : 136 dvC
- Danh pháp : 1-methyl-4-(prop-1-en-2-yl)-cyclohexene
- Nhiệt độ sôi : 175 - 176
0
C
- Tỉ trọng : 0,8402 g/ml
- Chỉ số khúc xạ : 1.471
÷ 1.474
- Góc quay cực : + 101.4
0
÷ +104.5
0

- Tự bốc cháy : 237

0
C
10

1.4.2. Hoạt tính sinh học của Limonene
Thành phần hóa học chính trong vỏ các loài thuộc giống Citrus là các tecpen
mà chiếm hàm lượng lớn là Limonene. Đây cũng chính là thành phần quan trọng
nhất có vai trò chủ đạo trong chất lượng của tinh dầu vỏ quả và thể hiện các hoạt
tính chống oxy hóa, kháng nấm và diệt trừ các côn trùng gây bệnh.
Các nghiên cứu của Chang cùng cộng sự năm 2008 đã thử khả năng kháng
nấm của tinh dầu vỏ Bưởi (Citrus maxima), tinh d
ầu vỏ cam (Citrus sinensis) và
Limonene đối với nấm A.flavus. Nấm A.flavus được nuôi cấy trong môi trường
thạch trong 07 ngày, nhiệt độ ủ dao động từ 28
0
C-30
0
C khi đạt bán kính 5mm thì
đưa ra thử nghiệm. Limonene, tinh dầu vỏ cam, tinh dầu vỏ bưởi hòa tan trong
aceton rồi đưa vào môi trường ở các nồng độ 250ppm, 500ppm, 750ppm, 1000ppm
và một mẫu trắng. Nấm được cấy vào các hộp pectri có chứa môi trường đã trộn
hoạt chất. Theo dõi sự phát triển của nấm trong 10 ngày.[39]
Kết quả thể hiện như sau:
Bảng 1.3: Hoạt tính kháng nấm của tinh dầu bưởi, tinh dầu Cam và Limonene
Sự phát triển của nấm trong 10 ngày (mm)
Hoạt chất
Nồng độ
(ppm)
0 ngày 2 ngày 4 ngày 6 ngày 8 ngày 10 ngày
%GI

*
Mẫu trắng
5.0 13,6 26,2 37,4 53,2 82,2 -
250
5.0
8,0 13,9 32,3 41,7 63,4 23,4
500
5.0
6,95 8,82 25,6 32,4 42,9 48,1
750 5.0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100
Tinh dầu
Bưởi
1000
5.0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100
250
5.0
9,06 15,1 34,6 43,3 65,7 18,2
500
5.0
8,26 12,2 26,2 33,6 44,5 46,2
750 5.0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100
Tinh dầu
Cam
1000
5.0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100
250
5.0
9,48 14,2 27,8 35,7 46,3 44,0
500 5.0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100
750

5.0
5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100
Limonene
1000
5.0
5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 100

* %GI: % kìm hãm phát triển (Growth inhibition)
11

Qua kết quả thử hoạt tính kháng nấm trên cho thấy Limonene đạt hiệu quả
kháng 100% ở nồng độ 500 ppm. Điều đó chứng tỏ Limonene đóng vai trò chính
trong việc thể hiện khả năng kháng nấm A.flavus.[39]
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng Limonene(D-Limonene)
D-Limonene là một monotecpen được dùng làm chất phụ gia trong thực
phẩm, xà phòng, nước hoa để tạo mùi và hương thơm. Ngoài ra, D-Limonene còn
được dùng làm chất tẩy nhờn trong các nhà máy sản xuất máy tính và thiết bị
điện
thay thế cho chlorofluorohydrocacbon (CFC). Một số nghiên cứu trên động vật đã
chỉ ra rằng D-Limonene có tác dụng ngăn ngừa ung thư đối với động vật có vú như
ung thư phổi, ung thư dạ dày và ung thư da.[39]
Năm 1990, NTP (National Toxicology Program) cho biết D-Limonene có
khả năng gây ung thư thận ở chuột đực nhưng ở chuột cái và các loài khác lại không
thấy thể hiện gì. Nghiên cứu của NTP trên chuột đực và chuột cái có độ tuổ
i từ 7-8
tuần bằng cách đưa một lượng D-Limonene từ 0,3-600 mg/ngày (đối với chuột cái),
0,75-150 mg/ngày (đối với chuột đực) trộn cùng dầu ngô vào dạ dày trong 5
ngày/tuần và theo dõi trong 103 tuần. Kết quả cho thấy trong 13 tuần đầu tiên dạ
dày chuột có hiện tượng bị tổn thương, tỷ lệ sống sót tỉ lệ nghịch với liều lượng
dùng D-Limonene. Sự tồn tại có chọn lọc là 80% với liều thấ

