bước đầu thiết lập quy trình sản xuất nước chấm bằng protease

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang

MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn
Chương 1: TỔNG QUAN
1.1 Giới thiệu chung 1
1.1.1 Tổng quan về sản phẩm nước chấm 1
1.1.2 Nguyên liệu sản xuất nước chấm 4
1.1.2.1 Nguyên liệu chính 4
1.1.2.2 Nguyên liệu phụ 8
1.1.3 Khái quát về protease 9
1.2 Kỹ thuật sản xuất nước chấm 11
1.2.1 Quá trình thủy phân trong thực phẩm 11
1.2.2 Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước chấm 13
1.2.3 Một số phương pháp sản xuất nước chấm 13
1.2.3.1 Phương pháp hóa giải 14
1.2.3.2 Phương pháp lên men 15
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 16
2.1.1. Đậu nành 16
2.1.2. Enzyme 16
2.1.3. Gia vị và phụ gia thực phẩm 17
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang

2.2. Phương pháp 18
2.2.1. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson 18
2.2.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry 20
2.2.3. Định hàm lượng đạm tổng số theo Kjeldahl 21
2.2.4. Xác định đạm formol theo phương pháp Sorensen 24
2.2.5. Xác định đạm NH
3
25
2.2.6. Xác định hàm lượng lipid thô 27
2.2.7. Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

29
2.2.8. Định lượng đường hòa tan 30

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1 Khảo sát các điều kiện ảnh hưởng đến hoạt tính của Alcalase 31
3.1.1 Đường chẩn để xác định hàm lượng Tyrosin 31
3.1.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ 32
3.1.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH 33
3.2 Chỉ tiêu hóa học của nguyên liệu đậu nành 33
3.2.1 Xác định hàm lượng đạm tổng số 33
3.2.2 Hàm lượng đạm formol 34
3.2.3 Xác định hàm lượng đạm amoniac 35
3.2.4 Xác định hàm lượng protein 35
3.2.5 Xác định hàm lượng đường khử 37
3.2.6 Xác định hàm lượng Lipid 38
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang

3.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân đậu nành 38
3.3.1 Khảo sát sự ảnh hưởng của pH đến quá trình thủy phân 38
3.3.2 Khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ enzyme
đến quá trình thủy phân 39
3.3.3 Khảo sát sự ảnh hưởng của thể tích nước
đến quá trình thủy phân 41
3.4 Chỉ tiêu hóa học của đậu nành sau thủy phân 42
3.4.1 Xác định hàm lượng đạm tổng số 42
3.4.2 Hàm lượng đạm formol 42
3.4.3 Hàm lượng đạm amoniac 43
3.4.4 Xác định hàm lượng protein của đậu nành
sau quá trình thủy phân 44
3.5 Chỉ tiêu hóa học của dung dịch sau thủy phân 44
3.5.1 Xác định hàm lượng đạm tổng số 44
3.5.2 Xác định hàm lượng đạm formol 45
3.5.3 Hàm lượng đạm NH
3
45
3.5.4 Xác định hàm lượng đường hòa tan 46
3.6 Xác định hiệu suất thủy phân 47
3.6.1 Hiệu suất thủy phân của protein trong đậu nành 47
3.6.2 Hiệu suất thủy phân đậu nành 47
3.7 Chỉ tiêu hóa học của nước chấm thành phẩm 48
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp


SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang

3.7.1 Xác định hàm lượng đạm tổng số 48

3.7.2 Xác định hàm lượng đạm formol 48
3.7.3 Xác định hàm lượng đạm NH
3
49
3.7.4 Xác định hàm lượng đường hòa tan 49
3.8 Chỉ tiêu vi sinh của nước chấm thành phẩm 49
3.9 Một số chỉ tiêu hóa học của nước chấm ngoài thị trường 50
Chương 4: KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
4.1 Kết luận 52
4.1.1 Khảo sát hoạt tính của enzym protease 52
4.1.2 Chỉ tiêu hóa học của đậu nành 52
4.1.3 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình
thủy phân đậu nành 52
4.1.4 Chỉ tiêu hóa học của đậu nành sau thủy phân 53
4.1.5 Chỉ tiêu hóa học của dung dịch sau thủy phân 53
4.1.6 Chỉ tiêu hóa học của nước chấm thành phẩm 54
4.1.7 Chỉ tiêu vi sinh của nước chấm thành phẩm 54
4.1.8 Bước đầu thiết lập quy trình sản xuất nước chấm bằng protease 55
4.2 Kiến nghị 56
Tài liệu tham khảo 57

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 1
Chương 1: TỔNG QUAN

1.1. GIỚI THIỆU CHUNG
1.1.1. Tổng quan về sản phm nước chấm
Nước chấm vừa là thực phNm giàu chất dinh dưỡng vì có chứa các acid amin, vừa
có tính chất gia vị giúp ta ăn ngon miệng rất cần trong chế biến thực phNm, cũng như chế

biến thức ăn ở gia đình. Về cơ sở sinh hóa tất cả các loại nước chấm đều là sản phNm thủy
phân nguyên liệu giàu protit từ động vật hay thực vật, dưới tác dụng của các chất như:
acid hay bazơ mạnh hoặc enzym. Do vậy thành phần chính của nước chấm là acid amin,
muối ăn, nước và một ít peptit. Đây là sản phNm cung cấp chất đạm cho cơ thể. [11]
1.1.1.1. Giá trị thực phm của nước chấm
Khi đánh giá chất lượng nước chấm về phương diện hóa học, trước hết người ta
chú ý đến lượng đạm toàn phần vì đây chính là chất dinh dưỡng có giá trị nhất của nước
chấm, tiếp theo cần xem xét lượng đạm amin. Từ hàm lượng đạm của hai loại đạm này
suy ra tỷ lệ đạm amin đối với đạm toàn phần cho biết mức độ thủy phân protein trong
nước chấm, tỷ lệ này càng cao càng tốt. Trung bình tỉ lệ này trong nước chấm lên men
khoảng 50 - 60%. Hàm lượng đạm amin cao làm giá trị mùi vị nước chấm được nâng
lên.[8]
1.1.1.2. Thành phần hóa học của nước chấm
Chất lượng nước chấm thay đổi tùy theo nguyên liệu, tỷ lệ phối chế, phương pháp
chế biến… Trong nước chấm lên men còn chứa khá nhiều đường do tác dụng của men
amylase của mốc lên tinh bột. Nước chấm còn chứa một lượng chất béo, một số vitamin,
muối ăn và các nguyên tố vi lượng khác. Vì vậy, các loại nước chấm nếu được sản xuất
theo đúng quy trình kỹ thuật và được bảo quản tốt sẽ có màu sắc đẹp, hương vị thơm và
có vị ngọt của đạm và đường. [8]
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 2
Bảng 1.1: Chỉ tiêu hóa lý của nước chấm hiện nay của Việt Nam [11]
Thành phần Hàm lượng
Nitơ toàn phần 12 – 20 (g/l)
Nitơ formol/nitơ toàn phần 55%
Nitơ NH
3
1,57 – 3 (g/l)
Độ acid (theo acid acetic) 5 – 7 (g/l)

pH 5,5 – 6,2 (g/l)
Muối ăn NaCl 230 – 250 (g/l)
Nitơ NH
3
/ Nitơ formol 20 – 30%
Nitơ formol 7,49 (g/l)
Fe 20 (mg/l)
Cu 20 (mg/l)
As 20 (mg/l)
Pb 0,5 (mg/l)
Ngoài ra, trong nước chấm còn chứa một lượng nhỏ các vitamin nhóm B, vài loại
muối khoáng.
1.1.1.3. Acid amin
Trong nước chấm có nhiều acid amin như arginin, methionin, tryptophan, tyrosin,
valin, serin, glycin, histidin, alanin, glutamic, asparagin… Những acid amin này cùng với
di, tri, tetra - peptid làm cho nước chấm có vị ngọt của đạm và mùi thơm của thịt.
Nước chấm sản xuất theo phương pháp lên men hầu như giữ được tất cả các acid
amin có trong đậu nành, còn nước chấm sản xuất theo phương pháp hóa giải thì có tỷ lệ
đạm amin trên đạm toàn phần cao hơn nước chấm lên men nên mùi vị ngon hơn. Tuy
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 3
nhiên, trong nước chấm hóa giải một số acid amin bị phân hủy, trước hết là tryptophan
sau đó đến lysin, cystein, arginin. Nếu phân hủy bằng acid quá độ thì một số acid amin bị
phân hủy thành các chất có mùi hôi như phenol, NH
3
, H
2
S…[8]
1.1.1.4. Đường