p nhất và 58% đối với
liều cao nhất. Điều đó cho thấy D-Limonene gây tổn thương hoặc có thể gây tử
vong đối với chuột ở một liều lượng phù hợp.
Đối với người, Webb và đồng nghiệp đã chứng minh rằng chỉ sau 3 ngày,
lượng D-Limonene được hấp thụ qua đường hô hấp đã giải phóng hoàn toàn bằng
cách kiểm tra máu của những người sống và hít thở bình thường trong không gian
được phun D-Limonene v
ới liều lượng từ 225-450mg/m
3
.[5,19]









Hình 1.1: Một số sản phẩm từ D-Limonene
12

Trong thập kỷ qua, việc ứng dụng D-Limonene đã được mở rộng rất nhiều,
người ta đã sử dụng nó trong cả ngành công nghiệp sơn hoặc dùng như là một chất
lỏng làm mát thứ cấp. Bước tiến lớn nhất là sử dụng D-Limonene vào việc tẩy rửa
cả trong công nghiệp lẫn quy mô hộ gia đình. D-Limonene có thể được sử dụng như
một dung môi thông thường hoặc pha loãng với n
ước.
Là một dung môi thông thường, D-Limonene có thể thay thế một loạt các sản
phẩm methyl ethyl ketone, acetone, toluene, ete glycol và các dung môi khử trùng

chứa Flo và Clo. Như hầu hết các dung môi hữu cơ khác, D-Limonene không tan
trong nước, do đó có thể sử dụng trong các công đoạn tách nước điển hình. D-
Limonene có tính hòa tan tương tự CFC nhưng lại ít độc nên là một dung môi tốt
hơn nhiều so với các dung môi tẩy rửa khác.
Bằng cách pha D-Limonene với một gói chất hoạt động bề mặt cùng vớ
i
nước pha loãng ta đã có một sản phẩm tẩy rửa an toàn. Nồng độ sử dụng của D-
Limonene trong những trường hợp này thường là 5-15%. Nhìn chung các giải pháp
này được sử dụng vào việc phun và lau rửa các thiết bị công nghiệp mà không để lại
dư lượng các chất hóa học như các chất tẩy rửa khác. D-Limonene là một chất hóa
học đa năng, an toàn và hiệu quả hơn so với các sản phẩm tẩy rử
a điển hình.[8]
Trong các hợp chất thiên nhiên, Limonene (D-Limonene) cũng được biết đến
với đặc tính xua đuổi và diệt côn trùng, trừ sâu. Đối với động vật cảnh, người ta đã
dùng dung dịch tinh dầu có chứa Limonene để phun xịt trừ bọ chó, bọ mèo và côn
trùng gây hại khác (ve, mò, rận rệp). Bên cạnh đó, Limonene còn có khả năng diệt
bọ gậy của nhiều chủng loại muỗi gây sốt rét và sốt xuất huyế
t, viêm não Nhật Bản,
bệnh chân voi. Những chủng loại bệnh này nếu không được ngăn ngừa rất có thể
tạo ra đại dịch trên toàn thế giới, ảnh hưởng không nhỏ đến đời sống và sức khỏe
của loài người.
Hink và đồng nghiệp đã nghiên cứu D-Limonene trên trứng ruồi, ấu trùng
ruồi và ruồi non cho thấy ở nồng độ D-Limonene 1.0% diệt được 62% trứng và
61% ấu trùng ruồi. Đối v
ới ruồi non, D-Limonene 10% diệt được 34% ruồi. Khi
tiếp tục tăng nồng độ của D-Limonene khảo nghiệm trên từng đối tượng đều cho kết
quả không thay đổi. Điều đó cho thấy D-Limonene có tác dụng đối với một số đối
tượng có tính nhạy cảm cao(sức đề kháng kém).[5]
Ở Việt Nam hiện nay chưa có nghiên cứu nào cụ thể về ứng dụng của
Limonene trong lĩnh vực phòng ng