Trong nước chấm có các loại đường glucoza, fructoza, maltoza, pentoza, dextrin.
Đường có vai trò quan trọng trong việc hình thành màu sắc nước chấm. [8]
1.1.1.5. Acid hữu cơ
Các acid hữu cơ có trong nước chấm quan hệ mật thiết với nhau tạo hương vị đặc
trưng của nước chấm. Trong đó, acid lactic chiếm hàm lượng nhiều nhất (chiếm khoảng
1,6%). Acid lactic tác dụng với nước tương tạo hợp chất lactat như lactat phenol. Ngoài ra
còn có acid acetic 0,2%, acid sucinic 0,087 – 0,16%, acid formic 0,05%. Muối của các
acid này tham gia tạo vị cho nước chấm. [8]
1.1.1.6. Chất màu
Màu của nước chấm chủ yếu do đường kết hợp với acid amin tạo nên. Màu của
nước chấm lên men được hình thành dần dần từ màu vàng đến màu nâu nhạt, cuối cùng là
nâu đậm.
Sự hình thành màu của nước chấm phụ thuộc vào nồng độ đường, acid amin và
nhiệt độ. Nếu tăng cường phản ứng giữa acid amin với đường thì không có lợi vì tạo ra
melanoid. Melanoid là chất mà cơ thể khó hấp thu và khi nồng độ của nó cao sẽ làm giảm
hương vị của sản phNm. Mặt khác, quá trình hình thành sản phNm màu này gây tổn thất
lớn acid amin. Để hạn chế quá trình này, ta chọn nguyên liệu có hàm lượng đường thấp,
tránh nâng cao nhiệt độ và kéo dài thời gian thủy phân. [8]
1.1.1.7. Thành phần hương thơm
Mùi của nước chấm là do tổng hợp của rất nhiều chất khác nhau tạo thành. Mùi
của nước chấm có thể phân ra acid hữu cơ, rượu, aldehyde, thành phần hương thơm có
lưu huỳnh, phenol… Cụ thể là các hợp chất như acetaldehyde, propandehyde,
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 4
butaldehyde, valeraldehyde, allyl mecaptan, methyel mecaptan, isobutan aldehyde,
dimelthyl capmetan, etyloleat , rượu ethylic, acid acetic, acid petanoic, acid propionic,
acid benzoic, benzaldehyde… có hương thơm ngũ cốc rang. [8]
1.1.2. Nguyên liệu sản xuất nước chấm
Nguyên liệu dùng trong sản xuất nước tương thường rất giàu đạm

- Nguyên liệu có nguồn gốc từ thực vật: đậu nành, bã đậu nành, đậu phộng, bã đậu
phộng…
- Nguyên liệu có nguồn gốc động vật: xương bò, xương heo, lông, móng.
1.1.2.1. Nguyên liệu chính
Đậu nành
Đậu nành là một loại hạt giàu chất dinh dưỡng như protein, lipid, glucid, muối
khoáng và vitamin. Trong công nghiệp thực phNm, đậu nành được xem là một nguyên liệu
quan trọng để sản xuất dầu thực vật và để sản xuất các sản phNm lên men.
Đậu nành có tên khoa học là Glycine max merrill hay còn gọi là đậu tương là loại
hạt giàu protein và lipid. Phần lớn hạt đậu nành được dùng cho sản xuất dầu thực vật và
các sản phNm giàu protein. Protein của đậu nành có hoạt tính sinh học cao và có thể hỗ trợ
khi thiếu protein của động vật. [2]
Đậu nành là loại cây thân cỏ một năm, hoa tập trung trên những nách lá, kiểu bào
nang. Mỗi quả có 2 - 3 hạt hình oval, có vỏ bao bọc, vỏ chiếm khoảng 5 - 10% khối lượng
hạt. Khối lượng 1000 hạt khô là 140 - 200g. Đậu nành có nhiều màu sắc khác nhau. Trong
đó, màu vàng là loại tốt nhất, nên được trồng và sử dụng nhiều. [2]




Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 5

a. Cây b. Trái c. Hạt
Hình 1.1: Cây, trái và hạt đậu nành
 Thành phần hóa học và dinh dưỡng của hạt đậu nành
Bảng 1.2: Thành phần hóa học và cấu tạo trong hạt đậu nành [7]
Thành phần Tỷ lệ Protein (%) Lipid (%) Carbohydrate (%) Tro (%)
Nguyên hạt 100,0 40,0 20,0 35,0 4,9

Nhân (tử điệp) 90,3 43,0 23,3 29,0 5,0
Vỏ hạt 7,3 8,8 1,0 86,0 4,3
Phôi 2,4 41,0 11,0 43,0 4,4

Ngoài các thành phần chính là protein, lipid, glucid, hạt đậu nành còn chứa nước,
các vitamin: A, B
1
, B
2
, B
5
, B
6
, B
12
, PP, C, E và muối khoáng (khoảng 4,6% trọng lượng
hạt ướt) như các nguyên tố Fe, Cu, Mn, Ca, Zn. Thành phần hóa học của đậu nành thay
đổi tùy theo giống, đất đai và khí hậu trồng trọt, phương pháp thu hoạch và bảo quản.
 Protein đậu nành: Protein đậu nành được tạo bởi các acid amin, trong đó có
đủ các loại acid amin không thay thế (ngoại trừ hàm lượng methionin thấp). Có thể nói
protein đậu nành gần giống protein của trứng và được xem như một trong những nguyên
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 6
liệu chế biến các sản phNm thay thế protein động vật. Hàm lượng protein tổng dao động
trong hạt đậu nành: 29,6 – 50,5%, trung bình là 36 – 40%.
• Các nhóm protein đơn giản (% so với tổng số protein):
o Albumin: 6 - 8%
o Globulin: 25 - 34%
o Glutelin: 13 - 14%

o Prolamin: chiếm lượng nhỏ không đáng kể.
Bảng 1.3: Thành phần các acid amin trong protein của đậu nành [7]
Acid amin Hàm lượng (%) Acid amin Hàm lượng (%)
Isoleucin
Leucin
Lysin
Methionnin
Cystin
1,1
7,7
5,9
1,6
1,3
Phenylalanin
Threonin
Tryptophan
Valin
Histidin
5,0
4,3
1,3
5,4
2,6

 Chất béo đậu nành: Chất béo chiếm khoảng 20% trọng lượng khô của hạt
đậu nành, nằm chủ yếu trong phần tử điệp của hạt. Chất béo chứa hai thành phần chủ yếu
là triglycerid (chiếm 96% lượng chất béo thô) và lecithine (chiếm 2% chất béo thô).
Ngoài ra, còn có khoảng 0,5% acid béo tự do và một lượng nhỏ carotenoid.
 Carbohydrates: Chiếm khoảng 34% trọng lượng hạt đậu nành, gồm hai
nhóm: đường tan (lớn hơn 10%) và đường không tan (20%).

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 7
Bảng 1.4: Thành phần carbohydrates [7]
Hydratcacbon Hàm lượng (%) Hydratcacbon Hàm lượng (%)
Cellulose
Hemicellulose
Stachyose
4,0
15,4
3,8
Rafinose
Saccharose
Các loại đường khác
1,1
5,0
5,1
 Khoáng: chiếm tỷ lệ thấp (khoảng 5% trọng lượng hạt khô)
Bảng 1.5: Thành phần khoáng trong đậu nành [7]
Khoáng Hàm lượng Khoáng Hàm lượng
Canxi
Photpho
Mangan
0,16 – 0,47%
0,41 – 0,82%
0,22 – 0,24%
Kẽm
Sắt

37 ppm

90 – 150
o
/
oo


 Vitamin: các vitamin chứa rất ít trong đậu nành và hầu như bị biến tính trong
khi chế biến.
Bảng1.6: Một số vitamin trong hạt đậu nành [7]
Vitamin Hàm lượng (ppm) Vitamin Hàm lượng (ppm)
Thiamin
Riboflavin
Niaxin
Pyridoxin
Biotin
Acid panthothenic
11,0 – 17,5
3,4 – 3,6
21,4 – 23,0
7,1 – 12,0
0,8
13,0 – 21,5
Inoxton
Acid folic
Vitamin A
Vitamin E
Vitamin K

1,9
2300

0,18 – 2,43
1,4
1,9


Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 8
 Các enzyme: trong đậu nành chủ yếu là Urease, Lipoxygenase Amilase
Ngoài ra còn có một số thành phần gây mùi do sự oxy hóa chất béo. Đặc biệt là acid béo
không no dưới tác dụng của Lipoxygenase.
1.1.2.2. Nguyên liệu phụ
Nước
Nước là nguyên liệu cơ bản nhất, không thể thay thế được trong sản xuất nước
chấm. Nước chiếm khoảng 70 – 80% trọng lượng nước chấm thành phNm.
Thành phần hóa học và chất lượng của nước ảnh hưởng trực tiếp đến toàn bộ quá
trình kỹ thuật sản xuất và đặc biệt ảnh hưởng rất lớn đến đặc điểm, tính chất và chất lượng
thành phNm.
Nước giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành vị của sản phNm. Vì thế, nước
đưa vào sản xuất nước chấm luôn được kiểm tra chất lượng, thành phần hoá học của nước
phải ổn định và không bị ô nhiễm.
Muối (NaCl)
Muối cũng là một nguyên liệu cho sản xuất nước chấm. Ngoài việc đảm bảo độ
mặn cho nước chấm muối còn có tác dụng hạn chế hoạt động của vi sinh vật gây chua và
gây mốc giúp cho nước chấm có thể bảo quản lâu.
Muối dùng trong sản xuất là muối hạt. Thành phần chủ yếu của muối hạt là NaCl,
nước, chất tan và chất không tan.
Chất phụ gia
 Caramen
Nước chấm sau khi lọc đã có màu nâu nhạt. Muốn cho sản phNm có màu đẹp, hấp