ừa côn trùng y tế. Phần lớn Limonene được dùng
13

làm chất tẩy rửa như nước lau nhà và nước rửa tay, xà phòng tắm,… do nó có mùi
thơm dịu nhẹ và có tính diệt khuẩn cao.
Vì vây, việc nghiên cứu chiết tách và thử nghiệm khả năng phòng trừ côn
trùng của Limonene là cần thiết để tạo ra một sản phẩm có nguồn gốc tự nhiên,
giảm ô nhiễm cho môi trường sống và an toàn cho người sử dụng.
1.6. Các phương pháp chiết tinh dầu và Limonene
Hiện nay trên thế giới, ngườ
i ta thường tách Limonene từ tinh dầu vỏ cam và
vỏ bưởi. Vỏ cam tươi đưa về qua xử lý sau đó dùng các phương pháp như cất cuốn
hơi nước hoặc ép, trích ly để tách lấy tinh dầu. Từ tinh dầu người ta sẽ tách
Limonene bằng cách chưng cất phân đoạn dưới áp suất giảm.
1.6.1. Cất lôi cuốn hơi nước
Có rất nhiều phương pháp sản xuất tinh dầu từ vỏ quả có múi như
ng thông
dụng nhất là phương pháp cất lôi cuốn hơi nước. Đây là phương pháp được sử dụng
khi chưng cất các hợp chất không bền nhiệt. Ưu điểm của nó là giữ được mùi hương
tự nhiên và quy trình đơn giản.
Có 3 dạng cất lôi cuốn tinh dầu như sau:
* Chưng cất với nước: Nguyên liệu và nước cùng cho vào một thiết bị. Khi
đun sôi, hơi nước bay ra sẽ cuốn theo tinh d
ầu, ngưng tụ hơi bay ra sẽ thu được hỗn
hợp gồm nước và tinh dầu, hai thành phần này không tan vào nhau nên dễ dàng tách
ra khỏi nhau.
* Chưng cất bằng hơi nước không có nồi hơi riêng: Nguyên liệu và nước
cùng cho vào một thiết bị nhưng cách nhau bởi một vỉ nồi. Khi đun sôi, hơi nước
bốc lên qua khối nguyên liệu kéo theo tinh dầu và đi ra thiết bị ngưng tụ. Để nguyên
liệu khỏi rơi vào ph

ần có nước ta có thể lót trên vỉ 1 hay nhiều lớp bao tải tùy theo
từng loại nguyên liệu. Phương pháp nay phù hợp với những cơ sở sản xuất có qui
mô trung bình.
* Chưng cất bằng hơi nước có nồi hơi riêng: Phương pháp này phù hợp với
những cơ sở sản xuất lớn, hơi nước được tạo ra từ một nồi hơi riêng và được dẫn
vào các thiết bị chưng cấ
t.
1.6.2. Chiết SCO
2
(CO
2
ở trạng thái siêu tới hạn)
Đối với mỗi một chất đang ở trạng thái khí, khi bị nén đẳng nhiệt tới một áp
suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng và ngược lại. Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà
tại đó, nếu tăng nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không hóa hơi trở lại mà tồn tại ở
14

một dạng đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn. Vật chất ở trạng thái trung gian này,
mang đặc tính của cả chất khí và chất lỏng.
Chất ở trạng thái siêu tới hạn có tỷ trọng tương đương như tỷ trọng của pha
lỏng. Nhưng sự linh động của các phân tử lại rất lớn, sức căng bề mặt nhỏ, hệ số
khuếch tán cao giống như khi chất ở trạng thái khí. Hình 1.1 biểu thị vùng trạng
thái siêu tới hạn của một chất trong biểu đồ cân bằng pha rắn, lỏng và khí của chất
đó theo sự biến thiên của áp suất và nhiệt độ. [4,31,37,33]
Các dung môi siêu tới hạn có khả năng hòa tan tốt các chất ở cả 3 dạng rắn,
lỏng và khí. Dung môi siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất dễ bay hơi và cả
các cấu tử không bay hơi của mẫu. Hiệu quả phân tách kết hợp của quá trình chưng
cất lôi cuốn và quá trình chiết ngược dòng lỏng - rắn.