dẫn người ta dùng caramen. Caramen là sản phNm thu được từ saccharose khi đun tới 180
– 190
0
C, là chất lỏng màu tối, hơi đắng, gọi là keo đắng.
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 9
 Chất điều vị (621 - natri glutamate)
Natri glutamate hay bột ngọt là sản phNm được dùng làm chất tạo vị trong sản xuất
nước chấm. Natri glutamate là muối của acid glutamic, nó là một trong các acid amin cần
thiết cho cơ thể con người. Ngoài ra nó còn có trong cơ thể động vật và một số loài thực
vật. Nó có vị đặc trưng của rau và thịt.
Công thức cấu tạo: HOOC – CH
2
– CH
2
– CH (NH
2
) – COONa
Là tinh thể màu trắng có vị ngọt, hơi mặn, tan nhiều trong nước, được sản xuất chủ
yếu từ khoai mì. Việc sử dụng natri glutamate làm tăng thêm giá trị dinh dưỡng cho sản
phNm. Tuỳ theo độ đạm mà cho hàm lượng bột ngọt khác nhau.
 Đường
Đường cho vào nước chấm nhằm tăng độ ngọt cho sản phNm, vì khi sản phNm hoàn
tất có độ mặn nên ta cho thêm một ít đường để điều hoà vị của nước chấm. Đường cho
vào sản phNm phải tinh khiết. Đường lẫn nhiều cặn bNn sẽ làm cho nước chấm bị chua và
mốc.
 Hương liệu
Mùi thơm của thực phNm do các nhóm hợp chất hoá học khác nhau tạo nên,
thường là các chất dễ bay hơi. Chúng có hàm lượng rất thấp nhưng hoạt tính rất cao.

Trong sản xuất nước chấm, hương liệu thường được sử dụng để tăng mùi thơm cho
sản phNm, tạo ra mùi tương ứng với mùi của nước chấm và có khả năng làm cho sản
phNm hấp dẫn hơn đối với người tiêu dùng. Các chất này có cường độ mùi cao và bền nên
cho mùi vào sản phNm tại công đoạn đóng bao bì.
1.1.3. Khái quát về protease
Hiện nay, việc sản xuất chế phNm enzyme các loại đã và đang phát triển mạnh mẽ
trên quy mô công nghiệp, đã có nhiều chế phNm enzyme bán trên thị trường thế giới. Các
chế phNm này đã được sản xuất và tinh chế có mức độ tinh khiết theo tiêu chuNn công
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 10
nghiệp và ứng dụng. Các chế phNm enzyme phổ biến như: amylase, protease, catalase,
cellulase, lipase…
Chế phNm enzyme không chỉ được ứng dụng trong Y học mà còn được ứng dụng
trong nhiều lĩnh vực khác nhau, trong công nghiệp, hóa học, thực phNm…
Việc sử dụng enzyme trong công nghiệp thực phNm ngày càng được ứng dụng
rộng rãi. Với protease được dùng trong công nghệ chế thịt, công nghệ chế biến cá… Với
amylase đã được dùng trong sản xuất bánh mì, rượu, bánh kẹo, sản xuất bia, sản xuất mật,
sản xuất các sản phNm rau…
Phân loại protease: [10]
 Dựa vào sự phân bố có thể chia protease thành hai nhóm:
• Protease nội bào
• Protease ngoại bào
 Dựa vào tính đặc hiệu với cơ chất, có thể chia ra:
• Endopeptidase: là enzyme thủy phân các liên kết pepsin ở giữa mạch;
• Exopeptidase: là enzyme thủy phân các liên kết peptide ở đầu mạch.
 Dựa vào pH hoạt động có thể chia ra:
• Protease acid
• Protease kiềm
• Protease trung tính

 Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme có thể chia ra:
• Protease serin (OH): trypsin, substilopeptidase;
• Protease tiol (SH): papain, bromelin,…;
• Protease aspartic (COOH): pepsin, renin,…;
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 11
• Protease kim loại: cacboxylpeptidase A.
 Dựa vào nguồn thu enzyme có thể chia ra:
• Protease động vật.
• Protease thực vật.
• Protease vi sinh vật.
1.2. KỸ THUẬT SẢN XUẤT NƯỚC CHẤM
1.2.1. Quá trình thủy phân trong thực phm
Phản ứng thủy phân là phản ứng phân giải các chất có sự tham gia của nước. Đây
là phản ứng phổ biến và quan trọng trong công nghiệp thực phNm. Người ta đã ứng dụng
phản ứng thủy phân để sản xuất ra hàng loạt sản phNm mới có tính chất khác xa với tính
chất của nguyên liệu ban đầu. Ví dụ như sản xuất nước mắm, tương, chao, nước chấm lên
men… từ protid của động vật và thực vật. Sau phản ứng thủy phân tính chất cảm quan,
dinh dưỡng của thực phNm có thể tăng lên. Trong đa số trường hợp phản ứng thủy phân
có lợi, tuy nhiên cũng có trường hợp phản ứng thủy phân cũng gây sự hư hỏng thực phNm
khi bảo quản như trong bảo quản thị, cá, trứng, dầu, mỡ…[11]
Phản ứng thủy phân thường là phản ứng mở đầu cho hàng loạt các phản ứng tiếp
diễn. Ví dụ: protid sau khi thủy phân thành acid amin, acid amin sẽ bị phân giải sâu xa
hơn như dezamin hóa, decarboxyl hóa… Cuối cùng tạo ra những sản phNm có hại về mặt
cảm quan và dinh dưỡng cho thực phNm. Polysaccharid sau khi thủy phân tạo
monosaccharid (monose), các monose tiếp tục bi oxy hóa sâu xa hơn tạo một loạt sản
phNm trung gian và sản phNm cuối cùng là CO
2
và H

2
O. Lipid bị thủy phân tạo acid béo
và glicerin, acid béo tiếp tục bi oxy hóa tạo sản phNm có mùi vị khó chịu (sự ôi của chất
béo)…[11]
Trong những trường hợp có hại trên, ta phải tạo điều kiện hạn chế phản ứng thủy
phân như bảo quản lạnh, sấy khô, vô hoạt enzyme thủy phân…
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 12
Còn trong trường hợp phản ứng thủy phân có lợi, ta phải tạo điều kiện kỹ thuật để
tốc độ phản ứng xảy ra tối đa và tìm cách ứng dụng chúng trong mọi lĩnh vực tạo ra các
sản phNm tốt, có ích lợi trong cuộc sống. Ngày nay, phản ứng thủy phân ngày càng được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sản xuất - đặc biệt là công nghiệp thực phNm.
Trong công nhiệp thực phNm, thông thường tác nhân thủy phân có thể là acid, kiềm hay
enzyme, trong đó được sử dụng rộng rãi và hiệu quả là enzyme thủy phân từ vi sinh
vật.[11]
Nhóm enzyme thủy phân gọi tên chung là hydrolase - có thể được tách ra từ thực
vật, động vật, vi sinh vật.
Phương trình tổng quát phản ứng thủy phân: R
1
R
2
+ H
2
O R
1
OH + R
2
H
Hydrolase được chia thành bốn nhóm tùy theo bản chất cơ chất nó tác dụng-

Esterase, glucosidase, peptidase.
Ứng với bốn phương trình phản ứng sau [11]

1) R
1
-COO-R
2
+ H
2
O R
1
-COOH + R
2
-OH
Các ester
2) R-O-R
3
+ H
2
O ROH + R
3
OH
Glucid, peptid
R = glucid
R
3
= glucid hoặc phi-glucid
3) R
4
-CO-NH-R

5
+ H
2
O R
4
COOH + R
5
NH
2

Protid, peptid
4) R-CO-NH
2
+ H
2
O R-COO-NH
4

Amid
Esterase
Glucosidase
Peptidase
Amidase
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 13
1.2.2. Cơ sở khoa học của phương pháp sản xuất nước chấm
Ngành công nghiệp chế biến thực phNm nước ta ngày càng phát triển mạnh nhờ
vào các tiến bộ khoa học kỹ thuật và sự phát triển kinh tế. Để tối ưu hóa công nghệ chế
biến thực phNm nói chung và sản xuất nước chấm nói riêng, chúng ta sử dụng các chế