Hình 1.1: Đồ thị biểu diễn tr
ạng thái của các chất ở vùng siêu tới hạn
Để đáp ứng các yêu cầu công nghệ chiết tách các hợp chất thiên nhiên, CO
2
là
dung môi được ưu tiên lựa chọn áp dụng vì các thuận lợi sau:
- CO
2
là một chất dễ kiếm, rẻ tiền vì là sản phẩm phụ của nhiều ngành công
nghệ hóa chất khác; [29]
Điểm ba (P
T
, T
T
)
Điểm tới hạn (P

C
, T
C
)

Khí
Lỏng
Rắn



Vùng siêu tới hạn

P
T
P
T

P
C

15

- Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết. Khi
được đưa lên đến trạng thái tới hạn, CO
2
không tự kích nổ, không bắt lửa và không
duy trì sự cháy; [35]
- CO
2

không độc với cơ thể, không ăn mòn thiết bị;
- Điểm tới hạn của CO
2
(P
c
= 73 atm; T
c
= 30,9
o
C) là một điểm có giá trị nhiệt
độ, áp suất không cao lắm so với các chất khác cho nên sẽ ít tốn năng lượng hơn để
đưa CO
2
tới vùng siêu tới hạn;
- Có khả năng hòa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn cũng như lỏng, đồng
thời cũng hòa tan được cả các chất thơm dễ bay hơi, không hòa tan các kim loại
nặng và có thể điều chỉnh các thông số trạng thái như áp suất và nhiệt độ để nâng
cao độ chọn lọc khi chiết tách;
- Khi sử dụng CO
2
thương phẩm để chiết tách không có dư lượng cặn độc hại
trong chế phẩm chiết.
1.6.3. Các phương pháp khác
Theo phương pháp của Winniczuk và Parish (1997), Limonene được tách
bằng cách thủy phân. Vỏ cam được đưa vào bình thủy phân có bổ sung thêm axít
sunfuric loãng ở nhiệt độ 150
0
C. Sản phẩm sau khi thủy phân được chuyển vào bình
hứng và đưa sang thiết bị ngưng thu được Limonene có hàm lượng có thể lên tới
99%.

Theo một quy trình sản xuất khác, người ta thu nhận D-Limonene bằng cách
ép vỏ quả có múi được một dạng dịch sền sệt. Sản phẩm thu được sau khi ép được
đưa vào cất lôi cuốn hơi nước. Sản phẩm cuối cùng là Limonene kỹ thuật ở dạng
thô.
1.6.4. Lựa chọn phương án công nghệ
Trong phạm vi của đề tài này, chúng tôi đã chọn phương pháp chiết bằng
cách chưng cất lôi cuốn hơi nước tinh dầu vỏ quả kết hợp với cất phân đoạn dưới áp
suất giảm để tách Limonene trong vỏ quả có múi. Phương pháp đối chứng để so
sánh là phương pháp chiết Limonene bằng phương pháp SCO
2
. Sản phẩm được đưa
phân tích và thử nghiệm hoạt tính sinh học trong ứng dụng phòng ngừa ruồi, muỗi.




16

CHƯƠNG II. THỰC NGHIỆM

2.1. Đối tượng nghiên cứu
Khảo sát ba đối tượng vỏ quả có múi thông dụng
trên thị trường:
- Bưởi Đoan Hùng – Phú Thọ (Citrus maxima)
- Cam sành (Citrus sinensis L.Osbeck) phổ biến ở
Bắc Giang, Hưng Yên, Hà Giang, Tiền Giang…
- Chanh (Citrus limon) phân bố trên cả nước
Các mẫu nguyên liệu tươi được xay nhỏ và xử lý trước
khi chiết.

2.2. Phương pháp nghiên cứu
Tiến hành khảo sát hàm lượng tinh dầu nói chung và Limonene nói riêng
trong 3 loại vỏ quả nói trên ở trạng thái mẫu tươi bằng phương pháp cất lôi cuốn hơi
nước. Từ đó lựa chọn ra đối tượng phù hợp làm nguyên liệu tách Limonene cho
hiệu suất cao nhất. Song song làm thí nghiệm với phương pháp chiết bằng SCO
2
để
đối chứng.
2.2.1. Cất lôi cuốn hơi nước
2.2.1.1. Thiết kế nghiên cứu
Để thực hiện các nhiệm vụ của đề tài, chúng tôi đã tiến hành các nghiên cứu
theo thiết kế dưới đây

(Sơ đồ 2.1)