phNm enzyme như là một trong những biện pháp hữu hiệu. Ứng dụng enzym và các chế
phNm enzyme vào công nghệ sản xuất nước chấm là một trong những công nghệ mới. Cơ
sở khoa học của nó là sử dụng các chế phNm enzyme (alcalase, novozym, flavourzym…)
thủy phân protid trong nguyên liệu thành nước chấm. [11]
Đối với phương pháp hóa giải, cơ sở của phương pháp này là thủy phân protid thực
vật hay động vật thành các acid amin dưới tác nhân xúc tác là acid mạnh (HCl, H
2
SO
4
)
hay kiềm mạnh (NaOH). Sau thủy phân trung hòa dung dịch bằng kiềm (hay acid) tùy
thuộc vào tác nhân xúc tác là acid hay kiềm đưa pH về 6,7 – 7. Bổ sung NaCl đạt 23 –
25%. [11]
Đối với phương pháp lên men, cơ sở của phương pháp này là thủy phân protid nhờ
xúc tác là enzyme vi sinh vật. Enzyme này có thể tạo ra bằng cách nuôi cấy vi sinh vật
trên môi trường riêng rồi đưa vào nguyên liệu giàu đạm – như trong sản xuất nước chấm
lên men (nước tương) hoặc tận dụng enzyme vi sinh vật có sẵn trong nguyên liệu ban đầu
như trong sản xuất nước mắm. Dưới tác dụng của enzyme vi sinh vật, thành phần nước
chấm thu được chủ yếu là acid amin, pepton, peptid trọng lượng phân tử nhỏ, dễ đồng
hóa, dễ hấp thu cho người, lượng NaCl cho vào đạt 20 – 25%. [11]
1.2.3. Một số phương pháp sản xuất nước chấm
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 14
1.2.3.1. Phương pháp hóa giải [4]


Nguyên liệu

Xay nhỏ


HCl Thủy phân


Làm nguội


NaCO
3
Trung hòa


Để lắng


Lọc thô Bã


Phụ gia Phối chế Nấu Dd NaCl


Lọc tinh Lọc


Thanh trùng

Nước chấm

Sơ đồ 1.1: Quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp hóa giải
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 15
1.2.3.2. Phương pháp lên men [4]

Nguyên liệu


Nghiền


Bột mì Trộn H
2
O


Hấp


Đánh tơi, làm nguội


Trộn mốc giống


Lên mốc

Nước muối Làm tơi


Thủy phân


Lọc


Pha đấu


Thanh trùng Nước chấm


Sơ đồ 1.2: Quy trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 16
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1. VẬT LIỆU
2.1.1. Đậu nành
 Đậu nành được mua ở chợ
 Đặc điểm hạt đậu:
o Tròn
o Màu vàng
o Không có sâu mọt
2.1.2. Enzyme

Loại enzyme sử dụng cho thí nghiệm có tên thương mại là Alcalase, được cung cấp
bởi công ty Nam Giang, địa chỉ: 133/11, đường Hồ Văn Huê, phường 9, Q. Phú Nhuận,
Tp. Hồ Chí Minh.
Đặc điểm Alcalase:
Alcalase là một chế phNm enzyme được sản xuất từ chủng Bacillus licheniformis, ở
dạng lỏng, có màu nâu và tan rất tốt trong nước.
 Ưu điểm của Alcalase trong quá trình thủy phân protein thực vật:
 Sau khi thủy phân vị của sản phNm tinh khiết và dịu.
 Không tạo các phản ứng có hại: khác với quy trình dùng acid, phương pháp
thủy phân dùng enzyme không tạo ra chất 3 - MCPD
 Các thông số hoạt động của Alcalase:
 Nhiệt độ 55
0
C – 70
0
C
 pH là 6,5 – 8,5
Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 17
 Xử lý sơ bộ:
Xử lý nhiệt protein trước khi thủy phân sẽ làm biến tính protein, giúp enzyme dễ
dàng thủy phân hơn và cũng sẽ giúp hạn chế sự nhiễm khuNn trong giai đoạn thủy phân.
Cần xay hay nghiền nhỏ trước khi qua giai đoạn thủy phân.



Hình 2.1: Protein bị thủy phân

2.1.3. Gia vị và phụ gia thực phm

 Muối (công ty cổ phần muối và thương mại miền Nam), đường (công ty
đường Biên Hòa) được mua ở chợ.
 Chất điều vị (621), chất tạo hương, màu caramel (150a), chất bảo quản (611)
được mua ở của hàng hóa chất - hương liệu.

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 18
2.2. PHƯƠNG PHÁP
2.2.1. Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Anson [3]
2.2.1.1. Nguyên tắc
Casein bị phân giải dưới tác dụng của protease tạo sản phNm là các đoạn peptide
ngắn hòa tan trong tricloroacetic (TCA), xác định lượng Tyrosine và Tryptophan hòa tan
bởi thuốc thử Folin
2.2.1.2. Cách tiến hành
o Dựng đường chuNn Tyrosine
Ống nghiệm
Dung dịch hóa chất
1 2 3 4 5 6
Dung dịch Tyrosine chuNn (ml) 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Lượng Tyrosine tương ứng ( µM)
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
Dung dịch HCl 0,2N (ml) 5,0 4,8 4,6 4,4 4,2 4,0
Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 5 5 5 5 5 5
Thuốc thử Folin (ml) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 660nm

Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ đường
chuNn Tyrosine tương quan giữa lượng Tyrosine (γM) và ∆OD (∆OD = OD
TT

– OD
TK
)

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 19
o Xác định lượng Tyrosine trong dung dịch nghiên cứu
Ống nghiệm
Dung dịch hóa chất
1 2
Dung dịch Casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở nhiệt độ 35
0
C
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 10 phút, lọc lấy dịch bên dưới

Lấy 6 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lô, mỗi lô ba ống để lấy trung bình
đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và cho vào ống B 5ml
dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 5 ml NaOH 0,5N và 0,6ml thuốc thử Folin, lắc mạnh, sau 10
phút, đo OD ở bước sóng 660nm. Tính ∆OD = OD
TT
– OD
TK
, dựa vào đồ thị chuNn suy ra
được µM Tyrosine.

2.2.1.3. Cách tính
Định nghĩa đơn vị Anson: một đơn vị Anson là lượng enzyme tối thiểu trong điều
kiện chuNn (35,5
0
C, pH 7,6) thủy phân casein trong 1 phút tạo thành sản phNm hòa tan
trong TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD ở bước sóng 660nm
tương ứng với 1µM Tyrosine trong đường chuNn.
,
M Tyrosine . V . L
H ñ P (U I)
t . v . v
µ
=

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 20
Với: Hđ P : Hoạt độ enzyme protease
V : Tổng thể tích hỗn hợp trong ống nghiệm 1 hoặc 2 (ml)
v : Thể tích dung dịch lọc đem phân tích (ml)
t : Thời gian thủy phân (phút)
v’ : Thể tích mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (ml)
L : Độ pha loãng mẫu enzyme
µM Tyrosine : Lượng µM Tyrosine trong v (ml) suy ra từ đường chuNn.

2.2.2. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Lowry [5]
2.2.2.1. Nguyên tắc:
Hầu hết các protein đều chứa Tyrosine và Tryptophan. Hàm lượng của những
amino acid này tùy thuộc vào loại protein, vì vậy những protein cùng một loại với nhau
có hàm lượng các amine này giống nhau

Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có màu.
Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng Tyrosine và Tryptophan (cũng là hàm
lượng Protein), vì vậy ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm lượng protein
2.2.2.2. Cách tiến hành
Dựng đường chuNn ta thực hiện đường chuNn với một loại protein tinh khiết sau đó
để có được các dung dịch albumin chuNn có nồng độ protein từ 0 đến 250 µg /ml
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ Protein µg/ml 0 50 100 150 200 250
Dung dịch albumin 0,1% (ml) 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
Nước cất(ml) 10 9,5 9,0 8,5 8,0 7,5

Luận văn tốt nghiệp GVHD: TS. Ngô Đại Nghiệp

SVTH: Nguyễn Hoàng Nhật Quang Trang 21
Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa pha ở
trên theo thứ tự từ 0 đến 5 vào bảy ống nghiệm sạch khác (gồm hai ống thử không và năm
ống từ 1 đến 5). Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong
5 phút. Sau đó thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 - 10 phút, thêm nước cất
cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 500nm.
Vẽ biểu đồ biểu diễn sự biến thiên của mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein
chuNn (µg/ml).
 Xác định hàm lượng protein trong mẫu
Hút 0,4ml dung dịch protein cần xác định cho vào một ống nghiệm sạch sấy khô.
Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó
thêm vào 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem
đo mật độ quang ở bước sóng 500nm (nên làm 3 ống nghiệm để lấy giá trị trung bình).
2.2.2.3. Cách tính
Từ đường chuNn so sánh mật độ quang của ống nghiệm chứa mẫu protein. Từ đó
suy ra hàm lượng protein của nguyên liệu là a (µg/ml)
Lượng protein (M) có trong 1 ml nguyên liệu a.10

-3
(mg/ml)
Hoạt tính riêng của enzyme (HTR) = Hoạt tính enzyme (UI/ml)/Hàm lượng protein
(mg/ml)
2.2.3. Định hàm lượng đạm tổng số theo Kjeldahl [3]
2.2.3.1. Nguyên tắc
Chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi cho tác
dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra ammoniac
(NH
4
)
2
SO
4
+ 2NaOH 2NH
4
OH + Na
2
SO
4
Lượng ammoniac phóng thích ra được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ là máy
Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng thừa H
2
SO
4
. Từ