17

2.2.1.2. Cách tiến hành
Nguyên liệu trước khi đem đi chưng cất được xử lý như sau: Cân 50g
nguyên liệu (vỏ bưởi, cam, chanh) đã nghiền cho vào cốc thủy tinh, ngâm với
100 ml nước muối NaCl 5%. Ngâm qua đêm để nước thâm nhập vào các mô tế bào,
sau đó hỗn hợp được siêu âm có gia nhiệt để tăng cường cho quá trình chuyển khối.
Chuyển nguyên liệu đã xử lý vào bình cầu c
ủa bộ thiết bị chưng cất tinh dầu
Clevender, lắp thiết bị, qua ống sinh hàn bổ sung thêm khoảng 300 ml nước muối
NaCl 5% (nếu nước trong bình ít, do khi ngâm nguyên liệu hút nước). Khi nước
trong bình sôi, hỗn hợp tinh dầu và nước sẽ theo ống dẫn hơi lên ống sinh hàn và
ngưng tụ lại chảy xuống ống thu tinh dầu, ở đây do tinh dầu không hòa tan trong
nước và tùy theo khối lượng riêng của nó nhỏ hơn hay lớn hơn khối l

ượng riêng của
nước mà nổi lên trên bình hoặc chìm dưới đáy bình, còn nước chưng theo ống xi
Sơ đồ 2.1: Thiết kế nghiên cứu

Các thông số
thích hợp

Cất cuốn
hơi nước

Phân tích
QUY TRÌNH CÔNG NGHỆ
Thử hoạt tính sinh học
Tinh dầu
Nghiền
Cất phân
đo
ạ
n

Các thông số
thích hợp

Limonene
Nguyên liệu

D-Limonene 95%
18

phông hồi lưu vào bình cầu. Thời gian chưng cất kéo dài cho đến khi thấy lượng

tinh dầu trong ống thu không đổi.
Sau khi kết thúc chưng cất, để nguội, đọc lượng tinh dầu trong ống thu. Tách
lớp tinh dầu, làm khan bằng Na
2
SO
4
sau đó bảo quản trong lọ tối màu ở nhiệt độ
thấp. Xác định hiệu suất cất theo % khối lượng nguyên liệu. Xác định thành phần
tinh dầu bằng thiết bị sắc kí khí khối phổ GC-MS.
Tinh dầu sau khi tinh chế được đưa vào thiết bị cất phân đoạn Fischer. Tiến
hành cất phân đoạn dưới áp suất giảm để tách Limonene.
2.2.2. Chiết bằng SCO
2

Quá trình chiết Limonene bằng SCO
2
được thực hiện trên hệ thiết bị chiết
xuất SFT 250. Bình chiết có dung tích 2000 ml, áp suất làm việc tối đa 689,5 bar,
vùng nhiệt độ làm việc từ 20-150
0
C. Các thiết bị ngoại vi gồm có bơm đẩy dung
môi phụ trợ 1011 B-100-S và máy nén khí làm việc tại 6,895 bar cung cấp khí nén
tạo động lực cho bơm CO
2
cao áp hoạt động.
2.2.2.1. Lựa chọn đối tượng nghiên cứu
Trước tiên, tiến hành khảo sát sơ bộ với các điều kiện thực nghiệm: các mẫu
vỏ cam, vỏ bưởi, vỏ chanh được nghiền nhỏ. Mỗi loại mẫu lấy 200g nguyên liệu/1
lần chiết cho vào trong túi vải sạch, đưa vào trong bình chiết. Bình chiết được thiết
kế có màng lọc ngăn trước cửa các đường ống CO

2
và tháo dịch chiết để tránh việc
các hạt nhỏ lọt vào trong cản trở dung môi.
Quá trình khảo sát sơ bộ được thực hiện ở các điều kiện chiết sau:
Thời gian chiết : 5h
Nhiệt độ bình chiết : 60
0
C
Áp suất bình chiết : 280 bar
Phân tích và so sánh lượng Limonene thu được từ các mẫu nguyên liệu để
lựa chọn đối tượng chiết cho hiệu suất cao nhất.
2.2.2.2. Quy hoạch hóa thực nghiệm xác định điều kiện chiết tối ưu
a. Giai đoạn 1: Chiết tinh dầu
Sau khi lựa chọn được đối tượng nghiên cứu thích hợp, chúng tôi tiến hành
khảo sát sự ảnh hưởng của áp suất (P), nhiệt độ (T) và th
ời gian (t) tới hiệu suất dầu
thu được (Y). Các nghiên cứu được thực hiện trên cơ sở mô hình thực nghiệm quy
hoạch trực giao bậc 2 với ba yếu tố:
Thời gian chiết : 1 - 5h
Nhiệt độ bình chiết : 30 - 60
0
C
19

Áp suất bình chiết : 100 - 280 bar
Sử dụng phần mềm MODDE 9.0 để xây dựng phương trình thực nghiệm, mô
phỏng kết quả trên đồ thị, tối ưu hóa các thông số công nghệ cho quá trình chiết.
Quy hoạch hóa trực giao bậc hai cần số thí nghiệm được xác định theo công thức:
N
=

2
k-q
+2k + n
o

Trong đó: N: tổng số thí nghiệm cần làm
2
k-q
:số thí nghiệm làm ở ma trận gốc
2k: số thí nghiệm làm ở điểm sao
n
o
: số thí nghiệm làm lặp lại ở tâm (n
o
>1)
k: số yếu tố khảo sát
q: mức rút gọn
Như vậy, cần tiến hành 17 thí nghiệm theo bảng quy hoạch, từ đó xây dựng
hàm mục tiêu:
Y = a
0
+ a
1
T + a
2
P + a
3
t + a
4
TP + a

5
Pt + a
6
tT + a
7
T
2
+ a
8
P
2
+ a
9
t
2
- Xác định các hệ số trong phương trình hồi quy (hàm mục tiêu)
- Đánh giá tính có nghĩa của các hệ số trong hàm mục tiêu tìm được dựa vào tiêu
chuẩn Student.
b
b
S
b
t =
; t
b
> t
bảng
(p, f
2
)

Trong đó: t
bảng
(p, f
2
) tiêu chuẩn Student tra bảng ở mức có nghĩa p và bậc tự do
f
2
(f
2
= n
o
-1)
- Đánh giá sự phù hợp của hàm mục tiêu dựa vào tiêu chuẩn Fisher khi đó loại bỏ
các hệ số không có nghĩa, chỉ giữ lại các hệ số có nghĩa trong hàm mục tiêu.
2
1
2
S
S
F
d −
= ; ),,(
12
ffpFF
≤

Trong đó: F(p,f
2
,f
1

): tiêu chuẩn Fisher tra bảng ở mức có nghĩa p với bậc tự do
f
2
và f
1
(f
2
= n
o
-1; f
1
= N-a)
a: số hệ số có nghĩa còn lại trong hàm mục tiêu
2
−d
S : phương sai dư
S
2
l
: phương sai lặp.
- Tìm điều kiện cực trị để hiệu suất chiết được tối ưu
Y
max
(%)
=
f (T
opt
, P
opt
, t

opt
)
Trong đó: T
opt
- nhiệt độ tối ưu (
o
C)
P
opt
- áp suất tối ưu (bar)
20

t
opt
- thời gian tối ưu (h)
Sử dụng các điều kiện tối ưu tìm được, tiến hành khảo sát kiểm chứng lại kết
quả lý thuyết. Thực hiện 03 thí nghiệm, mỗi thí nghiệm 200g nguyên liệu tại các
thông số tối ưu.
b. Giai đoạn 2: Chiết D-Limonene
Sử dụng lượng tinh dầu thu được ở giai đoạn 1 làm nguyên liệu cho quá trình
chiết D-Limonene. Dùng mô hình quy hoạch hóa thực nghiệm trực giao bậ
c 2 ba
yếu tố xác định các thông số tối ưu (cách làm như giai đoạn 1).
Quá trình chiết được nghiên cứu ở các điều kiện sau:
Khối lượng mẫu : 50g;
Nhiệt độ : 30 - 50
0
C;
Áp suất : 80 – 125 bar;
Thời gian : 1 – 5h;

Co-solvent : 0,5% Ethanol.
Sau đó, tiến hành 3 thí nghiệm kiểm chứng giá trị tối ưu thu được ở trên. Sản
phẩm được đưa đi phân tích hàm lượng D-Limonene, đối chiếu với kết quả cất lôi
cuốn hơi nước.
2.3. Thiết bị, hóa chất
2.3.1. Thiết bị
- Bộ cất tinh dầu Clevender;
- Thiết bị chiết SCO
2
SFT-250 (Mỹ);
- Thiết bị chưng cất phân đoạn Fischer;(Đức)
- Bếp điện
2.3.2. Hóa chất
- Ethanol 99,5%,
- CO
2
99%



Hình 2.1: Thiết bị chiết SFT-250 Hình 2.2: Thiết bị chưng cất phân đoạn